专利名称：多态性位点基因型预测血管紧张素转换酶抑制剂类药物作用效果的用途、方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及同型半胱氨酸代谢通路上的关键酶基因的多态性位点基因型用于预测血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)类药物的作用效果的用途。本发明还涉及一种用于测定同型半胱氨酸代谢通路上的关键酶基因的多态性位点基因型的多态性分型寡核苷酸，一种通过测定同型半胱氨酸代谢通路上的关键酶基因的多态性位点基因型，预测含有血管紧张素转换酶抑制剂类药物作用效果的方法和试剂盒。本发明属于医药领域。
背景技术：
高血压病是我国及全球最常见的慢性疾病之一。高血压的全球发病率高达31.3％，约有6.9亿人。高血压是引起危及生命的心、脑血管病如心肌梗死、脑卒中、肾脏功能不全等的主要原因。血压水平与心血管病发病率呈线性相关。流行病学研究显示，血压升高是脑卒中和冠心病发病的独立危险因素。因此，有效控制血压对防止高血压患者心脑血管并发症的发生具有重大的临床意义。临床上用于治疗高血压的药物主要分为六类利尿剂、β-肾上腺素受体阻滞剂、α-肾上腺素受体阻滞剂、钙拮抗剂、血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)和血管紧张素II受体(AT1-R)拮抗剂。人们对血压的认识和干预越来越完善，但是对于高血压患者降压治疗的血压达标率仍不满意。虽然血压的低控制率的原因是多方面的，如医生对控制目标的认识不同，患者不能改变不良生活习惯，对药物不耐受，治疗依从性差，单药治疗的血压控制率低(40％-50％)等，更重要的是，与临床上缺乏有效的针对患者个体差异的药物疗效预测系统有关。目前，临床上用于预测药物疗效的方法仅仅凭借医生的临床经验，这种预测方法具有明显的滞后性及盲目性，不能给医生选择药物提供准确的个体化信息。
已知药物疗效和副作用的个体差异与遗传因素有关。在家系和双生子研究中发现，约30％～60％的血压变异是由遗传因素造成的Lancet，1994；344169-171，并且存在小部分的单基因遗传性高血压。药物反应的遗传多态性表现为药物代谢酶的多态性、药物受体的多态性和药物靶标的多态性等。这些多态性的存在可能导致许多药物治疗中药效和不良反应的个体差异Science，2000；2871977-1978J Clin Invest，1994；941872-1882。
药物基因组学是基于基因多态性的DNA检测手段，如对一些疾病相关基因的单核苷酸多态性(SNP)检测，或对特定药物具有敏感性或抵抗性的患病人群进行SNP检测，能够预测患者将对某一特定的药物产生怎样的反应(疗效或副作用方面等)，从而解决药物治疗的安全和有效两方面问题，进而优选出最佳的治疗方法，指导医生为患者拟定个体化的给药方案；另外，药物基因组学还有助于减少临床用药不当，提高疗效，降低毒副作用，降低医疗费用，具有极高的社会效益和卫生经济学意义。
SNP是指不同个体间在基因水平上的单核苷酸变异，平均每1000对碱基出现一个SNP，两个无关个体间大约有300万个SNP。SNP在个体化用药上可谓是举足轻重。影响药物有效性的主要因素包括药物前体因代谢而激活，药物与靶细胞的结合能力，药物与药靶的结合和活性，活性药物被代谢、降解和排出；而安全性则取决于药物在体内的代谢、降解和排出环节以及药物在体内的非特异性结合和活性。不同个体在其中每一环节SNP的不同，最终都可能会造成对同一药物反应的差异，有时由于这种个体间遗传学上的差别，同一药物在不同个体内的效果和毒副作用的差异可以达到300倍之多。
目前发现原发性高血压涉及到的相关基因已超过70个，不同的基因导致的药物疗效对高血压患者有差别。多数研究集中于观察基因多态性对降压药物治疗引起的心血管反应的影响。例如，携带α-adducin基因460W等位子的高血压患者，与应用其他类降压药治疗相比，利尿剂治疗出现心肌梗死和中风的几率降低Lancet，1997；3491353-7。在降压作用方面，发现一氧化氮合酶(NOE)基因多态性和利尿剂、α-adducin基因多态性和利尿剂、G蛋白α-亚型基因多态性和β-肾上腺素受体阻滞剂、ACE基因多态性和血管紧张素II受体(ATl-R)拮抗剂等都存在相互作用Drugs，2004；641801-1816。ACE插入缺失的多态性与ACEI存在相互作用，表现为不同基因型在AT1受体蛋白的mRNA表达、左心室肥大、动脉硬化等方面的差异。
人体内同型半胱氨酸(Hcy，homosysteine)作为蛋氨酸代谢的中间产物，其本身并不参与蛋白质的合成。同型半胱氨酸主要通过两条途径进行代谢再甲基化途径和转硫途径。再甲基化途径约有50％同型半胱氨酸在蛋氨酸合酶的作用下，以维生素B12为辅因子，以N5-甲基四氢叶酸为甲基供体，发生再甲基化，重新合成蛋氨酸，参加体内蛋白质的代谢。这一反应中的甲基供体(N-5甲基四氢叶酸)是由N-5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR，methylenetetrahydrofolate reductase)作用于N-5,10-亚甲基四氢叶酸形成的；而甲硫氨酸合酶还原酶(MTRR，Methionine synthase reductase)是蛋氨酸合酶的辅助因子。另外，约50％的同型半胱氨酸也可通过转硫途径在胱硫醚β合酶(CBS，cystathionine β-synthase)的催化下，与丝氨酸缩合成胱硫酶，后者进一步生成半胱氨酸和α-酮丁酸，此过程需要磷酸吡哆醛(活性维生素B6)作为辅助因子TIPS，1990，11411-416。
血浆中的Hcy，不论是结合形式或者游离形式的Hcy，都统称为总Hcy(tHCY，total homocysteine)。近年来基础与临床研究均显示，tHCY是心脑血管疾病独立的危险因素。高tHCY血症可促发所有重要的心脑血管疾病发生，包括冠心病、脑卒中、肾功能损害、外周动脉疾病等心血管病学进展，2000，2129。大量的事实表明轻度到中度tHCY血症(tHCY浓度≥12umol/L，但≤100umol/L)是动脉粥样硬化所致心血管疾病最广泛、最强的、独立的危险因素。
Sutton等Circulation，1997，961745认为血Hcy水平与单纯收缩期高血压独立相关。Lim等Am J Epidemiol，2002，1561105-1113认为高水平的Hcy可增加发生高血压的危险性。高同型半胱氨酸血症(HHcy)是高血压病人死亡和左心室射血分数(LVEF)低的独立预测因子Arterioscler Thromb Vasc Biol 2005；25115-121。高血压病患者中tHcy水平较高，可能是较易发生心、脑、肾等靶器官损害的一个重要因素。并且体内叶酸、维生素B12水平与tHcy呈现负相关提示高血压患者补充叶酸、维生素B12可能会延缓其靶器官的损害。对高血压病患者，特别是tHcy水平较高者，有规律地补充叶酸、维生素B12可能会降低tHcy水平，从而延缓高血压病患者心、脑、肾等并发症的发生。一项为期2年的随机、对照的临床实验证实，长期给予叶酸(5mg/日)及维生素B6(250mg/日)以降低血液中tHCY的含量，可以协同降低血压Arterioscler Thromb Vasc Biol，2001，212072-2079。
Hcy代谢关键酶活性改变是血中Hcy水平升高的重要因素。MTHFR是N5-甲基四氢叶酸形成的关键酶，MTHFR基因C677T突变可致酶活性下降，使蛋氨酸循环障碍，血中Hcy水平升高。有报道认为，Hcy代谢关键酶的基因多态性与单纯收缩期高血压的发生关系密切。MTHFR可能是单纯收缩期高血压的易感基因，tHcy是单纯收缩期高血压的重要中间表型中华心血管病杂志，2003，31269-273。在已经发现的人类MTHFR基因突变中，多数是可以导致酶活性严重下降甚至酶活性缺失的突变，在人群中罕见，而第677位核苷酸的基因突变(C→T)引起该酶活性轻中度降低，同型半胱氨酸浓度增高Circulation，1996，943074-3078。而高同型半胱氨酸血症可造成血管内皮损伤和功能异常，刺激血管平滑肌细胞增生，引起血管舒缩因子平衡紊乱，导致妊娠高血压综合征(PIH)。因此，多数研究认为MTHFR基因是PIH的主要候选基因中国公共卫生，2004，20，6762-764。MTRR是蛋氨酸合成酶的辅助因子，催化甲基钴胺再生JCardiovasc Risk,2000；7197-200，人类MTRR的编码序列包含2094个碱基对，编码698个氨基酸的多肽，对于维持蛋氨酸和四氢叶酸在细胞内水平及维持Hcy在无毒性浓度水平有重要作用，若MTRR发生变异，可能会引起Hcy血浆浓度升高。
高血压患者的降压疗效与Hcy通路的基因多态性有关。有研究表明Thrombosis Research 2004，113361-369MTHFR C677T的基因多态性与ACEI类降压药疗效有关。对于444名中国的原发性高血压患者进行为期2周的ACEI类降压药物贝那普利的降压治疗，结果提示MTHFR C677T基因为TT的原发性高血压患者与基因型为CT或者CC的患者相比较基础血压值明显增高，而且对于ACEI类降压药物的降压效果较好，尤其对于舒张压的降压效果较好。
由于存在药物反应的个体差异，迫切需要医生在选择治疗高血压药物时能够根据患者对特定的药物产生的反应选出最佳的治疗方法，指导医生为患者拟定个体化的给药方案。
发明内容
为了克服临床选择ACEI类药物的盲目性，本发明为个体化用药提供一种预测含有ACEI类药物的作用效果的方法和试剂盒，即通过测定同型半胱氨酸代谢通路上关键酶基因的多态性位点基因型来预测含有ACEI类药物的作用效果。在多态性位点基因型分析的基础上可以预测个体使用含有ACEI类药物的有效性和安全性，指导临床用药，使个体能够得到个体化医疗，尽早和有效地控制血压，减少毒副作用的发生，降低医疗成本。
本发明的一个方面，涉及同型半胱氨酸代谢通路上的关键酶基因MTHFR和/或MTRR的多态性位点基因型用于预测药物组合物之作用效果的用途。
在本发明所述的用途中，所述MTHFR的多态性位点基因型至少包含选自C677T、A1298C多态性位点；所述MTRR的多态性位点基因型至少包含选自C1783T、G66A多态性位点。在本发明中，所述MTHFR的多态性位点基因型还可以包含选自G1793A、G215A、G482A、A1317G中的多态性位点；所述MTRR的多态性位点基因型还可以包含选自C524T、T669A、C997G、A1049G、C1243T、C1349G、C1544T中的多态性位点。在本发明中，所述的MTHFR或者MTRR的多态性位点还可以进一步包含与其他预测含有血管紧张素转换酶抑制剂类药物作用效果的基因多态性位点存在连锁不平衡的多态性位点，包括无义突变位点、错义突变位点以及位于基因内含子部位、基因调节部位的多态性位点。
在本发明的一个实施方案中，所述药物组合物为ACEI类药物，所述待预测的药物组合物的作用效果为升高血液中的同型半胱氨酸水平。本发明的另外一个实施方案中，所述药物组合物为ACEI类药物，所述待预测的药物组合物的作用效果为肝功能损害的作用效果。具体的，ACEI类药物主要通过影响肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)而起到调节血压的作用效果。ACEI通过与血管紧张素I转换酶结合，抑制血管紧张素转化酶(ACE)的活性，以此达到抑制血管紧张素II的生成，减少醛固酮的分泌；另外，限制缓激肽的降解，进而激活一氧化氮合成酶，保护血管内皮细胞功能，降低交感神经引发的血管壁张力，最终实现血压调节作用效果。用于本发明的所述药物组合物的ACEI类药物选自贝那普利(benazepril)、卡托普利(captopril)、依那普利(enalapail)、西拉普利(cilazapril)、培哚普利(perindopril)、地拉普利(delapril)、喹那普利(quinapril)、赖诺普利(lisinopril)、雷米普利(ramipril)、咪达普利(imidapril)、佐芬普利(zofenopril)、群多普利(trandolapril)、和福辛普利(fosinopril)等。其中依那普利、贝那普利和赖诺普利是ACEI类药物中常用的、具有代表性的药物。优选为依那普利、贝那普利、赖诺普利或福辛普利。具体的，当(1)所述MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变基因型和/或者多态性位点基因型为1298AA纯合基因型时，预测上述药物组合物升高同型半胱氨酸的作用效果强；所述MTHFR多态性位点基因型为677CC野生型，和/或者所述MTHFR多态性位点基因型为1298CC纯合型时，预测上述药物组合物升高同型半胱氨酸的作用效果弱；(2)所述MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型时，预测所述药物组合物的肝功能损害的作用效果强；所述MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型时，预测所述药物组合物的肝功能损害的作用效果弱；(3)所述MTRR多态性位点基因型为1783CT杂合型或1783TT纯合型，和/或者多态性位点基因型为66GG纯合型时，预测上述药物组合物升高同型半胱氨酸的作用效果强；所述MTRR多态性位点基因型为1783CC纯合型，和/或者所述MTRR多态性位点基因型为66AA纯合型或66AG杂合型时，预测上述药物组合物升高同型半胱氨酸的作用效果弱。
