生长素释放肽－载体偶联物的制作方法

专利名称：生长素释放肽－载体偶联物的制作方法
背景技术：
发明领域本发明涉及分子生物学、病毒学、免疫学和医学领域。本发明提供包含VLP和与其连接的来源于生长素释放肽(ghrelin)的特定肽的修饰病毒样颗粒(VLP)。
本发明还提供用于制备这种修饰的VLP的方法。本发明的修饰VLP用于生产治疗肥胖症和其他与摄食增加或体重增加有关的疾病，并且有效诱导免疫应答，特别是抗体应答的疫苗。此外本发明的组合物对于在所述范围内有效诱导自身特异性免疫应答尤其有用。
相关技术肥胖症是困扰全世界上百万人的一种疾病。有很多因子调控饥饿和进食行为，包括瘦素(leptin)、生长激素(GH)、神经肽Y(NPY)、野灰蛋白相关蛋白(AGRP)等。最近确认的进食行为的一种关键调节因子是生长素释放肽，它是在胃和脑的一些部分(下丘脑)中产生的酰化肽(Kojima et al.，Nature 402656-660(1999))。生长素释放肽由包含117个氨基酸的前蛋白原(prepro)形式酶促切割产生，获得在第3位丝氨酸处n-辛酰化的28个氨基酸长的肽。有生物学活性的生长素释放肽需要在这个位点上n-辛酰化。已经鉴定出生长素释放肽的第二个27个氨基酸的同种型(生长素释放肽-desQ14)，它在位点14处缺少谷氨酰胺(Q)，但是这个同种型只代表循环生长素释放肽的次要组分。类似于全长的生长素释放肽，生长素释放肽-des-Q14的生物活性依赖于第3位丝氨酸上的n-辛酰基。然而，最主要的功能活性是来自28个氨基酸的生长素释放肽同种型(Hosoda et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.279(3)909-913(2000))。生长素释放肽是高度保守的，因为人和大鼠的生长素释放肽只相差2个氨基酸。
生长素释放肽的受体(GHS-R)在脑的多个区域中表达，包括下丘脑的弓状核(Arc)和腹内侧核，以及脑垂体(Howard et al.，Science 273974-977(1996))；McKee et al.，Mol Endokrin.11415-423(1997)；Guan etal.，Mol Brain Research 4823-29(1997))，这表明生长素释放肽主要在脑中发挥作用。除了刺激GH从脑垂体释放外(Kojima et al.，Nature 402656-660(1999))，最近已经证实生长素释放肽是摄食的关键中心调节因子(Nakazato et al.，Nature 409194-198(2001))。具体地，在脑室内应用后，生长素释放肽显示刺激摄食。而且，抗-生长素释放肽抗体的脑室内应用抑制摄食。生长素释放肽注射诱导NPY释放的上调，抗-NPY抗体和AGRP拮抗体阻断生长素释放肽诱导的摄食，表明生长素释放肽通过增强NPY和AGRP的表达来调节进食(Nakazato et al.，Nature 409194-198(2001))。此外，每天外周施用生长素释放肽引起小鼠和大鼠体重增加，并且在禁食的大鼠中，血清生长素释放肽浓度提高，而在进食后降低，这进一步提示生长素释放肽在调控进食中起着关键的作用(Tschop et al.，Nature 407908-912)。在Arc中表达反义GHS-R RNA的转基因大鼠表现出较轻的体重和较少的脂肪组织，支持了生长素释放肽调节体重的观点(Shuto et al.，JCI 1091429-1436(2002))。也有生长素释放肽在人类进食行为中起关键作用的证据。对人外周施用生长素释放肽增进人的食欲并且增加食物摄取(Wren et al.，J Clin Endocrinol Metab865992-5998(2001))。普拉德-威利综合症是人类综合性肥胖症的最普遍形式，其患者显示生长素释放肽水平的高度增加(Cummings et al.，NatMed 8643-644(2002))。而且，在节食引起的体重减轻后人血浆的生长素释放肽水平剧烈增加，这与人们停止节食后体重迅速反弹相关。相比之下，在行胃旁路手术的患者中，在禁食期间及禁食之后，生长素释放肽水平保持较低，并且该患者在这些条件下，通常并不恢复其体重(Cummings et al.，N EnglJ Med 211623-1630(2002))。因此看来生长素释放肽是人类食物摄取和体重的关键调控因子。
既然生长素释放肽的外周给药能够增加食物摄取而导致体重增加(Tschop et al.，Nature 407908-912)，很可能是胃里产生的生长素释放肽通过血流到达脑部并触发进食。因此可能通过阻断生长素释放肽从血液到大脑的迁移来阻止动物和人类的食物摄取。已经显示特异性抗体能够阻断生长素释放肽在脑中的作用(Nakazato et al.，Nature 409194-198(2001))，很可能外周的抗体也将能够阻断外周生长素释放肽的作用。此外，由于抗体不能穿过血脑屏障，生长素释放肽-特异性抗体也许能够使生长素释放肽与脑隔离，而不会对大脑内的生长素释放肽产生作用。由于生长素释放肽也能在脑中产生，其中该生长素释放肽可能发挥不同于调节食物摄取的功能，这将是一个非常吸引人的可能性(Nakazato et al.，Nature 409194-198(2001))。因此，对肥胖症的一种可能的治疗方法是在宿主中诱导生长素释放肽特异性抗体，引起类似于在胃旁路患者中所观察到的长期的生长素释放肽阻断闭塞，从而使得食物摄取减少。
WO98/42840公开了生长素释放肽和来源于生长素释放肽的片段对胃肠道的作用，特别是其对胃动力和胃排空的影响。此外，US 6,420,521公开了短生长素释放肽用于影响包括胃排空、胃收缩和葡萄糖吸收在内的胃功能的用途。
WO 02/056905公开了包括有序和重复的抗原或抗原决定簇阵列的组合物。该有序和重复的抗原或抗原决定簇用于生产治疗传染病、治疗变态反应的疫苗，并且作为药物疫苗来预防或治疗癌症，以及有效诱导自体特异性免疫应答，特别是抗体应答。
发明概述我们已经发现，结合到具有内在重复组织的结构的核心颗粒上，特别是分别结合到病毒样颗粒(VLP)和VLP亚基上的特定生长素释放肽-肽，尤其当形成高度有序和重复的偶联物时，呈现出诱导特异性抗体的强免疫原性。我们发现来源于生长素释放肽N-末端，例如1-6、1-7或1-8，特别是1-8且偶联于VLP的短肽能够诱导针对天然形式的生长素释放肽的强烈抗体应答。这令人惊讶，因为天然的生长素释放肽在第三位被辛酰基残基修饰，而预期将阻止生长素释放肽该区域的特异性抗体的结合。这是特别不可能和令人惊异的结果，因为抗体一般识别蛋白质上大小约为7-10个氨基酸的表位。因此预期＜10个氨基酸的肽不可能诱导有效识别在第三位具有辛酰基修饰的天然生长素释放肽的抗体。这个发现具有很大的治疗学重要性，因为针对偶联于VLP的长生长素释放肽-肽(＞8-12)接种可导致可能引起自身免疫疾病的生长素释放肽特异的T细胞应答。例如肽1-6、1-7或肽1-8的短肽，极不可能被T细胞识别，由此同样不可能诱导有害的T细胞应答(参见Bachmann和Dyer，NatureReviews，Vol.3，January 2004中的参考文献39)。实际上，肽1-7太短而不能结合MHC分子，肽1-8太短而不能结合MHC II类分子，因此不能诱导这种T细胞应答。这样，我们发现偶联于VLP的肽1-6、肽1-7，和肽1-8构成安全的疫苗，该疫苗具有诱导与天然生长素释放肽交叉反应的强抗体应答的惊人能力。此外，偶联于VLP的生长素释放肽-肽能够减少体重增加。而且，我们发现令人惊讶的是，通过其C-末端偶联于病毒样颗粒的生长素释放肽-肽比通过其N-末端偶联于VLP的生长素释放肽-肽，能更有效地减少体重增加。由此，针对N-末端的抗体，出乎意料地比针对C-末端的抗体更为有效。因此本发明提供用于治疗肥胖症和相关疾病的预防和治疗方法，该方法是以结合于核心颗粒的生长素释放肽-来源的特定短肽，特别是以VLP-生长素释放肽-肽-偶联物以及特别是有序且重复的阵列为基础。这些预防和治疗性组合物能够在被接种的动物或人体中诱导高效价的抗-生长素释放肽抗体。因此，本发明涉及生长素释放肽及其脑相关特性。而且本发明涉及生长素释放肽在脑中的重要作用，尤其重要的是食欲调控、生长激素分泌，和能量动态平衡。已经观察到由我们的疫苗接种策略诱导的抗体还能够结合n-辛酰化形式的生长素释放肽。正如所指出的，当偶联于核心颗粒时，较短的生长素释放肽-肽也能够使用，并且备选地与佐剂一起给药，用于在人和动物体内诱导生长素释放肽特异性抗体。但是，优选没有T细胞应答诱导佐剂的给药。因此，这2个不同的制剂(具有佐剂(+)/没有(-)佐剂)允许在混合的T/B-细胞应答(+)和只有B-细胞应答(-)的诱导之间进行选择。
因此，通过C-或N-末端，优选通过其C末端分别偶联于核心颗粒或病毒样颗粒的生长素释放肽的短肽片段，特别是由残基1-5、1-6(SEQID NO1)、1-7(SEQ ID NO2)和1-8(SEQ ID NO3)，特别是1-6(SEQID NO1)和1-8(SEQ ID NO3)组成的短肽，能够诱导高度特异性的抗-生长素释放肽抗体。优选这种抗体能够在外周循环生长素释放肽进入CNS，并且对生长激素发挥作用而由此影响食物摄取之前中和它们。
因此在本发明的优选实施方案中，生长素释放肽-肽选自相应于SEQ ID NO72至74中所示序列中任何序列的第24-29、24-30和24-31位残基的生长素释放肽-肽，其中所述优选的生长素释放肽-肽片段选自(a)人生长素释放肽；(b)牛生长素释放肽；(c)绵羊生长素释放肽；(d)狗生长素释放肽；(e)猫生长素释放肽；(f)小鼠生长素释放肽；(g)猪生长素释放肽；和(h)马生长素释放肽。
更具体地，本发明的修饰的VLP能够诱导令人惊讶地识别此处所示的，特别是在实施例11中的n-辛酰基化形式的生长素释放肽的高水平抗体。而且，产生的抗体也识别另外一种同种型，生长素释放肽-desQ14。结果是，用以C-或N-末端连接至核心颗粒，或优选VLP的生长素释放肽-肽接种产生的抗体在小鼠中能够优选通过阻断n-辛酰基化的生长素释放肽进入大脑而在体内干扰生长素释放肽的功能，并调节食物摄取。因此，本发明专注于针对生长素释放肽的接种策略来治疗肥胖症和其他相关疾病。
正如在此，以及特别是在实施例12中所显示的，用以C-或N-末端连接，特别是以C-末端连接至核心颗粒或优选VLP的生长素释放肽-肽接种，在小鼠中导致较少的体重增长。因此，分别靶向生长素释放肽和生理学上的生长素释放肽-来源肽的本发明的疫苗和/或通过本发明的疫苗诱导的抗体，是用于肥胖症和其他相关疾病的潜在治疗剂。
由此，本发明也提供组合物，其包含(a)具有至少一个第一附着位点的核心颗粒；和(b)具有至少一个第二附着位点的至少一个抗原或抗原决定簇，其中所述的抗原或抗原决定簇是本发明的生长素释放肽-肽，并且其中所述的第二附着位点选自(i)所述抗原或抗原决定簇非天然存在的附着位点；以及(ii)所述的抗原或抗原决定簇天然存在的附着位点，其中所述的第二附着位点能够与所述的第一附着位点连接；并且其中所述的抗原或抗原决定簇和所述的核心颗粒通过所述的连接相互作用，优选形成有序重复的抗原阵列。适用于本发明核心颗粒的优选实施方案是病毒、病毒样颗粒、噬菌体、RNA噬菌体的病毒样颗粒、细菌的菌毛或鞭毛或具有内在重复结构的任何其他颗粒，优选能够形成本发明所述的有序重复的抗原阵列的重复结构。
更具体地，本发明提供包括病毒样颗粒和至少一个与其结合的本发明生长素释放肽-肽的修饰的VLP。由此，在另一方面，本发明提供修饰的病毒样的颗粒(VLP)，其包括病毒样颗粒(VLP)和至少一个来源于多肽生长素释放肽的肽(生长素释放肽-肽)，其中所述的生长素释放肽-肽由长度为6或8个氨基酸残基的肽组成，该肽与SEQ ID NO1或SEQ ID NO3同源或相同，并且其中所述VLP和本发明所述的生长素释放肽-肽彼此相连。在某些优选实施方案中，本发明的VLP和至少一个生长素释放肽-肽的连接是通过至少一个共价键，优选通过至少一个非肽键，以及更优选仅通过非肽键连接。
本发明还提供用于生产本发明的修饰的VLP的方法。本发明的修饰的VLP和组合物用于生产治疗肥胖症和相关疾病的疫苗，以及作为药物用于预防或治疗肥胖症和相关疾病，也用于有效诱导免疫应答，特别是抗体应答。此外，本发明的修饰的VLP和组合物对于有效诱导所述范围内的自体特异性免疫应答特别有用。
在本发明中，本发明的生长素释放肽-肽分别结合于核心颗粒和VLP，优选以定向方式结合，更优选产生有序重复的生长素释放肽-肽抗原阵列。而且，该核心颗粒和VLP的高度重复和有组织的结构，能够分别介导生长素释放肽-肽以高度有序重复的方式展示，而在那些优选的情形中产生高度有组织且重复的抗原阵列。此外，不受任何理论约束，本发明的生长素释放肽-肽与核心颗粒和VLP的分别结合，可通过提供T辅助细胞表位而发挥作用，因为核心颗粒和VLP对于分别用核心颗粒-生长素释放肽-肽阵列和VLP-生长素释放肽-肽阵列免疫的宿主是外源的。优选的阵列与现有技术中的偶联物不同，特别是在其高度组织化的结构、尺寸，以及阵列表面上抗原的重复性方面。
在本发明的一个方面中，本发明的生长素释放肽-肽在适宜的表达宿主中表达，或合成，而核心颗粒和VLP分别表达和纯化自适宜该核心颗粒和VLP各自折叠和组装的表达宿主。本发明的生长素释放肽-肽可以是化学合成的。由于生物活化的生长素释放肽在第3位包含n-辛酰基化的丝氨酸，化学合成是生产用于包含辛酰基化形式的生长素释放肽-肽的这种疫苗制剂的修饰生长素释放肽-肽的优选方法。之后通过使本发明的生长素释放肽-肽分别结合核心颗粒和VLP，组装成本发明的生长素释放肽阵列。
在进一步的方面，本发明提供组合物和药物组合物，其包括(a)修饰的核心颗粒，而在药物组合物的情况下，特别是修饰的VLP，以及(b)可接受的药物载体。
在进一步的方面，本发明提供药物组合物，优选疫苗组合物，其包括(a)病毒样颗粒；和(b)至少一个本发明的生长素释放肽-肽；并且其中所述的本发明的生长素释放肽-肽与所述的病毒样颗粒连接。
在更进一步的方面，本发明提供生产本发明的修饰的VLP的方法，包括(a)提供病毒样颗粒；和(b)提供至少一个本发明的生长素释放肽-肽；(c)特别是在适宜于介导VLP和生长素释放肽-肽之间连接的条件下，使所述病毒样颗粒和本发明所述的生长素释放肽-肽结合，使得所述的生长素释放肽-肽结合至所述的病毒样颗粒。
类似地，本发明提供生产本发明的修饰的核心颗粒的方法，包括(a)提供具有至少一个第一附着位点的核心颗粒；(b)提供具有至少一个附着位点(进一步称为“第二附着位点”)的至少一个本发明的生长素释放肽-肽，其中所述的第二附着位点选自(i)本发明所述的生长素释放肽-肽非天然存在的附着位点，和(ii)在本发明所述的生长素释放肽-肽内天然存在的附着位点；且其中所述的第二附着位点能够与所述的第一附着位点连接；以及(c)使所述核心颗粒和本发明所述的至少一个生长素释放肽-肽结合，其中本发明所述的生长素释放肽-肽和所述的核心颗粒通过所述的连接而相互作用，优选形成有序重复的抗原阵列。
另一方面，本发明提供免疫方法，包括将本发明的修饰的VLP、组合物或药物组合物施用于动物或人。
在进一步的方面，本发明提供本发明的修饰的VLP、组合物或药物组合物用于制造治疗肥胖症或相关疾病的药物的用途。
另一方面，本发明提供本发明的修饰的VLP、组合物或药物组合物用于制备治疗或预防肥胖症或相关疾病的药物的用途。此外，在更进一步的方面，本发明提供本发明的修饰的VLP、组合物或药物组合物单独或与其他试剂组合使用，来制造用于治疗或预防肥胖症或相关疾病，和/或刺激哺乳动物免疫系统的组合物、疫苗、药物或医药制剂的用途。
由此，本发明特别提供适用于预防和/或减轻或治疗肥胖症或相关状况的疫苗组合物。本发明进一步提供分别用于在动物，特别是诸如猫或狗等宠物以及人类中预防和/或减轻或治疗肥胖症或相关状况的免疫和疫苗接种方法。可预防性或治疗性地使用本发明的组合物。
在具体的实施方案中，本发明提供用于预防、治疗和/或缓解由“自体”基因产物，即此处所使用的“自身抗原”所引起或加剧的肥胖症或相关状况的方法。在相关的实施方案中，本发明提供分别用于在动物和人个体中诱导免疫应答的方法，其导致产生预防、治疗和/或缓解由“自体”基因产物引发或加剧的肥胖症或相关状况的抗体。
如本领域的普通技术人员所理解的，当本发明的组合物被施用于动物或人时，其可以是含有盐、缓冲液、佐剂或其他为改善该组合物效力所需要的物质的组合物。适用于制备该药物组合物的材料的实例在包括Remington′s Pharmaceutical Sciences(Osol，A编著，Mack Publishing Co.(1990))的许多资源中有提供。
如果接受个体能够耐受本发明的组合物的施用，则称该组合物为“药物理学可接受的”。进一步的，本发明的组合物将以“治疗有效量”(即，产生所需要的生理学效果的量)施用。
本发明的组合物可以本领域已知的多种方法来给药，但通常通过注射、输液、吸入、口服或其他适合的生理学方法来给药。该组合物也可进行肌内、静脉、或皮下给药。用于给药的组合物的成分包括含灭菌水(例如，生理盐水)或非含水的溶液和悬浮液。非含水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄榄油，和可注射的有机酯，例如油酸乙酯。载体或封闭包裹剂可用于增加皮肤渗透性并增强抗原的吸收。
就本领域已知的、本发明下列的说明书和权利要求书范围而言，本发明的其他实施方案对普通技术人员来说是显而易见的。
附图简述

图1显示来自生长素释放肽24-31GC或生长素释放肽24-31C偶联至QβVLP的反应的偶联产物的SDS-PAGE。泳道1是分子量标准，泳道2显示衍生化的QβVLP，泳道3显示可溶性级分中的Qβ-生长素释放肽24-31GC，泳道4显示可溶性级分中的Qβ24-31C。
图2显示先前已经用Qβ-生长素释放肽24-31GC或作为对照的QβVLP免疫，再用I125-生长素释放肽静脉攻击30分钟后的小鼠血清(图2A)和脑中(图2B)中I125-生长素释放肽的量。数值表示为血清(ng/ml)和脑(ng/g)中I125-生长素释放肽的平均量。已经用脑中存在的血液体积对脑进行校正。误差棒为SEM(平均值的标准误差)。
发明详述除非另有定义，否则此处使用的全部技术和科学的术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管与这里描述相似或相当的任何其他方法和材料也能用于实践或试验本发明，但是优选的方法和材料如下文中所描述。
1.定义佐剂这里使用的“佐剂”是指免疫应答的非特异性刺激物，或是允许在宿主内产生贮库的物质，当其与本发明的疫苗和药物组合物分别混合时，可提供更强的免疫应答。可使用多种佐剂。实例包括完全和不完全弗氏佐剂、氢氧化铝和修饰的胞壁酰二肽。其他佐剂有无机凝胶，例如氢氧化铝，表面活性物质，例如溶血卵磷脂，多聚醇、聚阴离子、肽、油状乳液、匙孔血蓝蛋白、二硝基酚，和潜在可用于人类的佐剂，例如BCG(卡介苗)和小棒杆菌(Corynebacterium parvum)。这些佐剂是本领域已知的。能与本发明的组合物一起施用的其他佐剂包括但不限于，单磷酰酯免疫调节剂、AdjuVax 100a、QS-21、QS-18、CRL1005、铝盐(明矾)、MF-59、OM-174、OM-197、OM-294和病毒体佐剂技术。佐剂也可包括这些物质的混合物。VLP是典型且优选的佐剂。但是，当术语“佐剂”在本申请的上下文中提及时，是指除VLP之外的佐剂。
具有来源于南美树种Quillaja Saponaria Molina树皮的具有佐剂活性的免疫活性皂角苷级分是本领域已知的。例如QS21，也称为QA21，是来自Quillaja Saponaria Molina树的HPLC纯化的级分，并且在美国专利号5,057,540中公开了其生产方法(作为QA21)。Quillaja皂角苷也已经被Scott et al.，Int.Archs.Allergy Appl.Immun.，1985，77，409公开可作为佐剂。单磷酰酯A及其衍生物是本领域已知的。从英国专利号2220211中已知，一种优选的衍生物是3-脱氧酰化的单磷酰酯A。更多优选佐剂在WO00/00462中有描述，其公开的内容在此引入作为参考。
然而，本发明的一个有利特性是本发明的修饰的核心颗粒甚至在没有佐剂情况下的高度免疫原性。正如在此已经概述，或随着本说明书下面将要说明的，在另外的或优选的实施方案中，提供了缺乏佐剂的疫苗和药物组合物，形成缺乏佐剂的用于治疗肥胖症的疫苗和药物组合物，从而具有较高的安全性，因为佐剂可能引发副作用。此处在用于治疗肥胖症的疫苗和药物组合物的上下文中所使用的术语“缺乏”，是指所使用的疫苗和药物组合物基本上没有佐剂，优选不含可检测量的佐剂。
氨基酸接头这里所使用的“氨基酸接头”，或本说明书中也称为“接头”，以第二附着位点连接本发明的生长素释放肽-肽，或更优选，已经包括、包含、或由第二附着位点组成，一般-但并非必须的-为一个氨基酸残基，优选为半胱氨酸残基。然而，即使由氨基酸残基组成的氨基酸接头是本发明的优选实施方案，此处所用的术语“氨基酸接头”并不意味着暗示这种氨基酸接头唯一地由氨基酸残基构成。优选该氨基酸接头的氨基酸残基由本领域众所周知的天然存在的氨基酸或非天然的氨基酸，全部L-或全部D-氨基酸或其混合物组成。然而，本发明内也包括具有巯基或半胱氨酸残基的分子的氨基酸接头。这样的分子优选含有C1-C6烷基、环烷基(C5，C6)、芳基或杂芳基部分。但是除了氨基酸接头外，优选含有C1-C6烷基-、环烷基-(C5，C6)、芳基-或杂芳基部分和缺乏任何氨基酸的接头，也包括在本发明的范围内。本发明的生长素释放肽-肽或任选的第二附着位点和氨基酸接头之间的连接优选通过至少一个共价键，或更优选通过至少一个肽键连接。
