专利名称：一种石蜡包埋组织提取蛋白质的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及蛋白质提取技术，具体涉及一种从石蜡包埋组织中提取蛋白质的方法。
背景技术：
医院病理科档案中积存的大量石蜡包埋组织，是一个可靠的分子生物学研究的材料来源。Goelz(1985)和Dubeau等(1986)成功地从蜡块中提取出高质量的DNA，完全可以满足某些肿瘤分子生物学研究的需要，结束了DNA研究依赖于新鲜或冰冻组织和细胞的历史，诊断与鉴别诊断研究和患者预后评估等方面均具有重要价值。随之Erlander(2003)所建立的石蜡包埋组织RNA提取及mRNA扩增技术成功的运用于微阵列表达谱分析，使石蜡包埋组织在基因水平的应用得到了充分的体现。但直到目前仍没有提取石蜡包埋组织全蛋白质并分析其表达情况的报道，仅有少数研究涉及个别蛋白的提取及临床价值研究。Ikeda(1998)和Yazaki(2003)分别成功的从石蜡包埋组织中提取出λ1淀粉样蛋白和膜结合蛋白，说明了从石蜡包埋组织中提取蛋白质的可行性。目前未有石蜡包埋组织提取全蛋白质的报道。
而双向电泳技术，特别是以固相pH梯度等电聚焦为第一向的双向电泳技术是当前分辨率最高，信息量最大的电泳技术。所以在上世纪90年代中期Wilkins提出蛋白质组学这一概念后，双向电泳立即成为这个革命性课题的开门技术。对于此项技术的应用大都建立在新鲜组织或培养细胞提取蛋白质再进行电泳，而对于石蜡包埋组织如何脱蜡，从中高质量分离蛋白质，最终用于双向电泳作为对蛋白质表达及进一步分析与疾病的相关性，是目前国际上该领域研究的空白。
发明内容
本发明目的是提供一种石蜡包埋组织中提取蛋白质的方法。
本发明所述的石蜡包埋组织中提取蛋白质的方法，将石蜡包埋组织采用二甲苯脱蜡，水化提取蛋白质。
本发明所述的石蜡包埋组织中提取蛋白质的方法，含有以下步骤首先将石蜡包埋组织切片；然后使用二甲苯脱蜡，再用乙醇水化，最后加入裂解液离心分离得到。
本发明所述的石蜡包埋组织中提取蛋白质的方法，组织切片的厚度较好是8～10μm。
本发明所述的二甲苯脱蜡方法是本领域常用的二甲苯脱蜡方法。具体步骤是加入二甲苯震荡混匀，作用2小时，离心去除二甲苯，重复3次，直至肉眼观察管壁光滑。
本发明所述的乙醇水化是本领域常用的水化方法。具体步骤是用100％、95％、85％、75％乙醇梯度水化，震荡混匀，室温作用30分钟，弃去上清，最后风干5分钟。
本发明所述的石蜡是本领域常用的组织切片用石蜡，熔点为58～60℃。
本发明所述的裂解液含有促溶剂、去污剂、还原剂及蛋白酶抑制剂。本发明所述的裂解液组成可以参考《蛋白质化学与蛋白质组学》(夏其昌，曾嵘等编著.北京科学出版社，2004，4；242-244)。
本发明所述的裂解液组成可以是尿素浓度为7mol/L，硫脲浓度为2mol/L，CHAPS浓度为4％(w/V)，DTT浓度为65mmol/L及载体两性电解质CA为1％(V/V)。其中CHAPS是3-(3-(胆酰胺基丙基)二甲氨基)丙磺酸盐，DTT是二硫苏糖醇。其中载体两性电解质CA，购买于美国Bio-Rad公司。本发明所述的PMSF为苯甲基磺酰氟。
本发明所述的裂解液可以是RIPA裂解液。其中RIPA裂解液，购买于上海申能博彩公司。
本发明所述的裂解液用量为组织块1∶5-1∶10(体积比)。
本发明所述的石蜡包埋组织中提取蛋白质的方法，加入裂解液时还可以加入核酸酶。
本发明所述的核酸酶包括DNA酶I和RNA酶A，排除核酸干扰，其浓度分别为100-200μg/ml及50-100μg/ml。其中DNA酶I常用是DNase I，购买于日本Takara公司；RNA酶A常用是RNase A，购买于美国Genview公司。其中DNA酶I浓度最好是200μg/ml，RNA酶A浓度最好是50μg/ml。