在本发明的又一实施方案中，所述药物组合物含有ACEI类药物和B族维生素，所述待预测的药物组合物的作用效果为降低同型半胱氨酸的作用、减轻肝功能损害的作用、降低血压的作用和/或靶器官保护的作用。具体的，所述药物组合物为含有ACEI类药物和B族维生素的药物组合物，其中所述ACEI类药物选自贝那普利、卡托普利、依那普利、西拉普利、培哚普利、地拉普利、喹那普利、赖诺普利、雷米普利、咪达普利、佐芬普利、群多普利和福辛普利，优选为依那普利、贝那普利、赖诺普利或福辛普利，所述B族维生素选自叶酸及其类似物、维生素B6和维生素B12。叶酸类似物包括甲酰四氢叶酸钙、L-甲基叶酸、叶酸盐、叶酸或叶酸盐的活性代谢产物和在体内释放或生产叶酸的物质。优选的，所述药物组合物为含有ACEI类药物和叶酸的药物组合物，甚至更优选的，所述药物组合物为含有依那普利和叶酸的药物组合物或含有贝那普利和叶酸的药物组合物。具体的，当(1)所述的MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变基因型和/或者多态性位点基因型为1298 AA纯合基因型时，预测所述药物组合物降低同型半胱氨酸的作用效果强；所述的MTHFR多态性位点基因型为677CC野生型，和/或者MTHFR多态性位点基因型为1298CC纯合型时，预测所述药物组合物降低同型半胱氨酸的作用效果弱；(2)所述MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生基因型时，预测所述药物组合物减轻单用ACEI类药物所致的肝功能损害的作用效果强；所述MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变基因型时，预测所述药物组合物无肝功能损害；；(3)所述的MTRR多态性位点基因型为1783CT杂合型或1783TT纯合型，和/或者多态性位点基因型为66GG纯合型时，预测所述药物组合物降低同型半胱氨酸的作用效果强；所述的MTRR多态性位点基因型为1783CC纯合型，和/或者多态性位点基因型为66AA纯合型或66AG杂合型时，预测所述药物组合物降低同型半胱氨酸的作用弱；(4)所述的MTHFR的多态性位点基因型为677TT纯合突变基因型和/或者多态性位点基因型为1298 AA纯合基因型时，预测所述药物组合物降低血压的作用效果强；所述的MTHFR的多态性位点基因型为677CC野生型，和/或者所述的MTHFR的多态性位点基因型为1298CC纯合型时，预测所述药物组合物降低血压的作用效果弱；(5)所述的MTRR多态性位点基因型为1 783CT杂合型或1783TT纯合型，和/或者多态性位点基因型为66GG纯合型时，预测所述药物组合物降低血压的作用效果强；多态性位点基因型为1783CC纯合型，和/或者多态性位点基因型为66AA纯合型或66AG杂合型时，预测所述药物组合物降低血压的作用效果弱；(6)所述的MTHFR的多态性位点基因型为677TT纯合突变基因型和/或者多态性位点基因型为1298CC纯合基因型时，预测所述药物组合物靶器官保护的作用效果强；所述的MTHFR的多态性位点基因型为677CC野生型，和/或者所述的MTHFR的多态性位点基因型为1298AA纯合型时，预测所述药物组合物靶器官保护的作用效果弱；(7)所述的MTRR多态性位点基因型为1783CT杂合型或1783TT纯合型，和/或者MTRR多态性位点基因型为66GG纯合型时，预测所述药物组合物靶器官保护的作用效果强；所述的MTRR多态性位点基因型为1783CC纯合型，和/或者多态性位点基因型为66AA纯合型或66AG杂合型时，预测所述药物组合物靶器官保护的作用效果弱。
在本发明中，所述的靶器官保护包括肾脏功能保护，预防PTCA术后再狭窄以及预防动脉硬化、冠状动脉硬化性心脏病、心绞痛、心肌梗死、心力衰竭、外周血管疾病、脑出血、脑梗塞、腔隙性脑梗塞、视网膜动脉硬化等并发症。
本发明的又一方面，涉及一种用于测定同型半胱氨酸代谢通路上的关键酶基因MTHFR和/或MTRR的多态性位点基因型的多态性分型寡核苷酸。优选地，所述多态性分型寡核苷酸是(1)等位基因特异性核酸引物，它能够检测同型半胱氨酸代谢通路上的关键酶基因MTHFR和/或MTRR的多态性位点基因型，或者(2)用于检测同型半胱氨酸代谢通路上的关键酶基因MTHFR和/或MTRR的多态性位点基因型的寡核苷酸探针，其能特异地与同型半胱氨酸代谢通路上的关键酶基因MTHFR和/或MTRR上的多态性位点的核酸杂交。优选地，所述寡核苷酸探针的长度为17-50个核苷酸。
本发明中，所述MTHFR的多态性位点基因型至少包含选自C677T、A1298C多态性位点；所述MTRR的多态性位点基因型至少包含选自C1783T和G66A的多态性位点。其中所述MTHFR的多态性位点基因型还可以包含选自G1793A、G215A、G482A和A1317G中的多态性位点；所述MTRR的多态性位点基因型还可以包含选自C524T、T669A、C997G、A1049G、C1243T、C1349G和C1544T中的多态性位点。
本发明的再一方面，涉及一种利用同型半胱氨酸代谢通路上的关键酶基因MTHFR和/或MTRR的多态性位点基因型预测药物组合物作用效果的方法，所述方法包括步骤1)利用上述多态性分型寡核苷酸检测来自个体的样品中所述关键酶基因的多态性位点基因型；2)根据所述多态性位点基因型预测所述药物组合物的作用效果。
在本发明所述的方法中，所述MTHFR的多态性位点基因型至少包含选自C677T、A1298C多态性位点；所述MTRR的多态性位点基因型至少包含选自C1783T和G66A的多态性位点。在本发明中，所述MTHFR的多态性位点基因型还可以包含选自G1793A、G215A、G482A和A1317G中的多态性位点；所述MTRR的多态性位点基因型还可以包含选自C524T、T669A、C997G、A1049G、C1243T、C1349G和C1544T中的多态性位点。在本发明中，所述的MTHFR或者MTRR的多态性位点还可以进一步包含与其他预测含有血管紧张素转换酶抑制剂类药物作用效果的基因多态性位点存在连锁不平衡的多态性位点，包括无义突变位点、错义突变位点以及位于基因内含子部位、基因调节部位的多态性位点。
在本发明上述方法的一个实施方案中，所述药物组合物为ACEI类药物，所述待预测的药物组合物的作用效果为升高血液中的同型半胱氨酸水平。在本发明上述方法的另一个实施方案中，所述药物组合物为ACEI类药物，所述待预测的药物组合物的作用效果为肝功能损害的作用效果。具体的，所述药物组合物为含有选自贝那普利、卡托普利、依那普利、西拉普利、培哚普利、地拉普利、喹那普利、赖诺普利、雷米普利、咪达普利、佐芬普利、群多普利和福辛普利的ACEI类药物的药物组合物，优选为依那普利、贝那普利、赖诺普利或福辛普利。具体的，当(1)所述MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变基因型和/或者多态性位点基因型为1298AA纯合基因型时，预测上述药物组合物升高同型半胱氨酸的作用效果强；所述MTHFR多态性位点基因型为677CC野生型，和/或者多态性位点基因型为1298CC纯合型时，预测上述药物组合物升高同型半胱氨酸的作用效果弱；(2)所述MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型时，预测所述药物组合物的肝功能损害的作用强；所述MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型时，预测所述药物组合物的肝功能损害的作用弱；(3)所述MTRR多态性位点基因型为1783CT杂合型或1783TT纯合型，和/或者多态性位点基因型为66GG纯合型时，预测上述药物组合物升高同型半胱氨酸的作用效果强；MTRR多态性位点基因型为1783CC纯合型和/或者多态性位点基因型为66AA纯合型或66AG杂合型时，预测上述药物组合物升高同型半胱氨酸的作用效果弱。
在本发明上述方法的又一具体实施方案中，所述药物组合物含有ACEI类药物和B族维生素，所述待预测的药物组合物的作用效果为降低同型半胱氨酸的作用效果、减轻肝功能损害的作用效果、降低血压的作用效果和/或靶器官保护的作用效果。具体的，所述ACEI类药物选自贝那普利、卡托普利、依那普利、西拉普利、培哚普利、地拉普利、喹那普利、赖诺普利、雷米普利、咪达普利、佐芬普利、群多普利和福辛普利，优选为依那普利、贝那普利、赖诺普利或福辛普利，所述B族维生素选自叶酸及其类似物、维生素B6和维生素B12。叶酸类似物包括甲酰四氢叶酸钙、L-甲基叶酸、叶酸盐、叶酸或叶酸盐的活性代谢产物和在体内释放或生成叶酸的物质。优选的，所述药物组合物为含有ACEI类药物和叶酸的药物组合物。更优选的，所述药物组合物为含有依那普利和叶酸的药物组合物，或者所述药物组合物为含有贝那普利和叶酸的药物组合物。具体的，当(1)所述的MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变基因型和/或者多态性位点基因型为1298 AA纯合基因型时，预测上述药物组合物降低同型半胱氨酸的作用效果强；所述的MTHFR多态性位点基因型为677CC野生型，和/或者MTHFR多态性位点基因型为1298CC纯合型时，预测上述药物组合物降低同型半胱氨酸的作用效果弱；(2)所述MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生基因型时，预测所述药物组合物减轻单用ACEI类药物所致的肝功能损害的作用效果强；所述MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变基因型时，预测所述药物组合物无肝功能损害；(3)所述的MTRR多态性位点基因型为C1783CT杂合型、或T1783 TT纯合型，和/或者多态性位点基因型为G66GG纯合型时，预测上述药物组合物降低同型半胱氨酸的作用效果强；所述的MTRR多态性位点基因型为C1783CC纯合型，和/或者所述的MTRR多态性位点基因型为A66AA纯合型或A66 AG杂合型时，预测上述药物组合物降低同型半胱氨酸的作用效果弱；(4)所述的MTHFR的多态性位点基因型为677TT纯合突变基因型，和/或者MTHFR多态性位点基因型为1298 AA纯合基因型时，预测上述药物组合物降低血压的作用效果强；所述的MTHFR多态性位点基因型为基因型为677CC野生型，和/或者MTHFR多态性位点基因型为1298CC纯合型时，预测上述药物组合物降低血压的作用效果弱；(5)所述的MTRR多态性位点基因型为1783CT杂合型或1783TT纯合型，和/或者多态性位点基因型为66GG纯合型时，预测上述药物组合物降低血压的作用效果强；所述的MTRR多态性位点基因型为基因型为1783CC纯合型，和/或者多态性位点基因型为66AA纯合型或66AG杂合型时，预测上述药物组合物降低血压的作用效果弱；(6)所述的MTHFR的多态性位点基因型为677TT纯合突变基因型和/或者1298 CC纯合基因型时，预测上述药物组合物靶器官保护的作用效果强；所述的MTHFR的基因型为677CC野生型，和/或者所述的MTHFR多态性位点基因型为1298AA纯合型时，预测上述药物组合物靶器官保护的作用效果弱；(7)所述的MTRR多态性位点基因型为1783CT杂合型或1783TT纯合型，和/或者多态性位点基因型为66GG纯合型时，预测上述药物组合物靶器官保护的作用效果强；所述的多态性位点基因型为1783CC纯合型，和/或者所述的多态性位点基因型为66AA纯合型或66AG杂合型时，预测上述药物组合物靶器官保护的作用效果弱。
在本发明的上述方法中，所述的靶器官保护包括肾脏功能保护，预防PTCA术后再狭窄以及预防动脉硬化、冠状动脉硬化性心脏病、心绞痛、心肌梗死、心力衰竭、外周血管疾病、脑出血、脑梗塞、腔隙性脑梗塞、视网膜动脉硬化等并发症。
在本发明所述的方法，可以使用包括选自以下的差异核酸分析技术聚合酶链反应(PCR)、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性、PCR-等位基因特异性寡核苷酸探针法、PCR-序列特异寡核苷酸法、序列测定、PCR-序列特异性引物法、PCR-荧光法、PCR指纹图法、寡核苷酸连接分析、荧光能量共振转移的检测法、生物芯片、核酸芯片、质谱技术、基因扫描、单链构象多态性、变性梯度凝胶电泳、酶或化学错配切割法、Taqman生物检测方法。
PCR、PCR-RFLP、生物芯片、序列测定、基因扫描基因型检测方法是本领域技术人员常规使用的方法。Taqman技术是一种运用荧光技术进行实时定量PCR的方法。生物芯片是指采用广岛原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子比如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等生物样品有序地固化于支持物(如玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体)的表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器如激光共聚焦扫描仪或电荷偶联摄影相机(CCD)对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量或质量。其中优选的检测方法为PCR、PCR-RFLP、Taqman技术、生物芯片、核酸芯片或者试剂盒。本发明对于多态性位点基因型的检测方法的说明并非是对于检测方法的限定，任何本领域技术人员采用常规的生物技术方法通过检测本发明的多态性位点基因型来预测含有ACEI类药物的作用效果均属于本发明内容，还可以进一步包括采用常规的生物技术方法通过检测本发明的多态性位点功能型基因型的转录产物和/或者表达产物的差异间接反映相关联的多态性位点来预测ACEI类药物的药效。
在本发明所述的方法，其中所述来自个体的生物样品选自如外周血细胞、白细胞、血清等的血液样品，尿液、唾液等体液样品，口腔粘膜试子、毛发、皮肤、活检组织等组织样品，组织样分泌物、排泄物样本，培养细胞，优选的，所述样品为血液样品，任选的，所述样品可以预先进行纯化，例如分离总核酸。
本发明的另一方面，还涉及一种利用同型半胱氨酸代谢通路上的关键酶基因MTHFR和/或MTRR的多态性位点基因型预测药物组合物之作用效果的试剂盒，其中所述MTHFR的多态性位点基因型至少包含选自C677T、A1298C多态性位点；所述MTRR的多态性位点基因型至少包含选自C1783T、G66A多态性位点，其中所述药物组合物为ACEI类药物，所述待预测的药物组合物的作用效果为升高同型半胱氨酸水平和/或肝功能损害，所述试剂盒包含至少一种本发明所述的多态性分型寡核苷酸，以及，任选的，用于检测反应的合适的缓冲体系和显色体系。具体的，当(1)所述的MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变基因型和/或1298AA纯合基因型时，预测所述药物组合物升高同型半胱氨酸的作用效果强；所述的MTHFR多态性位点基因型为677CC野生型，和/或多态性位点基因型为1298CC纯合型时，预测所述药物组合物升高同型半胱氨酸的作用效果效果弱；(2) 所述MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型时，预测所述药物组合物的肝功能损害的作用效果强；所述MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型时，预测所述药物组合物的肝功能损害的作用效果弱；(3)所述的MTRR多态性位点基因型为1783CT杂合型或1783TT纯合型，和/或多态性位点基因型为66GG纯合型时，预测所述药物组合物升高同型半胱氨酸的作用效果强；所述的MTRR多态性位点基因型为1783CC纯合型，和/或多态性位点基因型为66AA纯合型或66 AG杂合型时，预测所述药物组合物升高同型半胱氨酸的作用效果效果弱。