动物如这里所使用的术语“动物”是指包括，例如人、绵羊、麋鹿、鹿、黑尾鹿、貂、哺乳动物、猴子、马、牛、猪、山羊、狗、猫、大鼠、小鼠、鸟类、鸡、爬行动物、鱼、昆虫和蜘蛛类动物。优选的动物是哺乳动物。
抗原这里所使用的术语“抗原”是指如果被MHC分子呈递就能够被抗体或T-细胞受体(TCR)结合的分子。这里所使用的术语“抗体”同样包括T-细胞表位。另外抗原能够被免疫系统识别，和/或能够诱导体液免疫反应和/或细胞免疫应答而引起B-和/或T-淋巴细胞的活化。但是至少在某些情况下，这可能需要该抗原包含或连接于Th细胞表位并包含在佐剂中。一个抗原可以有一个或多个表位(B-和T-表位)。上面所指的特异性反应意味着，抗原一般优先与其相应的抗体或TCR以高度选择性的方式反应，而不是与由其他抗原诱导的其他许多抗体或TCR起反应。这里所用的抗原也可能是若干单独抗原的混合物。优选的抗原是短肽(6-8个氨基酸残基)。
抗原决定簇这里所使用的术语“抗原决定簇”是指被B-或T-淋巴细胞特异识别的抗原部分。B-淋巴细胞应答抗原决定簇产生抗体，而T淋巴细胞通过增殖和建立介导细胞和/或体液免疫所需的效应功能来应答抗原决定簇。
连接(association)这里所使用的术语“连接”，当用于第一和第二附着位点时，是指第一和第二附着位点优选通过至少一个非肽键结合。连接的性质可以是共价的、离子的、疏水的、极性的，或其任何组合，优选的连接性质是共价的。但是如这里所使用的术语“连接”，将不仅包括至少一个第一附着位点和至少一个第二附着位点的直接连接，而且另外和优选地包括，至少一个第一附着位点和至少一个第二附着位点通过中间分子，由此一般且优选地通过利用至少一个，优选一个异双功能交联剂间接结合。
第一附着位点此处所使用的，措辞“第一附着位点”是指非天然或天然起源的元件，可以与位于本发明的生长素释放肽-肽上的第二附着位点连接。第一附着位点可以是蛋白质、多肽、氨基酸、肽、糖、多核苷酸、天然或合成的聚合体、次级代谢物或化合物(生物素、荧光素、视黄醇、洋地黄毒苷、金属离子、苯甲基磺酰氟)，或其组合，或其化学反应性基团。第一附着位点一般且优选定位于核心颗粒(例如优选病毒样颗粒)的表面。多个第一附着位点一般以重复的构型分别出现在核心颗粒和病毒样颗粒的表面。
第二附着位点这里所使用的措辞“第二附着位点”是指与本发明的生长素释放肽-肽连接的元件，其可与分别定位于核心颗粒或病毒样颗粒表面上的第一附着位点连接。生长素释放肽-肽的第二附着位点可以是蛋白质、多肽、肽、糖、多核苷酸、天然或合成的聚合体、次级代谢物或化合物(生物素、荧光素、视黄醇、洋地黄毒苷、金属离子、苯甲基磺酰氟)，或其组合，或其化学反应性基团。至少一个第二附着位点存在于本发明的生长素释放肽-肽上。在本发明的特定实施方案中，至少一个第二附着位点可以被添加至本发明的生长素释放肽-肽上。因此，术语“具有至少一个第二附着位点的本发明的生长素释放肽-肽”是指至少包括本发明的生长素释放肽-肽和第二附着位点的本发明的生长素释放肽-肽。然而，特别是对于非天然来源的，即本发明的生长素释放肽-肽内非天然存在的第二附着位点，本发明的这些修饰的生长素释放肽-肽也可包括“氨基酸接头”。
外壳蛋白如这里所使用的，术语“外壳蛋白”是指能够被整合到该噬菌体或RNA噬菌体的衣壳装配体内的噬菌体或RNA噬菌体的蛋白质。但是，当指RNA噬菌体的外壳蛋白基因的特定基因产物时，使用术语“CP”。例如，RNA噬菌体Qβ的外壳蛋白基因的特定基因产物称为“QβCP”，而噬菌体Qβ的“外壳蛋白”包括″QβCP″以及A1蛋白。噬菌体Qβ的衣壳主要由QβCP组成，还有少量的A1蛋白。同样，VLPQβ外壳蛋白主要包含QβCP以及少量的A1蛋白。
核心颗粒这里所使用的术语“核心颗粒”是指具有内在重复组织的刚性结构。这里所使用的核心颗粒可以是合成方法的产物或生物过程的产物。
偶联的这里所使用的术语“偶联的”是指通过共价键或通过强非共价相互作用的附着，一般且优选通过共价键的附着。本领域技术人员常规使用的任何用于生物活性材料偶联的方法都可用于本发明。
有效量此处所使用的术语“有效量”是指实现所需要的生物效果所必须或足够的数量。该组合物的有效量是获得这个选择结果的量，并且此量能够被本领域的技术人员常规确定。例如治疗免疫系统缺陷的有效量可以是引起免疫系统激活的必须用量，其导致当暴露于抗原时产生抗原特异性免疫应答。该术语也与“足量”同义。
用于任何特别应用的有效量可根据下述因素而不同，例如待治疗的疾病或状况、待施用的特定组合物、受试者的大小、和/或疾病或状况的严重程度。本领域的普通技术人员能够凭经验确定本发明的特定组合物的有效量而无需进行不必要的实验。
表位此处所使用的术语“表位”是指在动物，优选哺乳动物，最优选在人类中，具有抗原性或免疫原活性的连续或不连续的多肽部分。表位被抗体识别，或被T细胞通过MHC分子中的其T细胞受体识别。此处所用的“免疫原性表位”被定义为如通过本领域已知的任何方法确定的、在动物中激发抗体应答或诱导T-细胞应答的多肽部分(参见例如，Geysen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 813998-4002(1983))。这里所使用的术语“抗原性表位”定义为如通过本领域已知的任何方法确定的、抗体能够免疫特异地结合其抗原的蛋白质部分。免疫特异结合排除非特异性结合，但不必排除与其他抗原的交叉反应性。抗原性表位不必要是免疫原性的。抗原性表位也可以是T-细胞表位，在这种情况下，其能够通过MHC分子内的T细胞受体而被免疫特异地结合。
一个表位一般包括对该表位为唯一的空间构象的7-10个氨基酸。如果该表位是有机分子，它可能与对硝基苯基一样小。优选的表位是被认为是B-细胞表位的本发明的生长素释放肽-肽。
融合这里所使用的术语“融合”是指不同来源的氨基酸序列通过其编码核苷酸序列的读框内组合而成为一条多肽链的组合。术语“融合”除了与末端之一融合外，还明确包括内部融合，即在多肽链中插入不同来源的序列。
生长素释放肽此处使用的术语“生长素释放肽”是指由生长素释放肽基因所编码的蛋白质。如在此使用的生长素释放肽包括在人、猫、狗和所有驯养动物以及其他动物中已知的所有形式的生长素释放肽。如在此使用的生长素释放肽包括有或没有n-辛酰基修饰的生长素释放肽。而且生长素释放肽也包括存在的生长素释放肽的所有剪接变体。此外，由于不同物种之间生长素释放肽的高度序列同源性(在大鼠和人的生长素释放肽之间之间只有2个氨基酸的交换(Kojima et al.，Nature 402656-660(1999))，与人生长素释放肽具有超过80％同一性，优选超过90％，或更优选超过95％，以及更优选超过99％同一性的生长素释放肽的所有天然变体在此也称为“生长素释放肽”。
这里所使用的术语“生长素释放肽-肽”或“本发明的生长素释放肽-肽”被定义为具有6-8个氨基酸残基长度的肽，该肽与SEQ ID NO1(GSSFLS)、SEQ ID NO2(GSSFLSP)或SEQ ID NO3(GSSFLSPE)同源或相同。同源性肽是这样的肽(i)来源于另一种动物的生长素释放肽，特别是哺乳动物的生长素释放肽，例如猫科或犬科动物的生长素释放肽，并表现与SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO3相应的氨基酸残基；或(ii)与SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO3只有两个位置的差别，优选与SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ IDNO3只有一个位置的差别，这些差别是在特定位置上的氨基酸特性的不同，例如氨基酸的替换、或氨基酸的修饰，例如酰化或糖基化，由此优选替换，更优选保守替换，并且优选所述差异并不是长度上的差异。同源性肽，因此特别是符合(i)的同源性肽，对于技术人员来说通过比对人生长素释放肽和其他动物的所述生长素释放肽是可以进行确认的。这里使用的术语“生长素释放肽-肽”或“本发明的生长素释放肽-肽”优选是指具有6或8个氨基酸残基长度的肽，该肽与SEQ ID NO1(GSSFLS)或SEQ ID NO3(GSSFLSPE)是同源或相同的。符合本发明优选实施方案的同源性肽是这样的肽(i)来源于另一种动物的生长素释放肽，特别是哺乳动物的生长素释放肽，例如猫科或犬科动物的生长素释放肽，并且表现与SEQ ID NO1或SEQ ID NO3相应的那些氨基酸残基。在这种情况下，当本发明的生长素释放肽-肽被包括在更大的范畴中，即融合多肽或具有添加接头肽或附着位点的生长素释放肽-肽时，该生长素释放肽-肽，例如SEQ ID NO1的生长素释放肽-肽优选后面没有脯氨酸残基，并且该生长素释放肽-肽，例如SEQ ID NO3的生长素释放肽-肽，优选后面没有组氨酸残基。可在真核或原核表达系统中通过重组表达来获得生长素释放肽-肽，如单独的生长素释放肽-肽，但优选作为与其他氨基酸或蛋白质的融合体，例如为了促进生长素释放肽-肽的折叠、表达或可溶性，或便于生长素释放肽-肽的纯化。优选生长素释放肽-肽和VLP的亚基蛋白或衣壳之间的融合体。在这种情况下，可将一个或多个氨基酸添加至生长素释放肽-肽的N-或C-末端，但优选生长素释放肽-肽位于融合多肽的N-末端，即通过其自身的C-末端与其融合配偶体偶联或连接。
非常优选地，为了使生长素释放肽-肽能够与VLP或衣壳或核心颗粒的亚基蛋白偶联，可向生长素释放肽-肽添加至少一个第二附着位点。或者该生长素释放肽-肽可利用本领域已知的方法合成，特别是通过有机化学肽合成法合成。这种肽可含有在相应的生长素释放肽-肽上并不存在的氨基酸。该肽可以通过辛酰基化修饰，但是令人惊讶的是这种修饰不是本发明的修饰的VLP、组合物或疫苗诱导有效抗体所必须的。
残基此处所使用的术语“残基”是指多肽骨架或侧链中的特定氨基酸。
免疫应答此处所使用的术语“免疫应答”是指体液免疫应答和/或细胞免疫应答，其引起B-和/或T-淋巴细胞和/或抗原呈递细胞的活化或增殖。但在一些场合下，该免疫应答可能是低强度的，并且只有当根据本发明使用至少一种底物时才可被检测到。“免疫原性的”是指用于刺激活的生物体的免疫系统的试剂，使得免疫系统的一种或多种功增强并针对该免疫原性剂。“增强”免疫应答的物质是指与没有添加该物质时测量的相同免疫应答相比较，添加该物质后观察到免疫应答更剧烈，或强化或以任何方式偏离。例如，利用51Cr释放测定，可测定在免疫过程中使用或不使用该物质所获得的样品中细胞毒性T细胞的溶胞活性，正如Bachmann et al.，(1997)″LCMV-specific CTL responses″，in ImmunologyMethods Manual，Academic Press Ltd中所公开的。与不使用该物质时的CTL溶胞活性相比，CTL溶胞活性增强时该物质的量，被称为增强该动物对抗原的免疫应答的足够量。在优选的实施方案中，免疫应答增强至少大约2倍，更优选大约3倍或以上。分泌的细胞因子的量或类型也可能改变。或者，诱导的抗体的量或其亚类也可能改变。
免疫此处使用的术语“免疫”或“免疫作用”或相关术语，是指赋予对靶抗原或表位产生充分免疫应答(包括抗体和/或细胞免疫，例如效应CTL)的能力。这些术语不要求产生完全免疫，但是产生的免疫应答要比基线足够高。例如，如果在应用本发明方法之后发生针对靶抗原的细胞和/或体液免疫应答，则就可认为哺乳动物针对该靶抗原进行了免疫。
连接的这里所使用的术语“连接的”以及术语“结合的”，在此可等同使用，是指可能是共价的结合或附着，例如，通过化学偶联，或是非共价的，例如，离子相互作用、疏水相互作用、氢键等。共价键可以是例如，酯、醚、磷酯、酰胺、肽、酰亚胺、碳硫键、碳磷键等。这里使用的术语“连接”，并且特别地如果指病毒样颗粒和本发明的至少一个生长素释放肽-肽之间的连接，将不仅包括VLP和本发明生长素释放肽-肽之间的直接连接，而且另外且优选地包括VLP和本发明生长素释放肽-肽之间通过中间分子的间接连接，由此一般且优选使用至少一个，优选一个异双功能交联剂。
天然来源这里所使用的术语“天然来源”是指其全部或部分不是合成的而在自然中存在或在自然中产生的。
非天然这里使用的该术语是指不是来自于自然，更具体地该术语是指来自于人造。
非天然来源这里使用的术语“非天然来源”一般是指合成的或不是来自天然的；更具体地，该术语是指来自于人造。
有序且重复的抗原或抗原决定簇阵列这里使用的术语“有序且重复的抗原或抗原决定簇阵列”，一般是指抗原或抗原决定簇的重复模式，其特征在于该抗原或抗原决定簇分别对于核心颗粒和病毒样颗粒典型且优选地均匀空间排列。在本发明的一个实施方案中，该重复模式可以是几何模式。合适的有序重复的抗原或抗原决定簇阵列的典型且优选的实施例是具有严格重复的类晶体顺序的抗原或抗原决定簇，优选间距1至30纳米，优选2至15纳米，更优选2至10纳米，更优选2至8纳米，以及进一步优选2至7纳米。
菌毛这里所使用的术语“菌毛”是指由蛋白质单体(例如菌毛单体)组成的细菌细胞的细胞外结构，这种结构被组织成有序重复的模式。而且，菌毛是涉及例如细菌细胞与宿主细胞表面受体的附着、细胞间遗传物质交换、和细胞-细胞识别的过程的结构。菌毛的实例包括1型菌毛、P-菌毛、F1C菌毛、S-菌毛、和987P-菌毛。菌毛的其他实例如下所述。
菌毛样结构此处所使用的措辞“菌毛样结构”是指具有类似于菌毛特征并由蛋白质单体组成的结构。“菌毛样结构”的一个实例是由表达修饰菌毛蛋白，但不形成与天然菌毛相同的有序重复阵列的细菌细胞形成的结构。
多肽这里所使用的术语“多肽”是指由单体(氨基酸)通过酰胺键(也称为肽键)线性连接组成的分子。它指氨基酸分子链，而不是指特定长度的产物。因此，肽、二肽、三肽、寡肽和蛋白质包括在多肽的定义内。本发明的优选肽是五肽、六肽、七肽和十肽。为了本发明的目的，多肽由多于十肽的更多氨基酸残基组成。该术语也是指多肽或肽的表达后修饰物，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。重组或衍生的多肽或肽不一定由指定的核酸序列翻译而来。它也可以用任何方式，包括化学合成而产生，化学合成对于肽是优选的方式。
自体抗原这里所使用的术语“自体抗原”是指由宿主的DNA编码的蛋白质，由宿主的DNA编码的蛋白质或RNA产生的产物被定义为自体的。而且，由两个或几个自体分子的组合产生的蛋白质，或代表自体分子的一部分的蛋白质，以及与上述定义的两种自体分子具有高度同源性(＞95％，优选＞97％，更优选＞99％)的蛋白质，也可以被认为是自体的。
治疗这里所用的术语“治疗”是指预防和/或治疗。当涉及传染性疾病时，例如，该术语是指增强受试者对病原体感染的抵抗力的预防性治疗，或换句话说，降低受试者被病原体感染或显示由传染导致的疾病症状的可能性，以及在受试者被感染后的抗感染治疗，例如，减轻或消除感染，或防止其恶化。当涉及肥胖症和相关疾病时，术语“治疗”是指增加受试者对肥胖症的抵抗力，和/或逆转肥胖症的预防性或治疗性处理。
疫苗此处所使用的术语“疫苗”是指含有修饰的核心颗粒，特别是本发明的修饰的VLP并且是能够施用于动物的形式的制剂。一般疫苗包含其中悬浮或溶解了本发明的组合物的常用的盐水或缓冲水溶液介质。以这种形式，本发明的组合物能够方便地用于预防、改善、或另外治疗疾病。当导入宿主中时，该疫苗能够引起免疫应答，包括但不限于，产生抗体和/或细胞因子、和/或激活细胞毒性T细胞、抗原呈递细胞、辅助性T细胞、树突状细胞和/或其他细胞应答。一般本发明的修饰的核心颗粒，优选本发明的修饰的VLP，优选地诱导主要为B-细胞应答，更优选只诱导B-细胞应答，这是另外一个优点。
任选地，本发明的疫苗另外包含能够以相对于本发明的化合物为次要或主要的比例存在的佐剂。
病毒样颗粒(VLP)这里所使用的术语“病毒样颗粒”是指类似病毒颗粒的结构。而且根据本发明的病毒样颗粒是非复制性和非传染性的，因为其缺乏全部或部分的病毒基因组功能，特别是病毒基因组的复制和感染性成分。病毒基因组功能可因物理或化学方法而被灭活，例如紫外线照射或甲醛处理，或优选通过遗传工程方法来使负责感染和/或复制的基因缺失或突变。根据本发明的病毒样颗粒可包含不同于其基因组的核酸。根据本发明的病毒样颗粒的典型且优选的实施方案是病毒壳体，例如相应病毒、噬菌体、或RNA噬菌体的病毒壳体。术语“病毒壳体”或“衣壳”在此可互换使用，是指由病毒蛋白亚基组成的大分子装配体。一般且优选地，病毒蛋白亚基分别装配成病毒壳体和衣壳，其具有内在重复组织的结构，其中所述的结构一般是球状或管状的。例如RNA噬菌体或HBcAg的衣壳具有二十面体对称的球形。这里所使用的术语“衣壳样结构”是指由病毒蛋白亚基组成的大分子装配体，类似于上述所定义的衣壳形态，但是又不同于典型的对称装配体，同时保持充分的有序和重复性程度。
噬菌体的病毒样颗粒这里所使用的“噬菌体的病毒样颗粒”以及术语“来源于噬菌体的病毒样颗粒”，在此可等同使用，是指类似于噬菌体结构的病毒样颗粒，不具有复制性和感染性，至少缺乏编码噬菌体复制机制的基因，并且一般也缺乏编码负责病毒附着或进入宿主的一种或几种蛋白质的一种或几种基因。但是这个定义应该也包括这样的噬菌体的病毒样颗粒，其中上述的一种或几种基因仍然存在但没有活性，因此也导致非复制和非感染性的噬菌体的病毒样颗粒。来源于RNA噬菌体的多数VLP显示二十面体对称并由180个亚基组成。本发明所公开的内容中，术语“亚基”和“单体”在上下文中可互换和等同使用。
RNA噬菌体外壳蛋白的VLP由RNA噬菌体外壳蛋白的180个亚基自组装形成的，并且任选地包含宿主RNA的衣壳结构称为“RNA噬菌体外壳蛋白的VLP”。一个具体的实例是Qβ外壳蛋白的VLP。在这个特定情形中，Qβ外壳蛋白的VLP可能仅仅由QβCP亚基组装而成(由QβCP基因的表达产生，该基因含有例如TAA终止密码子，通过抑制而阻止更长A1蛋白的任何表达，参见Kozlovska，T.M.，et al.，Intervirology399-15(1996))，或另外在衣壳组装中包含A1蛋白亚基。
病毒颗粒这里使用的术语“病毒颗粒”是指病毒的形态学形式。在一些病毒类型中，它包括周围包围有蛋白衣壳的基因组；其他的病毒具有附加的结构(例如包膜，尾等)。
一个或一种在此所公开内容中当使用术语“一个”或“一种”时，除非另外指出，都是指“至少一个(种)”或“一个(种)或多个(种)”。
如本领域技术人员所清楚了解的，本发明的某些实施方案涉及重组核酸技术的使用，例如克隆、聚合酶链式反应、DNA和RNA的纯化、重组蛋白质在原核和真核细胞中的表达等。这种方法学是本领域技术人员已知的，并且能够从出版的实验室方法手册中方便地找到(例如，Sambrook，J.et al.，eds.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2ndedition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)；Ausubel，F.et al.，编著，Current Protocols in Molecular Biology，JohnH.Wiley & Sons，Inc.(1997))。应用组织培养细胞系进行的基本实验室技术(Celis，J.，编著，Cell Biology，Academic Press，2nd edition，(1998))和基于抗体的技术(Harlow，E.and Lane，D.，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1988)；Deutscher，M.P.，″Guide to Protein Purification，″Meth.Enzymol.128，Academic PressSan Diego(1990)；Scopes，R.K.，Protein Purification Principles and Practice，3rd ed.，Springer-Verlag，New York(1994))也在文献中有充分的描述，所有这些在此引入作为参考。
2.用于增强免疫应答的组合物和方法公开的本发明提供用于在动物或人类中增强针对生长素释放肽或生长素释放肽-肽的免疫应答的组合物和方法。本发明的组合物包含或由下列成分组成(a)核心颗粒，优选VLP；和(b)至少一个生长素释放肽-肽，其中所述的生长素释放肽-肽由长度为6或8个氨基酸残基、与SEQ ID NOs1(GSSFLS)或3(GSSFLSPE)同源或相同的肽组成，并且其中a)和b)彼此相连。更具体地，该修饰的核心颗粒，优选本发明的修饰的VLP，包括或由病毒样颗粒和至少一个本发明的生长素释放肽-肽组成。优选本发明的生长素释放肽-肽与病毒样颗粒结合，由此形成有序且重复的抗原-VLP-阵列。而且，本发明使专业人员能方便地构建这种组合物，尤其来治疗和/或预防肥胖症。
在一个实施方案中，该核心颗粒包括，或选自，病毒、细菌菌毛、由细菌菌毛形成的结构、噬菌体、病毒样颗粒、RNA噬菌体的病毒样颗粒、病毒壳体颗粒或其重组形式。优选地所述的核心颗粒，更优选地所述的VLP，包括或是重组的病毒样颗粒。
可选择本领域已知的具有有序重复的外壳和/或核心蛋白质结构的任何病毒，作为本发明的核心颗粒；合适病毒的实例包括，辛德毕斯病毒和其他α病毒、弹状病毒(例如，水泡性口炎病毒)、细小核糖核酸病毒(例如，人鼻病毒，Aichi病毒)、披膜病毒(例如，风疹病毒)、正黏病毒(例如索戈托病毒、贝特肯病毒、禽流感病毒)、多瘤病毒(例如，多瘤病毒BK、多瘤病毒JC、禽多瘤病毒BFDV)、细小病毒、轮状病毒、诺沃克病毒、口蹄疫病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒、烟草花叶病毒、禽兽棚病毒、和人乳头瘤病毒，以及优选RNA噬菌体，其中优选所述的RNA噬菌体选自噬菌体Qβ、噬菌体R17、噬菌体M11、噬菌体MX1、噬菌体NL95、噬菌体fr、噬菌体GA、噬菌体SP、噬菌体MS2、噬菌体f2、噬菌体PP7和AP205。(例如，参见Bachmann，M.F.和Zinkernagel，R.M.，Immunol.Today 17553-558(1996)中的表1)。
