编码标记基因的乳清酸转运蛋白的制作方法

专利名称：编码标记基因的乳清酸转运蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及一类开创性的新的编码标记基因的乳清酸转运蛋白多肽。本发明的乳清酸转运蛋白其中的一种源自Lactocooccus lactis菌株，且由ysbC基因编码。本申请证明该乳清酸转运蛋白基因在选择、反向选择、筛选和双向选择方案中适合用来做为通用的非抗生素标记基因。
背景技术：
推定的用ysbC表示的基因以前被Lactococcus lactis菌株的基因组测序中鉴定，但该基因没有被定义，而且其预测编码的多肽的功能也没有被确定(WO 200177334，Bolotin等人，2001，The Complete Genome Sequence ofthe Lactic Acid Bacterium Lactococcus lactis ssp.Lactis IL 1403，Genome Res.11731)。预测的YsbC蛋白的氨基酸序列可从GeneSeqP数据库中获得，其登录号为ABB55104。
公众对分子生物学中的抗生素的使用日渐关注，在科学界也是如此。特别对带有抗生素遗传标记的重组细胞的培养表示担忧，主要是因为意识到这种标记侧面(lateral)转化到自然界中而带有的潜在风险。因此希望在分子生物学中确立新的非抗生素的标记基因来代替传统的抗生素抗性的编码的选择、反向选择、筛选和双向筛选标记。
本发明涉及一种源自Lactococcus lactis菌株(strain)的转运多肽。该乳清酸转运蛋白由一种在先前的基因组测序计划中预计了却没有定义(annotated)的ysbC基因的开放阅读框所编码。
对任何一种在公共数据库中与本申请的乳清酸转运蛋白有氨基酸同源性的多肽的检索显示，最接近的多肽也只有低于35％的序列同一性，而且与本发明的乳清酸转运蛋白完全不相关。所以，ysbC编码的乳清酸转运蛋白代表了一类完全开拓性的新的分子。
最新鉴定的乳清酸转运蛋白显示出在革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌细胞中都起作用，而且下面的例证显示ysbC是一种理想的适于通用的非抗生素标记基因，适用于选择、反向选择、筛选和双向筛选方案。


图1.概括地显示出嘧啶从头的生物合成的途径，其导致尿嘧啶-单-磷酸(phosphate)(UMP)的形成。通常，该途径中的第四步由单一的pyrD基因的产物来催化，但是在Lactococcus lactis中发现了两个pyrD基因，pyrDa和pyrDb，都编码功能性的生物合成的二氢乳清酸脱氢酶。编码其它的酶活性反应的基因有carAB(氨甲酰基磷酸合成酶)；pyrB(天门冬氨酸氨甲酰基转移酶)；pyrC(二氢乳清酸酶)；pyrD(二氢乳清酸脱氢酶)；pyrDa(二氢乳清酸脱氢酶A)；pyrDKpyrDb(二氢乳清酸脱氢酶B)；pyrE(乳清酸转磷酸核糖基酶)；pyrF(OMP脱羧酶)。PRP(pyrophosphate)代表5-磷酸核糖基-α-1-焦磷酸盐。
发明概述本发明解决的问题是提供了一种非抗生素的具通用性质的重组标记，适用于在分子生物学操作中替代传统的抗生素抗性编码基因，并且提供了用于筛选和/或鉴定至少含有重组的非抗生素标记一个拷贝的细胞、以及用所述标记处理(cured of)的细胞的方法。
本发明提供了一类开拓性的新的非常通用的乳清酸转运蛋白分子作为方案；编码通用的乳清酸转运蛋白的基因非常适用于非抗生素标记。以本发明和其序列信息为基础，本领域技术人员可从任何含有相关基因的细胞中直接分离出大量的与乳清酸转运蛋白活性相关的分子。
因此，第一方面，本发明涉及一种重组标志基因，编码的乳清酸转运蛋白多肽含有至少与SEQ ID NO2有60％的同一性，优选地至少65％，或者更优选地至少70％，75％，80％，85％，90％，95％，97％，或者最优选是与SEQ ID NO2有99％的同一性的氨基酸序列；或者一种重组编码乳清酸转运蛋白多肽的标记基因，所述标记基因含有的多核苷酸序列与SEQ ID NO1至少有60％同一性，优选地是至少65％，或更优选地至少至少有70％，75％，80％，85％，90％，95％，97％，或者最优选是与SEQ ID NO1至少有99％的同一性；或者一种编码乳清酸转运蛋白多肽的重组标记基因，所述标记基因含有的多核苷酸序列与SEQ ID NO1所示的序列在非常低严格条件下，优选地是低严格条件下，更优选地是在中等严格条件下，再好地是在中-高严格条件下，还优选的是在高严格条件下，而最优选是在非常高的严格条件下杂交。
本发明第二方面涉及一种至少含有一编码乳清酸转运蛋白多肽的重组标记基因的多核苷酸构建体，编码的乳清酸转运蛋白多肽含有的氨基酸序列至少与SEQ ID NO2有60％的同一性，优选地至少65％，或者更优选地至少70％，75％，80％，85％，90％，95％，97％，或者最优选是与SEQ ID NO2有99％的同一性；或者一种至少含有一(one)编码乳清酸转运蛋白多肽的重组的标记基因多核苷酸构建体，所述标记基因含有的多核苷酸序列与SEQ ID NO1至少有60％同一性，优选地是至少65％，或更优选地至少至少有65％，75％，80％，85％，90％，95％，97％，或者最优选是与SEQ ID NO1至少有99％的同一性；或者一种至少含有一个编码乳清酸转运蛋白多肽的重组标记基因的多核苷酸构建体，所述标记基因含有的多核苷酸序列与SEQ ID NO1所示的序列在非常低严格条件下，优选地是低严格条件下，更优选地是在中等严格条件下，甚至更优选地是在中-高严格条件下，还优选的是在高严格条件下，而最优选是在非常高的严格条件下杂交。
第三方面，本发明涉及一种至少含有一编码乳清酸转运蛋白多肽的外源标记基因的细胞，该乳清酸转运蛋白多肽含有至少与SEQ ID NO2有60％的同一性，优选地至少65％，或者更优选地至少70％，75％，80％，85％，90％，95％，97％，或者最优选是与SEQ ID NO2有99％的同一性；或者至少一个外源的编码乳清酸转运蛋白多肽的标记基因，所述标记基因含有的多核苷酸序列与SEQ ID NO1至少有60％的同一性，优选地是至少65％，或更优选地至少少有70％，75％，80％，85％，90％，95％，97％，或者最优选是与SEQ ID NO1至少有99％的同一性；或者至少一外源的编码乳清酸转运蛋白多肽的重组标记基因，所述标记基因含有的多核苷酸序列与SEQ ID NO1所示的序列在非常低严格条件下，优选地是低严格条件下，更优选地是在中等严格条件下，还优选地是在中-高严格条件下，还优选的是在高严格条件下，而最优选是在非常高的严格条件下杂交。
最后一方面，本发明涉及一种挑选或者鉴定至少含有重组标记基因一个拷贝的细胞，和/或者挑选或者鉴定已用重组标记基因处理了的细胞的方法，其中所述标记基因编码乳清酸转运蛋白多肽，其含有氨基酸序列至少与SEQ ID NO2有60％的同一性，优选地至少65％，或者更优选地至少70％，75％，80％，85％，90％，95％，97％，或者最优选是与SEQ ID NO2有99％的同一性；或者编码乳清酸转运蛋白多肽并且含有的多核苷酸序列与SEQ ID NO1至少有60％的同一性，优选地是至少65％，或更优选地至少有70％，75％，80％，85％，90％，95％，97％，或者最优选是与SEQ ID NO1至少有99％的同一性；或者编码乳清酸转运蛋白多肽，并且含有的多核苷酸序列与SEQ ID NO1所示的序列在非常低严格条件下，优选地是低严格条件下，更优选地是在中等严格条件下，再好地是在中-高严格条件下，还优选的是在高严格条件下，而最优选是在非常高的严格条件下杂交。和所述方法含有利用该标记基因在适宜条件下做为选择标记，筛选标记，反向选择标记，或者双向的标记的步骤，由此挑选或鉴定出细胞。
定义分子生物学根据本发明，本领域技术人员可以将之用于传统的分子生物学，微生物学和重组DNA技术。上述的技术在文献中已被充分地说明。参见例如，Sambrook，Fritsch & Maniatis，Molecular CloningA Laboratory Manual，Second Edition(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，New York(herein“Sambrook etal.，1989”)DNA CloningA PracticalApproach，Volumes I and II/D.N.Glover ed.1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed.1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames & S.J.Higginseds(1985))；Transcription And Translation(B.D.Hames & S.J.Higgins，eds.(1984))；Animal Cell Culture(R.I.Freshney，ed.(1986))；Immobilized Cells AndEnzymes(IRL Press，(1986))；B.Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)。