本发明所述的石蜡包埋组织中提取蛋白质的方法，具体含有以下步骤1.将石蜡包埋组织切成8～10μm厚的薄片；2.加入二甲苯震荡混匀，作用2小时，离心去除二甲苯，重复3次，直至肉眼观察管壁光滑；3.100％、95％、85％、75％乙醇梯度水化，震荡混匀，室温作用30分钟，弃去上清，最后风干5分钟；4.加入裂解液混合均匀得到提取液，将提取液在液氮中反复冻融3～4次或超声碎裂处理至提取液清亮，室温作用60分钟后离心收集上清液即为所提取的蛋白质溶液，其中裂解液中尿素浓度为7mol/L，硫脲浓度为2mol/L，CHAPS浓度为4％(w/V)，DTT浓度为65mmol/L及载体两性电解质CA浓度为1％(V/V)，用量为组织块1∶5-1∶10(体积比)，其中超声碎裂处理时间为5秒，间歇时间为10秒，功率为100～200W。
本发明所述的石蜡包埋组织中提取蛋白质的方法，还可以含有以下步骤1.将石蜡包埋组织切成8～10μm厚的薄片；
2.加入二甲苯震荡混匀，作用2小时，离心去除二甲苯，重复3次，直至肉眼观察管壁光滑；3.100％、95％、85％、75％乙醇梯度水化，震荡混匀，室温作用30分钟，弃去上清，最后风干5分钟；4.加入裂解液混合均匀得到提取液，将提取液在液氮中反复冻融3～4次或超声碎裂处理至提取液清亮，加入核酸酶，室温作用60分钟后离心收集上清液即为所提取的蛋白质溶液，其中裂解液中尿素浓度为7mol/L，硫脲浓度为2mol/L，CHAPS浓度为4％(w/V)，DTT浓度为65mmol/L及载体两性电解质CA浓度为1％(V/V)，用量为组织块1∶5-1∶10(体积比)，其中超声碎裂处理时间为5秒，间歇时间为10秒，功率为100～200W。其中核酸酶包括DNaseI浓度为100-200μg/ml和RNase A浓度为及50-100μg/ml。
本发明有助于回顾性全面研究石蜡标本的蛋白质表达谱，明显优于目前个别研究涉及的仅从石蜡组织中提取某单个蛋白的技术；由于石蜡包埋的病理标本可以得到长期保存，因此本发明能为肿瘤等疾病在蛋白质水平上进行回顾性分析开辟了新的思路，通过结合详细的临床资料，深入探讨疾病的发生、发展及预后关系都有着重要意义，而尤其是对于罕见或随访病例无法得到新鲜组织，本发明具有独到的优势。
本发明所述的石蜡包埋组织中提取蛋白质的方法，具有用时短、提取效率高、操作简单方便、成本低等优点。
图1用透射扫描仪得到的双向电泳图谱。
具体实施例方式
以下实施例使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1一、从石蜡包埋组织提取蛋白质1.收集了病理科2004-2005年活检的大肠癌石蜡包埋标本，将石蜡包埋组织切成9μm厚的薄片置于EP管中；2.加入二甲苯37℃作用2小时，100rpm离心3分钟，倾去二甲苯，重复3次，肉眼观察管壁光滑；3.100％、95％、85％、75％乙醇梯度水化，室温作用30分钟，100rpm离心3分钟，弃去上清，最后风干5分钟；
4.按1∶6体积加入裂解液(7M尿素，2M硫脲，4％CHAPS，65mM DTT，1mM PMSF，1％载体两性电解质)，振荡混合均匀得到提取液，将提取液在液氮中反复冻融3次，室温作用60分钟后，15000rpm离心60分钟，收集上清液。
二、sradford法测量所提取蛋白质浓度双向电泳方案如下采用3-10L胶条，上样量约100μg，被动泡涨16小时，等电聚焦设置为250V 3小时，500V 1小时，1000V 1小时，5000V 3小时，10000V，共70000VHr，两步平衡各15分钟，采用银染显色。双向电泳结果如图1所示。
实施例2一、从石蜡包埋组织提取蛋白质1.收集了病理科2004-2005年活检的大肠癌石蜡包埋标本，将石蜡包埋组织切成8μm厚捞片于载玻片上；2.浸入二甲苯室温作用2小时，更换二甲苯，重复3次；3.浸入100％、95％、85％、75％乙醇梯度水化，室温作用30分钟，最后风干5分钟；4.按按1∶10体积加入RIPA裂解液(含1mM PMSF)，充分振荡混合均匀得到提取液，将提取液用超声碎裂处理6次至溶液清亮不粘稠，处理时间为5秒，间歇时间为10秒，功率为120W，再加入50μg/ml RNaseA及200μg/ml DNaseI，室温作用60分钟后，15000rpm离心30分钟，收集上清液。