在进一步的实施方案中，本发明利用病毒的基因工程化来产生有序重复的病毒外壳蛋白和本发明的生长素释放肽-肽之间的融合体，或者，第一附着位点包括在，或优选是异源蛋白质、肽、抗原决定簇或所选择的反应性氨基酸残基内，并且本发明的生长素释放肽-肽具有添加的第二附着位点。本领域已知的其他遗传操作可用于本发明组合物的构建中；例如可能需要通过遗传突变限制重组病毒的复制能力。而且，用于本发明的病毒由于化学或物理灭活，或如所指出的，由于缺乏能够复制的基因组和/或基因组功能而是不能复制的。选择用于与第一附着位点融合的病毒蛋白应该具有组织化且重复的结构。这种有组织的重复结构包括病毒表面上间隔为5-30nm，优选5-15nm的类晶体结构。这类融合蛋白的形成会在病毒表面上产生多重、有序且重复的本发明的生长素释放肽-肽，或第一附着位点，并且反映了天然病毒蛋白的正常组织结构。如本领域技术人员所了解的，第一附着位点可以是任何适合的蛋白质、多肽、糖、多核苷酸、肽(氨基酸)、天然或合成的聚合物、次级代谢物或其一部分，或其组合，其可以发挥特异附着至少一个本发明的生长素释放肽-肽而优选地产生有序重复的抗原阵列的作用。当然，病毒外壳蛋白与本发明生长素释放肽-肽之间也可以不引入第一和/或第二附着位点而直接融合，在这种情况下，第一附着位点是病毒外壳蛋白的天然氨基酸，而第二附着位点是本发明生长素释放肽-肽的天然氨基酸，或与生长素释放肽-肽结合，优选融合的氨基酸接头的天然氨基酸，并且第一和第二附着位点通过肽键连接。
在本发明的另一个实施方案中，核心颗粒是重组的α病毒，更具体地是重组的辛德毕斯病毒。α病毒家族的几个成员，辛德毕斯病毒(Xiong，C.et al.，Science 2431188-1191(1989)；Schlesinger，S.，Trends Biotechnol.1118-22(1993))、塞姆利基森林病毒(SFV)(Liljestrm，P.和Garoff，H.，Bio/Technology 91356-1361(1991))和其他病毒(Davis，N.L.et al.，Virology 171189-204(1989))，已经被注意到可用作多种不同蛋白质的基于病毒的表达载体(Lundstrom，K.，Curr.Opin.Biotechnol.8578-582(1997)；Liljestrm，P.，Curr.Opin.Biotechnol.5495-500(1994))，以及作为研发疫苗的候选物。最近，已经公开了许多专利涉及利用α病毒表达异源蛋白质和研发疫苗的用途(参见美国专利号5,766,602、5,792,462、5,739,026、5,789,245和5,814,482)。本发明的修饰的α病毒核心颗粒的构建可按照上述文献所描述的，通过本领域通常已知的重组DNA技术方法来完成，所述文献在此引入作为参考。
可选择本领域已知的具有有序重复结构的任何病毒作为本发明的VLP。其外壳或衣壳蛋白能够用于制备VLP的例证性的DNA或RNA病毒已经在WO 2004/009124的第25页第10-21行，第26页的第11-28行，和第28页的第4行到第31页的第4行公开。这些公开的内容在此引入作为参考。
在另外的实施方案中，细菌菌毛蛋白、细菌菌毛蛋白的亚部分、或含有细菌菌毛蛋白或其亚部分的融合蛋白，可分别用于制备本发明的修饰的核心蛋白和组合物以及疫苗组合物。菌毛蛋白的实例包括由大肠杆菌(Escherichia coli)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(neisseria meningitidis)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoeae)、新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)、斯氏假单胞菌(pseudomonas stutzeri)、和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)产生的菌毛蛋白。适用于本发明的菌毛蛋白的氨基酸序列包括GenBank报告AJ000636、AJ132364、AF229646、AF051814、AF051815和X00981所列出的序列，其公开的全部内容在此引入作为参考。
适用于本发明的菌毛蛋白的具体和优选实施例在WO 02/056905的第41页第13至21行，和第41页第25行至第43页第22行公开，其在此引入作为参考。
在多数情况下，分别用于本发明组合物和疫苗组合物的菌毛或菌毛样结构分别由单一类型的菌毛蛋白亚基组成。但是，本发明的组合物也包括包含由不同菌毛蛋白亚基构成的菌毛或菌毛样结构的组合物和疫苗。本发明的优选实施方案的可能表达方法在WO 02/056905的第43页第28行至第44页第6行中公开。
此外，本发明的生长素释放肽-肽能够通过至少一个共价键与细菌菌毛或菌毛样结构连接。在一个优选的实施方案中，所述的至少一个共价键是非肽键。在进一步优选的实施方案中，第一附着位点是天然存在于菌毛蛋白内的或是工程构建在菌毛蛋白上的赖氨酸。在另一个进一步优选的实施方案中，第二附着位点是加入生长素释放肽-肽的半胱氨酸。
在另一个优选实施方案中，所述的至少一个共价键是肽键。用于本发明组合物的产生菌毛或菌毛样结构的细菌细胞能够被遗传工程化而产生与本发明的生长素释放肽肽融合的菌毛蛋白。这种形成菌毛或菌毛样结构的融合蛋白适用于本发明的疫苗组合物。
在一个优选的实施方案中，该核心颗粒是病毒样颗粒，优选其中该病毒样颗粒是重组的病毒样颗粒。技术人员能够利用重组DNA技术和公众可容易获得的病毒编码序列来产生VLP。
VLP的实例包括但不限于，乙型肝炎病毒(Ulrich，et al.，Virus Res.50141-182(1998))、麻疹病毒(Warnes，et al.，Gene 160173-178(1995))、辛德毕斯病毒、轮状病毒(US 5,071,651和US 5,374,426)、口蹄疫病毒(Twomey，et al.，Vaccine 131603-1610，(1995))、诺沃克病毒(Jiang，X.，etal.，Science 2501580-1583(1990)；Matsui，S.M.，et al.，J.Clin.Invest.871456-1461(1991))的衣壳蛋白、逆转录病毒GAG蛋白(WO 96/30523)、逆转录转座子Ty蛋白p1、乙型肝炎病毒(WO 92/11291)、人乳头瘤病毒(WO 98/15631)、RNA噬菌体、Ty、fr-噬菌体、GA-噬菌体、AP205-噬菌体和Qβ-噬菌体的表面蛋白。
对本领域技术人员显而易见的是，本发明的VLP不只限于任何具体的形式。该颗粒可以被化学合成或通过天然或非天然的生物过程合成。例如，这个类型的实施方案包括病毒样颗粒或其重组形式。
在更具体的实施方案中，该VLP可包括或基本上由或由能够装配成为VLP的选自下组的重组多肽或其片段组成轮状病毒的重组多肽、诺沃克病毒的重组多肽、α病毒的重组多肽、口蹄疫病毒的重组多肽、麻疹病毒的重组多肽、辛德毕斯病毒的重组多肽、多瘤病毒的重组多肽、逆转录病毒的重组多肽、乙型肝炎病毒的重组多肽(例如HBcAg)、烟草花叶病毒的重组多肽、禽兽棚病毒的重组多肽，人乳头瘤病毒的重组的多肽、噬菌体的重组多肽、RNA噬菌体的重组多肽、Ty的重组多肽、fr噬菌体的重组多肽、GA噬菌体的重组多肽和Qβ噬菌体的重组多肽。在这种多肽的所述片段或这种多肽的所述突变体能够组装成为VLP的情况下，病毒样颗粒可进一步包括或基本由或由这种多肽的一个或多个片段以及这种多肽的突变体组成。多肽的变体与其野生型对应物在氨基酸水平上具有例如至少80％、85％、90％、95％、97％或99％的同一性。
在一个优选的实施方案中，本发明的病毒样颗粒是乙型肝炎病毒的病毒样颗粒。乙型肝炎病毒样颗粒的制备尤其已经在WO 00/32227、WO01/85208和WO 01/056905中公开。所有这三个文件在此明确地引入作为参考。适用于本发明实施的HBcAg的另外一些变体已经在WO01/056905的第34-39页中公开。
在进一步的优选实施方案中，将赖氨酸残基导入HBcAg多肽，来介导本发明的生长素释放肽-肽与HBcAg的VLP的连接。在优选的实施方案中，利用包括、或由SEQ ID NO25的第1-144、或1-149、1-185位氨基酸组成的HBcAg来制备本发明的VLP和组合物，其中该氨基酸被修饰使得第79和80位的氨基酸被具有Gly-Gly-Lys-Gly-Gly氨基酸序列的肽所代替。这个修饰将SEQ ID NO25改变为SEQ ID NO26。在进一步优选的实施方案中，SEQ ID NO25的第48和110位的半胱氨酸残基，或其相应片段，优选1-144或1-149，被突变为丝氨酸。本发明进一步包括包含具有上述相应氨基酸改变的乙型肝炎核心蛋白突变体的组合物。本发明进一步分别包括分别包含HBcAg多肽的组合物和疫苗，该HBcAg多肽包括，或由与SEQ ID NO26有至少80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列组成。
在优选的实施方案中，VLP是RNA噬菌体的病毒样颗粒。在进一步优选的实施方案中，该病毒样颗粒包括、优选基本上由、或由RNA噬菌体的重组蛋白或其片段组成。在进一步优选的实施方案中，该病毒样颗粒包括，优选基本上由、或由RNA噬菌体的重组外壳蛋白或其片段组成。优选地，该RNA噬菌体选自a)噬菌体Qβ；b)噬菌体R17；c)噬菌体fr；d)噬菌体GA；e)噬菌体SP；f)噬菌体MS2；g)噬菌体M11；h)噬菌体MX1；i)噬菌体NL95；k)噬菌体f2；l)噬菌体PP7，和m)噬菌体AP205。
在本发明的另一个优选实施方案中，该病毒样颗粒包括，或基本上由、或由RNA噬菌体Qβ、或RNA噬菌体fr、或RNA噬菌体AP205、优选RNA噬菌体Qβ的能够组装成为VLP的重组蛋白或其片段组成。
在另一个优选实施方案中，该VLP包括，或由RNA噬菌体的重组蛋白或其片段组成，其中优选地所述的重组蛋白包括，或基本上由，或由RNA噬菌体的外壳蛋白组成。
在本发明的另一个优选实施方案中，该病毒样颗粒包括，或由RNA噬菌体Qβ、fr、AP205，或GA的能够组装成为VLP的重组蛋白，优选重组外壳蛋白或其片段组成。
因此，形成衣壳或VLP的RNA-噬菌体外壳蛋白，或与自体组装成衣壳或VLP相容的噬菌体外壳蛋白的片段，是本发明进一步的优选实施方案。例如，噬菌体Qβ外壳蛋白能够在大肠杆菌中重组表达。可以用于制备本发明组合物的噬菌体外壳蛋白的具体优选实例包括如下RNA噬菌体的外壳蛋白，例如噬菌体Qβ(SEQ ID NO4和SEQ ID NO5)、噬菌体R17(SEQ ID NO6)、噬菌体fr(SEQ ID NO7)、噬菌体GA(SEQ ID NO8)、噬菌体SP(SEQ ID NO9和SEQ ID NO10)、噬菌体MS2(SEQ ID NO11)、噬菌体M11(SEQ ID NO12)、噬菌体MX1(SEQID NO13)、噬菌体NL95(SEQ ID NO14)、噬菌体f2(SEQ ID NO15)、噬菌体PP7(SEQ ID NO16)、和噬菌体AP205(SEQ ID NO28)。此外，噬菌体Qβ(SEQ ID NO5)的A1蛋白，或从A1的C-末端缺失100、150或180个氨基酸的C-末端截短形式，可以被整合到Qβ外壳蛋白的衣壳装配体中。一般地，衣壳装配体中QβA1蛋白相对于QβCP的的百分比会受到限制，以确保衣壳的形成。在本发明进一步优选的实施方案中，RNA噬菌体的外壳蛋白具有选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO4、SEQ ID NO4和SEQ ID NO5的混合物、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9、SEQ ID NO9和SEQ ID NO10的混合物、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12、SEQ ID NO13、SEQ ID NO14、SEQ ID NO15、SEQ ID NO16、和SEQ ID NO28。
已经发现当在大肠杆菌中表达时，Qβ外壳蛋白会自组装成为衣壳(Kozlovska TM.et al.，GENE 137133-137(1993))。该衣壳含有通过二硫桥键以共价五聚体和六聚体相连接的180个拷贝的外壳蛋白(Golmohammadi，R.et al.，Structure 4543-5554(1996))，而产生有相当稳定性的Qβ外壳蛋白的衣壳。但是由重组Qβ外壳蛋白构成的衣壳或VLP可包含与衣壳内的其他亚基不是通过二硫键连接或不完全连接的亚基。但是，一般超过大约80％的亚基通过二硫键在VLPQβ衣壳蛋白内彼此连接。Qβ衣壳蛋白也显示出对有机溶剂和变性剂的不同寻常的抗性。令人惊讶的是，我们已经观察到浓度高达30％的DMSO和乙腈，和浓度高达1M的胍盐都不影响该衣壳的稳定性。Qβ外壳蛋白的衣壳的高稳定性是有利的特性，特别是当其用于本发明所述的哺乳动物和人类的免疫和接种用途的时候。
进一步优选的RNA噬菌体的病毒样颗粒，特别是根据本发明的Qβ，在WO 02/056905中公开，其所公开的内容在此全部引入作为参考。
更多的RNA噬菌体外壳蛋白也已经显示当在细菌宿主中表达时进行自我装配(Kastelein，RA.etal.，Gene 23245-254(1983)，Kozlovskaya，TM.et al.，Dokl.Akad.Nauk SSSR 287452-455(1986)，Adhin，MR.et al.，Virology 170238-242(1989)，Ni，CZ.，et al.，Protein Sci.52485-2493(1996)，Priano，C.et al.，J.Mol.Biol.249283-297(1995))。除了外壳蛋白之外，Qβ噬菌体衣壳还包含所谓的通读蛋白A1和成熟蛋白A2。A1是通过在UGA终止密码子处抑制而产生的，长度为329个氨基酸。用于本发明的噬菌体Qβ重组外壳蛋白的衣壳缺乏A2裂解蛋白，并含有来自于宿主的RNA。
在本发明更优选的实施方案中，该病毒样颗粒包括，或基本上由、或由RNA噬菌体的重组蛋白或其片段组成，其中该重组蛋白包括，基本上由、或由RNA噬菌体的突变外壳蛋白，优选上面提到的RNA噬菌体的突变外壳蛋白组成。在一个实施方案中，突变外壳蛋白是与本发明生长素释放肽-肽的融合蛋白。在另一个优选的实施方案中，RNA噬菌体的突变外壳蛋白已经通过替换的方式除去至少一个或至少两个赖氨酸残基，或通过替换的方式添加至少一个赖氨酸残基而被修饰；或者，该RNA噬菌体的突变外壳蛋白已经通过缺失至少一个或至少两个赖氨酸残基，或通过插入的方式添加至少一个赖氨酸残基而被修饰。缺失、替换、或添加至少一个赖氨酸残基可以改变偶联的程度，即RNA噬菌体VLP的每个亚基上生长素释放肽-肽的数量，特别地用来匹配和适应疫苗的需要。因此，在本发明进一步优选的实施方案中，RNA噬菌体的病毒样颗粒包括已经通过缺失或替换来除去至少一个天然存在的赖氨酸残基而被修饰，或已经通过插入或替换来添加至少一个赖氨酸残基而被修饰的所述RNA噬菌体的一个或多个外壳蛋白。
在本发明的优选实施方案中，平均每个亚基至少有1.0个生长素释放肽-肽连接到RNA噬菌体的VLP上。这个值是计算的对RNA噬菌体VLP的全部亚基或单体的平均值。在本发明进一步优选的实施方案中，至少有1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或至少2.0个生长素释放肽-肽连接到RNA噬菌体的VLP上，正如对于RNA噬菌体VLP的全部亚基或单体的偶联平均数所计算的。
在另一个优选的实施方案中，该病毒样颗粒包括，或基本上由、或由RNA噬菌体Qβ的重组蛋白或其片段组成，其中该重组蛋白包括，或基本上由、或由下列成分组成具有SEQ ID NO4的氨基酸序列的外壳蛋白，或具有SEQ ID NO4和SEQ ID NO5或SEQ ID NO5突变体，优选SEQ ID NO5的C-末端截短形式的氨基酸序列的外壳蛋白混合物，并且其中N-末端的甲硫氨酸优选被切除。
在本发明更优选的实施方案中，该病毒样颗粒包括、基本上由、或由Qβ的重组蛋白或其片段组成，其中该重组蛋白包括，或基本上由、或由突变体Qβ外壳蛋白组成。在另一个优选的实施方案中，这些突变的外壳蛋白已经通过替换的方法除去至少一个赖氨酸残基，或通过替换的方法增加至少一个赖氨酸残基而被修饰。或者，这些突变的外壳蛋白已经通过缺失至少一个赖氨酸残基，或通过插入的方法增加至少一个赖氨酸残基而被修饰。
4个赖氨酸残基暴露于Qβ外壳蛋白的表面。暴露的赖氨酸残基被精氨酸所替换的Qβ突变体也可用于本发明。因此下列Qβ外壳蛋白突变体和突变的QβVLP可用于实施本发明″Qβ-240″(Lys13-Arg；SEQ IDNO17)、″Qβ-243″(Asn 10-Lys；SEQ ID NO18)、″Qβ-250″(Lys 2-Arg，Lys13-Arg；SEQ ID NO19)、″Qβ-251″(SEQ ID NO20)和″Qβ-259″(Lys2-Arg，Lys16-Arg；SEQ ID NO21)。因此，在本发明进一步优选的实施方案中，该病毒样颗粒包括、基本上由、或由突变Qβ外壳蛋白的重组蛋白组成，其包括具有选自下组的氨基酸序列的蛋白质a)SEQ ID NO17；b)SEQ ID NO18；c)SEQ ID NO19；d)SEQ ID NO20；和e)SEQ IDNO21。上面所指出的Qβ外壳蛋白、突变Qβ外壳蛋白VLP和衣壳的构建、表达和纯化分别在WO 02/056905中有描述。由此特别参考上面提及的申请的实施例18。
在本发明进一步优选的实施方案中，该病毒样颗粒包括、或基本上由、或由Qβ的重组蛋白或其片段组成，其中该重组蛋白包括、基本上由、或由上面所述的Qβ突变体之一和相应的A1蛋白的混合物组成。
在本发明进一步优选的实施方案中，该病毒样颗粒包括，或基本上由、或由能够装配成为RNA噬菌体AP205的VLP的重组蛋白或其片段组成。
在另一个更优选的实施方案中，该病毒样颗粒包括、或基本上由、或由能够组装成为RNA噬菌体AP205的VLP的外壳蛋白或其片段组成。AP205VLP是高度免疫原性的。
WO 2004/007538，特别是在实施例1和实施例2中描述了如何获得包括AP205外壳蛋白的VLP，以及特别是其表达和纯化。WO2004/007538在此引入作为参考。AP205VLP的能够装配的突变体形式，包括在第5位氨基酸的脯氨酸替换为苏氨酸(SEQ ID NO29)，或SEQ IDNO28的在第14位氨基酸的天冬酰胺替换为天冬氨酸的AP205外壳蛋白，也用于实施本发明而产生本发明进一步优选的实施方案。
在本发明进一步优选的实施方案中，该病毒样颗粒包括、或基本上由、或由RNA噬菌体AP205的重组突变外壳蛋白或其片段组成。
在本发明进一步优选的实施方案中，该病毒样颗粒包括、或基本上由、或由RNA噬菌体AP205的重组外壳蛋白或其片段，和RNA噬菌体AP205的重组突变外壳蛋白或其片段的混合物组成。
在本发明进一步优选的实施方案中，该病毒样颗粒包括、或基本上由、或由RNA噬菌体AP205的重组外壳蛋白，或重组突变外壳蛋白的片段组成。
能够分别装配成为VLP和衣壳的重组AP205外壳蛋白片段也对本发明的实施有用。这些片段可通过分别在外壳蛋白或突变外壳蛋白中间或末端进行缺失而产生。适合装配成为VLP的向外壳蛋白和突变外壳蛋白序列中的插入或本发明的生长素释放肽-肽与外壳蛋白和突变外壳蛋白序列的融合，是本发明进一步的实施方案，并且分别产生嵌合的AP205外壳蛋白和颗粒。插入、缺失和与外壳蛋白序列融合的结果，以及其是否适合装配成为VLP可通过电子显微镜检查来确定。
已经确定了几种RNA噬菌体的晶体结构(Golmohammadi，R.et al.，Structure 4543-554(1996))。利用这种信息，能够鉴定表面暴露的残基，并且可修饰RNA噬菌体外壳蛋白而使得一个或多个反应性氨基酸残基能够通过插入或替换的方式被插入。结果是，这些修饰形式的噬菌体外壳蛋白也能够用于本发明。因此，形成衣壳或衣壳样结构的多种蛋白质变体(例如噬菌体Qβ、噬菌体R17、噬菌体fr、噬菌体GA、噬菌体SP、噬菌体AP205和噬菌体MS2的外壳蛋白)也能够用于制备本发明的修饰的核心颗粒，优选修饰的VLP，以及组合物。
尽管上面讨论的突变蛋白质的序列不同于其野生型对应物，但是这些突变蛋白质通常保持形成衣壳或衣壳样结构的能力。因此，本发明进一步包括各自的组合物和疫苗组合物，其进一步包括形成衣壳或衣壳样结构的蛋白质突变体，以及包括分别用于制备这种组合物和疫苗组合物的方法，用于制备这种组合物的个别蛋白亚基，和编码这些蛋白亚基的核酸分子。因此，在本发明的范围内包括形成衣壳或衣壳样结构，并且保持结合和形成衣壳或衣壳样结构的能力的野生型蛋白质的突变形式。
因此，本发明进一步包括各自含有如下蛋白质的组合物和疫苗组合物，其中所述蛋白质包括、或基本上由、或由与野生型蛋白质分别为至少80％、85％、90％、95％、97％、99％相同的氨基酸序列组成，它们形成有序阵列，且具有内在的重复结构。
在本发明的范围内进一步包括编码用于制备本发明组合物的蛋白质的核酸分子。