“多核苷酸”是一种从5’端到3’端阅读的脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸碱基的单-或双-链聚合物。多核苷酸包括RNA和DNA，并且可以天然分离，体外合成，或者由天然的与合成的分子结合而制备。
“核酸分子”或“核苷酸序列”指的是单链形式，或者双螺旋的核糖核酸(腺嘌呤，鸟嘌呤，尿嘧啶或者胞嘧啶核苷；“RNA分子”)或者脱氧核糖核苷(脱氧腺苷，脱氧鸟嘌呤核苷，脱氧胸腺嘧啶核苷，或者脱氧胞嘧啶核苷“DNA分子”)的磷酸酯多聚体。双链DNA，DNA-RNA和RNA-RNA螺旋是有可能的。术语核酸分子，特别是DNA或者RNA分子仅仅涉及分子的一级和二级结构，并不限制其是任何特别的三级或者四级形式。因此，该术语包括已发现的双链DNA，尤其是线性的或环状DNA分子(例如，限制性内切酶酶切片段)，质粒，和染色体。在论述特殊的双链DNA分子结构时，其序列可以根据给出的标准惯例在这里描述成仅仅是沿着DNA的非转录链从5’到3’的序列(即含有与mRNA相同序列的链)。“重组DNA分子”是经过分子生物学处理的DNA分子。
“重组标记基因”是一种经过分子生物学处理的多核苷酸标记，并且含在可以是环状的、线性的、或multimerized的分离的多核苷酸构建体中，当该结构(construct)被引入宿主细胞，或当它在宿主细胞中处理过后，其中的该标记基因足以作为用于挑选(selecting)或筛选(screening)的碱基在宿主细胞内存在或不存在的基础。传统的重组标记基因包括编码对各种抗生素有抗性的基因。
杂交当单链形式的核酸分子在适当的温度条件和溶液离子强度下可以与另一个核酸分子退火时，核酸分子“可杂交”到另一个核酸分子上的，例如cDNA，基因组DNA，或RNA，(见Sambrook等人，同上)。温度条件和离子强度决定杂交的“严格”程度。
对本发明来说，杂交指的是在非常低到非常高的严格条件下，核苷酸序列与被标记的、与SEQ ID NO1所示核苷酸序列杂交的多核苷酸探针进行杂交。与多核苷酸探针在这些条件下杂交的分子可以利用X线胶片或通过任何其他的本领域已知的方法检测到。无论何时上下文提到的术语“多核苷酸探针”指的是那种至少有15个核苷酸的探针。
在一个有意思的具体实施方式
中，多核苷酸探针是SEQ ID NO1上的至少15个核苷酸片段的互补链。另一个有意思的的具体实施方式
中，多核苷酸探针是一段至少15个核苷酸的、任何编码SEQ ID NO2多肽的核苷酸序列的互补链。在一个进一步的有意思的实施方式中，多核苷酸探针是SEQ ID NO1的互补链。在一个更进一步有意思的具体实施方式
中，多核苷酸探针是SEQ ID NO1成熟多肽编码区的互补链。
对于长度至少100个核苷酸的探针，非常低严格条件到非常高严格条件定义为在42℃ 5×SSPE，1.0％SDS，5×Denhardt’s溶液，100微克/毫升已剪切和变性的鲑精DNA下，按照标准的Southern印迹法步骤进行预杂交和杂交。优选地这种至少100核苷酸的长探针包含核苷酸不超过1000个。对于长度至少100个核苷酸的长探针，载体材料最后要用2×SSC，0.1％SDS在42℃下洗涤三次，每次15分钟(非常低严格)，优选地是用0.5×SSC，0.1％SDS在42℃下洗涤三次，每次15分钟(低严格)，更优选地是用0.2×SSC，0.1％SDS在42℃下洗涤三次，每次15分钟(中等严格)，还优选的是用0.2×SSC，0.1％SDS在55℃下洗涤三次，每次15分钟(中高严格)，最优选的是用0.1×SSC，0.1％SDS在60℃下洗涤三次，每次15分钟(高严格)，而特别优选地是用0.1×SSC，0.1％SDS在68℃下洗涤三次，每次15分钟(非常高严格)。
尽管不是特别优选，也可以考虑那些较短的探针，例如长度大约15到99个核苷酸，诸如长度大约15到大约70个核苷酸的探针。对于这样的短探针，严格条件定义为是，利用按照Bolton和McCarthy(1962，Proceedingsof the National Academy of Sciences USA 481390)的计算方法，在低于计算Tm 5℃到10℃的温度下，0.9M NaCl，0.09M Tris-HCl pH 7.6，6mMEDTA，0.5％NP-40，1×Denhardt’s溶液，1mM焦磷酸钠，1mM一元的钠磷酸盐，0.1mM ATP，和每毫升0.2mg的酵母RNA，按照标准Southern印迹法步骤进行的预杂交，杂交和杂交后洗涤。
对于长度15到99个核苷酸的短探针，用6×SCC加0.1％SDS洗涤15分钟一次，再在低于计算Tm 5℃到10℃下，用6×SSC洗涤两次各15分钟。
营养缺陷型在上下文中，术语“营养缺陷型”具有通常公认的意义，即有机体不能合成其生长所需的特殊的有机化合物(IUPAC Compendium of ChemicalTerminology，第二版1997，1992，64，147)。
序列同源性和比对为了达到本发明的目的，通过参数“同一性”来描述两个氨基酸序列或两个核苷酸序列之间的同源性。两个氨基酸序列之间的同一性程度可以利用对两个蛋白和DNA比对非常有用的全Smith-Waterman比对法来比对序列和计算同源性得分。默认得分矩阵(default scoring matrices)BLOSUM50和同一性矩阵(matrix)分别用于比对蛋白和DNA。对于蛋白缺口中第一个残基缺失是-12，对于DNA是-16，而蛋白在缺口(gap)的另外的残基罚分(penalty)是-2，对于DNA是-4。可以用FASTA package版本v20u6(W.RPearson和D.J.Lipman(1988)，″Improved Tools for Biological SequenceAnalysis″，PNAS 852444-2448，和W.R.Pearson(1990)″Rapid and SensitiveSequence Comparison with FASTP and FASTA″，Methods in Enzymology，18363-98)进行比对。
可以利用“ClustalW”(Thompson，J.D.，Higgins，D.G.和Gibson，T.J.(1994)CLUSTAL W improving the sensitivity of progressive multiple sequencealignment through sequence weighting positions-specific gap penalties andweight matrix choice.positions-specific gap penalties and weight matrix choice.Nucleic Acids Research，224673-4680)进行蛋白序列的序列多重对比。DNA序列的序列多重对比可以利用蛋白比对做为模板，从DNA序列中用对应的密码子替换氨基酸。
等位变体在上下文中术语“等位变体”(allelic variant)表示占有同样染色体位点的基因形成的两个或更多替换物。等位基因变异是通过突变自然产生的，并可在种群中产生多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或编码具有氨基酸序列改变的多肽。多肽的等位变体是一种由基因的等位变体编码的多肽。
核酸构建体本发明也涉及含有本发明的可操作的、与一或多个控制序列连接(link to)的核苷酸序列的核酸构建体，该控制序列在适当的宿主细胞中，在与该控制序列相容的条件下指导该编码序列表达。
编码本发明多肽的核苷酸序列可以用各种方法操作以备多肽的表达。在核苷酸序列插入载体之前，可以根据表达载体对核苷酸序列进行适当的或必要的处理。利用重组DNA方法修饰核苷酸序列的技术是本领域为大家所熟知的。
控制序列可以是适当的启动子序列，一种被用于表达该核苷酸序列的宿主细胞所识别的核苷酸序列。启动子序列包含介导多肽表达的转录控制序列。启动子可以是任何一种在选择的宿主细胞中显示转录活性的核苷酸序列，包括突变的、截短的、和杂合启动子，也可以获自编码对宿主细胞来说或是同源的或是异源的细胞外的或胞内的多肽的基因。
