专利名称：补料发酵生产d－核糖的方法
技术领域：
本发明属于发酵工程技术领域，特别涉及一种补料发酵生产D-核糖的方法。
背景技术：
D-核糖是一种具有重要生理功能的五碳糖，在食品和医药等领域有广泛的用途。在食品工业中，D-核糖可用于生产核苷酸类风味增强剂，如5/-肌苷酸，5/-鸟苷酸等；在医药方面，D-核糖有着非常广泛的应用，其中应用最广的是半合成法生产核黄素。D-核糖本身也具有一定的医疗作用，如用于治疗因心脏机能不全而引起的身体虚弱等病症和因器官移植引起的器官机能衰退等；由于D-核糖所具有的分子结构比较特殊，因此可用来合成一些具有特殊空间结构的药物前体物。
目前D-核糖的生产方法有三种从天然物中提取D-核糖，化学合成法以及微生物发酵法。其中以微生物发酵法最可行。目前对发酵法生产D-核糖的研究大多集中在诱变选育D-核糖高产菌种，培养基配方的改进以及培养条件(温度、pH值、溶氧等等)对D-核糖发酵的影响上。迄今为止，关于补料发酵生产D-核糖的研究很少，仅高淑红(D-核糖发酵过程参数的研究与控制，工业微生物，2000，30(4)19-22)、郭建锋(pH值对D-核糖发酵的影响及补料发酵的研究，氨基酸和生物资源，2002，24(1)26-28)、杨柳(枯草芽孢杆菌D-核糖摇瓶发酵条件的研究，天津轻工业学院学报，2001，111-13)等对D-核糖的流加补料发酵进行过研究。其中郭建锋和杨柳研究的是摇瓶补料发酵，D-核糖产量分别提高了13.1％和5.5％；高淑红采用控制pH值与补料相结合的方式进行研究，将D-核糖产量提高了30％。
补料分批发酵是根据菌株生长和初始培养基的特点，在分批发酵的某些阶段适当补加培养基，使菌体或其代谢产物的生产时间延长。补料分批发酵介于分批发酵与连续发酵之间，兼有两者的优点，而又克服了两者的缺点，因而具有很好的发展前景。
发明内容
本发明的目的是解决现有工艺中存在的D-核糖产量不高和剩余葡萄糖过多问题，从而提供一种补料发酵生产D-核糖方法。本实验所使用的菌种是枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)中的转酮醇酶缺陷型枯草芽孢杆菌(transketolase deficient Bacillus subtilis)，是从天津科技大学食品科学与生物工程学院处购得，经诱变选育得到转酮醇酶缺陷型枯草芽孢杆菌HGD2004。
本发明的技术解决方案如下一种补料发酵生产D-核糖的方法，其特征为包括以下步骤①斜面培养将转酮醇酶缺陷型枯草芽孢杆菌HGD 2004放入斜面培养基中，将斜面放置在培养箱中培养24小时，培养温度36℃，斜面培养基的初始pH值为7.0；②种子液培养然后将培养好的菌种转入种子液培养基中，使用回转恒温调速摇瓶柜进行培养；控制转速240r/min，培养温度36℃，初始pH值为7.0，培养12小时；③发酵培养最后将培养好的种子液转入发酵罐进行发酵培养；在发酵培养中向发酵罐中通入无菌空气，通气量0.082m3/h，罐压0.02MPa，培养温度36℃，发酵的前24小时搅拌转速为700～900r/min，24小时后搅拌转速为500～700r/min，控制pH值为6.0～7.0，发酵时间为48～72小时；④葡萄糖补料在③步骤中发酵培养进行到25～45小时时开始采用间歇递减流加方式，每隔5小时流加浓度为400～1000g/L的葡萄糖补料液，共流加3次，每次分别为42mL、33mL和25mL；⑤硫酸铵补料在③步骤中发酵培养进行到30～40小时，在葡萄糖补料的同时，采用间歇定量流加的方式，开始每隔5小时流加浓度为200～300g/L的硫酸铵补料液，共流加2次，一共流加24mL补料液，得到产物。