在其他实施方案中，本发明进一步包括包含如下蛋白质的组合物，其中该蛋白质包括、或基本上由、或由与SEQ ID NO4-21所示任何氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、97％、或99％同一性的氨基酸序列组成。
在本发明进一步优选的实施方案中，至少一个本发明的生长素释放肽-肽通过至少一个共价键分别结合到所述的核心颗粒和病毒样颗粒上。优选地，至少一个生长素释放肽-肽通过至少一个共价键分别结合到核心颗粒和病毒样颗粒上，其中所述的共价键是非肽键而产生核心颗粒-生长素释放肽颗粒，优选分别产生有序重复的阵列和生长素释放肽-VLP-偶联物，并且优选阵列。这个生长素释放肽-VLP阵列和偶联物分别通常且优选地具有重复有序的结构，这是由于至少一个，但经常是一个以上的本发明的生长素释放肽-肽分别以定向的方式结合到VLP和核心颗粒上。优选地，等于或多于120个，更优选等于或多于180个，更优选等于或多于270个，以及更优选等于或多于360个本发明的生长素释放肽-肽与VLP结合。
在本发明进一步优选的实施方案中，该修饰的VLP进一步包括至少一个，优选一个异双功能交联剂。本发明公开了使本发明的生长素释放肽-肽分别与核心颗粒和VLP结合的方法。如所指出的，在本发明的一个方面，本发明的生长素释放肽-肽通过化学交联的方式，通常且优选地通过使用异双功能交联剂来分别结合核心颗粒和VLP。几种异双功能交联剂是本领域已知的。在优选的实施方案中，该异双功能交联剂包含能与优选的第一附着位点，优选分别与核心颗粒和VLP的赖氨酸残基的侧链氨基，或至少一个VLP亚基起反应的官能团，并且含有另外的能与优选的第二附着位点，优选与添加或工程化添加至本发明的生长素释放肽-肽的半胱氨酸残基起反应的官能团，并且任选地也通过还原来获得该反应。几种异双功能交联剂是本领域已知的。其中包括优选的交联剂SMPH(Pierce)、Sulfo-MBS、Sulfo-EMCS、Sulfo-GMBS、Sulfo-SIAB、Sulfo-SMPB、Sulfo-SMCC、SVSB、SIA和可从例如Pierce ChemicalCompany(Rockford，IL，USA)获得的其他交联剂，并且其具有与氨基反应的一个官能团，和与半胱氨酸反应的一个官能团。适用于本发明实施的另一类别的交联剂其特征在于当偶联时在本发明的生长素释放肽-肽和核心颗粒或VLP之间导入二硫键。属于这个类别的优选交联剂包括(例如SPDP和Sulfo-LC-SPDP(Pierce)。
在本发明进一步优选的实施方案中，该修饰的VLP进一步包括氨基酸接头，其中优选地，所述的氨基酸接头不包含另外的生长素释放肽氨基酸残基序列。在本发明的优选实施方案中，第一附着位点包括，或优选地是氨基，优选赖氨酸残基的氨基。在本发明的另一个优选实施方案中，第二附着位点包括，或优选地是巯基，优选半胱氨酸的巯基。在本发明非常优选的实施方案中，至少一个第一附着位点是氨基，优选赖氨酸残基的氨基，并且至少一个第二附着位点是巯基，优选半胱氨酸的巯基。
在一些实施方案中，为了将本发明的生长素释放肽-肽分别与核心颗粒和VLP偶联，工程构建包含半胱氨酸残基的氨基酸接头作为第二附着位点或其一部分可能是优选或必需的。或者，半胱氨酸可通过添加至本发明的生长素释放肽-肽而被导入。或者，半胱氨酸残基可通过化学偶联而导入。
氨基酸接头的选择将依赖于本发明生长素释放肽-肽的性质，依赖于其生物化学特性，例如pI，电荷分布和糖基化。一般的，柔性氨基酸接头更有利。氨基酸接头的优选实施方案选自(a)CGG；(b)N末端γ1-接头；(c)N-末端γ3-接头；(d)Ig铰链区；(e)N-末端甘氨酸接头；(f)(G)kC(G)n，其中n＝0-12和k＝0-5(SEQ ID NO34)；(g)N-末端甘氨酸-丝氨酸接头；(h)(G)kC(G)m(S)l(GGGGS)n，其中n＝0-3、k＝0-5、m＝0-10、1＝0-2(SEQ ID NO35)；(i)GGC；(k)GGC-NH2；(l)C-末端γ1-接头；(m)C-末端γ3-接头；(n)C-末端甘氨酸接头；(o)(G)nC(G)k，其中n＝0-12和k＝0-5(SEQ ID NO36)；(p)C-末端甘氨酸-丝氨酸接头；(q)(G)m(S)l(GGGGS)n(G)oC(G)k，其中n＝0-3、k＝0-5、m＝0-10、l＝0-2，且o＝0-8(SEQ ID NO37)。在进一步优选的实施方案中，至少一个生长素释放肽-肽通过其C-末端与VLP连接。因此C-末端接头是本发明优选的实施方案。
氨基酸接头的进一步优选的实例有，免疫球蛋白的铰链区，甘氨酸丝氨酸接头(GGGGS)n(SEQ ID NO38)，和甘氨酸接头(G)n，全都进一步包含半胱氨酸残基作为第二附着位点且任选地进一步包含甘氨酸残基。所述氨基酸接头的典型优选实例是N-末端γ1CGDKTHTSPP(SEQID NO39)；C-末端γ1DKTHTSPPCG(SEQ ID NO40)；N-末端γ3CGGPKPSTPPGSSGGAP(SEQ ID NO41)；C-末端γ3PKPSTPPGSSGGAPGGCG(SEQ ID NO42)；N-末端甘氨酸接头GCGGGG(SEQ ID NO43)；C-末端甘氨酸接头GGGGCG(SEQ ID NO44)；C-末端甘氨酸-赖氨酸接头GGKKGC(SEQ ID NO45)；N-末端甘氨酸-赖氨酸接头CGKKGG(SEQ ID NO46)。
在本发明的更优选的实施方案中，在生长素释放肽-肽的C-末端优选GGCG(SEQ ID NO47)、GGC或GGC-NH2(″NH2″代表酰胺化)、GC或C接头作为氨基酸接头。一般的，甘氨酸残基会插入到体积大的氨基酸和用作第二附着位点的半胱氨酸之间，以避免偶联反应中的体积更大的氨基酸的潜在空间位阻。
根据上面描述的优选方法使用异双功能交联剂，本发明的生长素释放肽-肽分别与核心颗粒和VLP的结合可使本发明的生长素释放肽-肽分别与核心颗粒和VLP以定向的方式偶联。使本发明的生长素释放肽-肽分别与核心颗粒和VLP结合的其他方法包括其中本发明的生长素释放肽-肽利用碳化二亚胺EDC和NHS分别交联核心颗粒和VLP的方法。本发明的生长素释放肽-肽也可通过，例如与SATA、SATP或亚胺硫醇反应而先被硫醇化。本发明的生长素释放肽-肽，如果需要在去保护后，可如下与核心颗粒和VLP分别起反应。在分离过量的硫醇化试剂后，本发明的生长素释放肽-肽分别与核心颗粒和VLP反应，核心颗粒和VLP预先用包括半胱氨酸反应性部分的异双功能交联剂活化，因此显示对半胱氨酸残基有反应的至少一个或几个官能团，其中如上所述，硫醇化的本发明的生长素释放肽-肽可与其反应。任选地，少量的还原剂包括在该反应混合物中。在另外一些方法中，本发明的生长素释放肽-肽利用具有对核心颗粒和VLP的氨基或羰基有活性的官能团的同型双功能交联剂，例如戊二醛、DSG、BM[PEO]4、BS3(Pierce ChemicalCompany，Rockford，IL，USA)或其他已知的同型双功能交联剂，而分别附着于核心颗粒和VLP。或者，SEQ ID NO3的谷氨酸可用作第二附着位点来使本发明的生长素释放肽-肽与VLP连接，优选通过赖氨酸残基连接。
使VLP与本发明的生长素释放肽-肽结合的其他方法包括，其中核心颗粒和VLP分别被生物素化，并且本发明的生长素释放肽-肽表达为链霉抗生物素融合蛋白的方法，或其中本发明的生长素释放肽-肽和核心颗粒以及VLP都分别被生物素化的方法，例如在WO 00/23955中所描述的方法。其中可利用可溶性形式的受体和配体，并且能够分别与核心颗粒和VLP或本发明的生长素释放肽-肽交联的其他配体-受体对，能够用作使本发明的生长素释放肽-肽与核心颗粒和VLP分别结合的结合剂。或者，该配体或受体可与本发明的生长素释放肽-肽融合，从而介导分别与化学结合或融合有受体或配体的核心颗粒和VLP的结合。融合也可能通过插入或替换实现。
如前所述，在本发明的优选实施方案中，VLP是RNA噬菌体的VLP，并且在更优选的实施方案中，VLP是RNA噬菌体Qβ的VLP。
如果空间上允许的话，一个或几个抗原分子，即本发明的生长素释放肽-肽，能够附着于RNA噬菌体外壳蛋白的衣壳或VLP的一个亚基上，优选通过RNA噬菌体VLP的暴露的赖氨酸残基附着。因此，RNA噬菌体外壳蛋白的VLP，特别是Qβ外壳蛋白VLP的一个具体特征是每个亚基可与几个抗原偶联的可能性。这容许形成密集的抗原阵列。
在本发明优选的实施方案中，至少一个本发明的生长素释放肽-肽与核心颗粒或病毒样颗粒的分别结合是通过病毒样颗粒的至少一个第一附着位点与加入本发明生长素释放肽-肽的至少一个第二附着位点之间的连接而实现的。
Qβ外壳蛋白的VLP或衣壳在其表面显示固定数目的赖氨酸残基，其具有固定的拓扑学结构，三个赖氨酸残基指向衣壳内部并且与RNA相互作用，4个另外的赖氨酸残基向衣壳外部暴露。这些确定的特性促成了抗原附着于颗粒外部，而不是附着于其中赖氨酸与RNA相互作用的颗粒内部。
在本发明一个非常优选的实施方案中，本发明的生长素释放肽-肽通过已经加入本发明生长素释放肽-肽中的半胱氨酸残基，与RNA噬菌体外壳蛋白的VLP，特别是Qβ外壳蛋白的VLP的赖氨酸残基结合。
来自于RNA噬菌体的VLP的另一个优势是其在细菌中的高表达产量，这允许以可承受的成本生产大量的物质。另一个优选的实施方案是来自于RNA噬菌体外壳蛋白与本发明生长素释放肽-多肽的融合蛋白的VLP。
VLP作为载体的用途容许分别形成具有可变抗原密度的坚固的抗原阵列和偶联物。特别的，RNA噬菌体VLP的使用，尤其是RNA噬菌体Qβ外壳蛋白的VLP的使用容许获得非常高的表位密度。具有高表位密度的RNA噬菌体外壳蛋白VLP的组合物的制备可根据本申请的教导来实现。在本发明优选的实施方案中，当本发明的生长素释放肽-肽偶联于RNA噬菌体的VLP，优选偶联于Qβ外壳蛋白的VLP时，每个亚基的本发明生长素释放肽-肽的平均数目为0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或更高是优选的。
如这里所定义的，非天然的第二附着位点，当存在时，是已经被加入本发明的生长素释放肽-肽的化学部分。这样的非天然第二附着位点可以工程构建到本发明的生长素释放肽-肽中，优选通过基因工程构建或化学合成既含有生长素释放肽-肽又含有第二附着位点的多肽。
如上面所描述的，四个赖氨酸残基暴露在Qβ外壳蛋白VLP的表面上。一般这些残基当与交联剂分子反应时而被衍生化。在不是全部的暴露的赖氨酸残基都能偶联抗原的情况下，在衍化步骤后，已经与交联剂反应的赖氨酸残基的ε氨基上附着有交联剂分子。这导致一个或几个正电荷丢失，而可能不利于VLP的溶解性和稳定性。正如在下述公开的Qβ外壳蛋白突变体中，通过用精氨酸代替一些赖氨酸残基，我们防止了正电荷的过多丢失，因为精氨酸残基不与优选的交联剂发生反应。而且，用精氨酸代替赖氨酸残基可产生更确定的抗原阵列，因为可与抗原反应的位点变少了。
因此，在本申请公开的下列Qβ外壳蛋白突变体和突变的QβVLP中，暴露的赖氨酸残基被精氨酸替代Qβ-240(Lys13-Arg；SEQ ID NO17)、Qβ-250(Lys2-Arg，Lys13-Arg；SEQ ID NO19)、Qβ-251；(SEQ IDNO20)和Qβ-259(Lys2-Arg，Lys16-Arg；SEQ ID NO21)。克隆该构建体，表达蛋白质，纯化VLP并用于与本发明的生长素释放肽-肽偶联。
在进一步的实施方案中，我们公开了具有一个附加的赖氨酸残基、适于获得更高密度抗原阵列的Qβ突变外壳蛋白。克隆这个突变的Qβ外壳蛋白，Qβ-243(Asn 10-Lys；SEQ ID NO18)，表达该蛋白质，并分离和纯化衣壳或VLP，其显示导入附加的赖氨酸残基与亚基自组装成衣壳或VLP相匹配。
在设计非天然的第二附着位点之前，必须选择其融合、插入或一般工程化的位置。因此选择第二附着位点的位置以避免来自该第二附着位点或包含该位点的任何氨基酸接头的空间阻碍。在进一步的实施方案中，需要抗体应答针对不同于自身抗体与其天然配体相互作用位点的位点。在这种实施方案中，可选择第二附着位点以阻止产生针对自身抗体与其天然配体的相互作用位点的抗体。
在最优选的实施方案中，本发明的生长素释放肽-肽包括附加的单个第二附着位点或能够与核心颗粒和VLP或VLP亚基上的第一附着位点分别结合的单个反应性附着位点。这确保了至少一个，但一般为一个以上，优选多于10、20、40、80、120、150、180、210、240、270、300、360、400、450个本发明的生长素释放肽-肽分别确定且均一地结合和连接到核心颗粒和VLP上。因此抗原上具有单个第二附着位点或单个反应性附着位点，确保了单一和一致类型的结合和连接，分别产生非常高度有序和重复的阵列。例如，如果结合和连接分别通过赖氨酸-(作为第一附着位点)和半胱氨酸-(作为第二附着位点)相互作用实现，根据本发明该优选实施方案，确保了每个本发明的生长素释放肽-肽只有一个加入的半胱氨酸残基能够分别与VLP和核心颗粒的第一附着位点分别结合和连接。
在优选的实施方案中，氨基酸接头通过至少一个共价键，优选通过至少一个肽键的方式与抗原或抗原决定簇结合。优选地，氨基酸接头包括，或由第二附着位点组成。在更优选的实施方案中，该氨基酸接头包括巯基或半胱氨酸残基。在另一个优选的实施方案中，该氨基酸接头是半胱氨酸。
在本发明的一个优选实施方案中，至少一个本发明的生长素释放肽-肽分别与核心颗粒和VLP融合。在本发明更优选的实施方案中，本发明的生长素释放肽-肽与VLP或能够掺入VLP内的蛋白质的至少一个亚基融合，产生嵌合VLP-亚基生长素释放肽-肽融合蛋白。编码本发明的生长素释放肽-肽的基因，是在编码VLP外壳蛋白基因的内部或优选在其N-或C-末端。融合也可通过将生长素释放肽-肽序列插入部分外壳蛋白序列已经缺失的外壳蛋白突变体而实现，该突变体称为截短突变体。截短突变体可具有外壳蛋白序列的一部分的N-或C-末端或内部缺失。例如对于特定VLP HBcAg，用外源表位替换第79-80位氨基酸。通过电子显微镜检查，该融合蛋白当表达时优选保持装配成为VLP的能力。
可加入侧翼氨基酸残基来增加外壳蛋白和外源表位之间的距离。甘氨酸和丝氨酸残基是用于侧翼序列的特别有利的氨基酸。这种侧翼序列赋予额外的柔性，可减少外源序列融合进入VLP亚基序列时可能的去稳定效应，并且减少存在外源表位对装配的干扰。
在一个优选的实施方案中，修饰的VLP是嵌合性的VLP。在优选的实施方案中，所述嵌合性的VLP包括或由至少一个融合蛋白和至少一个病毒外壳蛋白组成。在另外的实施方案中，至少一个本发明的生长素释放肽-肽能够与许多其他的病毒外壳蛋白，例如QβA1蛋白截短形式的C-末端融合(Kozlovska，T.M.，et al.，Intervirology 399-15(1996))，或插入CP延伸区的第72和73位之间。例如Kozlovska等，(Intervirology，399-15(1996))描述了表位在第19位截短的QβCP延伸区C-末端融合的QβA1蛋白融合体。另一个实施例中，生长素释放肽-肽能够插入frCP的第2和3位氨基酸之间，形成生长素释放肽-肽-frCP的融合蛋白(Pushko P.et al.，Prot.Eng.6883-891(1993))。而且，生长素释放肽-肽能够与RNA噬菌体MS-2外壳蛋白的N末端突出β-发夹融合(WO92/13081)。或者，生长素释放肽-肽也可与乳头瘤病毒的衣壳蛋白融合，优选与1型牛乳头瘤病毒(BPV-1)的主要衣壳蛋白L1融合(Chackerian，B.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 962373-2378(1999)，WO 00/23955)。用生长素释放肽-肽替换BPV-1L1的第130-136位氨基酸也是本发明的实施方案。本发明抗原用于外壳蛋白、其突变体或片段、及病毒的外壳蛋白的实施方案已经在WO 2004/009124的第62页第20行至第68页第17行公开，其在此引入作为参考。
在本发明进一步优选的实施方案中，本发明的生长素释放肽-肽是具有6或8个氨基酸残基长度的生长素释放肽-肽，其中该肽与SEQ IDNO1或SEQ ID NO3同源，并且选自a)人生长素释放肽；b)猫生长素释放肽；c)狗生长素释放肽；d)牛生长素释放肽；e)羊生长素释放肽；f)马生长素释放肽，和g)猪生长素释放肽。
本发明进一步优选的实施方案中，本发明的生长素释放肽-肽分别是人、猫、猪、马、羊、牛、豚鼠、狗或小鼠的本发明的生长素释放肽-肽。本发明的生长素释放肽-肽能通过重组表达编码本发明生长素释放肽-肽的DNA来生产。优选地，该DNA不编码前原生长素释放肽而只编码活性的n-辛酰基-修饰的肽的肽骨架。其多种实例已经在文献中有描述，而且在修改后可以用于表达任何所需要物种的本发明的生长素释放肽-肽，优选以融合多肽的形式表达，例如与GST、DHFR、组氨酸标记、Flag标记、myc标记或抗体恒定区(Fc区域)融合。通过在本发明的生长素释放肽-肽及其标记之间引入肠激酶切割位点，本发明的生长素释放肽-肽可通过用肠激酶消化而在纯化后与标记分离。在另一个方法中，使用本领域技术人员已知的标准肽合成反应，能够在体外合成有或没有n-辛酰基修饰的本发明的生长素释放肽-肽。
在一个优选的实施方案中，生长素释放肽-肽选自GSSFLS(SEQ IDNO1)或GSSFLSPE(SEQ ID NO3)。在更优选的实施方案中，生长素释放肽-肽与SEQ ID NO1或SEQ ID NO3只有一个位置不同，其中所述的不同并不产生SEQ ID NO2。在进一步优选的实施方案中，所述的差别是在特定位置的氨基酸特性的差别，而不是长度的差别。
在一个优选的实施方案中，生长素释放肽-肽不包含n-辛酰基-修饰。
由于不同物种的生长素释放肽是高度同源的，很可能诱导交叉反应的抗体应答。因此针对狗或小鼠生长素释放肽的抗体应答也可能识别人的生长素释放肽，反之亦然。因此在本发明的范围内，与人生长素释放肽的氨基酸同一性大于80％，优选高于85％，更优选高于90％，或更优选高于95％、97％或99％的本发明全部生长素释放肽-肽，可用于疫苗接种，反之亦然。与SEQ ID NOs 1或3只有一个位置不同而不是SEQID NO2的本发明的这种生长素释放肽-肽是本发明优选的生长素释放肽-肽。
在本发明的一个优选实施方案中，修饰的VLP进一步包括至少一个多肽，其中所述的至少一个多肽与本发明的生长素释放肽-肽融合。附加氨基酸序列与生长素释放肽-肽融合可增加生长素释放肽-肽的溶解性和/或稳定性。一般且优选地，所述的至少一个多肽不包括或不由来自生长素释放肽-肽的氨基酸序列组成。在一个更优选的实施方案中，所述的至少一个多肽是氨基酸接头。在优选的实施方案中，所述的氨基酸接头包括或由至少一个第二附着位点组成。在更优选的实施方案中，所述的本发明的氨基酸接头包括或或优选地由C、GC或GGC的接头序列组成。优选地，所述的氨基酸接头与本发明的生长素释放肽的C-末端融合。优选地，具有所述附加的至少一个第二附着位点的本发明的生长素释放肽-肽包括，或由选自下列的氨基酸序列组成Ghrel24-31GCGSSFLSPEGC(SEQ ID NO50)Ghrel24-31C GSSFLSPEC(SEQIDNO51)Ghrel24-30GCGSSFLSPGC(SEQ ID NO52)Ghrel24-30C GSSFLSPC(SEQ ID NO53)Ghrel24-29GCGSSFLSGC(SEQ ID NO54)Ghrel24-29C GSSFLSC(SEQ ID NO55)在本发明的进一步优选的实施方案中，具有所述的至少一个第二附着位点的本发明的生长素释放肽-肽包括，或由SEQ ID NO50或SEQID NO51的氨基酸序列组成。
本发明的一些非常优选的生长素释放肽-肽在实施例9中有描述。这些肽包括C-末端半胱氨酸残基作为用于偶联VLP和菌毛的加入的第二附着位点。本发明的这些非常优选的短的生长素释放肽-肽当分别偶联于VLP和核心颗粒时，能够具有非常高的免疫原性。而且本发明的优选生长素释放肽-肽也能够克服当靶向自体蛋白时出现的安全性问题，因为较短的片段更不太可能含有T细胞表位。一般肽越短，对T细胞活化越安全。但是，太短的肽，即具有少于4个氨基酸的肽，可能不能够诱导能够强烈结合溶液中的生长素释放肽的高亲和抗体。
由于生长素释放肽的N-末端片段在全部已知物种中都是相同的，因此主要选择相应于第1-8位残基的生长素释放肽片段(GSSFLSPE)(SEQ ID NO3)的非常优选的生长素释放肽-肽片段。此外，在还未鉴定出生长素释放肽的物种中，它也可能是相同的。而且，C-末端残基，谷氨酸，当分别偶联至VLP和核心蛋白时，将增强溶解性，促进可溶性疫苗产物的生产。实际上，肽的可溶性经常是偶联效率和疫苗稳定性的限制因素。进一步的推论包括，避免潜在性T细胞表位。选择较小的肽片段减少了存在T细胞表位的可能性。当免疫小鼠时，通过C-末端与VLP偶联的第1-8位生长素释放肽残基可诱导N-末端特异性抗体，其能够结合活性的生长素释放肽，并且因此优选地阻止其通过血脑屏障而导致摄食减少。
由于与上述相似的原因，选择相应于第1-6位残基(GSSFLS)(SEQID NO1)的鼠生长素释放肽-肽片段的非常优选的生长素释放肽-肽片段。通过其C-末端与VLP偶联的第1-6位生长素释放肽残基将诱导中和活性生长素释放肽的抗体，并且因此优选地可阻止其通过血脑屏障，而导致食物摄取的减少。
在进一步的方面，本发明提供包括本发明的修饰的核心颗粒，或优选本发明的修饰的VLP的组合物。
在另一个方面，本发明提供包括本发明的修饰的核心颗粒，或优选本发明的修饰的VLP，以及可接受的药物载体的药物组合物。
在又一个方面，本发明提供包括本发明的修饰的核心颗粒或优选本发明的修饰的VLP的疫苗组合物。