本发明进一步提供了一种试剂盒，通过测定同型半胱氨酸代谢通路上的关键酶基因的多态性位点基因型，预测含有血管紧张素转换酶抑制剂类药物的作用效果。所述同型半胱氨酸代谢通路上的关键酶基因的多态性位点基因型至少选自MTHFR、MTRR中的一种基因的多态性位点基因型。MTHFR的多态性位点基因型至少包含C677T、A1298C多态性位点；MTRR的多态性位点基因型至少包含595His/Tyr(CT)、Ile22Met(AG)多态性位点，其中所述药物组合物含有ACEI类药物和B族维生素，所述待预测的药物组合物的作用效果为降低同型半胱氨酸、减轻肝功能损害、降低血压和/或靶器官保护，所述试剂盒包含至少一种本发明所述的多态性分型寡核苷酸，以及，任选的，用于检测反应的合适的缓冲体系和显色体系。具体的，当(1)所述的MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变基因型和/或1298 AA纯合基因型时，预测所述药物组合物降低同型半胱氨酸的作用效果强；所述的MTHFR多态性位点基因型为677CC野生型，和/或多态性位点基因型为1298CC纯合型时，预测所述药物组合物降低同型半胱氨酸的作用效果弱；(2)所述MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生基因型时，预测所述药物组合物减轻单用ACEI类药物所致的肝功能损害的作用效果强；所述MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变基因型时，预测所述药物组合物无肝功能损害；(3)所述的MTRR多态性位点基因型为1783CT杂合型或1783TT纯合型，和/或多态性位点基因型为66GG纯合型时，预测所述药物组合物降低同型半胱氨酸的作用效果强；所述的MTRR多态性位点基因型为1783CC纯合型，和/或多态性位点基因型为66AA纯合型或66 AG杂合型时，预测所述药物组合物降低同型半胱氨酸的作用效果弱；(4)所述的MTHFR的多态性位点基因型为677TT纯合突变基因型和/或1298 AA纯合基因型时，预测所述药物组合物降低血压的作用效果强；所述的MTHFR的多态性位点基因型为677CC野生型，和/或多态性位点基因型为1298CC纯合型时，预测所述药物组合物降低血压的作用效果弱；(5)所述的MTRR多态性位点基因型为1783CT杂合型或1783TT纯合型，和/或多态性位点基因型为66GG纯合型时，预测所述药物组合物降低血压的作用效果强；所述的MTRR多态性位点基因型为1783CC纯合型，和/或多态性位点基因型为66AA纯合型或66AG杂合型时，预测所述药物组合物降低血压的作用效果弱；(6)所述的MTHFR的多态性位点基因型为677TT纯合突变基因型和/或1298 CC纯合基因型时，预测所述药物组合物靶器官保护的作用效果强；所述的MTHFR的基因型为677CC野生型，和/或多态性位点基因型1298AA纯合型时，预测所述药物组合物靶器官保护的作用效果弱；(7)所述的MTRR多态性位点基因型为1783CT杂合型或1783TT纯合型，和/或多态性位点基因型为66GG纯合型时，预测所述药物组合物靶器官保护的作用效果强；所述的MTRR多态性位点基因型为1783CC纯合型，和/或多态性位点基因型为66AA纯合型或66AG杂合型时，预测所述药物组合物靶器官保护的作用效果弱。
本发明提供的试剂盒中MTHFR的多态性位点基因型还可以进一步包含选自G167A、G482A、C559T、C692T、C764T、G792+1A、C985T、C1015T、C1081T和A1317G中的多态性位点；MTRR的多态性位点基因型还可以进一步包含选自175 Leu/Ser(T524C)、257Thr/Ser(A669T)、333 Val/Leu(G997C)、350 Arg/Lys(G1049A)、415Arg/Pro(G1349C)和515 Val/Ala(T1544C)中的多态性位点。
本发明提到的试剂盒至少包括测定MTHFR的C677T多态性位点，还可以进一步包括测定上述的MTHFR其他多态性位点、MTRR的多态性位点中的一个或者一个以上位点，也包括上述多态性位点的不同的排列组合，该试剂盒用于预测含有ACEI类药物的作用效果。其中所述ACEI类药物选自贝那普利、卡托普利、依那普利、西拉普利、培哚普利、地拉普利、喹那普利、赖诺普利、雷米普利、咪达普利、佐芬普利、群多普利和福辛普利，优选为依那普利、贝那普利、赖诺普利或福辛普利，所述B族维生素选自叶酸及其类似物、维生素B6和维生素B12，优选为叶酸。
所述试剂盒除了包含测定上述多态性位点所需要的特定引物之外，还包含运用PCR扩增而进行检测的试剂盒的常规组件、试剂、缓冲液等，或者包含运用芯片、微检测系统等方法进行检测的试剂盒的常规组件、试剂、缓冲液等，本领域技术人员熟悉这些常规组件和检测方法。
基于同型半胱氨酸代谢通路的关键酶基因，尤其是MTHFR和MTRR基因，针对其不同的多态性位点，可以设计并且获得各种诊断剂和试剂盒以用于预测含有ACEI类药物的作用效果。基于本发明的预测方法和用途获得的各种诊断剂和试剂盒也属于本发明范围。
本发明中的“试剂盒”不限于试剂盒的固有形式，可以表现为微芯片、微检测系统或者依赖于各种载体的检测系统，以及包括前述检测系统的统一包装形式，如微孔板系统、纸质载体、玻璃载体、尼龙膜载体，塑料载体、硅胶载体、凝胶载体、膜质载体等。
本发明的又一方面，涉及一种基因芯片，其中包含本发明所述的用于测定同型半胱氨酸代谢通路上的关键酶基因MTHFR和/或MTRR的多态性位点基因型的多态性分型寡核苷酸。优选的，所述基因芯片是DNA芯片的形式。
本发明是基于多年的药物基因组学研究和流行病学研究，对于参与研究的高血压患者给予含有ACEI类药物进行治疗。依那普利为有代表性的ACEI类药物之一，在肝脏水解为依那普利拉，成为一种竞争性血管紧张素转换酶抑制剂，使血管紧张素I不能转换为血管紧张素II，结果血浆肾素活性增高，醛固酮分泌减少，血管阻力减低。同时还能干扰缓激肽的降解，降低血管阻力。代谢产物依那普利拉抑制血管紧张素酶I的作用比依那普利强，其有效半衰期为11小时，按推荐剂量给药，降压作用可维持24小时以上。常用降压剂量为5mg，每日一次，以后随血压反应调整剂量至每日10-40mg。
人类MTHFR基因定位于染色体1p36.3上，基因包括11个外显子和10个内含子，外显子的长度分别为99-252bp，内含子长度分别为192-981bp，cDNA全长2.2kb，编码一种黄素蛋白，其生化功能是催化从5,10-亚甲基四氢叶酸到5-甲基四氢叶酸的还原反应Zhou J，Kang SS，Wong P WK，et al.Purification and characterization ofmethylenetetrahydrofolate reductase from human cadaver liver.Biochem Med Metab Bio，1990，43234-242.。5-甲基四氢叶酸是一种甲基供体，参与多种重要的生物过程(如嘌呤、嘧啶的合成)。它还与甲硫氨酸代谢中同型半胱氨酸的复甲基化有关。MTHFR的多态性位点基因型，将改变MTHFR的功能活性。MTHFR酶活性降低，会导致HCY在体内蓄积，而HCY不仅与心血管疾病有关，而且具有胚胎毒性，可能是一种致畸性物质。MTHFR缺陷与心血管疾病和先天畸形的发生有关。
高同型半胱氨酸血症可促进所有重要的心脑血管疾病发生，包括冠心病、脑卒中、肾功能损害、外周动脉疾病等。高血压病患者中tHCY水平较高，可能是较易发生心、脑、肾等靶器官损害的一个重要因素。并且体内叶酸、维生素B12水平与HCY呈现负相关，提示高血压患者补充叶酸、维生素B12可能会延缓其靶器官的损害。对高血压病患者特别是tHCY水平较高者有规律地补充叶酸、维生素B12可能会降低tHCY水平，从而延缓高血压病患者心、脑、肾等并发症的发生。
常见的单核苷酸多态性(SNP)位点可以位于基因的外显子部位、内含子部位和非编码区部位，优选为外显子部位，尤其是能改变编码的氨基酸序列的多态性位点。
本发明人研究发现MTHFR的常见的多态性位点表现为但不限于以下形式C677T、G167A、G482A、C559T、C692T、C764T、G792+1A、C985T、C1015T、C1081T、A1298C、A1317G，优选为C677T、A1298C。MTHFR的多态性位点基因型，尤其是上述位于外显子部位能够影响到相应编码氨基酸序列的多态性位点，常常会影响到MTHFR的酶功能和活性，因此间接或者直接影响到含有ACEI类药物的作用效果。即通过测定MTHFR的多态性位点基因型，可以预测含有ACEI类药物的作用效果。MTHFR基因的多态性位点基因型，作为预测含有ACEI类药物的作用效果的指示系统之一可以指示MTHFR基因多态性对应的代谢(酶)活性/功能状态，作为新药的功能靶点，指导复方降压药物的研发；并可以指示结合研制的复方降压药物，更合理选择ACEI类药物的个体最适剂量和最适复合药物的配伍。
在已知MTHFR基因的C677T的多态性情况下，高血压病人经ACEI类药物治疗后，在服药后第57天，基因型为677TT纯合突变基因型个体与基因型为677CC野生型个体比较，体内同型半胱氨酸水平升高较明显，提示MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变基因型时，预测ACEI类药物升高同型半胱氨酸的作用效果强；所述的基因型为677CC野生型时，预测ACEI类药物升高同型半胱氨酸的作用效果弱。进一步的研究，比较治疗前后肝功能的变化情况，发现服用ACEI类药物后出现肝功能损害，主要表现为轻微肝功能损害，而且进一步分析MTHFR C677T多态性位点基因型，发现不同基因型的个体服用ACEI类药物后的肝功能损害的程度不同。基因型为677CC纯合野生基因型个体与基因型为677TT纯合突变型个体比较，肝功能损害明显，而677CT杂合型个体的肝功能损害与677CC或677TT纯合型相比肝功能损害的差别无显著性，提示MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型时，预测ACEI类药物肝功能损害的作用强；所述的基因型为677TT纯合突变型时，预测ACEI类药物肝功能损害的作用弱。
高血压病人经ACEI类药物和B族维生素联合治疗后，在服药后第57天，基因型为677TT纯合突变基因型个体与基因型为677CC野生型个体比较，体内同型半胱氨酸水平降低明显，提示MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变基因型时，预测含有ACEI类药物和B族维生素的药物降低同型半胱氨酸的作用效果强；MTHFR多态性位点基因型为677CC野生型时，预测含有ACEI类药物和B族维生素的药物降低同型半胱氨酸的作用效果弱。
高血压病人经ACEI类药物和B族维生素联合治疗后，在服药后第57天，比较不同的MTHFR C677T多态性位点基因型个体的肝功能变化，发现不同基因型个体联合服用ACEI类药物和B族维生素后肝损害的程度不同，677TT纯合突变基因型的个体服用ACEI类药物和B族维生素后，没有出现肝功能损害，而677CC野生型个体出现肝功能损害，677TT纯合突变型与677CC野生型个体相比，二者之间的差别有显著性。进一步研究发现个体服用ACEI类药物和B族维生素药物后，肝功能损害的程度与单用ACEI类药物比较均降低，提示联合服用ACEI类药物和B族维生素能够减低单用ACEI类药物的肝功能损害作用。比较不同的MTHFR C677T多态性位点基因型个体，发现不同基因型个体联合服用ACEI类药物和B族维生素降低单用ACEI类药物所致的肝功能损害的作用效果明显不同，基因型为677CC纯合野生型的个体与基因型为677TT纯合突变型个体比较，降低单用ACEI类药物所致的肝功能损害的作用效果明显，差别有显著性，而677CT杂合型个体与677CCC纯合野生型个体或者677TT纯合突变型个体相比，降低肝损害的作用效果无明显差别。结果提示MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生基因型时，预测含有ACEI类药物和B族维生素的药物减轻单用ACEI类药物所致的肝功能损害的作用效果强。
本发明人的研究还进一步发现，服用ACEI类药物和B族维生素的高血压病人，57天后，比较基因型为677TT纯合突变基因型个体与基因型为者677CC野生型个体，发现前者的血压下降明显，提示多态性位点基因型为677TT纯合突变基因型时，预测含有ACEI类药物和B族维生素的药物降低血压的作用效果强；MTHFR的多态性位点基因型为677CC野生型基因型时，预测含有ACEI类药物和B族维生素的药物组合物降低血压的作用效果弱。
同时还发现，MTHFR的多态性位点基因型为677TT纯合突变基因型时，预测含有ACEI类药物和B族维生素的药物组合物靶器官保护的作用效果强；MTHFR的基因型为677CC野生型时，预测含有ACEI类药物和B族维生素的药物组合物靶器官保护的作用效果弱。
在已知MTHFR基因的A1298C的多态性情况下，高血压病人经ACEI类药物治疗后，在服药后第57天，基因型为1298AA纯合基因型个体与基因型为1298CC纯合型个体比较，体内同型半胱氨酸水平升高较明显，提示MTHFR多态性位点基因型为1298AA纯合基因型时，预测ACEI类药物升高同型半胱氨酸的作用效果强；所述的基因型为1298CC纯合型时，预测ACEI类药物升高同型半胱氨酸的作用效果弱。
高血压病人经ACEI类药物和B族维生素联合治疗后，在服药后第57天，基因型为1298AA纯合基因型个体与基因型为1298CC纯合型个体比较，体内同型半胱氨酸水平降低明显，提示MTHFR多态性位点基因型为1298AA纯合基因型时，预测含有ACEI类药物和B族维生素的药物组合物降低同型半胱氨酸的作用效果强；MTHFR多态性位点基因型为1298CC纯合型时，预测含有ACEI类药物和B族维生素的药物组合物降低同型半胱氨酸的作用效果弱。
本发明人的研究进一步比较基因型为1298AA纯合基因型个体与基因型为1298CC纯合型个体，发现前者的血压下降明显，提示多态性位点基因型为1298CC纯合基因型时，预测含有ACEI类药物和B族维生素的药物组合物降低血压的作用效果强；MTHFR的多态性位点基因型为1298CC纯合型时，预测含有ACEI类药物和B族维生素的药物组合物降低血压的作用效果弱。
同时还发现，MTHFR的多态性位点基因型为1298AA纯合基因型时，预测含有ACEI类药物和B族维生素的药物组合物靶器官保护的作用效果强；MTHFR的基因型为1298CC纯合型时，预测含有ACEI类药物和B族维生素的药物组合物靶器官保护的作用效果弱。
甲硫氨酸合酶还原酶(MTRR)是蛋氨酸合酶的辅助因子，催化甲基钴胺再生，基因定位于5P 15.2～15.3，该基因包含15个外显子，大小从43bp到1213bp不等，含14个内含子，大小从108bp到5kb不等。人类的编码序列包含2094个碱基对，编码698个氨基酸的多肽，对于维持蛋氨酸和四氢叶酸在细胞内水平及维持同型半胱氨酸在无毒性浓度水平有重要作用，若MTRR发生变异，可能会引起同型半胱氨酸血浆浓度升高。
本发明人研究发现
MTRR的常见的多态性表现为但不限于以下形式595 His/Tyr(C1783T)、Ile22Met(A66G)、175 Leu/Ser(T524C)、257 Thr/Ser(A669T)、333 Val/Leu(G997C)、350 Arg/Lys(G1049A)、415 Arg/Pro(G1349C)、515 Val/Ala(T1544C)，优选为595 His/Tyr(C1783T)、22 Ile/Met(A66G)。MTRR的多态性位点基因型，尤其是上述位于外显子部位能够影响到相应编码氨基酸序列的多态性位点，常常会影响到MTRR的酶功能和活性，因此间接或者直接影响到含有ACEI类药物的作用效果。即通过测定MTRR的多态性位点基因型，可以预测含有ACEI类药物的作用效果。MTRR基因的基因型，作为预测含有ACEI类药物的作用效果的指示系统之一可以指示MTRR基因多态性对应的代谢(酶)活性/功能状态，作为新药的功能靶点，指导复方降压药物的研发；并可以指示结合研制的复方降压药物，更合理选择ACEI类药物的个体最适剂量和最适复合药物的配伍。