所述的补料发酵生产D-核糖的方法，还包括以下步骤在所述④葡萄糖补料步骤中，在经过每隔5小时、共流加3次的葡萄糖补料后，进行葡萄糖再补料采用间歇递减流加方式，每隔8小时流加浓度为1000g/L的葡萄糖补料液，共流加3次，每次分别为30mL、20mL和10mL；同时在所述⑤硫酸铵补料步骤中在每隔5小时，共流加2次硫酸铵补料后，也进行硫酸铵再补料采用一次性流加的方式，共流加一次，流加12mL浓度为200g/L的硫酸铵溶液。
所述的补料发酵生产D-核糖的方法中，在④葡萄糖补料步骤中，流加的葡萄糖补料液浓度优选为1000g/L。
所述的补料发酵生产D-核糖的方法中，在⑤硫酸铵补料步骤中，流加的硫酸铵补料液浓度优选为200g/L。
本发明所述的补料发酵生产D-核糖的方法中，斜面培养基的组成为酵母浸膏，7.0g/L；蛋白胨，15.0g/L；山梨醇，5.0g/L；氯化钠，2.0g/L；磷酸氢二钾，2.0g/L；磷酸二氢钾，1.0g/L；琼脂，26.0g/L。
本发明所述的补料发酵生产D-核糖的方法中，种子液培养基的组成包含酵母浸膏，5.0g/L；磷酸氢二钾，3.0g/L；磷酸二氢钾，1.0g/L；葡萄糖，20.0g/L。
本发明所述的补料发酵生产D-核糖的方法中，发酵罐中发酵培养基的组成包含葡萄糖，150.0g/L；硫酸铵，7.0g/L；硫酸锰，0.05g/L；玉米浆，20.0g/L；碳酸钙，15.0g/L。
本发明与现有技术相比有如下优点1，发酵培养基成分简单，价格低廉。其中，葡萄糖采用口服葡萄糖(六元/公斤)，玉米浆是玉米淀粉生产中的副产物。
2，发酵培养时间短，生产强度高。发酵结束后，葡萄糖基本被消耗完，有利于下游分离。
3，可以消除底物抑制，达到高密度细胞培养，同时延长次级代谢产物的生产时间，稀释有毒代谢产物。此外通过在发酵过程中补加碳愿和氮源，使D-核糖产量有较大幅度的提高，与不补料相比，D-核糖产量提高了95.9％。
具体实施例方式
菌种的准备将从天津科技大学食品科学与生物工程学院购得的转酮醇酶缺陷型枯草芽孢杆菌进行诱变选育，得到转酮醇酶缺陷型枯草芽孢杆菌HGD2004，诱变选育见文献《D-核糖生产菌的紫外诱变表征及工艺》(赵静波，吴兆亮，陈新征等.天津大学学报.2005，38(9)791-794.)，然后将所得菌种转酮醇酶缺陷型枯草芽孢杆菌HGD2004保藏以备使用。以下实施例所用菌株均由此法得到。
实施例1①斜面培养将转酮醇酶缺陷型枯草芽孢杆菌HGD2004放入斜面培养基中，斜面培养基的配方为酵母浸膏，7.0g/L；蛋白胨，15.0g/L；山梨醇，5.0g/L；氯化钠，2.0g/L；磷酸氢二钾，2.0g/L；磷酸二氢钾，1.0g/L；琼脂，26.0g/L。将斜面放置在培养箱中培养24小时，培养温度36℃，斜面培养基的初始pH值为7.0。
②种子液培养然后将培养好的菌种转入种子液培养基中，使用回转恒温调速摇瓶柜进行培养；控制转速240r/min，培养温度36℃，初始pH值为7.0，培养12小时。种子液培养基的配方为酵母浸膏，5.0g/L；磷酸氢二钾，3.0g/L；磷酸二氢钾，1.0g/L；葡萄糖，20.0g/L。
③发酵培养最后将培养好的种子液转入由德国贝朗公司生产的BIOSTATB型2L发酵罐进行发酵培养；发酵培养基的配方为葡萄糖，150.0g/L；硫酸铵，7.0g/L；硫酸锰，0.05g/L；玉米浆，20.0g/L；碳酸钙，15.0g/L。在发酵培养中向发酵罐中通入无菌空气，通气量0.082m3/h，罐压0.02MPa，培养温度36℃。发酵培养的前24小时搅拌转速为900r/min，24小时后搅拌转速为700r/min，控制pH值为6.0；④葡萄糖补料当③步骤中发酵培养进行到30小时，开始采用间歇递减流加方式，每隔5小时向正在发酵的体系中流加浓度为800g/L的葡萄糖补料液，共流加3次，每次分别为50mL、40mL和30mL。