本发明核酸构建体中指导转录的适当的启动子，特别是在细菌宿主细胞的例子是从大肠杆菌乳糖操纵子，天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂糖酶基因(dagA)，枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)，嗜热脂肪芽孢杆菌(BacillusStearothermophilus)生麦芽糖淀粉酶基因(amyM)，解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)，地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)，枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因，以及原核生物的β-内酰胺酶基因中获得的启动子(Villa-Kamaroff等1978，Proceedings of the National Academy ofSciences USA 753727-3731)，以及tac启动子(DeBoer等人，1983，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 8021-25)。进一步包括在“Useful proteins from recombinant bacteria”in Scientific American，1980，24274-94；和in Sambrook等人，1989，同上，中描述的启动子。
在丝状真菌的宿主细胞中，本发明核酸结构里的指导转录的适当的启动子的例子是从米曲霉(Asperigillus oryzae)TAKA淀粉酶，Rhizomucormiehei天冬氨酸蛋白酶，黑曲霉(Asperigillus niger)中性α-淀粉酶，黑曲霉酸性的稳定的α-淀粉酶，黑曲霉或泡盛曲霉(Asperigillus awamori)葡糖淀粉酶(glaA)，Rhizomucor miehei脂肪酶，米曲霉碱性蛋白酶，米曲霉磷酸丙糖异构酶，构巢曲霉(Asperigillus nidulans)乙酰胺酶，和尖胞镰孢(Fusariumoxysporum)类胰蛋白酶蛋白酶(WO 96/00787)中获得的基因的启动子，以及NA2-tpi启动子(一种来自黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉磷酸丙糖异构酶基因的杂合启动子)，及它们的突变的，截短的，和杂合的启动子。
在酵母宿主中，有效的启动子是获自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)烯醇酶(ENO-1)，酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)，酿酒酵母乙醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)，和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶的基因。其他的用于酵母宿主细胞的有效的启动子是Romanos等人1992，Yeast 8423-488.中描述的启动子。
控制序列也可以是一种适当的转录终止子序列，一种被宿主细胞所识别的终止转录的序列。该终止剂序列可被操作连接到编码多肽的核苷酸序列的3’末端。任何一种在选择的宿主细胞中起作用的终止子都可用在本发明中。用于丝状真菌宿主细胞的优选的终止子获自米曲霉TAKA淀粉酶，黑曲霉葡糖淀粉酶，构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶，黑曲霉α-葡糖苷酶，和尖胞镰孢类胰蛋白酶蛋白酶的基因。
用于酵母宿主细胞的优选的终止子获自酿酒酵母烯醇酶，酿酒酵母细胞色素C(CYC1)，和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因。其他的用于酵母宿主细胞的有效的终止子是Romanos等人1992(同上)描述的终止子。
控制序列也可以是一种适当的前导序列，宿主细胞的对于翻译很重要的mRNA非翻译区。该前导序列可被操作连接到编码多肽的核苷酸序列的5’末端。任何一种在选择的宿主细胞中起作用的前导序列都可用在本发明中。
用于丝状真菌宿主细胞的优选的前导序列获自米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉磷酸丙糖异构酶的基因。
对于酵母宿主，适当的前导序列获自酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)，酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)，酿酒酵母-3-磷酸甘油酸激酶，酿酒酵母α-因子，和酿酒酵母乙醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)的基因。
控制序列也可以是一种聚腺苷酸化序列，一种可操作连接到核苷酸序列3′末端的和转录时为宿主细胞识别的、作为添加多腺核苷残基到转录的mRNA上的信号。任何一种在选择的宿主细胞中起作用的聚腺苷酸化序列都可用在本发明中。
用于丝状真菌宿主细胞的优选的聚腺苷酸化序列获自米曲霉TAKA淀粉酶，黑曲霉葡糖淀粉酶，构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶，尖胞镰孢胰蛋白酶样蛋白酶，和黑曲霉α-葡糖苷酶的基因。
对于酵母宿主细胞有效的聚腺苷酸化序列在Guo和Sherman，1995Molecular Cellular Biology 155983-5990中有所描述。
控制序列也可以是一种信号肽编码区，其编码连接到多肽氨基末端的氨基酸序列并且指导编码的多肽进入细胞分泌途径。核苷酸序列编码序列的5′末端可以本身就含有天然地连接在具有编码分泌多肽的编码区部分的翻译阅读框的信号肽编码区。或者，编码序列的5′末端可以包含与编码序列外源的信号肽编码区。在没有天然包含信号编码区时需要外源信号肽编码区。或者外源信号肽编码区可以仅仅替换天然的信号肽编码区以增强多肽的分泌。然而，任何一种指导表达的多肽进入被选择的宿主细胞分泌途径的信号肽编码区都可以用于本发明。
用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码区是获自芽孢杆菌NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶，嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，地衣芽孢杆菌枯草芽孢杆菌蛋白酶，地衣芽孢杆菌α-淀粉酶，嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶类(nprT，nprS，nprM)，和枯草芽孢杆菌prsA基因的信号肽编码区。此外的信号肽描述于Simonen和Palva，1993，Microbiological Reviews 57 109-137中。
用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码区是获自米曲霉TAKA淀粉酶，黑曲霉中性淀粉酶，黑曲霉葡糖淀粉酶，Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶，Humicola insolens纤维素酶，和Humicola lanuginosa脂肪酶基因的信号肽编码区。
用于酵母宿主细胞的有用信号肽获自酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶基因。其他的有用的信号肽编码区描述于Romanos等人1992，(同上)中。
控制序列也可以是前肽编码区，其密码编码位于多肽氨基末端的氨基酸序列。生成的多肽就是已知的前酶或前多肽(或有时候称为酶原)。前多肽通常是无活性的，然后通过催化或自催化将前肽从前多肽上裂解下而成为成熟活性多肽。前肽编码区可以获自枯草芽孢杆菌碱性的蛋白酶(aprE)，枯草芽孢杆菌中性的蛋白酶(nprT)酿酒酵母α-因子，Rhizomucor miehei蛋白酶，和Myceliophthora thermophila漆酶(WO 95/33836)的基因。