在已知MTRR基因的His595Tyr(C1783T)和Ile22Met(A66G)多态性情况下，高血压病人给予含有ACEI类药物治疗，在服药后笫57天，比较基因型为595 His/Tyr(CT)杂合型、595 Tyr/Tyr(TT)纯合型个体和595 His/His(CC)纯合型个体，以及比较22 Met/Met(GG)纯合型个体、22Ile/Met(AG)杂合型个体和22 Ile/Ile(AA)纯合型个体之间的药物作用效果的差别，结果提示所述的MTRR多态性位点基因型为595 His/Tyr(CT)杂合型或595 Tyr/Tyr(TT)纯合型，和/或者MTRR多态性位点基因型为22 Met/Met(GG)纯合型时，预测ACEI类药物升高同型半胱氨酸的作用效果强；所述的MTRR多态性位点基因型为595 His/His(CC)纯合型，和/或者MTRR多态性位点基因型为22 Ile/Ile(AA)纯合型或22Ile/Met(AG)杂合型时，预测ACEI类药物升高同型半胱氨酸的作用效果差；在已知MTRR基因的His595Tyr(C1783T)和Ile22Met(A66G)多态性情况下，高血压病人给予ACEI类药物和B族维生素联合治疗后，在服药后笫57天，比较基因型为595 His/His(CC)纯合型、595 His/Tyr(CT)杂合型和595 Tyr/Tyr(TT)纯合型的个体，以及比较基因型为22 Met/Met(GG)纯合型、22Ile/Met(AG)杂合型和22 Ile/Ile(AA)纯合型个体，体内同型半胱氨酸水平的变化，结果提示MTRR多态性位点基因型为595 His/Tyr(CT)杂合型或595 Tyr/Tyr(TT)纯合型，和/或多态性位点基因型为22 Met/Met(GG)纯合型时，预测含有ACEI类药物和B族维生素的药物组合物降低同型半胱氨酸的作用效果强；MTRR多态性位点基因型为595His/His(CC)，和/或多态性位点基因型为22Ile/Ile(AA)纯合型或22Ile/Met(AG)杂合型时，预测含有ACEI类药物和B族维生素的药物组合物降低同型半胱氨酸的作用效果弱。
本发明人的研究还进一步发现，高血压病人服用ACEI类药物和B族维生素57天后，比较基因型595 His/Tyr(CT) 杂合型、595Tyr/Tyr(TT) 纯合型或者595 His/His(CC)纯合型个体，以及比较基因型为22 Met/Met(GG)纯合型、22Ile/Met(AG)杂合型和22 Ile/Ile(AA)纯合型个体，观察降低血压的作用效果。结果提示MTRR多态性位点基因型为595 His/Tyr (CT) 杂合型或595Tyr/Tyr(TT) 纯合型，和/或者多态性位点基因型为22 Met/Met(GG)纯合型时，预测含有ACEI类药物和B族维生素的药物组合物降低血压的作用效果强；MTRR多态性位点基因型为595 His/His(CC)，和/或多态性位点基因型为22 Ile/Ile(AA)纯合型或22Ile/Met(AG)杂合型时，预测含有ACEI类药物和B族维生素的药物组合物降低血压的作用效果弱。
同时还发现，MTRR多态性位点基因型为595 His/Tyr(CT)杂合型或595 Tyr/Tyr(TT)纯合型，和/或者多态性位点基因型为22Met/Met(GG)纯合型时，预测含有ACEI类药物和B族维生素的药物组合物靶器官保护的作用效果强；MTRR多态性位点基因型为595His/His(CC)，和/或多态性位点基因型为22Ile/Ile(AA)纯合型或22Ile/Met(AG)杂合型时，预测含有ACEI类药物和B族维生素的药物组合物靶器官保护的作用效果弱。
本发明的再一方面，还提供了利用功能基因预测含有ACEI类药物的作用效果的方法及试剂盒，可作为含有ACEI类药物的作用效果的指示系统，通过测定同型半胱氨酸代谢通路上关键酶基因的多态性位点基因型，预测含有ACEI类药物的作用效果。根据本发明提供的方法和试剂盒，测定同型半胱氨酸代谢通路上关键酶基因的多态性位点基因型，便于医生在用药时根据个体差异进行药物疗效的预测，进一步可以因此选择药物，进行个体化医疗，提高了临床用药和治疗的有效率与安全性，降低了发生毒副作用的风险和经济负担。应用这类功能基因多态性的发明成果，对今后更加经济有效地指导抗高血压药物的临床选药、预测用药的作用效果和指导新药研制具有产业与服务的应用价值。
本发明内容中，我们特别设计了用于测定多态性位点基因型位点的引物序列，并且根据该引物序列和靶序列特点确定了扩增效率高、特异性好和省时的检测方法，方便本领域的普通技术人员掌握和使用，有很好的实用价值。
特别是针对MTHFR的C677T多态性位点基因型设计了如下检测所用的PCR扩增引物，与常规的扩增引物相比较，扩增效率高、特异性好和省时，有更好的使用价值。MTHFR的C677T多态性位点基因型的特异性PCR扩增引物如下，扩增得到的片段长度为274bp正向物5’-ctt tga ggc tga cct gaa gc-3’反向引物5’-ctg gga aga act cag cga ac-3’具体实施方式
实施例1测定MTHFR基因的C677T(Ala222Val，dsSNP IDrs1801133)多态性位点并预测含有ACEI类药物的作用效果(一)测定MTHFR基因的C677T多态性位点基因型(1)提取宿主细胞的基因组DNA(a)在全血中加入30ml红细胞裂解液，缓慢摇匀，室温静置10分钟，期间，摇动数次，彻底裂解红细胞；
(b)于4℃、2000转/分离心10分钟，去上清，将沉淀之白细胞在旋转震荡器上打散，加蛋白酶40u1、RNA酶50ul，摇匀，加白细胞裂解液置15ml，混匀37℃水浴20分钟后取出，置冷水中；(c)加冷的蛋白沉淀液4ml，混匀后放在-20℃冰箱5分钟，取出于4℃、3000转/分离心10分钟，将上清液倒入己加好15ml异丙醇的50ml离心管中缓慢摇动数次，至DNA絮状物析出；(d)将析出的DNA絮状物移至另一1.5ml离心管中，75％乙醇1ml洗DNA絮状物后，室温干燥。
(e)加DNA水化液1.0ml，置摇床，摇动过夜，备用；(f)DNA浓度的测定采用紫外分光光度法，分别测定260nm及280nm两个波长下的OD值，以OD260nm×50所得值为DNA浓度。并以OD260nm/OD280nm比值估计DNA纯度。
(2)使用PCR和限制性酶切片段长度多态性分析方法(PCR-RFLP)检测MTHFR C677T多态性位点根据MTHFR C677T基因序列设计PCR特异性引物，包括PCR正向引物和PCR反向引物，按如下条件进行常规PCR扩增。
引物序列正向引物5’-CTT TGA GGC TGA CCT GAA GC-3’反向引物5’-CTG GGA AGA ACT CAG CGA AC-3’PCR反应体系基因组DNA 45ng，上下游引物10pmol(20umol/L)，dNTPs2.0mmol/l，10×buffer 1.0ul，Gold Taq DNA聚合酶3U，ddH2O补足总体积至10ul.
PCR反应条件95℃预变性10min后；94℃变性30sec，59℃退火45sec，68℃延伸45sec，35个循环周期；最后68℃延伸7min。；得到274bp的扩增片段。
酶切条件及体系(15ul)MTHFR C677T位点PCR产物目的片段长度为274bp，总的酶切体系为15ul，其中PCR产物10ul，10×NEBuffer#2 1.5ul，Hinf I内切酶4U(0.4ul)，和3.1ul ddH2O，37℃过夜。
Hinf I内切酶识别位点为5′...GANTC...3′3′...CTNA▲G...5′基因型结果判定将DNA酶切后的产物点样在2.5％琼脂糖胶上，200V电压下电泳1小时后，在紫外灯下读取胶图并进行基因型分析。个体基因型鉴定如下酶切片段为274bp，MTHFR基因型为677CC；酶切片段为274+228+46bp，MTHFR基因型为677CT；酶切片段为228+46bp，MTHFR基因型为677TT。
(二)药物作用效果的预测基因型为677TT纯合突变基因型时，ACEI类药物升高同型半胱氨酸的作用效果强；基因型为677CC纯合野生型时，ACEI类药物升高同型半胱氨酸的作用效果弱；基因型为677CT杂合型时，ACEI类药物升高同型半胱氨酸的作用效果与677CC纯合野生型或677TT纯合突变型相比差别没有显著性。
基因型为677TT纯合突变基因型时，含有ACEI类药物和B族维生素的药物降低同型半胱氨酸的作用效果强；所述的MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型时，含有ACEI类药物和B族维生素的药物降低同型半胱氨酸的作用效果弱。
基因型为677TT纯合突变基因型时，含有ACEI类药物和B族维生素的药物降低血压的作用效果强；基因型为677CT杂合型或者677CC野生型基因型时，含有ACEI类药物和B族维生素的药物降低血压的作用效果弱。
基因型为677TT纯合突变基因型时，含有ACEI类药物和B族维生素的药物靶器官保护的作用效果强；基因型为677CT杂合型或者677CC野生型时，含有ACEI类药物和B族维生素的药物靶器官保护的作用效果弱。
本实施例中，ACEI类药物为依那普利，B族维生素为叶酸。
以上方法通过流行病学研究验证，先将高血压病人按照MTHFRC677T基因型分为三组677CC纯合野生型组、677CT杂合型组和677TT纯合突变型组，分别单独给予ACEI类药物依那普利或者联合给予依那普利和叶酸治疗57天，分别测定用药前后的同型半胱氨酸水平、血压值(包括收缩压、舒张压)和尿白蛋白，观察药物作用效果效果，结果如下在高血压病人单独服用依那普利后第57天，体内同型半胱氨酸水平升高，且同型半胱氨酸水平随突变子T677的个数增加呈递增趋势。在677TT纯合突变型个体与677CT杂合型或者677CC野生型个体比较，同型半胱氨酸水平升高明显，经过多因子校正后的均值差异仍达到统计学显著性水平；而677CT和677CC个体间同型半胱氨酸水平的均值差异经统计学分析无显著性差异，提示MTHFR基因C677T多态性位点基因型和依那普利升高同型半胱氨酸有关，其中，677TT基因型个体同型半胱氨酸水平升高比较明显(见表1a)。
表1a 依那普利升高同型半胱氨酸的作用效果(umol/L，D57-D0)与MTHFR基因C677T多态性位点的关系
注调整了性别、年龄、BMI、吸烟、饮酒和基线同型半胱氨酸等因素。CC，代表677CC野生型；TT，代表677TT纯合突变型；CT，代表677CT杂合型。
采用病例-对照的研究方法，将MTHFRC677T多态性位点基因型为677CC纯合野生型个体和677CT杂合型个体合并为一组，将677TT纯合突变型个体为一组，以服药后57天Hcy与服药前的Hcy数值进行比较分类，定义第57天的Hcy值与服药前的基线Hcy值相比升高≥10％为有效；＜10％为无效，得到如表1b的数据。结果提示，有28.6％(22/77×100％)的个体服用ACEI类药物后Hcy升高≥10％；而有38.5％(10/(10+16)×100％)的TT纯合突变型个体在服用ACEI类药物后Hcy升高≥10％；仅有23.3％(12/(12+39)×100％)的CT杂合型和CC野生型个体在服用ACEI类药物后Hcy升高≥10％，结果提示不同基因型之间服用依那普利后升高Hcy的比例不同，TT基因型的个体服用ACEI类药物后更加容易升高Hcy的水平。
表1b 依那普利升高同型半胱氨酸的作用效果与MTHFR基因C677T多态性位点的关系(以57天Hcy升高≥10％为有效标准)
注定义“有效”为服用后第57天tHcy水平与第0天(服药前)相比升高≥10％，定义“无效”为服用后笫57天tHcy水平与第0天(服药前)相比升高＜10％。
敏感性＝10/22*100％＝45.5％特异性＝39/55*100％＝70.9％PV+＝10/26*100％＝38.5％ PV-＝39/51*100％＝76.5％*卡方值＝1.881，p＝0.170在高血压病人联合服用依那普利和叶酸后第57天，体内同型半胱氨酸水平显著降低，且同型半胱氨酸水平下降幅度与突变子T677的个数呈正相关。多因子校正后，677TT纯合突变型个体或677CT杂合型均比677CC野生型个体同型半胱氨酸水平下降明显，其中677TT纯合突变型个体同型半胱氨酸水平下降幅度最大，提示依那普利和叶酸联合用药对携带MTHFR C677T位点的不同基因型个体内同型半胱氨酸水平治疗具有遗传选择性(见表2a)。
表2a 依那普利和叶酸联合降低同型半胱氨酸的作用效果与MTHFR基因C677T多态性位点的关系
注调整了性别、年龄、BMI、吸烟、饮酒和基线同型半胱氨酸等因素。CC，代表677CC野生型；TT，代表677TT纯合突变型；CT，代表677CT杂合型。
采用病例-对照的研究方法，将MTHFR 677CC野生型基因型个体和677CT杂合型个体合并为一组，将677TT纯合突变型个体为一组，以服药后57天Hcy与服药前的Hcy数值进行比较分类，定义第57天的Hcy值与服药前的基线Hcy值相比降低≥15％为有效；＜15％为无效，得到如表2b的数据。结果提示，有56.9％(82/144×100％)的个体服用ACEI类药物后Hcy降低≥15％；而有69.4％(34/(34+15)×100％)的TT纯合突变型个体在服用ACEI类药物后Hcy降低≥15％；仅有50.5％(48/(48+47)×100％)的CT杂合型和CC野生型个体在服用ACEI类药物后Hcy降低≥15％，结果提示不同基因组之间联合服用依那普利和叶酸后降低Hcy的比例不同，TT基因型的个体联合服用ACEI类药物和叶酸后更加容易降低Hcy水平，即联合服用ACEl类药物和叶酸降低Hcy的作用效果更加明显。经过统计学分析，此差别有显著性(卡方检验，p＝0.030)。
表2b 依那普利和叶酸联合降低同型半胱氨酸的作用效果与MTHFR基因C677T多态性位点的关系(以57天Hcy下降≥15％为有效标准)
注定义“有效”为服用后第57天tHcy水平与第0天(服药前)相比下降≥15％，定义“无效”为服用后第57天tHcy水平与第0天(服药前)相比下降＜15％。
敏感性＝34/82*100％＝41.5％特异性＝47/62*100％＝75.8％PV+＝34/49*100％＝69.4％ PV-＝47/95*100％＝49.5％*卡方值＝4.691，p＝0.030在高血压病人联合服用依那普利和叶酸后第57天，患者血压降低，且受到MTHFR C677T位点的修饰作用效果，导致血压下降幅度随突变子T677的个数增加呈递增趋势。在677TT纯合突变型个体与677CT杂合型或者677CC野生型个体比较，血压显著降低，且达到统计学水平，而677CT和677CC个体间血压下降幅度的差异不明显，提示MTHFR的C677T多态性与含有ACEI类药物的降压作用效果相关，携带677TT基因型个体降压疗效更好(见表3)。
表3 依那普利和叶酸联合降低血压的作用效果与MTHFR基因677CT多态性位点的关系
注调整了性别、年龄、BMI、吸烟、饮酒和基线血压等因素。CC，代表677CC野生型；TT，代表677TT纯合突变型；CT，代表677CT杂合型。