发酵培养时间为64小时，最终D-核糖产量为64.68g/L，剩余葡萄糖浓度为10g/L。
实施例2在③发酵培养步骤中，控制pH值为7.0，其它反应步骤同实施例1。发酵培养时间为72小时，D-核糖产量为63.61g/L，剩余葡萄糖浓度为11.5g/L。
实施例3在③发酵培养步骤中，控制pH值为6.5，其它反应步骤同实施例1。发酵培养时间为64小时，D-核糖产量为70.35g/L，剩余葡萄糖浓度为6.5g/L。
实施例4①斜面培养将转酮醇酶缺陷型枯草芽孢杆菌HGD2004放入斜面培养基中，斜面培养基的配方为酵母浸膏，7.0g/L；蛋白胨，15.0g/L；山梨醇，5.0g/L；氯化钠，2.0g/L；磷酸氢二钾，2.0g/L；磷酸二氢钾，1.0g/L；琼脂，26.0g/L。将斜面放置在培养箱中培养24小时，培养温度36℃，斜面培养基的初始pH值为7.0。
②种子液培养然后将培养好的菌种转入种子液培养基中，使用回转恒温调速摇瓶柜进行培养；控制转速240r/min，培养温度36℃，初始pH值为7.0，培养12小时。种子液培养基的配方为酵母浸膏，5.0g/L；磷酸氢二钾，3.0g/L；磷酸二氢钾，1.0g/L；葡萄糖，20.0g/L。
③发酵培养最后将培养好的种子液转入由德国贝朗公司生产的BIOSTATB型2L发酵罐进行发酵培养；发酵培养基的配方为葡萄糖，150.0g/L；硫酸铵，7.0g/L；硫酸锰，0.05g/L；玉米浆，20.0g/L；碳酸钙，15.0g/L。在发酵培养中向发酵罐中通入无菌空气，通气量0.082m3/h，罐压0.02MPa，培养温度36℃。发酵培养的前24小时搅拌转速为900r/min，24小时后搅拌转速为700r/min，控制pH值为6.5；
④葡萄糖补料当③步骤中发酵培养进行到30小时，开始采用间歇递减流加方式，每隔5小时向正在发酵的体系中流加浓度为400g/L的葡萄糖补料液，共流加3次，每次分别为50mL、40mL和30mL。
发酵培养时间为48小时，D-核糖产量为54.78g/L，剩余葡萄糖浓度为4g/L。
实施例5在④葡萄糖补料步骤中，葡萄糖补料液的浓度为1000g/L，其它反应步骤同实施例4。发酵培养时间为64小时，D-核糖产量为72.15g/L，剩余葡萄糖浓度为7g/L。
实施例6①斜面培养将转酮醇酶缺陷型枯草芽孢杆菌HGD2004放入斜面培养基中，斜面培养基的配方为酵母浸膏，7.0g/L；蛋白胨，15.0g/L；山梨醇，5.0g/L；氯化钠，2.0g/L；磷酸氢二钾，2.0g/L；磷酸二氢钾，1.0g/L；琼脂，26.0g/L。将斜面放置在培养箱中培养24小时，培养温度36℃，斜面培养基的初始pH值为7.0。
②种子液培养然后将培养好的菌种转入种子液培养基中，使用回转恒温调速摇瓶柜进行培养；控制转速240r/min，培养温度36℃，初始pH值为7.0，培养12小时。种子液培养基的配方为酵母浸膏，5.0g/L；磷酸氢二钾，3.0g/L；磷酸二氢钾，1.0g/L；葡萄糖，20.0g/L。