在一个实施方案中，本发明提供还包括佐剂的本发明的疫苗组合物。在另一个实施方案中，本发明的疫苗组合物不含佐剂。在本发明的进一步实施方案中，该疫苗组合物包括本发明的核心颗粒，其中该核心颗粒包括，优选地是病毒样颗粒，其中优选所述的病毒样颗粒是重组的病毒样颗粒。优选地，该病毒样颗粒包括、或基本上由、或由RNA噬菌体的重组蛋白、或其片段，优选RNA噬菌体的外壳蛋白组成。在优选的实施方案中，RNA噬菌体的外壳蛋白具有选自下列的氨基酸(a)SEQ ID NO4；(b)SEQ ID NO4和SEQ ID NO5的混合物；(c)SEQ IDNO6；(d)SEQ ID NO7；(e)SEQ ID NO8；(f)SEQ ID NO9；(g)SEQ IDNO9和SEQ ID NO10的混合物；(h)SEQ ID NO11；(i)SEQ ID NO12；(k)SEQ ID NO13；(l)SEQ ID NO14；(m)SEQ ID NO15；(n)SEQIDNO16；和(o)SEQ ID NO28。或者，本发明的疫苗组合物中病毒样颗粒的重组蛋白包括、或基本上由、或由RNA噬菌体的突变外壳蛋白组成，其中该RNA噬菌体选自(a)噬菌体Qβ；(b)噬菌体R17；(c)噬菌体fr；(d)噬菌体GA；(e)噬菌体SP；(f)噬菌体MS2；(g)噬菌体M11；(h)噬菌体MX1；(i)噬菌体NL95；(k)噬菌体f2；(l)噬菌体PP7；和(m)噬菌体AP205。
在优选的实施方案中，所述RNA噬菌体的突变外壳蛋白已经通过除去、或通过以替换方式添加至少一个赖氨酸残基替换而被修饰。在另一个优选的实施方案中，所述RNA噬菌体的突变外壳蛋白已经通过缺失至少一个赖氨酸残基，或通过以插入方式添加至少一个赖氨酸残基而被修饰。在优选的实施方案中，该病毒样颗粒包括RNA噬菌体Qβ或RNA噬菌体fr、RNA-噬菌体GA、或RNA噬菌体AP205的重组蛋白或其片段。
在进一步的方面，本发明提供针对生长素释放肽进行免疫，优选用于治疗肥胖症的方法，包括将本发明的疫苗组合物施用于动物或人的步骤。在一个优选的实施方案中，疫苗组合物被施用于人，并且其中所述的生长素释放肽-肽是人的生长素释放肽-肽。
在另一个优选的实施方案中，所述的动物是猫科动物起源的，并且其中所述的生长素释放肽-肽是猫科动物的生长素释放肽-肽。在另一个优选的实施方案中，所述的动物是犬科动物起源的，并且其中所述的生长素释放肽-肽是犬科动物的生长素释放肽-肽。
在一个方面，本发明提供本发明的修饰的核心颗粒，优选本发明的修饰的VLP用作药物。
在进一步的方面，本发明提供本发明的修饰的核心颗粒，优选本发明的VLP，用于制造治疗肥胖症的药物的用途。
实施例实施例1HBcAg1-185-Lys的构建。
肝炎核心抗原(HBcAg)1-185如WO 02/056905的实施例23中所描述的进行修饰。c/el表位(第72至88位残基)区域的部分(脯氨酸79和丙氨酸80)被肽Gly-Gly-Lys-Gly-Gly(SEQ ID NO33)遗传替代，产生HBcAg-Lys构建体(SEQ ID NO26)。导入的赖氨酸残基在其侧链上含有反应性氨基，其能够用于HBcAg颗粒与含有游离半胱氨酸基团的任何抗原的分子间化学交联。使用PCR方法和常规的克隆技术制备HBcAg1-185-Lys基因。
如上述WO 02/056905的实施例23中所描述的，通过从pEco63扩增HBcAg基因的两个单独片段，随后通过PCR融合两个片段以组装成全长基因来插入Gly-Gly-Lys-Gly-Gly序列(SEQ ID NO33)。使用下列PCR引物组合片段1引物1EcoRIHBcAg(s)(SEQ ID NO56)引物2Lys-HBcAg(as)(SEQ ID NO57)片段2引物3Lys-HBcAg(s)(SEQ ID NO58)引物4HBcAgwtHindIIIICGCGTCCCAAGCTTCTAACATTGAGATTCCCGAGATTG (SEQID NO59)组装
引物1EcoRIHBcAg(s)(SEQ ID NO56)引物2HBcAgwtHindIIII(SEQ ID NO59)然后装配的全长基因用EcoRI(GAATTC)和HindIII(AAGCTT)酶进行消化，并克隆到在相同限制性位点切开的pKK载体(Pharmacia)中。
实施例2HBcAg的MIR区域中肽表位的融合。
FBcAg1-185的第79和80位残基用序列VNLTWSRASG(SEQ IDNO60)的表位CεH3替换。CεH3序列源自人IgE重链的第三个恒定区的序列。该表位利用装配PCR的方法被插入HBcAg1-185序列。在第一个PCR步骤中，使用源自ATCC克隆pEco63，并用引物HBcAg-wt EcoRIfwd和HBcAg-wt Hind III rev扩增的HBcAg1-185基因，作为两个单独反应中的模板以扩增包含编码CεH3序列的序列元件的2个片段。之后这2个片段在装配PCR反应的第二步PCR中进行组装。
在第一个PCR步骤中的引物组合CεH3fwd与HBcAg-wt Hind IIIrev，和HBcAg-wt EcoRI fwd与CεH3rev。在装配PCR反应中，在第一个PCR步骤中分离的两个片段首先通过3个PCR循环组装，这一步不需要外部引物，之后向反应混合物加入外部引物进行随后的25个循环。外部引物HBcAg-wt EcoRI fwd和HBcAg-wt Hind III rev。
使用EcoRI和HindIII位点将PCR产物克隆到pKK223中，用于在大肠杆菌中表达(参见WO 02/056905的实施例23)。在大肠杆菌中表达嵌合的VLP，并如WO 02/056905的实施例23中所描述的进行纯化。从凝胶过滤中洗脱的HBcAg1-185-CεH3的洗脱体积显示了融合蛋白装配为嵌合VLP。
引物序列CεH3fwd5′GTT AAC TTG ACC TGG TCT CGT GCT TCT GGT GCA TCCAGG GAT CTA GTA GTC 3′(SEQ ID NO61)V N L T W S R A S G A80 S R D L V V86(SEQ ID NO62)
CεH3rev5′ACC AGA AGC ACG AGA CCA GGT CAA GTT AAC ATC TTCCAA ATT ATT ACC CAC 3′(SEQ ID NO63)D78E L N N G V72(SEQ ID NO64)HBcAg-wt EcoRI fwd5′CCGgaattcATGGACATTGACCCTTATAAAG(SEQ ID NO65)HBcAg-wt Hind III reV5′CGCGTCCCaagcttCTAACATTGAGATTCCCGAGATTG(SEQ IDNO66)实施例3HBcAg的MIR区域中生长素释放肽24-31-肽表位的融合。
HBcAg1-185的第79和80位残基用生长素释放肽-肽表位的序列GSSFLSPE(SEQ ID NO3)替换。用实施例2中描述的相同策略来设计两个重叠的引物，并通过装配PCR构建融合蛋白。将PCR产物克隆到pKK223.3载体中，并在大肠杆菌K802中表达。如WO 02/056905的实施例24中所描述的表达和纯化嵌合的VLP。
实施例4生长素释放肽24-31-肽表位与在CP延伸的第19位截短的QβA1蛋白C-末端的融合。
在pQβ10作为模板的PCR反应中使用与QβA1基因5’端退火的一条引物和与A1基因3’端退火的一条引物，后者还含有编码序列GSSFLSPE(SEQ ID NO3)的生长素释放肽片段的序列元件。将PCR产物克隆到pQβ10(Kozlovska T.M.et al.，Gene 137133-37(1993))中，并且如WO 02/056905的实施例18中所述表达和纯化嵌合的VLP。
实施例5在fr外壳蛋白的第2和3位之间插入生长素释放肽24-31-肽表位。
编码序列GSSFLSPE(SEQ ID NO3)的生长素释放肽-肽序列，并且含有Bsp119I相容末端和能进行框内插入的附加核苷酸的互补引物可通过标准的分子生物学技术插入pFrd8载体的Bsp119I位点(Pushko，P.etal.，Prot.Eng.6883-91(2993))。或者，pFrd8载体的突出端在用Bsp119I消化后用Klenow补平，并且将编码鼠生长素释放肽-肽序列的寡核苷酸和用于框内克隆的其他核苷酸在用Klenow处理后连接至pFrd8中。具有正确方向插入的克隆通过测序进行分析。除了使用Sepharose CL-4B或Sephacryl S-400(Pharmacia)进行色谱步骤之外，如Pushko，P.et al，Prot.Eng.6883-91(1993)所描述的，在大肠杆菌JM109或大肠杆菌K802中表达和纯化嵌合的融合蛋白。用硫酸铵沉淀细胞裂解物，并通过两个连续的凝胶过滤纯化步骤进行纯化，类似于WO 02/056905的实施例18中所描述的用于Qβ的步骤。
实施例6在载体pOGS8111中Ty1蛋白p1的第67和68位之间插入生长素释放肽24-31-肽表位。
合成两个编码人生长素释放肽-肽序列GSSFLSPE(SEQ ID NO3)、末端与pOGS8111的NheI位点相容的互补寡核苷酸。根据EP06777111的描述，加入附加的核苷酸以提供编码鼠生长素释放肽表位序列的框内插入。位于插入表位侧翼的氨基酸AS和SS是由在pOGS8111的TyA(d)基因中插入该寡核苷酸而产生的改变的NheI位点编码的。
如EP0677111和其中的参考文献所描述的，将POGS8111转化进入酿酒酵母MC2中来用于表达嵌合的Ty VLP。嵌合的Ty VLP通过EP0677111中所描述的蔗糖梯度超速离心进行纯化。
实施例7将生长素释放肽24-31-肽表位插入1型乳头瘤病毒(BPV-1)的主要衣壳蛋白L1。
用编码具有序列GSSFLSPE(SEQID NO3)的生长素释放肽表位的序列替换在所描述(Chackerian，B.et al.，Proc.Natl.Acad.USA 962373-2378(1999))的pFastBac1(GIBCO/BRL)载体中克隆的BPV-1L1基因第130-136位氨基酸的编码序列。该构建体的序列通过核苷序列测定来检验。利用如制造商所描述的GIBCO/BRL棒状病毒系统产生重组的棒状病毒。如Kirnbauer，R.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.8912180-84(1992)和Greenstone，H.L，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.951800-05(1998)所描述的，从棒状病毒感染的Sf9细胞中纯化嵌合的VLP。
实施例8用与VLP融合的生长素释放肽-肽免疫小鼠。
实施例3、5、6和7中产生的展示序列GSSFLSPE(SEQ ID NO3)的鼠生长素释放肽表位的嵌合VLP如实施例12所描述的用于免疫小鼠。如实施例13所描述的，在生长素释放肽特异性ELISA分析中分析从免疫小鼠获得的血清。通过跟踪小鼠的体重增加和测量食物摄取来检验该疫苗的效果。
实施例9生长素释放肽-肽与VLP的偶联根据标准的步骤化学合成包括与生长素释放肽片段C-末端融合的GC或C接头序列的生长素释放肽片段24-31和24-30(SEQ ID NO50-53)。
根据标准的步骤化学合成包括与生长素释放肽片段C-末端融合的GC或C接头序列的生长素释放肽片段24-29(SEQ ID NO54-55)。
Ghrel24-31GC GSSFLSPEGC(SEQ ID NO50)Ghrel24-31CGSSFLSPEC(SEQ ID NO51)Ghrel24-30GC GSSFLSPGC(SEQ ID NO52)Ghrel24-30CGSSFLSPC(SEQ ID NO53)Ghrel24-29GC GSSFLSGC(SEQ ID NO54)Ghrel24-29CGSSFLSC(SEQ ID NO55)
使在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的2ml 2.0mg/ml QβVLP的溶液，与114.4μl SMPH(Pierce)溶液(来自溶解于DMSO的50mM的原液)在25℃下反应30分钟。之后在4℃下，使反应液用2L20mMHepes，150mM NaCl，pH7.2透析两次，每次2小时。
之后，将已透析的衍生化QβVLP用来偶联生长素释放肽24-31-GC、生长素释放肽24-31C、生长素释放肽24-30GC或生长素释放肽24-30C。简而言之，将1ml衍生化的QβVLP(浓度为2mg/ml)与286μl 10mM的肽溶液，于15℃在20mM Hepes，150mM NaCl，pH7.2中反应2小时。之后，偶联反应液于13000rpm离心5分钟并收集上清液，透析一次共2小时，然后用2L 20mM Hepes，150mM NaCl，pH7.2于4℃透析过夜。
使用16％TRIS/BIS SDS-PAGE凝胶(Invitrogen)，通过SDS-PAGE评估生长素释放肽与QβVLP的共价化学偶联。偶联反应的考马斯蓝染色凝胶证实出现相应于所预测的共价连接于Qβ的生长素释放肽-肽的分子量条带(图1)。相应于每个亚基偶联1、2、3或4个肽的偶联条带用箭头标明。这些附加条带的出现与单独的衍生化QβVLP相比，证明该生长素释放肽片段与QβVLP共价地结合。通过考马斯蓝染色的SDS-PAGE的光密度分析来评估偶联效率(即，mol Qβ-生长素释放肽/mol Qβ单体(总的))，是每个Qβ单体大约结合2个生长素释放肽片段。
之后将已透析的衍生化QβVLP用于与生长素释放肽24-29-GC或生长素释放肽24-29-C偶联。简而言之，将1ml衍生化的QβVLP(浓度为2mg/ml)与286μl 10mM肽溶液，于15℃，在20mM Hepes，150mMNaCl，pH7.2中反应2小时。之后，将偶联反应物于13000rpm离心5分钟并收集上清液，透析一次共2小时，之后用2L 20mM Hepes，150mMNaCl，pH7.2于4℃透析过夜。
生长素释放肽-肽与fr VLP的偶联将在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的120μM fr VLP溶液，与从在DMSO中的储液稀释为10倍摩尔过量的SMPH(Pierce)于25℃在摇床上反应30分钟。随后将反应溶液用1L 20mM Hepes，150mMNaCl，pH7.2在4℃下透析两次，每次2小时。之后将透析的fr反应混合物与等摩尔浓度的生长素释放肽-肽，或以1∶2的生长素释放肽-肽/fr比例，于16℃在摇床上反应过夜。用SDS-PAGE分析偶联产物。
生长素释放肽-肽与AP205VLP的偶联将在20mM Hepes，150mM NaCl，pH7.2中的120μM AP205VLP溶液与从在DMSO中的储液稀释为10倍摩尔过量的SMPH(Pierce)于25℃在摇床上反应30分钟。之后将反应液于4℃下在1L 20mM Hepes，150mM NaCl，pH 7.2中透析2次，每次2小时。之后将透析的AP205反应混合物与等摩尔浓度的生长素释放肽-肽或以1∶2的生长素释放肽-肽/AP205比例，于16℃在摇床上反应过夜。用SDS-PAGE分析偶联产物。
生长素释放肽-肽与HBcAg-Lys-2cys-Mut的偶联将在20mM Hepes，150mM NaCl，pH 7.2中的120μMHBcAg-Lys-2cys-Mut溶液与从在DMSO中的储液稀释为10倍摩尔过量的SMPH(Pierce)于25℃在摇床上反应30分钟。之后将反应液于4℃在1L 20mM Hepes，150mM NaCl，pH 7.2中透析2次，每次2小时。之后将透析的HBcAg-Lys-2cys-Mut反应混合物与等摩尔浓度的生长素释放肽-肽或以1∶2的生长素释放肽-肽/HBcAg-Lys-2cys-Mut比例，于16℃在摇床上反应过夜。用SDS-PAGE分析偶联产物。
生长素释放肽-肽与菌毛的偶联将在20mM Hepes，pH7.2中的125μM大肠杆菌1型菌毛溶液与从在DMSO中的储液稀释为50倍摩尔过量的交联剂SMPH(Pierce))于室温在摇床上反应60分钟。反应混合物在PD-10柱(Amersham-PharmaciaBiotech)上脱盐。合并从柱上洗脱下来的含蛋白质级分，使脱盐的衍生化菌毛蛋白以等摩尔浓度或以1∶2的肽/菌毛比与生长素释放肽-肽在摇床上于16℃反应过夜。用SDS-PAGE分析偶联产物。
实施例10用偶联于QβVLP的生长素释放肽24-31-GC、24-31C、24-30GC或24-30C免疫小鼠用偶联于现有的QβVLP的鼠生长素释放肽24-31-GC、24-31C、24-30GC或24-30C(从实施例9a获得)接种成年雌性C57BL/6小鼠(每组5只)。将来自每个样品的100μg已透析的疫苗在PBS中稀释到200μl体积，并在第0、14、28和42天进行皮下注射(在两腹侧注射100μl)。施用不含佐剂的疫苗。一组小鼠注射PBS作为对照。在第0、14、28、42和56天从小鼠眼眶后取血，并如实施例11中所描述的通过ELISA分析其血清。
实施例11用ELISA检测生长素释放肽特异性抗体ELISA平板(96孔MAXIsorp，NUNC免疫平板)用在包被缓冲液(0.1M NaHCO3，pH 9.6)中、浓度为20μg/ml的生长素释放肽蛋白(Bachem)于4℃包被过夜。用洗涤缓冲液(PBS-0.05％Tween)洗涤平板后，用封闭缓冲液(2％BSA-PBS-Tween 20溶液)于37℃封闭该平板2小时，之后再次洗涤并用连续稀释的小鼠血清孵育。作为对照，也检测相同小鼠的免疫前血清。平板于室温下孵育2小时。再次洗涤后，用HRPO标记的Fc特异性山羊抗-小鼠IgG抗体(Jackson Immunoresearch)检测结合的抗体，并于室温下孵育1小时。再次洗涤后，平板用OPD溶液(1个OPD片剂，25μl OPD缓冲液和8μl H2O2)显色6分钟，并用5％的H2SO4溶液终止反应。平板在ELISA阅读仪(Biorad Benchmark)上于450nm处读数。ELISA滴度表示为在ELISA分析中产生最大OD值的一半的血清稀释度。表1显示了生长素释放肽-特异性抗体的平均滴度。显示的结果是来自每组5只小鼠所汇集的血清的滴度。ELISA滴度表示为在ELISA分析中产生最大OD值的一半的血清稀释度。用偶联于现有QβVLP的鼠生长素释放肽24-31-GC、24-31C、24-30GC或24-30C免疫的所有小鼠，在第56天激发出良好的生长素释放肽-特异性抗体滴度(表1)。免疫前血清或来自注射PBS的小鼠的血清没有显示针对鼠生长素释放肽的任何反应性。最大OD滴度值的一半小于100，这被认为低于该分析的截断值。这清楚地证明，即使当其是自体蛋白时，生长素释放肽-VLP偶联物也能够诱导对生长素释放肽蛋白的高抗体滴度。这清楚地表明用生长素释放肽片段产生的抗体能够识别生长素释放肽蛋白。
表1用Qb-Ghr 24-31GC、Qb-Ghr 24-31C、Qb-Ghr 24-30GC或Qb-Ghr 24-30C，在第0、14、28和42天免疫的小鼠中，抗-生长素释放肽-特异性IgG抗体的平均滴度(表示为稀释倍数)。
实施例12在饮食诱导的肥胖症动物模型中，与QβVLP偶联的生长素释放肽24-31GC、生长素释放肽24-31C和生长素释放肽24-30GC的功效实验用实施例9中获得的偶联于QβVLP的生长素释放肽24-31GC、生长素释放肽24-31C和生长素释放肽24-30GC如实施例10中所述接种起始体重相当(18.71g-19.75g)的成年雌性C57BL/6小鼠(每组5只)。给小鼠注射PBS作为对照。第一次注射后，全部小鼠都给予高脂肪饮食(35％重量为脂肪，60％为能量)，用以帮助发展饮食诱导的肥胖症。随意给予食物和水。个体动物的体重在首次注射后大约90天期间内定期监测。
如表2所示，用偶联于QβVLP的生长素释放肽24-31GC、生长素释放肽24-31C和生长素释放肽24-30GC免疫的小鼠，在实验期间，体重增加少于注射PBS的对照动物。实际上，在首次免疫88天后，对照动物体重已经增长了大概76％，而用偶联于QβVLP的生长素释放肽24-31GC、生长素释放肽24-31C和生长素释放肽24-30GC免疫的小鼠，体重分别只增长了60％、67％和73％。因此，这三个接种组与对照组相比，显示明显减少的体重增长。这些结果清楚证明了生长素释放肽-VLP偶联物能够减少体重的增加。
表2用偶联于QβVLP的生长素释放肽24-31GC、生长素释放肽24-31C和生长素释放肽24-30GC免疫88天后，以百分比表示的每组10只小鼠的平均体重增加和SEM。
实施例13用与QβVLP偶联的生长素释放肽24-29-GC和24-29C免疫小鼠用实施例9中获得的偶联于QβVLP的生长素释放肽24-29-GC和24-29C接种成年雄性或雌性C57BL/6小鼠。简而言之，将来自每个样品的100μg已透析的疫苗在PBS中稀释至200μl体积，在第0、14、28和42天皮下注射(在两腹侧注射100μl)，之后根据需要注射。施用的疫苗含有或不含有佐剂。作为对照，一组小鼠用含有或不含有佐剂的QβVLP免疫，或注射PBS。在第0、14、28、42天以及之后以规律的间隔从小鼠眼眶后取血。之后如实施例11中描述的通过ELISA定量生长素释放肽特异性抗体。
实施例14在饮食诱导的肥胖症动物模型中，偶联于QβVLP的生长素释放肽24-29GC或24-29C的功效实验如实施例10中描述的，用实施例11中获得的偶联于QβVLP的生长素释放肽24-30C、24-29GC或24-29C接种初始体重相当的成年雄性或雌性C57BL/6小鼠。用单独的QβVLP免疫小鼠或注射PBS作为对照。之后如果实验过程中生长素释放肽特异性抗体滴度明显下降则对小鼠进行加强免疫。全部小鼠都给予高脂肪饮食(35％重量为脂肪，60％为能量)，以帮助发展饮食诱导的肥胖症。随意给予食物和水。以规律的间隔监测体重。