也可以按照需要添加调节序列，该调节序列可以使得相对于宿主细胞的生长调节多肽的表达。调节系统的实例是那些引起基因表达开启或闭合以响应化学的或物理的刺激，包括调节化合物存在的系统。原核系统中的调节系统包括lac，tac，和trp操作子系统。在酵母中，可以采用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，TAKAα-淀粉酶启动子，黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子可被用作调节序列。其他的调节序列的实例是那些可以使得基因扩增的序列。在真核生物系统中，调节序列包括在氨甲喋呤存在时扩增的二氢叶酸还原酶基因和在重金属存在时扩增的金属硫蛋白基因。这些情况中，编码多肽的核苷酸序列可操作地与调节序列连接。
相关乳清酸转运蛋白的分离SEQ ID NO1的核苷酸序列或其子序列，以及SEQ ID NO2的氨基酸序列或其片段可被用于设计多核苷酸探针，用于根据本领域已知的方法从不同属或种的菌株中鉴定和克隆编码具有乳清酸转运蛋白活性的多肽的DNA。特别是上述的探针能被用于与感兴趣的属或种的基因组或cDNA杂交，随后进行标准Southern印迹法方法以鉴定和分离其中相应的基因。上述探针与完整序列相比可以相当的短，但是长度至少应该是15个核苷酸，较好的长度是至少25个核苷酸，更好的长度是至少35个核苷酸，例如长度至少是70个核苷酸。然而，优选多核苷酸探针长度至少是100个核苷酸。例如，多核苷酸探针长度可以至少是200个核苷酸，长度至少300个核苷酸，长度至少400个核苷酸或长度至少500个核苷酸。甚至可以使用更长的探针，例如，例如，多核苷酸探针长度至少是600个核苷酸，长度至少700个核苷酸，长度至少800个核苷酸或长度至少900个核苷酸。DNA和RNA探针都可以用。探针一般要被标记以检测相应的基因(例如，含有32P，3H，35S，生物素H或抗生物素蛋白)。
因此，从上述的其他有机体制备的基因组DNA或cDNA文库可被用来筛选出与上面描述的探针杂交和编码具有乳清酸转运蛋白活性的多肽的DNA。源自上述其他有机体的基因组或其他的DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他的分离技术来分离。从文库或分离的DNA中得到的DNA可以转移并固定在硝化纤维或其他的适当的载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO1同源的克隆或DNA，固定有DNA的载体材料要用Southern印迹鉴定。
对本发明来说，杂交指的是在非常低到非常高的严格条件下，核苷酸序列与被标记的、与SEQ ID NO1所示核苷酸序列杂交的多核苷酸探针杂交。在这些条件下与多核苷酸探针杂交的分子可以使用X线胶片或通过任何其他的本领域已知的方法检测到。无论何时上下文提到的术语“多核苷酸探针”指的是那种至少有15个核苷酸的探针。
本发明的多肽可以从任何属的微生物中获得。对本发明来说，在这里使用的术语“获自”(obtain from)应该指的是核苷酸序列编码的多肽由核苷酸序列是天然存在的或被插入的细胞产生的。
本发明的多肽可以是细菌多肽。例如，可以是革兰氏阳性细菌的多肽，例如芽孢杆菌(Bacillus)多肽，例如Bacillus alkalophilus，Bacillusamyloliquefaciens，短芽孢杆菌(Bacillus brevis)，环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)，凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)，Bacillus lautus，Bacillus lentus，地衣芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，嗜热脂肪芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，或苏芸金杆菌(Bacillus thuringiensis)多肽；链霉菌属多肽，例如Sterptomyces lividans或Sterptomyces murinus多肽；或革兰氏阴性细菌的多肽，例如大肠菌或假单胞菌属(Pseudomonas)sp.多肽。
本发明的多肽可以是真菌多肽，优选的是酵母多肽，例如念珠菌属(Candida)，克卢费氏酵母属(Kluyveromyces)，毕赤氏酵母属(Pichia)，糖酵母属(Saccharomyces)，裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，或Yarrowia多肽；较好的是丝状的真菌多肽例如枝顶孢属(Acremonium)，曲霉，短梗霉属(Aureobasidium)，Cryptococcus，Filibasidium，镰刀菌属(Fusarium)，腐殖菌属(Humicola)，Magnaporthe，毛霉属(Mucor)，Myceliophthora，Neocallimastix，脉孢菌(Neurospora)，拟青霉属(Paecilomyces)，青霉属(Penicillium)，Piromyces，裂褶菌属(Schizophyllum)，Talaromyces，Thermoascus，Thielavia，Tolypocladium，或木霉属(Trichoderma)多肽。
在一个重要的具体实施方式
中，多肽是卡尔斯伯酵母(Saccharomycescarlsbergensis)，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，Saccharomycesdiastaticus，Saccharomyces cerevisiae douglasii，Saccharomyces kluyveri，Saccharomyces norbensis或Saccharomyces oviformis多肽。
在另一个重要的具体实施方式
中，多肽是Asperigillus aculeatus，泡盛曲霉，Asperigillus foetidus，Asperigillus japonicus，构巢曲霉，黑曲霉，米曲霉，Fusarium bactridioides，Fusarium cerealis，Fusarium crookwellense，Fusarium culmorum，禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)，Fusariumgraminum，Fusarium heterosporum，Fusarium negundi，尖胞镰孢，网状镰孢(Fusarium reticulatum)，粉红色镰刀菌(Fusarium roseum)，接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)，Fusarium sarcochroum，Fusarium sporotrichioides，Fusarium sulphureum，Fusarium torulosum，Fusarium trichothecioides，Fusariumvenenatum，Humicola insolens，Humicola lanuginosa，Mucor miehei，Myceliophthora thermophila，Neurospora crassa，Penicillium purpurogenum，Trichoderma harzianum，Trichoderma koningii，Trichoderma longibrachiatum，Trichoderma reesei，或绿色木霉(Trichoderma viride)多肽。很清楚，对于上述的种属，本发明包括了理想的和不理想的两种情形，及其它分类学的等价物，例如anamorphs，已知的未署名的种属。本领域技术人员会很容易地识别适当等价物的同一性。
此外，利用上面提到的探针可以鉴定上述多肽，并且从其它来源，包括从自然界中分离的微生物(例如土壤，混合肥料(composts)，水，等等。)中获得。从天然栖息地分离微生物的技术是本领域公知的。随后，可以同样地通过筛选另一个微生物的基因组或cDNA文库来获得核苷酸序列。一旦用探针检测出编码多肽的核苷酸序列，可以利用本领域普通技术人员所知的技术分离或克隆该序列(参见，例如Sambrook等人，1989，同上)。
用于分离或克隆编码多肽的核苷酸序列的技术是本领域已知的，包括从基因组DNA分离，由cDNA制备，或将其结合使用。从上述的基因组DNA克隆本发明的核苷酸序列可以通过例如，利用已知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测克隆的、具有共用结构特点的DNA片段来实行。参见，例如，Innis等人，1990，PCRA Guide to Methods andApplication，Academic Press，New York。也可以利用其他的扩增方法，例如连接酶链式反应(LCR)，连接激活转录(LAT)和以核苷酸序列为基础的扩增(NASBA)。