③发酵培养最后将培养好的种子液转入由德国贝朗公司生产的BIOSTATB型2L发酵罐进行发酵培养；发酵培养基的配方为葡萄糖，150.0g/L；硫酸铵，7.0g/L；硫酸锰，0.05g/L；玉米浆，20.0g/L；碳酸钙，15.0g/L。在发酵培养中向发酵罐中通入无菌空气，通气量0.082m3/h，罐压0.02MPa，培养温度36℃。发酵培养的前24小时搅拌转速为900r/min，24小时后搅拌转速为700r/min，控制pH值为6.5；④葡萄糖补料当③步骤中发酵培养进行到30小时，开始采用间歇递减流加方式，每隔5小时向正在发酵的体系中流加浓度为1000g/L的葡萄糖补料液，共流加3次，每次分别为50mL、40mL和30mL。
⑤硫酸铵补料在③步骤中发酵培养进行到30小时，在葡萄糖补料的同时，开始采用间歇定量流加的方式，每隔5小时流加浓度为200g/L的硫酸铵补料液，共流加2次，每次流加12mL补料液。
发酵培养时间为56小时，D-核糖产量为77.75g/L，葡萄糖耗尽。
实施例7在⑤硫酸铵补料中，流加的硫酸铵补料液浓度为250g/L，其它反应步骤同实施例6。发酵培养时间为56小时，最终D-核糖产量为76.04g/L，葡萄糖耗尽。
实施例8在⑤硫酸铵补料中，流加的硫酸铵补料液浓度为300g/L，其它反应步骤同实施例6。发酵培养时间为56小时，D-核糖产量为69.94g/L，葡萄糖耗尽。
实施例9①斜面培养将转酮醇酶缺陷型枯草芽孢杆菌HGD2004放入斜面培养基中，斜面培养基的配方为酵母浸膏，7.0g/L；蛋白胨，15.0g/L；山梨醇，5.0g/L；氯化钠，2.0g/L；磷酸氢二钾，2.0g/L；磷酸二氢钾，1.0g/L；琼脂，26.0g/L。将斜面放置在培养箱中培养24小时，培养温度36℃，斜面培养基的初始pH值为7.0。
②种子液培养然后将培养好的菌种转入种子液培养基中，使用回转恒温调速摇瓶柜进行培养；控制转速240r/min，培养温度36℃，初始pH值为7.0，培养12小时。种子液培养基的配方为酵母浸膏，5.0g/L；磷酸氢二钾，3.0g/L；磷酸二氢钾，1.0g/L；葡萄糖，20.0g/L。
③发酵培养最后将培养好的种子液转入由德国贝朗公司生产的BIOSTATB型2L发酵罐进行发酵培养；发酵培养基的配方为葡萄糖，150.0g/L；硫酸铵，7.0g/L；硫酸锰，0.05g/L；玉米浆，20.0g/L；碳酸钙，15.0g/L。在发酵培养中向发酵罐中通入无菌空气，通气量0.082m3/h，罐压0.02MPa，培养温度36℃。发酵培养的前24小时搅拌转速为900r/min，24小时后搅拌转速为700r/min，控制pH值为6.5；④葡萄糖补料当③步骤中发酵培养进行到30小时，开始采用间歇递减流加方式，每隔5小时向正在发酵的体系中流加浓度为400g/L的葡萄糖补料液，共流加3次，每次分别为50mL、40mL和30mL。
⑤硫酸铵补料在③步骤中发酵培养进行到40小时，在葡萄糖补料的同时，开始采用间歇定量流加的方式，每隔5小时流加浓度为200g/L的硫酸铵补料液，共流加2次，每次流加12mL补料液。
发酵培养时间为56小时，D-核糖产量为67.15g/L，葡萄糖耗尽。
实施例10
在⑤硫酸铵补料中，流加的硫酸铵补料液浓度为250g/L，其它反应步骤同实施例9。发酵培养时间为56小时，D-核糖产量为68.07g/L，葡萄糖耗尽。
实施例11在⑤硫酸铵补料中，流加的硫酸铵补料液浓度为300g/L，其它反应步骤同实施例9。发酵培养时间为58小时，D-核糖产量为69.19g/L，葡萄糖耗尽。
实施例12①斜面培养将转酮醇酶缺陷型枯草芽孢杆菌HGD2004放入斜面培养基中，斜面培养基的配方为酵母浸膏，7.0g/L；蛋白胨，15.0g/L；山梨醇，5.0g/L；氯化钠，2.0g/L；磷酸氢二钾，2.0g/L；磷酸二氢钾，1.0g/L；琼脂，26.0g/L。将斜面放置在培养箱中培养24小时，培养温度36℃，斜面培养基的初始pH值为7.0。