在高血压病人联合服用依那普利和叶酸后第57天，患者尿蛋白的排出量降低，且受到MTHFR C677T位点的修饰作用效果。在677TT纯合突变型个体与677CT杂合型或者677CC野生型个体比较，尿蛋白降低显著，而677CT和677CC个体间尿蛋白降低的差异不明显，提示MTHFR的C677T多态性位点基因型与含有ACEI类药物的肾功能保护作用效果相关，携带677TT基因型个体肾功能受损程度最小(见表4)。
表4 依那普利和叶酸联合对靶器官保护作用效果与MTHFR基因C677T多态性位点的关系
注调整了性别、年龄、BMI、吸烟、饮酒及基线尿蛋白等因素。CC，代表677CC野生型；TT，代表677TT纯合突变型；CT，代表677CT杂合型。
本实施例中，ACEI类药物另外还分别选用贝那普利、赖诺普利或者福辛普利，B族维生素优选为叶酸。以上方法通过流行病学研究验证，先将高血压病人分为三组纯合野生型组、杂合型组、纯合突变型组，分别单独给予ACEI类药物贝那普利、赖诺普利或者福辛普利或者联合给予ACEI类药物贝那普利、赖诺普利或者福辛普利和叶酸治疗57天，观察其药物作用效果，结果如下在高血压病人单独服用上述ACEI类药物贝那普利、赖诺普利或者福辛普利中的一种后第57天，体内同型半胱氨酸水平升高；且同型半胱氨酸水平随突变子T677的个数增加呈递增趋势。在677TT纯合突变型个体与677CT杂合型或者677CC野生型个体比较，同型半胱氨酸水平升高明显，多因子校正后的均值差异仍达到统计学显著性水平；而677CT和677CC个体间同型半胱氨酸水平的均值差异经统计学分析无显著性差别，提示MTHFR基因C677T多态性位点基因型和上述ACEI类药物贝那普利、赖诺普利或者福辛普利升高同型半胱氨酸有关，其中，677TT基因型个体同型半胱氨酸水平升高比较明显。
在高血压病人联合服用上述ACEI类药物贝那普利、赖诺普利或者福辛普利中的一种和叶酸后第57天，体内同型半胱氨酸水平显著降低，且同型半胱氨酸水平下降幅度与突变子T677的个数呈负相关。多因子校正后，677TT纯合突变型个体或677CT杂合型均比677CC野生型个体同型半胱氨酸水平下降明显，其中677TT纯合突变型个体下降幅度最大，提示贝那普利和叶酸联合用药对携带MTHFR C677T位点的不同基因型个体内同型半胱氨酸水平治疗具有遗传选择性。
在高血压病人联合服用上述ACEI类药物贝那普利、赖诺普利或者福辛普利中的一种和叶酸后第57天，患者血压降低，且受到MTHFR C677T位点的修饰作用效果，导致血压下降幅度随突变子T677的个数增加呈递增趋势。在677TT纯合突变型个体与677CT杂合型或者677CC野生型个体比较，血压显著降低，且达到统计学水平，而677CT和677CC个体间血压下降幅度的差异不明显，提示MTHFR的677CT多态性位点基因型与含有ACEI类药物的降压作用效果相关，携带677TT基因型个体降压疗效更好。
在高血压病人联合服用上述ACEI类药物贝那普利、赖诺普利或者福辛普利中的一种和叶酸后第57天，患者尿蛋白的排出量降低，且受到MTHFR C677T位点的修饰作用效果。在677TT纯合突变型个体与677CT杂合型或者677CC野生型个体比较，尿蛋白降低显著，而677CT和677CC个体间尿蛋白降低的差异不明显，提示MTHFR的677CT多态性位点基因型与含有ACEI类药物的肾功能保护作用效果相关，携带677TT基因型个体肾功能受损程度最小。
(三)通过测定个体基因型参数及其他生理参数，预测含有ACEI类药物作用效果的预测方法1、获得如本实施例相似的数据资料结果，即MTHFR C677T多态性位点基因型参数和基本生理参数年龄、性别、身高、体重、吸烟史、饮酒史、职业、教育程度、基础收缩压、基础舒张压。
2、根据多元线性回归分析，得到用来预测含有ACEI类药物的作用效果的预测模型。
预测方程分别为降压疗效的预测方程(1)舒张压下降幅度的预测方程Δdbp＝13.957+2.6017×677TT+0.8126×677CT-0.5771×年龄+0.1177×BMI+0.3632×性别-0.0847×饮酒史+0.30978×吸烟史-0.0416×身高-0.0485×体重+0.4611×职业+0.5295×教育程度+0.2261×基础舒张压Δdbp为治疗后的舒张压的下降值。
(2)收缩压下降幅度的预测方程Δsbp＝13.099+5.3826×677TT+0.7826×677CT-0.7892×年龄+0.8902×BMI+0.2019×性别-0.8913×饮酒史+0.3892×吸烟史-0.0232×身高-0.0312×体重+0.3145×职业+0.4265×教育程度+0.4917×基础收缩压Δsbp为治疗后的收缩压的下降值。
以上步骤中的基因型参数值的取值方式如下按照测定的MTHFR C677T基因型多态性位点的基因型取值。当个体的基因型为TT纯合突变型时，预测方程中677TT基因型参数取值为1,677CT基因型参数取值为0；当个体的基因型为CT杂合型时，预测方程中677TT基因型参数取值为0,677CT基因型参数取值为1；当个体的基因型为CC纯合野生型时，预测方程中677TT基因型参数取值为0,677CT基因型参数取值为0。
以上步骤中的基本生理参数值的取值方式如下年龄参数取实际年龄数值，单位为岁；BMI(体重指数)参数为体重(公斤)/身高(米)2(kg/m2)；性别参数为男性取0，女性取1；饮酒史参数为从不饮酒取0，曾经饮酒或者现在饮酒取1；吸烟史参数为从不吸烟取0，曾经吸烟或者现在吸烟取1；身高参数取实际身高值，单位为厘米(cm)；体重参数取实际体重值，单位为公斤(kg)；职业参数为农民取0，非农民取1；教育程度参数为中等以上教育程度取0，其他为1；基础收缩压参数为实际基础收缩压值，单位为毫米汞柱(mmHg)。
3、根据预测方程计算得到的结果定量预测含有ACEI类药物的作用效果。
根据上述预测方程计算得到的结果预测含有ACEI类药物的作用效果。
中华人民共和国卫生部颁发的《新药临床研究标准》关于心血管药物研究指南的规定，判定降压作用效果的临床结果为显效、有效和无效。
1)显效治疗后舒张压下降≥10mmHg，并降至正常范围，或舒张压下降≥20mmHg。
2)有效治疗后舒张压下降虽未达到10mmHg，但已降至正常范围，或舒张压下降(10-20)mmHg；如为收缩期高血压，收缩压下降≥30mmHg。
3)无效治疗后血压下降未达到有效标准。
参照此标准，在本发明中，我们将按照此标准判定降压作用效果为“显效”和“有效”的个体统一定义为“降压有效”，而将按照此标准判定降压作用未达到显效和有效标准的“无效”个体定义为“降压无效”。
实施例2测定MTHFR基因的A1298C多态性位点(Glu 429Ala，dbSNP IDrs1801131)并预测含有ACEI类药物的作用效果(一)测定MTHFR基因的1298AC多态性位点基因型(1)按照常规的操作流程，采用与实施例1相似的方法提取宿主细胞的基因组DNA(2)使用Taqman方法检测MTHFR基因的1298AC多态性位点基因型(a)用PCR仪扩增MTHFR功能基因多态位点及其侧翼序列，在5ul PCR反应体系中含有基因组DNA 10ng，2.5ul的Taq man 2XUniversal PCR Master Mix No AmpErase UNG(组成成份包括AmpliTaq Gold DNA Polymerase，dNTPs with Dutp，PassiveReference，已优化的缓冲液)，及0.72uM的正向引物，0.72uM的反向引物及两段带荧光报告集团的等位基因特异性探针各0.16uM。
引物序列为正向引物5’GGAGGAGCTGCTGAAGATGTG 3，反向引物5’TGGTTCTCCCGAGAGGTAAAGA 3，等位基因特异性探针的序列为VIC-5’CCAGTGAAGAAAGTGTC 3’-NFQ，对应于“A”等位基因，携带VIC荧光报告集团。
FAM-5’CAGTGAAGCAAGTGTC 3’-NFQ对应于“C”等位基因，携带FAM荧光报告集团。
PCR反应条件95℃10min，1个循环；92℃15s，60℃1min，50个循环。
(b)在7900型荧光定量PCR仪上检测荧光信息将完成PCR反应的PCR板放入7900型荧光定量PCR仪上，选用“Allelic Discrimination”程序，进行扫描与结果的判断发出FAM荧光者的基因型为1298CC纯合子；发出VIC荧光者的基因型为1298AA纯合子；发出两种荧光者的基因型为1298AC杂合子。
(二)药物作用效果的预测基因型为1298AA纯合基因型时，ACEI类药物升高同型半胱氨酸的作用效果强；基因型为1298CC纯合型或者1298AC杂合型时，ACEI类药物升高同型半胱氨酸的作用效果弱。
基因型为1298 AA纯合基因型时，含有ACEI类药物和B族维生素的药物降低同型半胱氨酸的作用效果强；所述的MTHFR多态性位点基因型为1298CC纯合型或者1298AC杂合型时，含有ACEI类药物和B族维生素的药物降低同型半胱氨酸的作用效果弱。
基因型为1298AA纯合基因型时，含有ACEI类药物和B族维生素的药物降低血压的作用效果强；基因型为1298CC纯合型或者1298AC杂合型时，含有ACEI类药物和B族维生素的药物降低血压的作用效果弱。
基因型为1298AA纯合基因型时，含有ACEI类药物和B族维生素的药物靶器官保护的作用效果强；基因型为1298CC纯合型或者1298AC杂合型时，含有ACEI类药物和B族维生素的药物靶器官保护的作用效果弱。
本实施例中，ACEI类药物优选为依那普利、贝那普利或赖诺普利中的一种，B族维生素优选为叶酸。
以上方法通过流行病学研究验证，先将高血压病人按照MTHFRA1298C多态性位点基因型随机分为三组纯合野生型组、杂合型组、纯合突变型组，治疗方案分为两种单独给予ACEI类药物依那普利治疗57天；联合给予依那普利和叶酸治疗57天。测定药物的作用效果和靶器官保护指标分别为用药前后的同型半胱氨酸水平、血压值(包括收缩压、舒张压)和尿白蛋白水平。研究结果如下在高血压病人单独服用依那普利后第57天，体内同型半胱氨酸水平升高。携带1298AA纯合野生型个体与1298AC杂合型或者1298CC纯合突变型个体比较，同型半胱氨酸水平升高明显，而1298AC和1298CC个体间同型半胱氨酸水平的均值差异无显著性，提示MTHFR基因A1298C多态性位点基因型和依那普利升高同型半胱氨酸有关，其中，1298AA基因型个体同型半胱氨酸水平升高比较明显(见表5)。
表5 依那普利升高同型半胱氨酸作用效果与MTHFR基因A1298C多态性位点的关系
注调整了性别、年龄、BMI、吸烟、饮酒等因素。CC，代表1298CC纯合突变型；AC，代表1298AC杂合型；AA，代表1298AA野生型。
在高血压病人联合服用依那普利和叶酸后第57天，体内同型半胱氨酸水平显著降低，多因子校正后，1298AA野生型个体与1298AC杂合型或者1298CC纯合突变型个体比较，同型半胱氨酸水平下降更加明显，其中，1298AA野生型个体同型半胱氨酸水平下降幅度最大，提示依那普利和叶酸联合用药对携带MTHFR A1298C位点的不同基因型个体内同型半胱氨酸水平治疗具有遗传选择性(见表6)。
在高血压病人联合服用依那普利和叶酸后第57天，患者尿蛋白的排出量降低，且受到MTHFR A1298C位点的修饰作用。在1298AA野生型个体与A1298C杂合型或者1298CC野生型个体比较，尿蛋白降低显著，而A1298C杂合型和1298CC野生型个体间尿蛋白降低的差异不明显，提示MTHFR的A1298C多态性位点基因型与含有ACEI类药物的肾功能保护作用相关，携带1298AA基因型个体肾功能受损程度最小(见表6)。
表6 依那普利和叶酸联合治疗对于同型半胱氨酸的降低作用及靶器官保护作用与MTHFR基因1298AC(Ala/Glu)多态性位点的关系
注调整了性别、年龄、BMI、吸烟、饮酒等因素。CC，代表1298CC纯合型；AC，代表1298AC杂合型；AA，代表1298AA纯合型。
在高血压病人联合服用依那普利和叶酸后第57天，患者血压显著降低，同时受到MTHFR A1298C位点的修饰作用。在1298AA野生型个体与1298AC杂合型或者1298CC纯合突变型个体比较，血压显著降低，且达到统计学水平，而1298AC杂合型和1298CC纯合突变型个体间血压下降幅度的差异不明显，提示MTHFR的A1298C多态性位点基因型与含有ACEI类药物的降压作用相关，携带1298AA基因型个体降压疗效更好(见表7)。
表7 依那普利和叶酸联合降低血压的作用与MTHFR基因1298AC(Ala/Glu)多态性位点的关系
注调整了性别、年龄、BMI、吸烟、饮酒等因素。CC，代表1298CC纯合突变型；AC，代表1298AC杂合型；AA，代表1298AA野生型。
本实施例中，ACEI类药物另外还分别选用贝那普利、赖诺普利或者福辛普利，B族维生素优选为叶酸。以上方法通过流行病学研究验证，先将高血压病人分为三组纯合野生型组、杂合型组、纯合突变型组，分别单独给予ACEI类药物贝那普利、赖诺普利或者福辛普利或者联合给予ACEI类药物贝那普利、赖诺普利或者福辛普利和叶酸治疗57天，分别观察到如上所述相一致的药物作用效果。
实施例3测定MTRR His595Tyr(C1783T，dbSNP IDrs10380)多态性位点并预测含有ACEI类药物的作用效果(一)测定MTRR基因的His595Tyr(CT)多态位点基因型(1)提取宿主细胞的基因组DNA在标准的操作规程的基础上，用盐沉淀法，抽提唾液细胞中基因组DNA。DNA于-20℃保存。
(2)使用TaqMan方法检测MTRR His595Tyr(C1783T)多态位点基因型。
(a)用PCR仪扩增MTRR His595Tyr基因多态位点及其侧翼序列，在5ul PCR反应体系中含有基因组DNA 10ng，2.5ul的TaqMan2X Universal的PCR Master Mix No AmpErase UNG(组成成份包括AmpliTaq Gold DNA Polymerase，dNTPs with Dutp，PassiveReference，已优化的缓冲液)，及0.72uM的正向引物、0.72uM的反向引物及两段带荧光报告集团的等位基因特异性探针各0.16uM，剩下用ddH2O补足反应体系。
对应于“C(或His)”等位基因，特异性探针携带VIC荧光报告基团。
对应于“T(或Tyr)”等位基因，特异性探针携带FAM荧光报告基团。
PCR反应条件
95℃预变性10min；94℃变性15sec，60℃退火加延伸60sec，50个循环周期扩增。
(b)在7900型荧光定量PCR仪上检测荧光信息将完成PCR反应的PCR板放入7900型荧光定量PCR仪上，选用“Allelic Discrimination”程序，进行扫描与结果的判断发出FAM荧光者的基因型为Tyr/Tyr纯合子；发出VIC荧光者的基因型为His/His纯合子；发出两种荧光者的基因型His/Tyr杂合子。
(二)药物作用效果的预测通过流行病学研究验证如下所述的药效预测结果。
基因型为595 His/Tyr(CT) 杂合型和/或595 Tyr/Tyr(TT)纯合型时，ACEI类药物升高同型半胱氨酸的作用效果最强；基因型为595 His/His(CC)纯合型时，ACEI类药物升高同型半胱氨酸的作用效果较差。