可以通过遗传工程中所使用的标准的克隆程序获得该核苷酸序列，将其从原来的位置重置于不同的、将被产生的位置。该克隆程序可以包括切除和分离所需的编码多肽的核苷酸序列片段，将该片段插入到载体分子中，和将该重组载体导入宿主细胞，在宿主细胞里该核苷酸序列的各拷贝或克隆将被复制。该核苷酸序列可以是基因组，cDNA，RNA，半合成的，合成源的，或任何的它们的组合。
由本发明核苷酸序列编码的多肽也包括融合多肽或可裂解的融合多肽，其中多肽是与另一个多肽或其片段的N-末端或C-末端融合的。融合多肽是通过将编码另一个多肽的核苷酸序列(或其部分)与本发明的核苷酸序列(或其部分)融合而产生的。融合多肽的制备技术是本领域已知的，包括将编码多肽的编码序列的连接在一起以使它们在框(in frame)中而且由同样的启动子和终止子控制该融合多肽的表达。
变体分子为了满足合成含有与SEQ ID NO2相比至少有一个位置的取代，缺失和/或插入的氨基酸序列的多肽所需，可以修饰编码本发明多肽的核苷酸序列。这些人工变体可以与分离自天然来源的多肽在一些设计方法方面有所不同，例如在比活性，热稳定性，pH最佳值，等等方面不同的改变。对于本领域的技术人员来说，很明显上述的这些修饰可以在对于分子功能关键的区域的外界部分进行，但仍能产生有活性的多肽。对于本发明核苷酸序列编码的多肽的活性来说必不可少的氨基酸残基可以根据本领域已知的方法来鉴定，这些氨基酸残基最好不被修饰，例如取代，可以采用例如，定位诱变或丙氨酸-扫描诱变(参见，例如Cunningham和Wells，1989，Science 2441081-1085)。在后续的技术中，突变是在分子中每一个带正电荷的残基处进行的，并且要对产生的突变分子进行(酶)活性检测以确定对分子活性很重要的氨基酸残基。也可以通过对三维结构的分析来确定底物酶相互作用的位置，如利用核磁共振分析，结晶学或光亲和标记(参见，例如deVos等人，1992，Science 255306-312；Smith等人，1992，Journal ofMolecular Biology 224899-904；Wlodaver等人，1992，FEBS Letters 30959-64)这些技术来确定。
此外，编码本发明多肽的核苷酸序列可以通过进行核苷酸替换来修饰，该核苷酸取代不会导致该核苷酸序列编码出另一种氨基酸序列，但却是对应于为宿主有机体生产酶而设计使用的密码子。可以通过本领域已知的任何一种方法进行定位诱变，在核苷酸序列中引起的突变使得某个核苷酸转换成另一个核苷酸。特别有效的方法是利用超螺旋，带有感兴趣的插入物的双链DNA载体和两个包含想要的突变的合成引物。寡核苷酸引物，每个都与载体相对链互补，通过Pfu DNA聚合酶在温度周期变化期间延长。在引物的结合中，产生突变的包含交错切口的质粒。随着温度周期变化，用特异于甲基化和半甲基化DNA的DpnI处理产物，以消化亲代DNA模板并选择包含突变的合成的DNA。也可以采用本领域已知的其它方法。对于核苷酸取代一般说明参见例如，Ford等人，1991，Protein Expression和Purification 295-107。
表达载体本发明也涉及含有本发明核酸构建体的重组表达载体。上面描述的各种的核苷酸和控制序列可以连接在一起而产生重组表达载体，可以包括一或多个方便的限制酶切位点，以使得在该位点插入或取代编码多肽的核苷酸序列。或者，可以通过将含有该序列的核苷酸序列或核酸构建体插入用于表达的适当的载体中来表达本发明的核苷酸序列。在构建的表达载体中，编码序列位于载体上，以便该编码序列可操作地与适当的、用于表达的控制序列连接。
重组体表达载体可以是任何一种能够方便地用于重组DNA方法和能够引起核苷酸序列表达的载体(例如质粒或病毒)。载体的选择一般取决于该载体与载体将要导入的宿主细胞的兼容性。载体可以是线性的或闭合环形的质粒。
载体可以是一种自主复制载体，即一种以染色体外的实体形式存在的载体，其复制独立于染色体的复制，例如，质粒，一种染色体外元件，一种微型染色体或一种人工染色体。
载体可以具有任何一种确定的自我复制元件和方式。或者，该载体可以是一种当其导入到宿主细胞时，被整合到基因组中并随着其整合入的染色体一起复制的载体。此外，也可以利用单一的载体或质粒，或两个或更多的共同包含总DNA的、被导入到宿主细胞基因组中的载体或质粒，或转座子。
本发明的载体最好包含一或多个可以使被转化的细胞易被选择的选择性标记。选择性标记是一种基因，其产物可提供对杀生剂或病毒的抗性，对重金属的抗性，由原养型到营养缺陷型(prototrophy to auxotrophs)，等等。
细菌的选择性标记的实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因或带有抗生素抗性例如氨苄青霉素，卡那霉素氯霉素或四环素抗性的标记。用于酵母宿主细胞的适当的标记是ADE2，HIS3，LEU2，LYS2，MET3，TRP1，和URA3。供丝状真菌宿主细胞之用的选择性标记包括，但不局限于，amdS(乙酰胺酶)，argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶(carbamoyltransferase))，bar(phosphinothricin转乙酰酶)，hygB(潮霉素磷酸转移酶)，niaD(硝酸盐还原酶)，pyrG(乳清酸核苷(orotidine)-5’-磷酸脱羧酶)，sC(硫酸腺嘌呤基转移酶)(sulfate adenyltransferase)，trpC(邻氨基苯甲酸合酶)，及其等价物。
优选的供曲霉属细胞之用的是构巢曲霉或米曲霉的amdS，和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。
本发明的载体最好含有可以使载体稳定整合到宿主细胞基因组中或使载体在细胞中独立于基因组自主复制的元件。
为了整合入宿主细胞基因组，载体可以依靠编码多肽的核苷酸序列或任何一种其他的载体元件通过同源的或非同源重组使载体稳定整合入基因组。或者，载体可以包含额外的核苷酸序列通过同源重组指导整合入宿主细胞的基因组。附加的核苷酸序列可以使载体从染色体的精确位置整合入宿主细胞基因组。为了提高在精确位置整合的可能性，整合元件应该最好含有足够数量的与相应目标序列高度同源的核苷酸，例如100到1,500碱基对，较好的是400到1,500碱基对，更好的是800到1,500碱基对，以提高同源重组的概率。整合元件可以是任何一种与宿主细胞基因组中的目标序列同源的序列。此外，整合元件可以是非-编码或编码核苷酸序列。另一方面，载体可以通过非-同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
为了能自主复制，载体可以进一步包含能够使载体在所述的宿主细胞中自动复制的复制起点。细菌的复制起点的实例是质粒pBR322，pUC19，pACYC177，和pACYC184的复制起点，使得在大肠杆菌中复制，和pUB110，pE194，pTA1060，和，pAMB1使得在芽孢杆菌中复制。供酵母宿主细胞之用的复制起点的实例是2微米复制起点，ARS1，ARS4，ARS1和CEN3组合，ARS4和CEN6的组合。复制起点可以带有使其在宿主细胞中带有温度-敏感的特性的突变(参见，例如Ehrlich，1978，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 751433)。
可以将一个以上拷贝的本发明的核苷酸序列插入宿主细胞中以增加基因产物的产量。为了增加核苷酸序列的拷贝数，可以通过将至少一额外拷贝序列整合入宿主细胞而实现，或可以通过纳入具有该核苷酸序列可扩增的选择性标记基因，细胞中含有选择性标记基因的扩增的拷贝，和由此附加的该核苷酸序列的拷贝，在适当的可选择的试剂的存在下对培养细胞进行选择。
上述用于将原件连接构建本发明重组表达载体的方法对于本领域技术人员是熟知的(参见Sambrook等人，1989，同上)。
宿主细胞本发明也涉及含有本发明核酸构建体的重组宿主细胞，以便有利于用于重组产生多肽。将含有本发明核苷酸序列的载体导入宿主细胞，这样载体维持作为染色体的整合子(integrant)或如同在先描述的做为一个自我复制的染色体外的载体。
宿主细胞可以是单细胞微生物，例如原核生物，或非单细胞微生物，例如真核生物。
有效的单细胞是细菌细胞，例如革兰氏阳性细菌包括但不限于杆菌细胞，例如Bacillus alkalophilus，Bacillus amyloliquefaciens，短芽孢杆菌，环状芽孢杆菌，Bacillus clausii，凝结芽孢杆菌，Bacillus lautus，Bacillus lentus，地衣芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌，嗜热脂肪芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，和苏芸金杆菌细胞；链霉菌属细胞，例如Sterptomyces lividans或Sterptomycesmurinus；或革兰氏阴性细菌，例如大肠菌或假单胞菌属(Pseudomonas)sp.多肽或革兰氏阴性细菌。在一个最佳具体实施方式