②种子液培养然后将培养好的菌种转入种子液培养基中，使用回转恒温调速摇瓶柜进行培养；控制转速240r/min，培养温度36℃，初始pH值为7.0，培养12小时。种子液培养基的配方为酵母浸膏，5.0g/L；磷酸氢二钾，3.0g/L；磷酸二氢钾，1.0g/L；葡萄糖，20.0g/L。
③发酵培养最后将培养好的种子液转入由德国贝朗公司生产的BIOSTATB型2L发酵罐进行发酵培养；发酵培养基的配方为葡萄糖，150.0g/L；硫酸铵，7.0g/L；硫酸锰，0.05g/L；玉米浆，20.0g/L；碳酸钙，15.0g/L。在发酵培养中向发酵罐中通入无菌空气，通气量0.082m3/h，罐压0.02MPa，培养温度36℃。发酵培养的前24小时搅拌转速为900r/min，24小时后搅拌转速为700r/min，控制pH值为6.5；④葡萄糖补料当③步骤中发酵培养进行到30小时，开始采用间歇递减流加方式，每隔5小时向正在发酵的体系中流加浓度为400g/L的葡萄糖补料液，共流加3次，每次分别为50mL、40mL和30mL。
⑤硫酸铵补料在③步骤中发酵培养进行到35小时，在葡萄糖补料的同时，开始采用间歇定量流加的方式，每隔5小时流加浓度为250g/L的硫酸铵补料液，共流加2次，每次流加12mL补料液。
发酵培养时间为58小时，D-核糖产量为73.01g/L，葡萄糖耗尽。
实施例13①斜面培养将转酮醇酶缺陷型枯草芽孢杆菌HGD2004放入斜面培养基中，斜面培养基的配方为酵母浸膏，7.0g/L；蛋白胨，15.0g/L；山梨醇，5.0g/L；氯化钠，2.0g/L；磷酸氢二钾，2.0g/L；磷酸二氢钾，1.0g/L；琼脂，26.0g/L。将斜面放置在培养箱中培养24小时，培养温度36℃，斜面培养基的初始pH值为7.0。
②种子液培养然后将培养好的菌种转入种子液培养基中，使用回转恒温调速摇瓶柜进行培养；控制转速240r/min，培养温度36℃，初始pH值为7.0，培养12小时。种子液培养基的配方为酵母浸膏，5.0g/L；磷酸氢二钾，3.0g/L；磷酸二氢钾，1.0g/L；葡萄糖，20.0g/L。
③发酵培养最后将培养好的种子液转入由德国贝朗公司生产的BIOSTATB型2L发酵罐进行发酵培养；发酵培养基的配方为葡萄糖，150.0g/L；硫酸铵，7.0g/L；硫酸锰，0.05g/L；玉米浆，20.0g/L；碳酸钙，15.0g/L。在发酵培养中向发酵罐中通入无菌空气，通气量0.082m3/h，罐压0.02MPa，培养温度36℃。发酵培养的前24小时搅拌转速为900r/min，24小时后搅拌转速为700r/min，控制pH值为6.5；④葡萄糖补料当③步骤中发酵培养进行到30小时，开始采用间歇递减流加方式，每隔5小时向正在发酵的体系中流加浓度为1000g/L的葡萄糖补料液，共流加3次，每次分别为50mL、40mL和30mL；然后再进行一次葡萄糖补料，即③步骤中发酵培养进行到48小时，开始采用间歇递减流加方式，每隔8小时流加浓度为1000g/L的葡萄糖补料液，共流加3次，每次分别为30mL、20mL和10mL。
⑤硫酸铵补料在③步骤中发酵培养进行到30小时，在葡萄糖补料的同时，开始采用间歇定量流加的方式，每隔5小时流加浓度为200g/L的硫酸铵补料液，共流加2次，每次流加12mL补料液；然后再进行一次硫酸铵补料，即在③步骤中发酵培养进行到48小时，开始采用一次性流加的方式，共流加一次，流加12mL浓度为200g/L的硫酸铵溶液。
发酵培养时间为72小时，D-核糖产量为93.83g/L，葡萄糖耗尽。
权利要求