二、SDS-PAGE采用5％积层胶和8％分离胶，采用银染显色。
实施例3一、从石蜡包埋组织提取蛋白质1.收集了病理科2004-2005年活检的大肠癌石蜡包埋标本，将石蜡包埋组织切成9μm厚的薄片置于EP管中；2.加入二甲苯37℃作用2小时，100rpm离心3分钟，倾去二甲苯，重复3次，肉眼观察管壁光滑；3.100％、95％、85％、75％乙醇梯度水化，室温作用30分钟，100rpm离心3分钟，弃去上清，最后风干5分钟；4.按1∶5体积加入裂解液(7M尿素，2M硫脲，4％CHAPS，65mM DTT，1mM PMSF，1％载体两性电解质)，振荡混合均匀得到提取液，将提取液在液氮中反复冻融4次，再加入100μg/ml RNaseA及100μg/ml DNaseI，室温作用60分钟，15000rpm离心60分钟，收集上清液。
二、sradford法测量所提取蛋白质浓度双向电泳方案如下采用3-10L胶条，上样量约100μg，被动泡涨16小时，等电聚焦设置为250V 3小时，500V 1小时，1000V 1小时，5000V 3小时，10000V，共70000VHr，两步平衡各15分钟，采用银染显色。
实施例4一、从石蜡包埋组织提取蛋白质1.收集了病理科2004-2005年活检的大肠癌石蜡包埋标本，将石蜡包埋组织切成8μm厚捞片于载玻片上；2.浸入二甲苯室温作用2小时，更换二甲苯，重复3次；3.浸入100％、95％、85％、75％乙醇梯度水化，室温作用30分钟，最后风干5分钟；4.按按1∶7体积加入RIPA裂解液(含1mM PMSF)，充分振荡混合均匀得到提取液，将提取液用超声碎裂处理10次至溶液清亮不粘稠，处理时间为5秒，间歇时间为10秒，功率为100W，再加入70μg/ml RNaseA及150μg/ml DNaseI，室温作用60分钟后，15000rpm离心30分钟，收集上清液。
二、SDS-PAGE采用5％积层胶和8％分离胶，采用银染显色。
权利要求
1.一种石蜡包埋组织中提取蛋白质的方法，含有以下步骤a)将石蜡包埋组织切成8～10μm的薄片；b)加入二甲苯震荡混匀，作用2小时，离心去除二甲苯，重复3次；c)100％、95％、85％、75％乙醇梯度水化，震荡混匀，室温作用30分钟，弃去上清，风干5分钟；d)加入裂解液，混合均匀得到提取液，将提取液在液氮中反复冻融3～4次或超声碎裂处理至提取液清亮，室温作用60分钟后离心收集上清液，其中裂解液中尿素浓度为7mol/L，硫脲浓度为2mol/L，CHAPS浓度为4％(w/V)，DTT浓度为65mmol/L及载体两性电解质CA浓度为1％(V/V)，用量为组织块1∶5-1∶10(体积比)，其中超声碎裂处理时间为5秒，间歇时间为10秒，？功率为100～200W。
2.权利要求1所述的石蜡包埋组织中提取蛋白质的方法，其特征在于裂解液是RIPA裂解液。
3.权利要求1和2所述的石蜡包埋组织中提取蛋白质的方法，其特征在于步骤d中加入100～200μg/ml的DNA酶I和50～100μg/ml的RNA酶A。
全文摘要
本发明一种石蜡包埋组织中提取蛋白质的方法涉及生物技术领域，尤其涉及蛋白质提取技术。本发明所述的石蜡包埋组织中提取蛋白质的方法含有以下步骤首先将石蜡包埋组织切片；然后使用二甲苯脱蜡，再用乙醇水化，最后加入裂解液和核酸酶离心分离得到。本发明具有用时短、提取效率高、操作简单方便、成本低等优点。
文档编号C12P21/00GK1803828SQ20051012087
公开日2006年7月19日 申请日期2005年12月28日 优先权日2005年12月28日
发明者赵亮, 丁彦青 申请人:南方医科大学