实施例15在肥胖症的遗传动物模型中，偶联于QβVLP的生长素释放肽24-31GC、生长素释放肽24-31C、生长素释放肽24-30GC、生长素释放肽24-30C、生长素释放肽24-29GC或24-29C的功效实验如实施例10中描述的，用实施例9中获得的偶联于现有QβVLP的生长素释放肽24-31GC、生长素释放肽24-31C、生长素释放肽24-30GC、生长素释放肽24-30C、生长素释放肽24-29GC或生长素释放肽24-29C接种成年雄性或雌性C57BL/6ob/ob小鼠。用QβVLP免疫小鼠或注射PBS作为对照。之后如果实验过程中生长素释放肽特异性抗体滴度明显下降则对小鼠进行加强免疫。全部小鼠都随意给予标准饮食(由4％-10％重量的脂肪组成)，并可自由获得饮水。以规律的间隔监测体重。
实施例16在治疗性饮食诱导的肥胖症动物模型中，偶联于QβVLP的生长素释放肽24-31GC、生长素释放肽24-31C、生长素释放肽24-30GC、生长素释放肽24-30C、生长素释放肽24-29GC或生长素释放肽24-29C的功效实验对成年的雄性或雌性C57BL/6小鼠随意饲喂高脂肪饮食约17-24周或直到它们已经变得肥胖(重量＞45g)。之后将小鼠分组，使得所有组的初始体重的分布和平均初始体重相似。
用在实施例9中获得的偶联于QβVLP的鼠生长素释放肽24-31GC、生长素释放肽24-31C、生长素释放肽24-30GC、生长素释放肽24-30C、生长素释放肽24-29GC或生长素释放肽24-29C如实施例10所述接种小鼠。用QβVLP免疫小鼠或注射PBS作为对照。如果生长素释放肽特异性抗体滴度开始减少，则对小鼠进一步加强免疫。在第0、14、28、42、56、70天以及随后以月为间隔从小鼠眼眶后取血。如实施例11所描述的通过ELISA分析血清的生长素释放肽特异性抗体。以规律的间隔监测体重。
实施例17在体内动物模型中，用偶联于QβVLP的生长素释放肽24-31GC阻断外源的放射性生长素释放肽向脑的迁移。
如实施例10中所描述的，用实施例9中获得的偶联于QβVLP的生长素释放肽24-31GC接种成年雌性C57BL/6小鼠(每组3只)。用QβVLP注射小鼠作为对照。在第174天施行另一次免疫，并且14天后所有的小鼠用10ng碘化的丝氨酸-辛酰基化的鼠生长素释放肽(I125-生长素释放肽)静脉内攻击。攻击30分钟后，杀死小鼠并收集血清和脑组织。通过闪烁计数测量放射性水平并且计算个体小鼠的血清和脑中存在的I125-生长素释放肽的量。
图2显示与QβVLP免疫的对照小鼠相比，用偶联于QβVLP的生长素释放肽24-31GC免疫的小鼠脑中I125-生长素释放肽显著减少，血清中I125-生长素释放肽量增加。尽管与生理上的血液生长素释放肽浓度相比，施用了60倍过量的I125-生长素释放肽，生长素释放肽特异性抗体还是能够结合和防止I125-生长素释放肽从血液进入脑。这个结果清楚证实了生长素释放肽-VLP偶联物能够螯合血清中的生长素释放肽并因此阻断其在脑中发挥它的作用。
实施例18在体内动物模型中，用偶联于QβVLP的生长素释放肽24-31GC阻断生长素释放肽-诱导的生长激素分泌如实施例10中描述的，用实施例9中获得的偶联于QβVLP的生长素释放肽24-31GC接种成年雌性C57BL/6小鼠(每组5只)。用QβVLP注射小鼠作为对照。大约6周后(第80天)，小鼠禁食48小时，之后用10μg丝氨酸-辛酰基化的鼠生长素释放肽静脉内攻击。攻击5分钟后，从小鼠眼眶后取血并收集血清。通过生长激素特异的ELISA(大鼠生长激素Biotrak测定，Amersham)检测血清中的生长激素水平。
表3显示与QβVLP免疫的对照小鼠相比，用偶联于QβVLP的生长素释放肽24-31GC免疫的小鼠中，生长素释放肽诱导的生长激素释放显著减少。生长素释放肽-特异性抗体能够结合和螯合血清中外源性施用的生长素释放肽，因此，阻断其对生长激素释放的作用。这个结果清楚证实了生长素释放肽-VLP偶联物能够阻止生长素释放肽诱导的生长激素释放。
表3在用Qβ-生长素释放肽24-31GC或QβVLP于第0、14、28和42天免疫的小鼠中，在用10μg丝氨酸-辛酰基化的生长素释放肽攻击5分钟后，平均的生长激素水平。
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<223>噬菌体Q-beta 243突变体<400>18Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Lys Ile Gly Lys Asp Gly Lys1 5 10 15Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val50 55 60Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys65 70 75 80Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe85 90 95Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu100 105 110Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu115 120 125
Asn Pro Ala Tyr130<210>19<211>132<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌体Q-beta 250突变体<400>19Ala Arg Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Arg Asp Gly Lys1 5 10 15Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val50 55 60Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys65 70 75 80Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe85 90 95Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu100 105 110Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu
115 120 125Asn Pro Ala Tyr130<210>20<211>132<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌体Q-beta 251突变体<400>20Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Arg1 5 10 15Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val50 55 60Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys65 70 75 80Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe85 90 95Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu100 105 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu115 120 125Asn Pro Ala Tyr130<210>21<211>132<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌体Q-beta 259突变体<400>21Ala Arg Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Arg1 5 10 15Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val50 55 60Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys65 70 75 80Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe85 90 95Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu
100 105 110Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu115 120 125Asn Pro Ala Tyr130<210>22<211>185<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>22Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu50 55 60Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala65 70 75 80Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys85 90 95Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg100 105 110
Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr115 120 125Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro130 135 140Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg145 150 155 160Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg165 170 175Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys180 185<210>23<211>212<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>23Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr1 5 10 15Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile20 25 30Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu35 40 45Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser50 55 60
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His65 70 75 80His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp Leu Met Asn85 90 95Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Val Ser Arg Asp100 105 110Leu Val Val Gly Tyr Val Asn Thr Thr Val Gly Leu Lys Phe Arg Gln115 120 125Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val130 135 140Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala145 150 155 160Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr165 170 175Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro180 185 190Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg195 200 205Glu Ser Gln Cys210<210>24<211>188<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒<400>24Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ser Ser Tyr Gln Leu Leu1 5 10 15Asn Phe Leu Pro Leu Asp Phe Phe Pro Asp Leu Asn Ala Leu Val Asp20 25 30Thr Ala Thr Ala Leu Tyr Glu Glu Glu Leu Thr Gly Arg Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Ile Arg Gln Ala Leu Val Cys Trp Asp Glu50 55 60Leu Thr Lys Leu Ile Ala Trp Met Ser Ser Asn Ile Thr Ser Glu Gln65 70 75 80Val Arg Thr Ile Ile Val Asn His Val Asn Asp Thr Trp Gly Leu Lys85 90 95Val Arg Gln Ser Leu Trp Phe His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Gln100 105 110His Thr Val Gln Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr115 120 125Pro Ala Pro Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro130 135 140Glu His Thr Val Ile Arg Arg Arg Gly Gly Ala Arg Ala Ser Arg Ser145 150 155 160
Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro165 170 175Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Ser Thr Asn Cys180 185<210>25<211>185<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>25Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu50 55 60Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala65 70 75 80Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys85 90 95Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg100 105 110Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
115 120 125Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro130 135 140Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg145 150 155 160Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg165 170 175Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys180 185<210>26<211>188<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>26Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30Thr Ala Ala Ala Leu Tyr Arg Asp Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp50 55 60Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Thr Asn Leu Glu Asp Gly Gly65 70 75 80
Lys Gly Gly Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Val85 90 95Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr100 105 110Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp115 120 125Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser130 135 140Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser145 150 155 160Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro165 170 175Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys180 185<210>27<211>3635<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>质粒pAP283-58<400>27cgagctcgcc cctggcttat cgaaattaat acgactcact atagggagac cggaattcga 60gctcgcccgg ggatcctcta gaattttctg cgcacccatc ccgggtggcg cccaaagtga 120ggaaaatcac atggcaaata agccaatgca accgatcaca tctacagcaa ataaaattgt 180
gtggtcggat ccaactcgtt tatcaactac attttcagca agtctgttac gccaacgtgt 240taaagttggt atagccgaac tgaataatgt ttcaggtcaa tatgtatctg tttataagcg 300tcctgcacct aaaccggaag gttgtgcaga tgcctgtgtc attatgccga atgaaaacca 360atccattcgc acagtgattt cagggtcagc cgaaaacttg gctaccttaa aagcagaatg 420ggaaactcac aaacgtaacg ttgacacact cttcgcgagc ggcaacgccg gtttgggttt 480ccttgaccct actgcggcta tcgtatcgtc tgatactact gcttaagctt gtattctata 540gtgtcaccta aatcgtatgt gtatgataca taaggttatg tattaattgt agccgcgttc 600taacgacaat atgtacaagc ctaattgtgt agcatctggc ttactgaagc agaccctatc 660atctctctcg taaactgccg tcagagtcgg tttggttgga cgaaccttct gagtttctgg 720taacgccgtt ccgcaccccg gaaatggtca ccgaaccaat cagcagggtc atcgctagcc 780agatcctcta cgccggacgc atcgtggccg gcatcaccgg cgcacacagt gcggttgctg 840gcgcctatat cgccgacatc accgatgggg aagatcgggc tcgccacttc gggctcatga 900gcgcttgttt cggcgtgggt atggtggcag gccccgtggc cgggggactg ttgggcgcca 960tctccttgca tgcaccattc cttgcggcgg cggtgcttca acggcctcaa cctactactg 1020ggctgcttcc taatgcagga gtcgcataag ggagagcgtc gatatggtgc actctcagta 1080caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc aactccgcta tcgctacgtg actgggtcat 1140ggctgcgccc cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc 1200ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc 1260accgtcatca ccgaaacgcg cgaggcagct tgaagacgaa agggcctcgt gatacgccta 1320tttttatagg ttaatgtcat gataataatg gtttcttaga cgtcaggtgg cacttttcgg 1380ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg 1440ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt 1500
attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt 1560gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg 1620ggttacatcg aactggatct caacagcggt aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa 1680cgttttccaa tgatgagcac ttttaaagtt ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtatt 1740gacgccgggc aagagcaact cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga cttggttgag 1800tactcaccag tcacagaaaa gcatcttacg gatggcatga cagtaagaga attatgcagt 1860gctgccataa ccatgagtga taacactgcg gccaacttac ttctgacaac gatcggagga 1920ccgaaggagc taaccgcttt tttgcacaac atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt 1980tgggaaccgg agctgaatga agccatacca aacgacgagc gtgacaccac gatgcctgta 2040gcaatggcaa caacgttgcg caaactatta actggcgaac tacttactct agcttcccgg 2100caacaattaa tagactggat ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc 2160cttccggctg gctggtttat tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg gtctcgcggt 2220atcattgcag cactggggcc agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg 2280gggagtcagg caactatgga tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg 2340attaagcatt ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata tactttagat tgatttaaaa 2400cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct catgaccaaa 2460atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga 2520tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg 2580ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact 2640ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gtccttctag tgtagccgta gttaggccac 2700cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg 2760gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg 2820
gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga 2880acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgcgagcatt gagaaagcgc cacgcttccc 2940gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg 3000agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc 3060tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc 3120agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgttcttt 3180cctgcgttat cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc 3240gctcgccgca gccgaacgac gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc 3300caatacgcaa accgcctctc cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc tgtggtgtca 3360tggtcggtga tcgccagggt gccgacgcgc atctcgactg catggtgcac caatgcttct 3420ggcgtcaggc agccatcgga agctgtggta tggccgtgca ggtcgtaaat cactgcataa 3480ttcgtgtcgc tcaaggcgca ctcccgttct ggataatgtt ttttgcgccg acatcataac 3540ggttctggca aatattctga aatgagctgt tgacaattaa tcatcgaact agttaactag 3600tacgcaagtt cacgtaaaaa gggtatcgcg gaatt 3635<210>28<211>131<212>PRT<213>噬菌体AP205<400>28Met Ala Asn Lys Pro Met Gln Pro Ile Thr Ser Thr Ala Asn Lys Ile1 5 10 15Val Trp Ser Asp Pro Thr Arg Leu Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ser Leu20 25 30
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<223>AP205外壳蛋白<400>29Met Ala Asn Lys Thr Met Gln Pro Ile Thr Ser Thr Ala Asn Lys Ile1 5 10 15Val Trp Ser Asp Pro Thr Arg Leu Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ser Leu
20 25 30Leu Arg Gln Arg Val Lys Val Gly Ile Ala Glu Leu Asn Asn Val Ser35 40 45Gly Gln Tyr Val Ser Val Tyr Lys Arg Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gly50 55 60Cys Ala Asp Ala Cys Val Ile Met Pro Asn Glu Asn Gln Ser Ile Arg65 70 75 80Thr Val Ile Ser Gly Ser Ala Glu Asn Leu Ala Thr Leu Lys Ala Glu85 90 95Trp Glu Thr His Lys Arg Asn Val Asp Thr Leu Phe Ala Ser Gly Asn100 105 110Ala Gly Leu Gly Phe Leu Asp Pro Thr Ala Ala Ile Val Ser Ser Asp115 120 125Thr Thr Ala130<210>30<211>3607<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>质粒pAP281-32<400>30cgagctcgcc cctggcttat cgaaattaat acgactcact atagggagac cggaattcga 60gctcgcccgg ggatcctcta gattaaccca acgcgtagga gtcaggccat ggcaaataag 120
acaatgcaac cgatcacatc tacagcaaat aaaattgtgt ggtcggatcc aactcgttta 180tcaactacat tttcagcaag tctgttacgc caacgtgtta aagttggtat agccgaactg 240aataatgttt caggtcaata tgtatctgtt tataagcgtc ctgcacctaa accgaaggtc 300agatgcctgt gtcattatgc cgaatgaaaa ccaatccatt cgcacagtga tttcagggtc 360agccgaaaac ttggctacct taaaagcaga atgggaaact cacaaacgta acgttgacac 420actcttcgcg agcggcaacg ccggtttggg tttccttgac cctactgcgg ctatcgtatc 480gtctgatact actgcttaag cttgtattct atagtgtcac ctaaatcgta tgtgtatgat 540acataaggtt atgtattaat ggtagccgcg ttctaacgac aatatgtaca agcctaattg 600tgtagcatct ggcttactga agcagaccct atcatctctc tcgtaaactg ccgtcagagt 660cggttgggtt ggacagacct ctgagtttct ggtaacgccg ttccgcaccc cggaaatggt 720caccgaacca ttcagcaggg tcatcgctag ccagatcctc tacgccggac gcatcgtggc 780ccgcatcacc ggcgccacag gtgcggtgct ggcgcctata tcgccgacat caccgatggg 840gaagatcggg ctcgccactt cgggctcatg atcgctggtt tccgcctggg tatggtggca 900ggccccgtgg cccgggggac tgttgggcgc catctccttg catgcaccat tccttgcggc 960ggcggtgctc aacggcctca acctactact gggctgcttc ctaatgcagg agtcgcataa 1020gggagagcgt cgatatggtg cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc 1080caactccgct atcgctacgt gactgggtca tggctgcgcc ccgacacccg ccaacacccg 1140ctgacgcgcc ctgacgggct tgtctgcttc cggcatccgc ttacagacaa gctgtgaccg 1200tctccgggag ctgcatgtgt cagaggtttt caccgtcatc accgaaacgc gcgaggcagc 1260ttgaagacga aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca tgataataat 1320ggtttcttag acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggacccc ctattggttt 1380atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct 1440
tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc 1500cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa 1560agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg 1620taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgtttttca atgatgagca cttttaaagt 1680tctgctatgt gtcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg 1740catacactat tctcagaatg acttggtggt acctaccagt cacagaaaag catcttacgg 1800atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg 1860ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca 1920tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa 1980acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtac gaacggcaac aacgttgcgc aaactattaa 2040ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata 2100aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat 2160ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc 2220cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata 2280gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt 2340actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga 2400agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag 2460cggtcagacc ccgtagaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa 2520tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag 2580agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg 2640tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat 2700acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta 2760
ccgggttgga ctcaagacga taggtaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg 2820gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc 2880gcgagcattg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa 2940gcggcagggt cggaacaaga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc 3000tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt 3060caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct 3120ttggctggcc ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc 3180gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc gacggcgcag 3240cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cccaatacgc aaaccgcctc tccccgcgcg 3300ttggccgatt cattaatgca gctgtggtgt catggtcggt gatcgccagg gtgccgacgc 3360gcatctcgac tgcatggtgc accaatgctt ctggcgtcag gcagccatcg gaagctgtgg 3420tatggccgtg caggtcgtaa atcactgcat aattcgtgtc gctcaaggcg cactcccgtt 3480ctggataatg ttttttgcgg cgacatcata acggttctgg caaatattct gaaatgagct 3540ggtgacaatt aatcatcgaa ctagttaact agtacgcaag ttcacgtaaa aagggtatcg 3600cggaatt3607<210>31<211>28<212>PRT<213>人<400>31Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Arg Val Gln Gln Arg Lys1 5 10 15Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg20 25
<210>32<211>28<212>PRT<213>小鼠<400>32Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys1 5 10 15Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg20 25<210>33<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>接头<400>33Gly Gly Lys Gly Gly1 5<210>34<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>N-末端甘氨酸接头<220>
<221>重复<222>(1)..(1)<223>甘氨酸可以重复0至5次
<220>
<221>重复<222>(3)..(3)<223>甘氨酸可以重复0至12次<400>34Gly Cys Gly1<210>35<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>N末端甘氨酸丝氨酸接头<220>
<221>重复<222>(1)..(1)<223>甘氨酸可以重复0至5次<220>
<221>重复<222>(3)..(3)<223>甘氨酸可以重复0至10次<220>
<221>重复<222>(4)..(4)<223>丝氨酸可以重复0至2次<220>
<221>重复<222>(5)..(9)<223>这些残基可以重复0至3次作为一组<400>35Gly Cys Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5<210>36<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>C-末端甘氨酸接头<220>
<221>重复<222>(1)..(1)<223>甘氨酸可以重复0至12次<220>
