专利名称：一种用于抗氧化药物筛选的细胞模型及其构建方法
技术领域：
本发明涉及一种药物筛选模型，具体的说，涉及一种用于抗氧化药物筛选的细胞模型及其构建方法。
背景技术：
氧化损伤是常见的病理现象。人类衰老、肿瘤发生过程中氧化损伤是原因之一。抗氧化药物主要是通过清除活性氧自由基，预防脂质过氧化的产生和阻断脂质过氧化的链式反应来发挥其作用[1]。
药物筛选模型是寻找和发现新药的重要条件之一。以往经典的抗氧化模型如过氧化氢等的检测方法比较复杂且有着明显的缺陷，因为它们不能反映化合物的抗氧化机制(如抗氧化蛋白之间的相互作用)、不能高通量和微量化检测。分子与细胞水平的筛选模型具有材料用量少，药物作用机制明确，可进行大规模筛选等特点，已成为目前药物筛选的主要方法。在03109791.X专利申请中，发明人提供了一种采用信号转导和活化因子(STAT)作为药物筛选靶点并包括荧光酶报告基因的细胞筛选模型，可用于抗肿瘤药物和及抗过敏药物的筛选。
抗氧化反应元件(Antioxidant Response Element，ARE)的基本概念是顺式作用的DNA序列与反式作用因子如何协调控制真核基因的表达。这些相互作用是由转录因子或转录因子复合物特异结合到增强子或启动子元件上介导的。这些元件即通常所说的调控序列，它一般见于转录起始位点的上游。调控序列(抗氧化元件)确定后，将所研究的基因中推测的顺式作用序列与一个易于检测其产物的报告基因编码序列相连，通过对报告基因表达产物的测定来测出完整的调控序列。
转录因子Nrf2在中心蛋白内部结合到抗氧化蛋白基因5’调控区的抗氧化反应元件上，介导抗氧化应激的蛋白的表达。由于在研究基因方面，ARE可诱导单氧化物酶和拥有顺式增强元件，包括鼠Gsta1亚基因增强作用和鼠与人的NQO1基因等，使它在转录因子及信号通路方面有着重要的增强作用[2]。
建立基于抗氧化元件的抗氧化药物细胞筛选模型有利于该类药物的高通量筛选，为发现和寻找新药提供了一种简便快速的方法[3]。
发明内容
本发明的目的是提供一种简便、快速的筛选抗氧化药物的细胞模型。
本发明提供的药物模型是克隆了报告基因表达载体，并在载体启动子上游位点插入一个或一个以上串连的抗氧化反应元件(ARE)的体外培养细胞。
其中，报告基因优选pTAL-SEAP载体。当几个ARE序列串连时，优选的数量是2～20个，在每个ARE序列间可插入连接碱基。体外培养细胞优选293细胞。
本发明中的抗氧化元件，不仅能阐述抗氧化介导的调控基因的表达机制及规律，还可诱导细胞表面亲电子的化合物和酚基抗氧化作用；可进行微量检测；高通量；直接定位在靶位点(靶标)，准确可靠。把靶基因如(病毒感染、肿瘤、炎症、免疫系统疾病等)表达的调控序列与编码某种酶活性的基因相连，输入细胞内，通过简单地检测酶活性变化，就可以反映化合物对转录因子和基因表达作用性和程度。
本发明的另一目的是提供细胞模型的构建方法(1)合成抗氧化反应元件调控序列ARE片段，在ARE片段的5′末端和3′末端设计酶切位点，以便于和载体连接；(2)ARE片段和报告基因表达载体由连接酶催化，转化大肠杆菌；扩增，提取质粒DNA，测序以鉴定阳性克隆；(3)用脂质体法转染质粒，培养瞬时转染的细胞，制成氧化损伤模型。
其中步骤(1)ARE片段串连的抗氧化反应元件的个数优选在2～20之间，每个元件间以碱基连接；步骤(2)中报告基因表达载体优选pTAL-SEAP载体；步骤(3)中体外培养细胞优选293细胞。
在本发明的一个实施例中，提供了一种最佳的方案，其中步骤(1)所述ARE片段串连的抗氧化反应元件的个数是6个，每个元件间以2个碱基TA连接。
本发明提供的细胞模型具有活细胞的结构及其复杂功能，易于操作。利用细胞体系易于推断实验结果，并且能阐明关键的细胞功能，提高了筛选活性化合物的能力，能更好地反映其作用机制。细胞模型简单、灵敏，可在微孔中操作的荧光检测，尤其适用于高通量药物筛选。
图1、重组报告基因载体pARE-TAL-SEAP构建流程图2、重组报告基因载体pARE-TAL-SEAP酶切鉴定，A为Marker DL-2000，B、C为XHo I、Kpn I双酶切片段图3、H2O2氧化损伤后25μmol/L浓度的样品对293细胞的保护作用图4、H2O2氧化损伤后100μmol/L浓度的样品对293细胞的保护作用
具体实施例方式
以下实施例是为了进一步说明本发明提供的抗氧化药物筛选细胞模型的实施方式和用途。实施例是为了解释而不是以任何方式限制本发明的范围，本领域技术人员在权利要求的范围内所做出的某些改变和调整也应认为属于本发明的范围。
实施例一、重组质粒的建立1、材料1.1细胞株、质粒与菌株HEK-293细胞为本室保存。SEAP报告基因载体pTAL-SEAP、β-半乳糖苷酶(β-galactosiase，β-gal)表达质粒由吕秋军研究员提供。大肠杆菌DH5α为本室保存。
1.2工具酶及其他试剂Kpn I Xho I限制性内切酶、T4DNA连接酶、T4Polynucleotide Kinase、ATP酶购自宝生物公司；PRMI 1640培养基、质粒提取试剂盒购自Promege公司；SEAP荧光检测试剂盒购自CLONTECH公司；脂质体LIPOFECTAMINETM2000 Reagent购自Gibco InvitrogenCorporation公司。