中，细菌宿主细胞是Bacilluslentus，地衣芽孢杆菌，嗜热脂肪芽孢杆菌，或枯草芽孢杆菌细胞。在另一个最佳具体实施方式
中，芽孢杆菌细胞是alkalophilic Bacillus。
载体导入细菌宿主细胞可以通过，例如原生质体的转化而实现(参见，例如Chang和Cohen，1979，Molecular General Genetics 168111-115)，利用感受态细胞(参见，例如Young和Spizizin，1961，Journal ofBacteriology 81823-829，或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，Journalof Molecular Biology 56209-221)，电穿孔法(参见，例如Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques 6742-751)，或结合(参见，例如Koehler和Thorne，1987，Journal of Bacteriology 1695771-5278)。
宿主细胞可以是真核生物，例如哺乳动物，昆虫，植物，或真菌细胞。
在一个优选具体实施方式
中，宿主细胞是真菌细胞。这里所用的“真菌”包括Ascomycota门(Phyla)，Basidiomycota门，Chytridiomycota门和Zygomycota门(正如Hawksworth等人In，Ainsworth and Bisby’s Dictionary ofThe Fungi，8th edition，1995，CAB International，University Press，Cambridge，UK所定义的)以及Oomycota(如同在Hawksworth等人1995，同上，第171页所例举的)和所有的mitosporic真菌(Hawksworth等人1995，同上)。
在一个更优选的具体实施方式
中，真菌宿主细胞是酵母细胞。在这里所利用的“酵母”包括产子囊(ascosporogenous)酵母(内孢霉目)(Endomycetales)，basidiosporogenous酵母，和属于Fungi Imperfecti(芽生菌)(Blastomycetes)的酵母。因为酵母定义为的分类今后可能会有变化，出于本发明的目的，酵母应该定义为如Biology and Activities of Yeast(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.，and Davenport，R.R.，eds，Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeries No.9，1980)所描述的。
在一个更加优选的具体实施方式
中，酵母宿主细胞是念珠菌属，汉逊酵母属(Hansenula)，毕赤氏酵母属(Pichia)，糖酵母属(Saccharomyces)，裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或Yarrowia细胞。
在一个最优选的具体实施方式
中，酵母宿主细胞是卡尔斯伯酵母，酿酒酵母，Saccharomyces diastaticus，Saccharomyces douglasii，Saccharomyceskluyveri，Saccharomyces norbensis或Saccharomyces oviformis细胞。在另一个最好的具体实施方式
中，酵母宿主细胞是Kluyveromyces lactis细胞。在另一个最优选的具体实施方式
中，酵母宿主细胞是Yarrowia lipolytica细胞。
在另一个更优选的具体实施方式
中，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。丝状真菌包括所有的真菌门(Eumycota)和Oomycota亚门(subdivision)的丝状型(正如Hawksworth等人1995，同上所定义的)。丝状真菌的特点在于菌丝体的壁由壳多糖，纤维素，葡聚糖，脱乙酰壳多糖，甘露聚糖及其他复合多糖类组成。营养生长是通过菌丝的延长，而碳的分解代谢是obligately需氧型的。相反，酵母的营养生长例如酿酒酵母(Saccharomy cerevisiae)是通过芽生出单细胞的叶状体，而碳的分解代谢可能是厌氧的。
在一个更优选的具体实施方式
中，丝状真菌宿主细胞是一种但不限于枝顶孢属(Acremonium)，曲霉属，镰刀菌属，腐殖菌属，毛霉属，Myceliophthora，脉孢菌属(Neurospora)，青霉属(Penicillium)，Thielavia，Tolypocladium，或木霉属(Trichoderma)的细胞。
在一个最优选的具体实施方式
中，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉(Aspergillus awamori)，Aspergillus foetidus，Aspergillus japonicus，构巢曲霉，黑曲霉或米曲霉的细胞。在另一个最优选具体实施方式
中，丝状真菌宿主细胞是Fusarium bactridioides，Fusarium cerealis，Fusarium crookwellense，黄色镰孢(Fusarium culmorum)，禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)，Fusariumgraminum，Fusarium heterosporum，Fusarium negundi，尖胞镰孢，网状镰孢(Fusarium reticulatum)，粉红色镰刀菌(Fusarium roseum)，接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)，Fusarium sarcochroum，Fusarium sporotrichioides，Fusarium sulphureum，Fusarium torulosum，Fusarium trichothecioides，或Fusarium venenatum细胞。在一个更加优选的具体实施方式
中，丝状真菌母细胞是Fusarium venenatum(Nirenberg sp nov.)细胞。在另一个最优选的具体实施方式
中，丝状真菌宿主细胞是Humicola insolens，Humicolalanuginosa，Mucor miehei，Myceliophthora thermophila，Neurospora crassa，Penicillium purpurogenum，Thielavia terrestris，Trichoderma harzianum，Trichoderma koningii，Trichoderma longibrachiatum，Trichoderma reesei，或绿色木霉(Trichoderma viride)的细胞。
真菌细胞可以通过包括在某种意义上已知的自身原生质体形成，原生质体转化，和细胞壁的再生等方法进行转化。适当的曲霉宿主细胞转化方法在EP 238 023和Yelton等人1984，Proceedings of the National Academy ofSciences USA 811470-1474中有所描述。适当的镰刀菌属种转化方法在Malardier等人1989，Gene 78147-156和WO 96/00787中有所描述。可以利用在Becker和Guarente，In Abelson，J.N.and Simon，M.I.，editors，Guideto Yeast Genetics and Molecular Biology，Methods in Enzymology，Volume 194，pp 182-187，Academic Press，Inc.，New York；Ito等人1983，Journal ofBacteriology 153163；和Hinnen等人1978，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 751920中描述的方法进行酵母转化。