基因型为595 His/Tyr(CT) 杂合型和/或595 Tyr/Tyr(TT)纯合型时，含有ACEI类药物和B族维生素的药物组合物降低同型半胱氨酸的作用效果强；基因型为595 His/His(CC)纯合型时，含有ACEI类药物和B族维生素的药物组合物降低同型半胱氨酸的作用效果弱。
基因型为595 His/Tyr(CT) 杂合型和/或595 Tyr/Tyr(TT)纯合型时，含有ACEI类药物和B族维生素的药物组合物降低血压的作用效果强；基因型为595 His/His(CC)纯合型时，含有ACEI类药物和B族维生素的药物组合物降低血压的作用效果弱。
基因型为595 His/Tyr(CT) 杂合型和/或595 Tyr/Tyr(TT)纯合型时，含有ACEI类药物和B族维生素的药物组合物靶器官保护的作用效果强；基因型为595 His/His(CC)纯合型时，含有ACEI类药物和B族维生素的药物组合物靶器官保护的作用效果弱。
本实施例中，ACEI类药物优选为依那普利，B族维生素优选为叶酸。先将高血压病人按照MTRR C1783T随机分为三组纯合野生型组、杂合型组、纯合突变型组；治疗方案为两种单独给予ACEI类药物依那普利治疗57天；联合给予依那普利和叶酸连续治疗57天。测定药物的作用效果包括靶器官保护的指标包括用药前后的同型半胱氨酸水平、血压值(包括收缩压、舒张压)和尿白蛋白水平。研究结果如下表8 依那普利升高同型半胱氨酸作用效果与MTRR基因C1783T多态性位点的关系
注调整了性别、年龄、BMI、吸烟、饮酒等因素。CC，代表1783CC纯合型；CT，代表1783CT杂合型；TT，代表1783TT纯合型。
表9 依那普利和叶酸联合治疗对于同型半胱氨酸的降低作用效果及靶器官保护作用与MTRR基因C1783T多态性位点的关系
注调整了性别、年龄、BMI、吸烟、饮酒等因素。CC，代表1783CC纯合型；CT，代表1783CT杂合型；TT，代表1783TT纯合型。
表10 依那普利和叶酸联合降低血压的作用效果与MTRR基因C1783T多态性位点的关系
注调整了性别、年龄、BMI、吸烟、饮酒等因素。CC，代表1783CC纯合型；CT，代表1783CT杂合型；TT，代表1783TT纯合型。
本实施例中，ACEI类药物另外还分别选用贝那普利、赖诺普利或者福辛普利，B族维生素优选为叶酸。以上方法通过流行病学研究验证。先将高血压病人分为三组纯合野生型组、杂合型组、纯合突变型组，分别单独给予ACEI类药物贝那普利、赖诺普利或者福辛普利或者联合给予ACEI类药物贝那普利、赖诺普利或者福辛普利和叶酸治疗57天，分别观察如上所述相一致的药物作用效果。
实施例4测定MTRR基因Ile22Met(A66G，dbSNP IDrs1801394)多态性位点基因型并预测含有ACEI类药物的作用效果(一)测定MTRR基因的Ile22Met多态位点基因型DNA提取同实施例1，多态位点基因型测定方法与实施例1相似，其中用PCR仪扩增MTRR Ile22Met基因多态位点及其侧翼序列。对应于“A(或Ile)”等位基因，特异性探针携带VIC荧光报告基团；对应于“G(或Met)”等位基因，特异性探针携带FAM荧光报告基团。
将完成PCR反应的PCR板放入7900型荧光定量PCR仪上，选用“Allelic Discrimination”程序，进行扫描与结果的判断发出FAM荧光者的基因型为Met/Met纯合子；发出VIC荧光者的基因型为Ile/Ile纯合子；发出两种荧光者的基因型Ile/Met杂合子。
(二)药物作用效果的预测基因型为22 Met/Met(GG)纯合型时，ACEI类药物升高同型半胱氨酸的作用效果强；基因型为22 Ile/Ile(AA)纯合型或者22Ile/Met(AG)杂合型时，ACEI类药物升高同型半胱氨酸的作用效果弱。
基因型为22 Met/Met(GG)纯合型时，含有ACEI类药物和B族维生素的药物组合物降低同型半胱氨酸的作用效果强；所述的MTHFR多态性位点基因型为22Ile/Ile(AA)纯合型或者22Ile/Met(AG)杂合型时，含有ACEI类药物和B族维生素的药物降低同型半胱氨酸的作用效果弱。
基因型为22 Met/Met(GG)纯合型时，含有ACEI类药物和B族维生素的药物组合物降低血压的作用效果强；基因型为22Ile/Ile(AA)纯合型或者22Ile/Met(AG)杂合型时，含有ACEI类药物和B族维生素的药物组合物降低血压的作用效果弱。
基因型为22Met/Met(GG)纯合型时，含有ACEI类药物和B族维生素的药物组合物靶器官保护的作用效果强；基因型为22Ile/Ile(AA)纯合型或者22Ile/Met(AG)杂合型时，含有ACEI类药物和B族维生素的药物组合物靶器官保护的作用效果弱。
本实施例中，ACEI类药物优选为依那普利、贝那普利或赖诺普利中的一种，B族维生素优选为叶酸。
以上方法通过流行病学研究验证，先将高血压病人按MTRRA66G位点随机分为三组纯合野生型组、杂合型组、纯合突变型组；治疗方案为两种单独给予ACEI类药物依那普利，联合给予依那普利和叶酸连续治疗57天；测定药物的治疗效果和靶器官保护的指标包括用药前后的同型半胱氨酸水平、血压值(包括收缩压、舒张压)和尿白蛋白水平。研究结果如下表11 依那普利升高同型半胱氨酸作用效果与MTRR基因A66G多态性位点的关系
注调整了性别、年龄、BMI、吸烟、饮酒等因素。AA，代表66AA纯合型；AG，代表66AG杂合型；GG，代表66GG纯合型。
表12 依那普利和叶酸联合治疗对于同型半胱氨酸的降低作用效果及靶器官保护作用与MTRR基因A66G多态性位点的关系
注调整了性别、年龄、BMI、吸烟、饮酒等因素。AA，代表6AA纯合型；AG，代表66AG杂合型；GG，代表66GG纯合型。
表13 依那普利和叶酸联合降低血压的作用效果与MTRR基因A66G多态性位点的关系
注调整了性别、年龄、BMI、吸烟、饮酒等因素。AA，代表66AA纯合型；AG，代表66AG杂合型；GG，代表66GG纯合型。
本实施例中，ACEI类药物另外还分别选用贝那普利、赖诺普利或者福辛普利，B族维生素优选为叶酸。以上方法通过流行病学研究验证，先将高血压病人分为三组纯合野生型组、杂合型组、纯合突变型组，分别单独给予ACEI类药物贝那普利、赖诺普利或者福辛普利或者联合给予ACEI类药物贝那普利、赖诺普利或者福辛普利和叶酸治疗57天，分别观察如上所述相一致的药物作用效果。
实施例5测定MTHFR C677T多态性位点基因型预测含有ACEI类药物的作用效果的试剂盒(PCR-PFLP方法)(一)试剂盒的组成成分核酸提取试剂，PCR反应试剂，MTHFRC677T多态性位点基因型特异性引物、核酸聚合酶、限制性内切酶、酶切反应混合液和阳性对照模板、阴性对照模板，分别分装后组装成的试剂盒。其中阳性对照模板包括MTHFR C677T纯合野生型、杂合型、纯合突变型阳性对照模板；特异性引物为能够特异性扩增至少含有MTHFR C677T多态性位点的引物。
(二)检测的步骤(1)提取宿主细胞的基因组DNA(a)取400ul红细胞裂解液加入1.5ml离心管中，加入100ul左右新鲜全血或者抗凝全血。37℃水浴5分钟，15000g离心1分钟；(b)去上清，加入100ul白细胞裂解液，高速振荡30秒至液体均一，37℃水浴5分钟。加入35ul蛋白沉淀液，高速振荡20秒后15000g离心90秒，离心管底可见褐色沉淀；(c)将上清液全部移入装有100ul异丙醇的1.5ml离心管中，来回轻柔的摇匀数次至有白色絮状物出现；(d)弃上清液，注意保留白色沉淀，加入100ul 75％乙醇(以无水乙醇配制)，15000g离心90秒，弃上清，室温干燥沉淀；(e)加核酸储存液100ul，所得溶液即为全血基因组DNA；(f)DNA浓度的测定采用紫外分光光度法，分别测定260nm及280nm两个波长下的OD值，以OD260nm×50所得值为DNA浓度。并以OD260nm/OD280nm比值估计DNA纯度。
(2)使用PCR和限制性酶切片段长度多态性分析方法(PCR-RFLP)检测MTHFR 677CT多态性位点根据MTHFR 677CT基因序列设计PCR特异性引物，包括PCR正向引物和PCR反向引物，按如下条件进行常规PCR扩增。
引物序列正向引物5’-CTT TGA GGC TGA CCT GAA GC-3’反向引物5’-CTG GGA AGA ACT CAG CGA AC-3’PCR反应体系基因组DNA 45ng，上下游引物10pmol(20umol/L)，dNTPs 2.0mmol/l，，10×buffer 1.0ul，Gold Taq DNA polymerase 3U，ddH2O补足总体积至10ul.
PCR反应条件95℃预变性10min后；94℃变性30sec，59℃退火45sec，68℃延伸45sec，35个循环周期；最后68℃延伸7min。得到274bp的片段。
酶切条件及体系(15ul)MTHFR C677T位点PCR产物目的片段长度为274bp，总的酶切体系为15ul，其中PCR产物10ul，10×NEBuffer#21.5ul，Hinf I内切酶4U(0.4ul)，和3.1ul ddH2O，37℃过夜。
Hinf I内切酶识别位点为5′...GANTC...3′3′...CTNA▲G...5′(三)基因型测定的结果判定将DNA酶切后的产物点样在2.5％琼脂糖胶上，200V电压下电泳1小时后，在紫外灯下读取胶图并进行基因型分析。个体基因型鉴定如下酶切片段为274bp，MTHFR基因型为677CC野生型；酶切片段为274+228+46bp，MTHFR基因型为677CT杂合型；酶切片段为228+46bp，MTHFR基因型为677TT纯合突变型。
(四)对于含有ACEI类药物的作用效果的预测根据上述步骤(三)的基因型结果，参照与实施例1的步骤(二)预测药效相同的方法，对于含有ACEI类药物的作用效果进行预测。
实施例6测定MTHFR A1298C多态性位点基因型预测含有ACEI类药物作用效果的试剂盒(Taqman方法)(一)试剂盒的组成成分核酸提取试剂，PCR反应试剂，MTHFR基因特异性引物、特异性探针、核酸聚合酶、和阳性对照模板、阴性对照模板，分别分装后组装成的试剂盒。其中阳性对照模板包括MTHFR C677T纯合野生型、杂合型、纯合突变型阳性对照模板；特异性探针为检测MTHFR C677T多态性位点的野生型和突变型探针，本试剂盒中优选为Taqman探针。
(二)检测的步骤(1)按照常规的操作流程，采用与实施例1相似的方法提取宿主细胞的基因组DNA。
(2)使用Taqman方法检测MTHFR基因的1298AC多态性位点基因型(a)用PCR仪扩增MTHFR功能基因多态位点及其侧翼序列，在5ul PCR反应体系中含有基因组DNA 10ng，2.5ul的Taqman 2×Universal PCR Master Mix No AmpErase UNG(组成成份包括AmpliTaq Gold DNA Polymerase，dNTPs with dUTP，PassiveReference，已优化的缓冲液)，及0.72uM的正向引物，0.72uM的反向引物及两段带荧光报告集团的等位基因特异性探针各0.16UuM。
引物序列为正向引物5’GGAGGAGCTGCTGAAGATGTG 3’反向引物5’TGGTTCTCCCGAGAGGTAAAGA 3’等位基因特异性探针的序列为VIC-5’CCAGTGAAGAAAGTGTC 3’-NFQ，对应于“A”等位基因，携带VIC荧光报告集团。
FAM-5’CAGTGAAGCAAGTGTC 3’-NFQ对应于“C”等位基因，携带FAM荧光报告集团。
PCR反应条件95℃10min，1个循环；92℃15s，60℃1min，50个循环。
(三)基因型测定的结果判定在7900型荧光定量PCR仪上检测荧光信息。
将完成PCR反应的PCR板放入7900型荧光定量PCR仪上，选用“Allelic Discrimination”程序，进行扫描与结果的判断发出FAM荧光者的基因型为1298CC纯合子；发出VIC荧光者的基因型为1298AA纯合子；发出两种荧光者的基因型为1298AC杂合子。
(四)对于含有ACEI类药物的作用效果的预测
根据上述步骤(三)的基因型结果，参照与实施例2的步骤(二)预测药效相同的方法，对于含有ACEI类药物的作用效果进行预测。
实施例7测定MTHFR基因的C677T(Ala222Val，dsSNP IDrs1801133)多态性位点基因型并预测含有ACEI类药物对于肝功能的作用效果(一)采取如实施例1(一)中相似的方法测定MTHFR的C677T多态性位点基因型。
(二)预测药效ACEI类药物有肝功能损害的作用。基因型为677CC纯合野生基因型时，预测ACEI类药物肝功能损害的作用强；基因型为677TT纯合突变型时，预测ACEI类药物肝功能损害的用效果弱；基因型为677CT杂合型时，ACEI类药物肝功能损害的作用与677CC纯合野生型或677TT纯合突变型相比差别没有显著性。
联合服用含有ACEI类药物和B族维生素药物，不同的MTHFRC677T基因型个体的肝功能损害的程度不同。基因型为677TT纯合突变基因型时，服用含有ACEI类药物和B族维生素药物没有肝功能损害；677CC野生型个体，服用含有ACEI类药物和B族维生素药物有肝功能损害，二者之间的差别有显著性。
联合服用含有ACEl类药物和B族维生素药物与单用ACEI类药物相比，肝功能损害明显减轻，比较MTHFR C677T的不同基因型的个体，发现不同的基因型个体肝功能损害的减轻程度明显不同，即不同的MTHFR C677T基因型的个体服用含有ACEI类药物和B族维生素药物后的获益不同。基因型为677CC纯合野生基因型时，服用含有ACEI类药物和B族维生素药物的减轻单用ACEI类药物的肝功能损害作用的作用效果强；基因型为677TT纯合突变型时，服用含有ACEI类药物和B族维生素药物减轻单用ACEI类药物的肝功能损害的作用效果弱。
本实施例中，ACEI类药物为依那普利，B族维生素为叶酸。本实施例选用的ACEI类药物还为贝那普利、赖诺普利或者福辛普利。
以上方法通过流行病学研究验证，先将高血压病人按照MTHFRC677T基因型分为三组677CC纯合野生型组、677CT杂合型组和677TT纯合突变型组，分别单独给予依那普利或者联合给予依那普利和叶酸治疗57天，分别测定用药前后的肝功能，观察药物作用效果，结果如下在高血压病人单独服用依那普利后第57天，体内肝功能指标升高，提示ACEI类药物存在肝损害作用。比较677TT纯合突变型个体与677CT杂合型或者677CC野生型个体，发现不同的MTHFR C677T基因型个体服用ACEI类药物的肝功能损害的作用有差别。其中，677CC纯合野生型个体服用ACEI类药物的肝功能损害的作用强，677TT纯合突变型个体服用ACEI类药物的肝功能损害的作用弱，经过多因子校正后的均值差异仍达到统计学显著性水平；而677CT杂合型个体与677CC野生型个体、677TT纯合突变型个体相比，服用ACEI类药物的肝功能损害的作用差别无显著性(见表14、表15、表16)。
联合服用含有ACEI类药物和B族维生素药物，比较MTHFRC677T的不同基因型的个体，发现不同的基因型个体肝功能损害的程度明显不同。基因型为677TT纯合突变型的个体服用含有ACEI类药物和B族维生素，没有肝功能损害；基因型为677CC纯合野生型的个体服用含有ACEI类药物和B族维生素，有肝功能损害，二者之间的差别有显著性。