<221>重复<222>(3)..(3)<223>甘氨酸可以重复0至5次<400>36Gly Cys Gly1<210>37<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>C末端甘氨酸丝氨酸接头<220>
<221>重复<222>(1)..(1)<223>甘氨酸可以重复0至10次<220>
<221>重复
<222>(2)..(2)<223>丝氨酸可以重复0至2次<220>
<221>重复<222>(3)..(7)<223>这些残基可以重复0至3次作为一组<220>
<221>重复<222>(8)..(8)<223>甘氨酸可以重复0至8次<220>
<221>重复<222>(10)..(10)<223>甘氨酸可以重复0至5次<400>37Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Cys Gly1 5 10<210>38<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>甘氨酸丝氨酸接头<220>
<221>重复<222>(1)..(5)<223>这些残基可以重复任意次作为一组<400>38Gly Gly Gly Gly Ser1 5
<210>39<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>N-末端gammal<400>39Cys Gly Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro1 5 10<210>40<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>C-末端gamma 1<400>40Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Gly1 5 10<210>41<211>17<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>N-末端gamma 3<400>41Cys Gly Gly Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala1 5 10 15Pro
<210>42<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>C-末端gamma 3<400>42Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala Pro Gly Gly1 5 10 15Cys Gly<210>43<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>N-末端甘氨酸接头<400>43Gly Cys Gly Gly Gly Gly1 5<210>44<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>C-末端甘氨酸接头<400>44
Gly Gly Gly Gly Cys Gly1 5<210>45<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>C-末端甘氨酸-赖氨酸接头<400>45Gly Gly Lys Lys Gly Cys1 5<210>46<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>N-末端甘氨酸-赖氨酸接头<400>46Cys Gly Lys Lys Gly Gly1 5<210>47<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>C.末端接头<400>47Gly Gly Cys Gly1
<210>48<211>57<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>AP205核糖体结合位点<400>48tctagaattt tctgcgcacc catcccgggt ggcgcccaaa gtgaggaaaa tcacatg 57<210>49<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>载体pQb185的SD序列<400>49tctagattaa cccaacgcgt aggagtcagg ccatg 35<210>50<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>生长素释放肽-肽突变体24-31GC<400>50Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu Gly Cys1 5 10<210>51<211>9<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>生长素释放肽-肽突变体24-31C<400>51Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu Cys1 5<210>52<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>生长素释放肽-肽突变体24-30GC<400>52Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Gly Cys1 5<210>53<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>生长素释放肽-肽突变体24-30C<400>53Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Cys1 5<210>54<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>生长素释放肽-肽突变体24-29GC<400>54Gly Ser Ser Phe Leu Ser Gly Cys1 5<210>55<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>生长素释放肽-肽突变体24-29C<400>55Gly Ser Ser Phe Leu Ser Cys1 5<210>56<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>EcoRIHBcAg(s)引物<400>56ccggaattca tggacattga cccttataaa g 31<210>57<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Lys-HBcAg(as)引物<400>57cctagagcca cctttgccac catcttctaa attagtaccc acccaggtag c 51
<210>58<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Lys-HBcAg(s)引物<400>58gaagatggtg gcaaaggtgg ctctagggac ctagtagtca gttatgtc 48<210>59<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HBcAgwtHindIIII引物<400>59cgcgtcccaa gcttctaaca ttgagattcc cgagattg 38<210>60<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>表位CeH3<400>60Val Asn Leu Thr Trp Ser Arg Ala Ser Gly1 5 10<210>61<211>51<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>CeH3fwd引物<220>
<221>CDS<222>(1)..(51)<400>61gtt aac ttg acc tgg tct cgt gct tct ggt gca tcc agg gat cta gta48Val Asr Leu Thr Trp Ser Arg Ala Ser Gly Ala Ser Arg Asp Leu Val1 5 10 15gtc51Val<210>62<211>17<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CeH3fwd引物<400>62Val Asn Leu Thr Trp Ser Arg Ala Ser Gly Ala Ser Arg Asp Leu Val1 5 10 15Val<210>63<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CeH3rev引物
<400>63accagaagca cgagaccagg tcaagttaac atcttccaaa ttattaccca c 51<210>64<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CeH3rev引物肽<400>64Asp Glu Leu Asn Asn Gly Val1 5<210>65<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HBcAg-wt EcoRI fwd引物<400>65ccggaattca tggacattga cccttataaa g 31<210>66<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HBcAg-wt Hind III rev引物<400>66cgcgtcccaa gcttctaaca ttgagattcc cgagattg 38<210>67
<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物p1.44<400>67aaccatggca aataagccaa tgcaaccg 28<210>68<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物p1.45<400>68aatctagaat tttctgcgca cccatcccgg 30<210>69<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物p1.46<400>69aaaagcttaa gcagtagtat cagacgatac g 31<210>70<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物p1.47<400>70
gagtgatcca actcgtttat caactacatt ttcagcaagt ctg43<210>71<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物p1.48<400>71cagacttgct gaaaatgtag ttgataaacg agttggatca ctc43<210>72<211>117<212>PRT<213>人<400>72Met Pro Ser Pro Gly Thr Val Cys Ser Leu Leu Leu Leu Gly Met Leu1 5 10 15Trp Leu Asp Leu Ala Met Ala Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His20 25 30Gln Arg Val Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu35 40 45Gln Pro Arg Ala Leu Ala Gly Trp Leu Arg Pro Glu Asp Gly Gly Gln50 55 60Ala Glu Gly Ala Glu Asp Glu Leu Glu Val Arg Phe Asn Ala Pro Phe65 70 75 80Asp Val Gly Ile Lys Leu Ser Gly Val Gln Tyr Gln Gln His Ser Gln85 90 95
Ala Leu Gly Lys Phe Leu Gln Asp Ile Leu Trp Glu Glu Ala Lys Glu100 105 110Ala Pro Ala Asp Lys115<210>73<211>117<212>PRT<213>犬<400>73Met Pro Ser Pro Gly Thr Val Cys Ser Leu Leu Leu Leu Gly Met Leu1 5 10 15Trp Leu Asp Leu Ala Met Ala Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His20 25 30Gln Lys Leu Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu35 40 45Gln Pro Arg Ala Leu Ala Gly Trp Leu Arg Pro Glu Asp Gly Gly Gln50 55 60Ala Glu Gly Ala Glu Asp Glu Leu Glu Val Arg Phe Asn Ala Pro Phe65 70 75 80Asp Val Gly Ile Lys Leu Ser Gly Val Gln Tyr Gln Gln His Ser Gln85 90 95Ala Leu Gly Lys Phe Leu Gln Asp Ile Leu Trp Glu Glu Ala Lys Glu100 105 110
Ala Pro Ala Asp Lys115<210>74<211>117<212>PRT<213>小鼠<400>74Met Pro Ser Pro Gly Thr Val Cys Ser Leu Leu Leu Leu Gly Met Leu1 5 10 15Trp Leu Asp Leu Ala Met Ala Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His20 25 30Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu35 40 45Gln Pro Arg Ala Leu Ala Gly Trp Leu Arg Pro Glu Asp Gly Gly Gln50 55 60Ala Glu Gly Ala Glu Asp Glu Leu Glu Val Arg Phe Asn Ala Pro Phe65 70 75 80Asp Val Gly Ile Lys Leu Ser Gly Val Gln Tyr Gln Gln His Ser Gln85 90 95Ala Leu Gly Lys Phe Leu Gln Asp Ile Leu Trp Glu Glu Ala Lys Glu100 105 110Ala Pro Ala Asp Lys11权利要求
1.一种修饰的病毒样颗粒(VLP)，其包含(a)病毒样颗粒(VLP)，和(b)至少一个生长素释放肽-肽，其中所述的生长素释放肽-肽由长度为6或8个氨基酸残基的肽组成，所述的肽与SEQ ID NO1或SEQ ID NO3同源或相同，并且其中a)和b)相互连接。
2.权利要求1的修饰的VLP，其中所述的生长素释放肽-肽选自SEQ ID NO1或SEQ ID NO3，并且优选其中所述的生长素释放肽-肽是SEQ ID NO3。
3.权利要求1的修饰的VLP，其中所述的生长素释放肽-肽与SEQID NO1或SEQ ID NO3只有1个位置的差别，并且其中优选所述的差别是氨基酸替换，并且更优选是保守的氨基酸替换。
4.权利要求1-3的修饰的VLP，其中所述的生长素释放肽-肽是哺乳动物的生长素释放肽-肽，特别是来自人、狗、猫、牛、羊、马、小鼠或大鼠的生长素释放肽-肽。
5.前述权利要求中任一项的修饰的VLP，其中所述的生长素释放肽-肽不包含n-辛酰基修饰，并且其中优选所述的生长素释放肽-肽在SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的第3位不包含n-辛酰基修饰，并且其中更优选所述的生长素释放肽-肽在SEQ ID NO3的第3位不包含n-辛酰基修饰。
6.前述权利要求中任一项的修饰的VLP，其中所述的病毒样颗粒包括选自下组的重组蛋白(a)RNA噬菌体的重组蛋白；(b)噬菌体的重组蛋白；(c)辛德毕斯病毒的重组蛋白；(d)轮状病毒的重组蛋白；(e)口蹄疫病毒的重组蛋白；(f)逆转录病毒的重组蛋白；(g)诺沃克病毒的重组蛋白；(h)α病毒的重组蛋白；(i)人类乳头瘤病毒的重组蛋白；(j)多瘤病毒的重组蛋白；(k)麻疹病毒的重组蛋白；(l)乙型肝炎病毒的重组蛋白；(m)Ty的重组蛋白；和(n)能够装配成为VLP的(a)至(m)中任何重组蛋白的片段。
7.权利要求1-6中任一项的修饰的VLP，其中所述的VLP包含或由能够装配成为VLP的、RNA噬菌体的重组蛋白或其片段组成，并且其中所述的RNA噬菌体是Qβ、fr、AP205或GA。
8.权利要求1-7中任一项的修饰的VLP，其中该VLP(a)与生长素释放肽-肽(b)通过至少一个共价键连接。
9.前述权利要求中任一项的修饰的VLP，其中所述的生长素释放肽-肽与所述的VLP融合。
10.权利要求1-8的修饰的VLP，其中该VLP(a)与生长素释放肽-肽(b)通过至少一个非肽键连接。
11.前述权利要求中任一项的修饰的VLP，其进一步包括氨基酸接头，并且其中优选所述的氨基酸接头选自(a)GGC；(b)GGC-CONH2；(c)GC；(d)GC-CONH2；(e)C；和(f)C-CONH2。
12.前述权利要求中任一项的修饰的VLP，其中所述的生长素释放肽-肽通过其C-末端与所述的VLP连接。
13.前述权利要求中任一项的修饰的VLP，其中所述的VLP颗粒包括至少一个第一附着位点，并且其中所述的至少一个生长素释放肽-肽包括至少一个第二附着位点，该第二附着位点选自(i)所述的生长素释放肽-肽非天然存在的附着位点；和(ii)所述的生长素释放肽-肽天然存在的附着位点，并且其中所述的第二附着位点能够与所述的第一附着位点连接，优选形成有序且重复的抗原阵列。
14.权利要求13的修饰的VLP，其中具有所述加入的至少一个第二附着位点的所述生长素释放肽-肽包括或由选自下组的氨基酸序列组成(a)Ghrel24-31GCGSSFLSPEGC(SEQ ID NO50)；或(b)Ghrel24-31CGSSFLSPEC(SEQ ID NO51)。
15.权利要求13或权利要求14的修饰的VLP，其中所述的第一附着位点包括、或优选是氨基，并且其中进一步优选所述的第一附着位点是赖氨酸残基的氨基。
16.权利要求13至15中任一项的修饰的VLP，其中所述的第二附着位点包括、或优选是巯基，并且其中进一步优选所述的第二附着位点是半胱氨酸残基的巯基。
17.包含权利要求1-16中任一项的修饰的VLP的组合物。
18.一种药物组合物，其包含(a)权利要求1-16中任一项的修饰的VLP；和(b)可接受的药物载体。
19.包含权利要求1-16中任一项的修饰的VLP的疫苗组合物。
20.权利要求19的疫苗组合物，其中所述的疫苗组合物不含佐剂。
21.一种制备如权利要求1-16中任一项的修饰的VLP的方法(a)提供具有至少一个第一附着位点的VLP；(b)提供具有至少一个第二附着位点的至少一个生长素释放肽-肽，其中所述的第二附着位点能够与所述的第一附着位点连接，以及(c)使所述的VLP和所述的生长素释放肽-肽结合以制备修饰的VLP，其中所述的生长素释放肽-肽和所述的VLP通过所述的连接相互作用。
22.一种免疫方法，包括将权利要求1-16中任一项的修饰的VLP施用于动物或人。
23.权利要求22的免疫方法，其中(i)所述的动物是人类，并且其中所述的生长素释放肽-肽是人的生长素释放肽-肽；(ii)所述的动物是猫科动物来源的，并且其中所述的生长素释放肽-肽是猫科动物的生长素释放肽-肽；或(iii)所述的动物是犬科动物来源的，并且其中所述的生长素释放肽是犬科动物的生长素释放肽。
24.权利要求1-16中任一项的修饰的VLP或权利要求17的组合物用作药物。
25.权利要求1-16中任一项的修饰的VLP或权利要求17的组合物用于制备治疗肥胖症的药物的用途。
全文摘要
本发明涉及分子生物学、病毒学、免疫学和医学领域。本发明提供包含VLP和与其连接的来源于生长素释放肽的特定肽的修饰病毒样颗粒(VLP)。本发明也提供制备该修饰的VLP的方法。本发明的修饰的VLP在用于治疗肥胖症和其他与食物摄取增加或体重增加相关的疾病，并且有效诱导免疫应答，特别是抗体应答的疫苗制备中是有用的。此外，本发明的组合物在所指出的范畴内对于诱导自体特异性免疫应答尤其有效。
文档编号C12N7/00GK1905903SQ200580001759
公开日2007年1月31日 申请日期2005年1月19日 优先权日2004年1月20日
发明者马丁·F·巴克曼, 阿尔玛·富卢里贾 申请人:赛托斯生物技术公司