发明的详细说明第一方面涉及一种编码含有与SEQ ID NO2至少有60％的同一性的氨基酸序列的乳清酸转运蛋白多肽的重组标记基因，已经证明该多肽具有首创的、ysbC编码的多肽可鉴定的乳清酸转运蛋白活性，如同在此披露的，完全获取的ysbC序列是一个简单的从任何一种细胞中分离对应ysbC同系物，该细胞携带有相关的乳清酸转运蛋白编码基因。
传统上，分子生物学家已经可以辨别选择性标记和筛选标记。一般地，选择性(selective)标记只允许那些带有标记的细胞在一定的选择条件下生长，反之，筛选(screening)标记则仅仅是抑制那些带有标记的细胞的生长，因此可以清楚地识别它们。当分子生物家想要从宿主细胞中除去标记时，一般既可以利用染色体交叉(crossing-out)产生的结果，也可以采用将质粒从细胞质中处理这种方法，然后再使用“反向选择”的条件。反向选择可以以选择的方法为基础，或可以以筛选的方法为基础。当标记具有一种根据条件，在第一次导入宿主细胞时提供选择或筛选，并在随后的从宿主细胞中去除时也提供选择或筛选的特性时，该标记一般被称为“双向选择标记”。
因此，本发明一个优选的具体实施方式
涉及第一个方面的标记基因是选择标记，筛选标记，反向选择标记，和/或双向选择标记。
本申请鉴定出一种非常通用的转运子编码标记，其通用性(versatility)部分是基于该标记不但能够转将乳清酸转运到宿主细胞中，而且也能将乳清酸类似物，抑制宿主细胞生长的5-氟代乳清酸(FOA)转化进去，这些由在下面的非限制性的实例来证实。
所以，在一个优选的具体实施方式
中，本发明涉及第一个方面的标记基因，其中编码的乳清酸转运蛋白多肽也转运一或多个乳清酸类似物，最好是乳清酸类似物5-氟代乳清酸。
为了实现本发明标记基因的较高或较低表达，发明人建议利用至少一个异源的和/或人造的启动子来调整启动子强度。如何调整启动子强度在例如WO 93/10249，和WO 98/07846(都是Novozymes A/S)中有所披露，其中两者都在此全文合并引入。通过并列(in line)多个启动子以增加启动子活性的方法，或选择性地偶联mRNA的稳定序列的方法在WO99/43835(Novozymes A/S)中有所披露，该文献在此也被全文引用。
因此，在一个优选的具体实施方式
中，本发明涉及第一个方面的标记基因，该基因从至少一个异源的和/或人造的启动子开始转录。
当然，本发明一方面还涉及至少含有一个第一个方面的重组标记基因的多核苷酸构建体。
因而，本发明一个优选的具体实施方式
涉及第二方面的多核苷酸构建体，其中至少一个重组标记基因是选择标记，筛选标记，反向选择标记，或双向选择标记。
另一个优选的具体实施方式
涉及第二个方面的多核苷酸构建体，其中编码的乳清酸转运蛋白多肽也转运一或多个乳清酸类似物；优选是乳清酸类似物5-氟代乳清酸。
还有另一个优选的具体实施方式
涉及第二方面的多核苷酸构建体，其中标记基因从至少一个异源的和/或人造的启动子开始转录。
本领域技术人员已知几种不同种类的多核苷酸构建体，最熟悉的大概是RNA和DNA，而在优选的具体实施方式
中，第二方面的多核苷酸构建体是DNA。
当多核苷酸转入宿主细胞时，可以作为染色体外的实体，例如质粒，而且可以在细胞中保持这种形式，它与细胞一起复制，当细胞在分裂或生长的出芽阶段时分到所有的后代细胞中。已经证明当序列呈现在染色体外的多核苷酸结构上时，可以确保该结构在细胞中维持和稳定性，而且它们已经被认为是自主复制的序列(ARS)或自主维护的序列(AMA)。
本发明的一个优选的具体实施方式
涉及第二方面的多核苷酸构建体，其中该构建体在染色体外的，而且含有一或多个提供在宿主细胞中自主复制和/或自主维护(maintenace)的序列，最好是ARS，或AMA1。
有时候，多核苷酸构建体整合到宿主细胞的基因组中，这也是本发明的一个优选的具体实施方式
。
其他的第二方面的优选具体实施方式
涉及的多核苷酸构建体是质粒，一种线性化的质粒，或多元化(multimerized)的质粒，并且优选是至少含有一个能在宿主细胞中起作用的复制起点的质粒。
当在工业宿主细胞中不想采用抗生素抗性编码标记时，那么在中间宿主的细胞构建步骤中选用这些标记，只是在后面的阶段将其除去，这样也许是有力使用它们。
因此，第二方面的优选的具体实施方式
涉及还含有至少一个编码多肽的选择标记基因的多核苷酸，当在宿主细胞中表达时，依次针对抗生素表现其抗性。
第三方面涉及含有至少一个外源的第一方面的标记基因，或第二方面的多核苷酸构建体的细胞。
因而，第三方面的一个优选的具体实施方式
是细胞，其中至少一个标记基因是选择标记，筛选标记，反向选择标记，或双向选择标记。优选至少一个编码乳清酸转运蛋白多肽的标记基因也转运一或多个乳清酸类似物，5-氟代乳清酸。
同样地，如上所述，优选至少一个标记基因从至少一个异源的和/或人造的启动子开始转录。
如同此处和别处描述的，本发明适用于各式各样的宿主细胞。非限制性的实例是将本发明应用在革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌细胞，Lactococcus，芽孢杆菌，而在下面的实例中用的是埃希氏杆菌属。
然而，第三方面的细胞优选微生物的细胞，优选的是细菌细胞，更优选的是革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌细胞，而最优选的是乳酸杆菌属(Lactococcus)，芽孢杆菌属或埃希氏杆菌属。
通常，在先前步骤中由于ysbC标记的获得而被筛选或选择的细胞可以在随后的反向选择程序中正是由于这个相同标记的缺失而被筛选或选择。将含有该标记基因的多核苷酸构建体逐步(stepwise)导入宿主细胞，随后将该构建体从宿主细胞中进行处理，并通常将部分的构建体留在后面，这种标记基因常常被称为双向标记基因。
如果细胞是因为ysbC标记缺失而成为嘧啶营养缺陷的，那么没有外界提供的嘧啶，该标记的缺失将导致其生长的抑制。这样就很容易建立一种筛选，如同上面的实例中描述的。
另一个实例是，如果ysbC标记缺失，细胞对有抑制性的乳清酸类似物5-氟代乳清酸(FOA)表现抗性，那么该标记的缺失将导致该细胞再次表现抗性。这样也很容易建立一种选择，如同上面的实例中描述的。
本发明的最后一发明涉及一种挑选或鉴定至少含有重组标记基因一拷贝的细胞，和/或挑选或鉴定已经用该重组标记基因处理的细胞的方法，其中所述标记基因编码含有的氨基酸序列与SEQ ID NO2至少有60％的同一性的乳清酸转运蛋白多肽，所述方法含有利用该标记基因做为选择标记，筛选标记，反向选择标记，或双向标记的步骤，由此，在适宜条件下挑选或鉴定出该细胞。
本发明的一个优选的具体实施方式
涉及最后一个方面的方法，其中细胞是嘧啶营养缺陷型的，在该重组标记缺失时没有功能性的乳清酸转运蛋白，并且其中的重组标记是被转化到营养缺陷的宿主细胞中的，随后该细胞培养在无尿嘧啶但补充有乳清酸的生长培养基中，只有含有重组标记的细胞才能生长，其中该标记用作选择标记。
另一个优选的具体实施方式
涉及最后一个方面的方法，其中细胞是嘧啶营养缺陷型的，含有编码功能性的乳清酸转运蛋白蛋白的重组标记基因，接着将该标记基因从细胞中进行处理，细胞培养在无尿嘧啶的生长培养基中，其中仅仅抑制该标记基因被处理的细胞，其中该标记被用作筛选标记；优选的是，细胞是由于至少一个编码将二氢乳清酸转化成乳清酸的酶的基因突变而造成的嘧啶营养缺陷型，而且最好是由于pyrD，pyrDa，pyrDb和pyrK中的一个或更多产生突变。
还有另一个优选的具体实施方式
涉及最后一个方面的方法，其中细胞在重组标记缺失时缺乏功能性的乳清酸转运蛋白蛋白，而且对乳清酸类似物5-氟代乳清酸有抗性，重组标记是被导入到细胞中，随后该细胞培养在补充有抑制浓度的FOA生长培养基中，只有含有重组标记的细胞对FOA敏感且被抑制，其中该标记用作筛选标记。
仍是另一个优选的具体实施方式
涉及最后一个方面的方法，其中细胞含有重组标记基因且对FOA敏感，随后将该标记基因从细胞中处理掉，将该细胞培养在补充有抑制浓度的FOA的生长培养基中，只有重组标记被处理掉的抗FOA的细胞能生长，其中该标记用作反向选择标记。
本发明的一个优选的具体实施方式
涉及最后一个方面的方法，其中首先挑选或鉴定出至少含有重组标记基因一拷贝的细胞，然后挑选或鉴定重组标记基因已经被处理的细胞，其中标记被用作双向标记；优选细胞是抗FOA的，嘧啶营养缺陷型的和当重组标记缺失时缺乏功能性的乳清酸转运蛋白，并且重组标记是首先被引入到乳清酸营养缺陷型宿主细胞，然后将该细胞培养在补充有乳清酸的生长培养基中，其中只有含有重组标记的细胞才能生长，随后通过在补充有抑制浓度的FOA生长培养基中的培养将标记基因从细胞中处理，其中只有重组标记基因被处理的抗FOA的细胞才能生长，其中的标记被用作双向的选择标记；优选该细胞是由于编码将二氢乳清酸转换成乳清酸的酶的基因突变，优选是由于pyrD，pyrDa，pyrDb，和pyrK中的一个或多个突变而导致的嘧啶营养缺陷的细胞。