联合服用含有ACEI类药物和B族维生素药物与单用ACEI类药物相比，肝功能损害明显减轻，比较MTHFR C677T的不同基因型的个体，发现不同的基因型个体肝功能损害的减轻程度明显不同，即不同MTHFR C677T基因型的个体服用含有ACEI类药物和B族维生素药物后的获益不同。基因型为677CC纯合野生基因型时，服用含有ACEI类药物和B族维生素药物的减轻单独服用ACEI类药物的肝功能损害的作用效果强；基因型为677TT纯合突变型时，服用含有ACEI类药物和B族维生素药物减轻单独服用ACEI类药物的肝功能损害的作用效果弱(见表14、表15、表16)。
表14 依那普利对于肝功能的作用效果与MTHFR基因C677T多态性位点的关系
注调整了性别、年龄、BMI、吸烟、饮酒等因素。CC，代表677CC纯合野生型；CT，代表677CT杂合型；TT，代表677TT纯合突变型。
表15 依那普利对于肝功能的作用效果与MTHFR基因C677T多态性位点的关系
注调整了性别、年龄、BMI、吸烟、饮酒等因素。CC，代表677CC纯合野生型；CT，代表677CT杂合型；TT，代表677TT纯合突变型。
表16 依那普利、依那普利+叶酸对于肝功能的作用效果与MTHFR基因C677T多态性位点的关系
注调整了性别、年龄、BMI、吸烟、饮酒等因素。CC，代表677CC纯合野生型；CT，代表677CT杂合型；TT，代表677TT纯合突变型。
将CC基因型和TT基因型个体服药57后ALT的变化值(U/L，D57-D0)进行方差分析，结果为CC基因型和TT基因型个体分别服用依那普利和“依那普利+叶酸”四组的均值之间的方差为F＝5.58，p＝0.004，提示四组之间的差别有显著性；比较CC基因型个体和TT基因型个体服用依那普利和叶酸后与单独服用依那普利相比肝功能损害的均值变化，方差分析结果为F＝4.4，p＝0.03，提示CC基因型个体和TT基因型个体之间服用依那普利和叶酸后降低单独服用依那普利的肝功能损害的作用效果的差别有显著性，CC基因型服用依那普利和叶酸降低单用依那普利的肝功能损害的作用效果强。(表16)采用病例-对照的研究方法，比较MTHFR C677T多态性位点基因型为677CC纯合野生型个体和677TT纯合突变型个体，均服用依那普利降压药，根据服药后与服药前相比的肝功能变化进行分类比较，结果提示不同的基因型个体服用ACEI类药物都出现肝功能的升高，即都出现肝损害。定义将服药后第57天的肝功能水平与服药前的基线肝功能水平相比升高大于或等于15％定义存在肝功能损害，即肝功能损害定义为(ALT57-ALT0)/ALT0≥15％；将服药后第57天的肝功能水平与服药前的基线肝功能水平相比升高小于15％定义无肝功能损害，即无肝功能损害定义为(ALT57-ALT0)/ALT0＜15％。得到如表17的数据。结果提示不同基因型个体服用ACEI类药物后出现肝损害的比例不同，CC纯合野生型个体服用ACEI类药物后更加容易出现肝功能损害，TT纯合突变型个体不容易出现肝功能损害。即MTHFR 677CC野生型时，预测ACEI类药物的肝功能损害作用强；677TT纯合突变型时，预测ACEI类药物的肝功能损害作用弱。
表17 依那普利的肝损害作用与MTHFR基因C677T多态性位点的关系(以服药后第57天ALT升高≥1 5％为肝功能损害标准)
敏感性＝32/46×100％＝69.6％特异性＝34/54×100％＝59.3％PPV＝32/52×100％＝61.5％ NPV＝34/48×100％＝70.8％*卡方值＝2.88，p＝0.09实施例8采用小试生产的试剂盒对于服用含有ACEI类药物的高血压患者的药物作用效果进行预测我们应用小试生产的试剂盒，对服用含有ACEI类药物的高血压患者的MTHFR C677T的多态性位点基因型位点进行检测，同时检测其他生理参数，如年龄、性别、身高、体重、吸烟史、饮酒史、职业、教育程度、基础收缩压、基础舒张压。根据实施例1中步骤(三)提供的预测方程，根据MTHFR C677T多态性位点基因型参数和基本生理参数，按照实施例1中步骤(三)提供的预测方程，计算得到舒张压和收缩压的下降预测值，按照实施例1中提到的疗效判定标准进行降压疗效的预测判定，将得到的预测降压疗效的数据与根据血压的实测值按照上述同样的疗效判定标准得到的降压疗效数据进行比较(结果见表18)。
表18 MTHFR C677T多态性位点对降压效果的预测结果
敏感性＝54/66×100％＝81.8％特异性＝50/78×100％＝64.1％PPV＝54/82×100％＝65.9％ NPV＝50/62×100％＝80.6％由上表可见，测定个体MTHFR C677T的多态性位点基因型，并且同时测定一些个体的生理参数，根据本发明中前述提供的预测方程，通过本发明的试剂盒来预测对于含有ACEI类药物的降压效果的敏感性为81.8％，特异性为64.1％，阳性预测值(PPV)为65.9％，阴性预测值(NPV)为80.6％，有很好的准确性，因此有很高的实际应用价值。
进一步证实，更加同样的方法，测定MTHFR C677T的多态性位点基因型，根据前述的预测方程，通过本发明的试剂盒来预测含有ACEI类药物的作用效果有很高的灵敏度、特异性、PPV和NPV，准确性高，有很高的实际应用价值。
权利要求
1.同型半胱氨酸代谢通路上的关键酶基因MTHFR和/或MTRR的多态性位点基因型用于预测药物组合物之作用效果的用途，其中所述MTHFR的多态性位点基因型至少包含选自C677T和A1298C的多态性位点，所述MTRR的多态性位点基因型至少包含选自C1783T、G66A的多态性位点，其中所述药物组合物为ACEI类药物，所述待预测的药物组合物的作用效果为升高同型半胱氨酸水平以及肝功能损害。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述药物组合物为选自贝那普利、卡托普利、依那普利、西拉普利、培哚普利、地拉普利、喹那普利、赖诺普利、雷米普利、咪达普利、佐芬普利、群多普利和福辛普利的ACEI类药物，优选为依那普利、贝那普利、赖诺普利或福辛普利。
3.如权利要求1所述的用途，其中所述MTHFR的多态性位点基因型还可以包含选自G1793A、G215A、G482A和A1317G的多态性位点，所述MTRR的多态性位点基因型还可以包含选自C524T、T669A、C997G、A1049G、C1243T、C1349G和C1544T的多态性位点，其中，所述的MTHFR或者MTRR的多态性位点还可以进一步包含与其他预测含有血管紧张素转换酶抑制剂类药物作用效果的基因多态性位点存在连锁不平衡的多态性位点，包括无义突变位点、错义突变位点以及位于基因内含子部位、基因调节部位的多态性位点。
4.如权利要求1所述的用途，其中(1)所述MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变基因型和/或多态性位点基因型为1298AA纯合基因型时，预测所述药物组合物升高同型半胱氨酸的作用效果强；所述MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型，和/或多态性位点基因型为1298CC纯合型时，预测所述药物组合物升高同型半胱氨酸的作用效果弱；(2)所述MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型时，预测所述药物组合物的肝功能损害的作用强；所述MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型时，预测所述药物组合物的肝功能损害的作用弱；(3)所述MTRR多态性位点基因型为1783CT杂合型或1783TT纯合型，和/或多态性位点基因型为66GG纯合型时，预测所述药物组合物升高同型半胱氨酸的作用效果强；所述MTRR多态性位点基因型为1783CC纯合型，和/或多态性位点基因型为66AA纯合型或66 AG杂合型时，预测所述药物组合物升高同型半胱氨酸的作用效果弱。
5.同型半胱氨酸代谢通路上的关键酶基因MTHFR和/或MTRR的多态性位点基因型用于预测药物组合物之作用效果的用途，其中所述MTHFR的多态性位点基因型至少包含选自C677T和A1298C多态性位点；所述MTRR的多态性位点基因型至少包含选自C1783T和G66A多态性位点，所述药物组合物含有ACEI类药物和B族维生素，所述待预测的药物组合物的作用效果为降低同型半胱氨酸、减轻肝功能损害、降低血压和/或靶器官保护。
6.如权利要求5所述的用途，其中所述药物组合物含有ACEI类药物和B族维生素，其中所述ACEI类药物选自贝那普利、卡托普利、依那普利、西拉普利、培哚普利、地拉普利、喹那普利、赖诺普利、雷米普利、咪达普利、佐芬普利、群多普利、福辛普利，优选为依那普利、贝那普利、赖诺普利或福辛普利，所述B族维生素选自叶酸及其类似物、维生素B6和维生素B12，优选为叶酸。
7.如权利要求5所述的用途，其中所述MTHFR的多态性位点基因型还可以包含选自G1793A、G215A、G482A和A1317G中的多态性位点，所述MTRR的多态性位点基因型还可以包含选自C524T、T669A、C997G、A1049G、C1243T、C1349G和C1544T中的多态性位点，其中，所述的MTHFR或者MTRR的多态性位点还可以进一步包含与其他预测含有血管紧张素转换酶抑制剂类药物作用效果的基因多态性位点存在连锁不平衡的多态性位点，包括无义突变位点、错义突变位点以及位于基因内含子部位、基因调节部位的多态性位点。
8.如权利要求5所述的用途，其中(1)所述的MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变基因型和/或1298 AA纯合基因型时，预测所述药物组合物降低同型半胱氨酸的作用效果强；所述的MTHFR多态性位点基因型为677CC野生型，和/或多态性位点基因型为1298CC纯合型时，预测所述药物组合物降低同型半胱氨酸的作用效果弱；(2)所述MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生基因型时，预测所述药物组合物减轻单用ACEI类药物所致的肝功能损害的作用效果强；所述MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变基因型时，预测所述药物组合物无肝功能损害；(3)所述的MTRR多态性位点基因型为1783CT杂合型或1783TT纯合型，和/或多态性位点基因型为66GG纯合型时，预测所述药物组合物降低同型半胱氨酸的作用效果强；所述的MTRR多态性位点基因型为1783CC纯合型，和/或多态性位点基因型为66AA纯合型或66AG杂合型时，预测所述药物组合物降低同型半胱氨酸的作用效果弱；(4)所述的MTHFR的多态性位点基因型为677TT纯合突变基因型和/或1298 AA纯合基因型时，预测所述药物组合物降低血压的作用效果强；所述的MTHFR的多态性位点基因型为677CC野生型，和/或多态性位点基因型为1298CC纯合型时，预测所述药物组合物降低血压的作用效果弱；(5)所述的MTRR多态性位点基因型为1783CT杂合型或1783TT纯合型，和/或多态性位点基因型为66GG纯合型时，预测所述药物组合物降低血压的作用效果强；所述的MTRR多态性位点基因型为1783CC纯合型，和/或多态性位点基因型为66AA纯合型或66AG杂合型时，预测所述药物组合物降低血压的作用效果弱；(6)所述的MTHFR的多态性位点基因型为677TT纯合突变基因型和/或1298 CC纯合基因型时，预测所述药物组合物靶器官保护的作用效果强；所述的MTHFR的基因型为677CC野生型，和/或多态性位点基因型为1298AA纯合型时，预测所述药物组合物靶器官保护的作用效果弱；(7)所述的MTRR多态性位点基因型为1783CT杂合型或1783TT纯合型，和/或多态性位点基因型为66GG纯合型时，预测所述药物组合物靶器官保护的作用效果强；所述的MTRR多态性位点基因型为1783CC纯合型，和/或多态性位点基因型为66AA纯合型或66AG杂合型时，预测所述药物组合物靶器官保护的作用效果弱。
9.如权利要求5所述的用途，其中，所述的靶器官保护为肾脏功能保护，预防PTCA术后再狭窄，预防患有或者易于患有动脉硬化、冠状动脉硬化性心脏病、心绞痛、心肌梗死、心力衰竭、外周血管疾病、脑出血、脑梗塞、腔隙性脑梗塞、视网膜动脉硬化并发症。
10.一种用于测定同型半胱氨酸代谢通路上的关键酶基因MTHFR和/或MTRR的多态性位点基因型的多态性分型寡核苷酸，优选地，所述多态性分型寡核苷酸是(1)等位基因特异性核酸引物，它能够检测同型半胱氨酸代谢通路上的关键酶基因MTHFR和/或MTRR的多态性位点基因型，或者(2)用于检测同型半胱氨酸代谢通路上的关键酶基因MTHFR和/或MTRR的多态性位点基因型的寡核苷酸探针，其能特异地与同型半胱氨酸代谢通路上的关键酶基因MTHFR和/或MTRR上的多态性位点的核酸杂交，其中所述MTHFR的多态性位点基因型至少包含选自C677T和A1298C多态性位点，所述MTRR的多态性位点基因型至少包含选自C1783T和G66A多态性位点，优选地，寡核苷酸探针的长度为17-50个核苷酸。
11.如权利要求10所述的多态性分型寡核苷酸，其中所述MTHFR的多态性位点基因型还可以包含选自G1793A、G215A、G482A和A1317G中的多态性位点；所述MTRR的多态性位点基因型还可以包含选自C524T、T669A、C997G、A1049G、C1243T、C1349G和C1544T中的多态性位点。
12.一种利用同型半胱氨酸代谢通路上的关键酶基因MTHFR和/或MTRR的多态性位点基因型预测药物组合物之升高血液中的同型半胱氨酸水平以及肝功能损害的作用效果的方法，其中所述MTHFR的多态性位点基因型至少包含选自C677T和A1298C多态性位点；所述MTRR的多态性位点基因型至少包含选自C1783T和G66A多态性位点，其中所述药物组合物为ACEI类药物，所述方法包括步骤(1)利用权利要求10或11所述的多态性分型寡核苷酸检测来自个体的样品中所述关键酶基因的多态性位点基因型；(2)根据所述多态性位点基因型判定所述药物组合物升高血液中的同型半胱氨酸水平以及肝功能损害的作用效果。
13.权利要求12所述的方法，其中所述所述药物组合物为选自贝那普利、卡托普利、依那普利、西拉普利、培哚普利、地拉普利、喹那普利、赖诺普利、雷米普利、咪达普利、佐芬普利、群多普利和福辛普利的ACEI类药物，优选为依那普利、贝那普利、赖诺普利或福辛普利。
14.如权利要求12所述的方法，其中所述MTHFR的多态性位点基因型还可以包含选自G1793A、G215A、G482A和A1317G中的多态性位点；所述MTRR的多态性位点基因型还可以包含选自C524T、T669A、C997G、A1049G、C1243T、C1349G和C1544T中的多态性位点，其中，所述的MTHFR或者MTRR的多态性位点还可以进一步包含与其他预测含有血管紧张素转换酶抑制剂类药物作用效果的基因多态性位点存在连锁不平衡的多态性位点，包括无义突变位点、错义突变位点以及位于基因内含子部位、基因调节部位的多态性位点。