1.3主要仪器二氧化碳培氧箱(Nuaire)；倒置生物显微镜(XSZ-D2)、台式高速离心机(D-37520，OsterodeLabfuge400R)；核酸蛋白分析仪(UD-640)；微孔板荧光读数仪(POLARstar talaxy)。
2、方法2.1调控序列的设计与合成根据抗氧化反应元件特异(ARE)序列为TGACTCAGC，每个元件间以2个碱基TA连接，本研究设计的重组报告基因载体的调控序列为ARE片段6×ARE，由北京奥科生物技术有限公司合成。根据pTAL-SEAP载体启动子上游多克隆位点酶切图谱在6×ARE片段的5′末端和3′末端分别设计了Kpn I和Xho I酶切位点，以便于和载体连接。50μl体系中T4多核苷酸激酶20(U)；1mmATP；加上引物100pmol，37℃反应1h，然后68℃ 20min灭活T4多核苷酸激酶，以上反应95℃ 5min后逐渐降至50℃，维持20℃约1-2h完成退火。
2.2片段的回收和纯化根据基因载体pTAL-SEAP和6×ARE正义、反义经退火处理形成的双链DNA，载体用Kpn I和Xho I双酶切回收并纯化。
2.3重组报告基因载体的构建、筛选及鉴定双链6×ARE片段和pTAL-SEAP载体由T4DNA连接酶催化，于16℃反应4h，6×ARE与载体的摩尔比为9∶1。将连接反应混合物转化大肠杆菌DH5α。挑取10个单菌落，小量扩增，提取质粒DNA，经Kpn I和Xho I双酶切后用2％agase琼脂糖电泳鉴定及送往北京华大中生科技有限公司进行测序以鉴定阳性克隆。重组报告基因载体pARE-TAL-SEAP构建流程如图1。
实施例二、抗氧化药物的筛选在含5％新生小牛血清的RPMI 1640培养基5％CO2条件下培养稳定转染的293细胞。收细胞接种于24孔板，每孔细胞数为5×104待细胞达90％时用脂质体法转染质粒。每孔加入pARE-TAL-SEAP 1μg，β-gal 0.1μg脂质体2μl，转染6h后每孔补充0.5ml完全培养液，同时加入25μmol/L H2O2于每孔中，以制成氧化损伤模型。
用25μmol/L H2O2氧化损伤293细胞后加入25μmol/L及100μmol/L的1#、2#、3#、4#样品。其中5#样品为一不具有抗氧化作用的阴性对照，6#样品为已知的具有抗氧化活性的物质其他为待测样品。
在上述的四种化合物中1#的抗氧化活性在100μmol/L时的作用最强(SEAP值是最高的)，而在25μmol/L时的作用不明显。1#的抗氧化活性在100μmol/L时诱导SEAP的最大表达水平较对照孔可升高1.14倍(见图3、图4)，说明其可抑制H2O2诱导的氧化应激反应。而6#样品无此功能。
参考文献1、M itchell JH et al.Arch Biochem Biophys，1998，360(1)142-1482、Truyen Nguyen，Philip J.et al.Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.2003.43233-603、刘琼、吕秋军、温利清等。基于报告基因的雌激素受体α亚型配体筛选模型的建立和应用.药学学报.2000.35(10)747。
权利要求
1.一种用于抗氧化药物筛选的细胞模型，是克隆了报告基因表达载体，并在载体启动子上游位点插入一个或一个以上串连的抗氧化反应元件的体外培养细胞。
2.根据权利要求1所述的细胞模型，其特征是所述报告基因表达载体选自pTAL-SEAP载体。
3.根据权利要求1或2所述的细胞模型，其特征是串连的抗氧化反应元件的个数在2～20之间。
4.根据权利要求3所述的细胞模型，其特征是串连的抗氧化反应元件的个数是6个，每个元件间以2个碱基TA连接。
5.根据权利要求1所述的细胞模型，其特征是所述体外培养细胞选自293细胞。
6.权利要求1所述细胞模型的构建方法，其特征是包含以下步骤(1)合成抗氧化反应元件ARE片段，在ARE片段的5’末端和3’末端设计酶切位点，以便于和载体连接；(2)ARE片段和报告基因表达载体由连接酶催化，转化大肠杆菌；扩增，提取质粒DNA，测序以鉴定阳性克隆；(3)用脂质体法转染质粒，培养瞬时转染的细胞，制成细胞模型。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征是步骤(1)中ARE片段串连的抗氧化反应元件的个数在2～20之间，每个元件间以碱基连接。
8.根据权利要求6所述的构建方法，其特征是步骤(2)中报告基因表达载体选自pTAL-SEAP载体。
9.根据权利要求6所述的构建方法，其特征是步骤(3)中所述体外培养细胞选自293细胞。
全文摘要
本发明提供了一种用于抗氧化药物筛选的细胞模型，该模型是克隆了报告基因表达载体，并在载体启动子上游位点插入一个或一个以上串连的抗氧化反应元件的体外培养细胞。本发明还提供了模型的构建方法。细胞模型易于推断实验结果，能阐明关键的细胞功能，能更好地反映药物作用机制，可在微孔中进行荧光检测，尤其适用于高通量药物筛选。
文档编号C12N15/63GK1958791SQ200510118390
公开日2007年5月9日 申请日期2005年10月31日 优先权日2005年10月31日
发明者谢玲, 黄海潇, 张 浩, 熊国林, 邢爽, 吕秋军, 从玉文, 罗庆良 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所