1，一种补料发酵生产D-核糖的方法，其特征为包括以下步骤①斜面培养将转酮醇酶缺陷型枯草芽孢杆菌HGD 2004放入斜面培养基中，将斜面放置在培养箱中培养24小时，培养温度36℃，斜面培养基的初始pH值为7.0；②种子液培养然后将培养好的菌种转入种子液培养基中，使用回转恒温调速摇瓶柜进行培养；控制转速240r/min，培养温度36℃，初始pH值为7.0，培养12小时；③发酵培养最后将培养好的种子液转入发酵罐进行发酵培养；在发酵培养中向发酵罐中通入无菌空气，通气量0.082m3/h，罐压0.02MPa，培养温度36℃，发酵的前24小时搅拌转速为700～900r/min，24小时后搅拌转速为500～700r/min，控制pH值为6.0～7.0，发酵时间为48～72小时；④葡萄糖补料在③步骤中发酵培养进行到25～45小时时开始采用间歇递减流加方式，每隔5小时流加浓度为400～1000g/L的葡萄糖补料液，共流加3次，每次分别为50mL、40mL和30mL；⑤硫酸铵补料在③步骤中发酵培养进行到30～40小时，在葡萄糖补料的同时，采用间歇定量流加的方式，开始每隔5小时流加浓度为200～300g/L的硫酸铵补料液，共流加2次，每次流加12mL补料液，得到产物。
2，如权利要求1中所述的补料发酵生产D-核糖的方法，其特征在于还包括以下步骤在所述④葡萄糖补料步骤中，在经过每隔5小时、共流加3次的葡萄糖补料后，进行葡萄糖再补料采用间歇递减流加方式，每隔8小时流加浓度为1000g/L的葡萄糖补料液，共流加3次，每次分别为30mL、20mL和10mL；同时在所述⑤硫酸铵补料步骤中在每隔5小时，共流加2次硫酸铵补料后，也进行硫酸铵再补料采用一次性流加的方式，共流加一次，流加12mL浓度为200g/L的硫酸铵溶液。
3，如权利要求1中所述的补料发酵生产D-核糖的方法，其特征在于在④葡萄糖补料步骤中，流加的葡萄糖补料液浓度为1000g/L。
4，如权利要求1中所述的补料发酵生产D-核糖的方法，其特征在于在⑤硫酸铵补料步骤中，流加的硫酸铵补料液浓度为200g/L。
5，如权利要求1中所述的补料发酵生产D-核糖的方法，其特征在于所述斜面培养基的组成为酵母浸膏，7.0g/L；蛋白胨，15.0g/L；山梨醇，5.0g/L；氯化钠，2.0g/L；磷酸氢二钾，2.0g/L；磷酸二氢钾，1.0g/L；琼脂，26.0g/L。
6，如权利要求1中所述的补料发酵生产D-核糖的方法，其特征在于所述种子液培养基的组成包含酵母浸膏，5.0g/L；磷酸氢二钾，3.0g/L；磷酸二氢钾，1.0g/L；葡萄糖，20.0g/L。
7，如权利要求1中所述的补料发酵生产D-核糖的方法，其特征在于所述发酵罐中发酵培养基的组成包含葡萄糖，150.0g/L；硫酸铵，7.0g/L；硫酸锰，0.05g/L；玉米浆，20.0g/L；碳酸钙，15.0g/L。
全文摘要
一种补料发酵生产D－核糖的方法，其特征为通过对转酮醇酶缺陷型枯草芽孢杆菌菌种进行诱变选育后将其依次放入斜面培养基、种子液培养基和发酵培养基中进行培养，在发酵培养期间采用间歇递减流加方式和间歇定量流加的方式流加葡萄糖补料液和硫酸铵补料液，最终得到最终D－核糖。该方法采用补料法发酵生产D－核糖，发酵培养基成分简单，价格低廉，发酵结束时葡萄糖基本被耗尽，且使D－核糖产量有较大幅度的提高，与不补料相比，D－核糖产量提高了95.9％。
文档编号C12R1/125GK1814771SQ20051012218
公开日2006年8月9日 申请日期2005年12月6日 优先权日2005年12月6日
发明者吴兆亮, 刘虎, 胡滨, 郑辉杰 申请人:河北工业大学