15.如权利要求12所述的方法，其中(1)所述的MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变基因型和/或者1298AA纯合基因型时，预测所述药物组合物升高同型半胱氨酸的作用效果强；所述的MTHFR多态性位点基因型为677CC野生型，和/或者多态性位点基因型为1298CC纯合型时，预测所述药物组合物升高同型半胱氨酸的作用效果弱；(2)所述MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生基因型，预测所述药物组合物的肝功能损害的作用强；所述MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型时，预测所述药物组合物的肝功能损害的作用弱；(3)所述MTRR的多态性位点基因型为1783CT杂合型或1783 TT纯合型，和/或者多态性位点基因型为66GG纯合型时，预测所述药物组合物升高同型半胱氨酸的作用效果强；所述MTRR的多态性位点基因型为1783CC纯合型，和/或者多态性位点基因型为66AA纯合型或66 AG杂合型时，预测所述药物组合物升高同型半胱氨酸的作用效果弱。
16.一种利用同型半胱氨酸代谢通路上的关键酶基因MTHFR和/或MTRR的多态性位点基因型预测药物组合物之降低同型半胱氨酸的作用效果，减轻肝功能损害的作用效果、降低血压的作用效果和/或靶器官保护的作用效果的方法，其中所述MTHFR的多态性位点基因型至少包含选自C677T和A1298C中的多态性位点；所述MTRR的多态性位点基因型至少包含选自C1783T和G66A中的多态性位点，所述药物组合物含有ACEI类药物和B族维生素，所述方法包括步骤(1)利用权利要求10或11所述的多态性分型寡核苷酸检测个体的生物样品中所述关键酶基因的多态性位点基因型；(2)根据所述多态性位点基因型判定所述药物组合物降低同型半胱氨酸的作用效果，减轻肝功能损害的作用效果、降低血压的作用效果和/或靶器官保护的作用效果。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述ACEI类药物选自贝那普利、卡托普利、依那普利、西拉普利、培哚普利、地拉普利、喹那普利、赖诺普利、雷米普利、咪达普利、佐芬普利、群多普利和福辛普利，优选为依那普利、贝那普利、赖诺普利或福辛普利，所述B族维生素选自叶酸及其类似物、维生素B6和维生素B12，优选为叶酸。
18.如权利要求16所述的方法，其中所述MTHFR的多态性位点基因型还可以包含选自G1793A、G215A、G482A和A1317G中的多态性位点；所述MTRR的多态性位点基因型还可以包含选自C524T、T669A、C997G、A1049G、C1243T、C1349G和C1544T中的多态性位点，其中，所述的MTHFR或者MTRR的多态性位点还可以进一步包含与其他预测含有血管紧张素转换酶抑制剂类药物作用效果效果的基因多态性位点存在连锁不平衡的多态性位点，包括无义突变位点、错义突变位点以及位于基因内含子部位、基因调节部位的多态性位点。
19.如权利要求16所述的方法，其中(1)所述的MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变基因型和/或1298 AA纯合基因型时，预测所述药物组合物降低同型半胱氨酸的作用效果强；所述的MTHFR多态性位点基因型为677CC野生型，和/或多态性位点基因型为1298CC纯合型时，预测所述药物组合物降低同型半胱氨酸的作用效果弱；(2)所述MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生基因型时，预测所述药物组合物减轻单用ACEI类药物所致的肝功能损害的作用效果强；所述MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变基因型时，预测所述药物组合物无肝功能损害；(3)所述的MTRR多态性位点基因型为1783CT杂合型或1783TT纯合型，和/或多态性位点基因型为66GG纯合型时，预测所述药物组合物降低同型半胱氨酸的作用效果强；所述的MTRR多态性位点基因型为1783CC纯合型，和/或多态性位点基因型为66AA纯合型或66AG杂合型时，预测所述药物组合物降低同型半胱氨酸的作用效果弱；(4)所述的MTHFR的多态性位点基因型为677TT纯合突变基因型和/或1298AA纯合基因型时，预测所述药物组合物降低血压的作用效果强；所述的MTHFR的多态性位点基因型为677CC野生型，和/或多态性位点基因型为1298CC纯合型时，预测所述药物组合物降低血压的作用效果弱；(5)所述的MTRR多态性位点基因型为1783CT杂合型或1783TT纯合型，和/或多态性位点基因型为66GG纯合型时，预测所述药物组合物降低血压的作用效果强；所述的MTRR多态性位点基因型为1783CC纯合型，和/或多态性位点基因型为66AA纯合型或66AG杂合型时，预测所述药物组合物降低血压的作用效果弱；(6)所述的MTHFR的多态性位点基因型为677TT纯合突变基因型和/或1298CC纯合基因型时，预测所述药物组合物靶器官保护的作用效果强；所述的MTHFR的基因型为677CC野生型，和/或多态性位点基因型为1298AA纯合型时，预测所述药物组合物靶器官保护的作用效果弱；(7)所述的MTRR多态性位点基因型为1783CT杂合型或1783TT纯合型，和/或多态性位点基因型为66GG纯合型时，预测所述药物组合物靶器官保护的作用效果强；所述的MTRR多态性位点基因型为1783CC纯合型，和/或多态性位点基因型为66AA纯合型或66AG杂合型时，预测所述药物组合物靶器官保护的作用效果弱。
20.如权利要求16所述的方法，其中，所述的靶器官保护为肾脏功能保护，预防PTCA术后再狭窄，预防动脉硬化、冠状动脉硬化性心脏病、心绞痛、心肌梗死、心力衰竭、外周血管疾病、脑出血、脑梗塞、腔隙性脑梗塞、视网膜动脉硬化并发症。
21.如权利要求12或16所述的方法，其中使用包括选自以下的差异核酸分析技术聚合酶链反应、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析、PCR-等位基因特异性寡核苷酸探针法、PCR-序列特异寡核苷酸法、序列测定、PCR-序列特异性引物法、PCR-荧光法、PCR指纹图法、寡核苷酸连接分析、荧光能量共振转移的检测法、生物芯片、核酸芯片、质谱技术、基因扫描、单链构象多态性、变性梯度凝胶电泳、酶或化学错配切割法、和Taqman生物检测方法。
22.如权利要求12或16所述的方法，其中所述的生物样品选自外周血细胞、白细胞、血清等的血液样品，尿样、唾液等体液样品，口腔粘膜试子、毛发、皮肤、活检组织等组织样品，组织样分泌物、排泄物样本，培养细胞，优选的，所述样品为血液样品，任选的，所述样品可以预先进行纯化，包括分离总核酸。
23.一种利用同型半胱氨酸代谢通路上的关键酶基因MTHFR和/或MTRR的多态性位点基因型用于预测药物组合物之作用效果的试剂盒，其中所述MTHFR的多态性位点基因型至少包含选自C677T和A1298C多态性位点；所述MTRR的多态性位点基因型至少包含选自C1783T和G66A多态性位点，其中所述药物组合物为ACEI类药物，所述待预测的药物组合物的作用效果为升高血液中的同型半胱氨酸水平以及肝功能损害，所述试剂盒包含至少一种如权利要求10或11中任一项所述的多态性分型寡核苷酸，以及，任选的，用于检测反应的合适的缓冲体系和显色体系。
24.如权利要求23所述的试剂盒，其中所述药物组合物为含有选自贝那普利、卡托普利、依那普利、西拉普利、培哚普利、地拉普利、喹那普利、赖诺普利、雷米普利、咪达普利、佐芬普利、群多普利和福辛普利的ACEI类药物的药物组合物，优选为依那普利、贝那普利、赖诺普利或福辛普利。
25.如权利要求23所述的试剂盒，其中所述MTHFR的多态性位点基因型还可以包含选自G1793A、G215A、G482A和A1317G中的多态性位点；所述MTRR的多态性位点基因型还可以包含选自C524T、T669A、C997G、A1049G、C1243T、C1349G和C1544T中的多态性位点，其中，所述的MTHFR或者MTRR的多态性位点还可以进一步包含与其他预测含有血管紧张素转换酶抑制剂类药物作用效果的基因多态性位点存在连锁不平衡的多态性位点，包括无义突变位点、错义突变位点以及位于基因内含子部位、基因调节部位的多态性位点。
26.如权利要求23所述的试剂盒，其中(1)所述的MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变基因型和/或1298AA纯合基因型时，预测所述药物组合物升高同型半胱氨酸的作用效果强；所述的MTHFR多态性位点基因型为677CC野生型，和/或多态性位点基因型为1298CC纯合型时，预测所述药物组合物升高同型半胱氨酸的作用效果效果弱；(2)所述MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生基因型，预测所述药物组合物的肝功能损害的作用强；所述MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变基因型时，预测所述药物组合物的肝功能损害的作用弱；(3)所述的MTRR多态性位点基因型为1783CT杂合型或1783TT纯合型，和/或多态性位点基因型为66GG纯合型时，预测所述药物组合物升高同型半胱氨酸的作用效果强；所述的MTRR多态性位点基因型为1783CC纯合型，和/或多态性位点基因型为66AA纯合型或66AG杂合型时，预测所述药物组合物升高同型半胱氨酸的作用效果效果弱。
27.一种利用同型半胱氨酸代谢通路上的关键酶基因MTHFR和/或MTRR的多态性位点基因型预测药物组合物之作用效果的试剂盒，其中所述MTHFR的多态性位点基因型至少包含选自C677T和A1298C多态性位点；所述MTRR的多态性位点基因型至少包含选自C1783T和G66A多态性位点，所述药物组合物含有ACEI类药物和B族维生素，所述待预测的药物组合物的作用效果为降低同型半胱氨酸、减轻肝功能损害、降低血压和/或靶器官保护，所述试剂盒包含至少一种权利要求10或11中任一项的多态性分型寡核苷酸，以及，任选的，用于检测反应的合适的缓冲体系和显色体系。
28.如权利要求27所述的试剂盒，其中所述药物组合物含有ACEI类药物和B族维生素，其中所述ACEI类药物选自贝那普利、卡托普利、依那普利、西拉普利、培哚普利、地拉普利、喹那普利、赖诺普利、雷米普利、咪达普利、佐芬普利、群多普利和福辛普利，优选为依那普利、贝那普利、赖诺普利或福辛普利，所述B族维生素选自叶酸及其类似物、维生素B6和维生素B12，优选为叶酸。
29.如权利要求27所述的试剂盒，其中所述MTHFR的多态性位点基因型还可以包含选自G1793A、G215A、G482A和A1317G中的多态性位点；所述MTRR的多态性位点基因型还可以包含选自C524T、T669A、C997G、A1049G、C1243T、C1349G和C1544T中的态性位点，其中，所述的MTHFR或者MTRR的多态性位点还可以进一步包含与其他预测含有血管紧张素转换酶抑制剂类药物作用效果的基因多态性位点存在连锁不平衡的多态性位点，包括无义突变位点、错义突变位点以及位于基因内含子部位、基因调节部位的多态性位点。
30.如权利要求27所述的试剂盒，其中(1)所述的MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变基因型和/或1298AA纯合基因型时，预测所述药物组合物降低同型半胱氨酸的作用效果强；所述的MTHFR多态性位点基因型为677CC野生型，和/或多态性位点基因型为1298CC纯合型时，预测所述药物组合物降低同型半胱氨酸的作用效果弱；(2)所述MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生基因型时，预测所述药物组合物减轻单用ACEI类药物所致的肝功能损害的作用效果强；所述MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变基因型时，预测所述药物组合物无肝功能损害；(3)所述的MTRR多态性位点基因型为1783CT杂合型或1783TT纯合型，和/或多态性位点基因型为66GG纯合型时，预测所述药物组合物降低同型半胱氨酸的作用效果强；所述的MTRR多态性位点基因型为1783CC纯合型，和/或多态性位点基因型为66AA纯合型或66AG杂合型时，预测所述药物组合物降低同型半胱氨酸的作用效果弱；(4)所述的MTHFR的多态性位点基因型为677TT纯合突变基因型和/或1298AA纯合基因型时，预测所述药物组合物降低血压的作用效果强；所述的MTHFR的多态性位点基因型为677CC野生型，和/或多态性位点基因型为1298CC纯合型时，预测所述药物组合物降低血压的作用效果弱；(5)所述的MTRR多态性位点基因型为1783CT杂合型或1783TT纯合型，和/或多态性位点基因型为66GG纯合型时，预测所述药物组合物降低血压的作用效果强；所述的MTRR多态性位点基因型为1783CC纯合型，和/或多态性位点基因型为66AA纯合型或66AG杂合型时，预测所述药物组合物降低血压的作用效果弱；(6)所述的MTHFR的多态性位点基因型为677TT纯合突变基因型和/或1298CC纯合基因型时，预测所述药物组合物靶器官保护的作用效果强；所述的MTHFR的基因型为677CC野生型，和/或多态性位点基因型1298AA纯合型时，预测所述药物组合物靶器官保护的作用效果弱；(7)所述的MTRR多态性位点基因型为1783CT杂合型或1783TT纯合型，和/或多态性位点基因型为66GG纯合型时，预测所述药物组合物靶器官保护的作用效果强；所述的MTRR多态性位点基因型为1783CC纯合型，和/或多态性位点基因型为66AA纯合型或66AG杂合型时，预测所述药物组合物靶器官保护的作用效果弱。
31.如权利要求27所述的试剂盒，其中，所述的靶器官保护为肾脏功能保护，预防PTCA术后再狭窄，预防动脉硬化、冠状动脉硬化性心脏病、心绞痛、心肌梗死、心力衰竭、外周血管疾病、脑出血、脑梗塞、腔隙性脑梗塞、视网膜动脉硬化并发症。
32.一种基因芯片，其中包含如权利要求10或11所述的用于测定同型半胱氨酸代谢通路上的关键酶基因MTHFR和/或MTRR的多态性位点基因型的多态性分型寡核苷酸。
全文摘要
本发明涉及同型半胱氨酸代谢通路上的关键酶基因的多态性位点基因型用于预测血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)类药物的作用效果的用途，用于测定同型半胱氨酸代谢通路上的关键酶基因多态性位点基因型的多态性分型寡核苷酸，通过测定同型半胱氨酸代谢通路上的关键酶基因的多态性位点基因型，预测含有ACEI类药物的作用效果的方法和试剂盒。
文档编号C12Q1/68GK1982471SQ200510130528
公开日2007年6月20日 申请日期2005年12月14日 优先权日2005年12月14日
发明者徐希平, 戴成祥, 邢厚恂, 王燕, 毛广运, 蒋善群, 张善春, 王玉 申请人:北京华安佛医药研究中心有限公司, 安徽省生物医学研究所