实施例发明人期望本发明乳清酸转运蛋白能够在非常广谱的宿主细胞中起作用，包括真核细胞和原核细胞。作为该乳清酸转运蛋白功能性的非限制性的实例，其用途在三种极为不同的细菌中被证实实例1中的Lactococcuslactis(L lactis)，实例2中的大肠杆菌(E.coli)，和实例3中的枯草芽孢杆菌(B.subtilis)。
菌株和质粒表1.用于实例的菌株和质粒。1U-尿嘧啶需求的；OR+应用乳清酸；Neor新霉素抗性；ysbC，ysbB和ysbA源于质粒pDBORO(结果未公开)


培养基和生长条件L.lactis培养基SA-葡萄糖培养基(Jensen和Hammer，1993)100ml 10×MOPS10ml维生素溶液100ml 17L-氨基酸溶液
100mg L-半胱氨酸(粉末)50mg L-酪氨酸(粉末)5ml 1.9M NH4Cl1ml 0.276M K2SO410ml 0.132M K2HPO45ml 3M NaOAc pH 7.050ml 20％葡萄糖溶液对于液体培养基，添加高压灭菌的蒸馏水到1升并且用0.2微米过滤器除菌。使用前添加任何一种必要的auxothrophic物质和抗生素。
对于琼脂平板，添加高压灭菌的蒸馏水到500毫升并且用0.2微米过滤器除菌。将15g的琼脂加到500毫升的蒸馏水中，高压灭菌，冷却到55℃，与无菌的SA-葡萄糖浓缩液混合，再添加任何一种必要的auxothrophic需求的物质和抗生素，然后倒琼脂平板。
10×MOPS400ml 1M MOPS/KOH pH 7.4(新鲜制备)40ml 1M Tricine/KOH pH 7.4(新鲜制备)10ml 10mM FeSO410ml 0.5mM CaCl25.3ml 1M MgCl2100ml 5M NaCl10ml微量营养素425ml高压灭菌蒸馏水通过0.2微米的过滤器除菌，冷藏保存微量营养素3micro-M (Nh4)6(MO7)24400micro-M H3BO330micro-M CoCl210micro-M CuSO480micro-M MnCl2
10micro-M ZnSO4通过0.2微米的过滤器除菌，冷藏保存17L-氨基酸溶液3.0g每种 L-丙氨酸，L-谷氨酸，L-脯氨酸，L-丝氨酸2.0g每种 L-精氨酸，L-甘氨酸，L-赖氨酸，L-苯基丙氨酸，L-苏氨酸1.0g每种 L-天冬酰胺，L-谷氨酰胺，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-甲硫氨酸，L-色氨酸(Trypthophan)，L-缬氨酸0.5g L-组氨酸添加高压灭菌的蒸馏水到1升，调节pH到7.0并且用0.2微米过滤器除菌，冷藏保存。
维生素溶液10mg 生物素100mg 叶酸100mg 核黄素100mg 烟酰胺(Niacinamide)100mg 硫胺素(Thiamine)100mg 泛酸钙200mg 吡哆醛(pyridoxal)添加高压灭菌的蒸馏水到1升，调节pH到7.0并且用0.2微米过滤器除菌，冷藏保存。
M17-葡萄糖培养基(Terzaghi和Sandine，1975)5.0g 胰胨5.0g 大豆蛋白胨(soya pepton)5.0g 肉汤-提取物(meat-extract)2.5g 酵母提取物0.5g 抗坏血酸(ascorbic acid)0.25g MgSO4
19g Na2-甘油磷酸盐(glycerophosphate)对于液体培养基，加水到1升并高压灭菌。pH 6.9左右。使用前添加0.5％的葡萄糖和任何一种必要的auxothrophic和抗生素。
对于琼脂平板，添加15g琼脂，加水到1升并高压灭菌。冷却到55℃，加入0.5％葡萄糖和任何一种必要的auxothrophic需要物(requirements)和抗生素，然后倒琼脂平板。
用于琼脂平板的SR(Holo和Nes，1989)10g 胰胨5g酵母提取物100g 蔗糖加H2O到1升而且如果需要调整pH到6.8，然后加入25g 胶质15g 琼脂高压灭菌，冷却到55℃，加入任何必要的营养缺陷型(auxothrophic)所需要的和抗生素，然后倒琼脂平板。
大肠杆菌培养基LB培养基10g 胰腺酶(Pancreatically)消化的来自酪蛋白的蛋白胨5g 细菌(Bacto)-酵母提取物4g NaCl对于液体培养基，添加水到1升，调整pH到7.0并高压灭菌。使用前添加任何一种必须的要求的营养缺陷型(auxothrophic)所需和抗生素。
对于琼脂平板，加水到1升，调整pH到7.0，添加15g琼脂，并高压灭菌。冷却到55℃，加入任何一种必要的营养缺陷型所需和抗生素，然后倒琼脂平板。
ABTG培养基(Clark and Maale，1967)配制 250ml1ml A109ml BT(细菌)琼脂
1％或2％ 20％酪蛋白氨基酸0.2％ 葡萄糖将ABTG培养基冷却到55℃，加入任何一种必要的营养缺陷型所需和抗生素，然后倒琼脂平板。
A10(100ml)2g (NH4)2SO46g Na2HPO43g KH2PO43g NaCl；Add 80ml H2O，调整pH到6.4并加水到100mlBT3.75g细菌琼脂(Bacto-agur)150ml H2O；高压灭菌枯草芽孢杆菌培养基LB培养基10g 胰腺酶消化的来自酪蛋白的蛋白胨5g 细菌-酵母提取物4g NaCl对于液体培养基，加水到1升，调整pH到7.0并高压灭菌。使用前添加evt.任何一种必须的营养缺陷型所要求的和抗生素。
对于琼脂平板，加水到1升，调整pH到7.0，添加15g琼脂，并高压灭菌。冷却到55℃，加入任何一种必要的营养缺陷型所需和抗生素，然后倒琼脂平板。
GM1培养基85ml 脱矿质水(demineralized H2O)10ml 10×MM溶液150微升 1M MgSO4
1.0ml 酵母提取物5％1.0ml 1mg/ml维生素B1(B1)250微升20％酪蛋氨基酸1.0ml 4mg/ml trypthophane溶液2.5ml 20％葡萄糖；添加任何一种必须的要求的营养缺陷型所需和抗生素。
GM2培养基85ml 脱矿质H2O10ml 10×MM溶液0.5ml 1M MgSO40.5m1 酵母提取物5％1.0ml 1mg/ml维生素B1(B1)1.0ml 4mg/ml Trypthophane溶液2.5ml 20％葡萄糖；添加任何一种必须的要求的营养缺陷型所需和抗生素。
10×MM溶液20g (NH4)2SO4106g K2HPO4.3H2O60g KH2PO410g Na-柠檬酸盐.2H2O2g MgSO4.7H2O；加入700ml MilliQ H2O，用10N NaOH将pH调整到7.0并加入MilliQ H2O到1升。
基本培养基(500ml)400ml脱矿质H2O100ml5×SZ5ml 20％谷氨酸1ml 0.1mg/ml MnSO4250微升50mM FeCl3
5ml 1mg/ml维生素B1(B1)5ml 4mg/ml Trypthophane溶液10ml 葡萄糖20％；添加任何一种必须的要求的营养缺陷型所需和抗生素。
琼脂平板的基本培养基(500ml)400ml 脱矿质H2O10g细菌琼脂高压霉菌，冷却至55℃.
加入100ml 5×SZ5ml 20％谷氨酸1ml 0.1mg/ml MnSO4250微升 50mM FeCl35ml 1mg/ml维生素B1(B1)5ml 4mg/ml Trypthophane溶液10ml葡萄糖20％；加入任何一种必要的营养缺陷型所需和抗生素，然后倒琼脂平板。
5×SZ (Spizizens盐)10g (NH4)2SO470g K2HPO4.3H2O30g KH2PO45gNa-柠檬酸盐.2H2O1g MgSO4.7H2O；加入700ml MilliQ H2O，用10N NaOH将pH调整到7.0并加入MilliQ H2O到1升。
1％淀粉琼脂平板(500ml)5.0g 胰腺酶消化的来自酪蛋白的蛋白胨2.5g 细菌-酵母提取物2.0g NaCl
加H2O到500ml，调整pH到7.25.0g 可溶性淀粉10g 琼脂高压灭菌，冷却到55℃，加入任何一种必要的营养缺陷型所需和抗生素，然后倒琼脂平板。
碘化钾溶液0.5％ 碘化物(Iodide)1.0％ 碘化钾生长条件乳球菌(Lactococcal)培养物在分别补充有0，5％和1％葡萄糖的M17肉汤(broth)(Terzaghi和Sandine，1975)或者基本的SA培养基(Jensen和Hammer，1993)中，30℃下生长。大肠杆菌在Luria-Bertani(LB)肉汤或者基本的ABTG培养基(Clark和Maale，1967)中，37℃下生长。B subtilis菌在LB培养基或者基本(minimal)的MM培养基中，37℃下生长。琼脂平板是由将15g/ml的琼脂加到肉汤培养基中而制成。如有必要，可以将以下的添加物加到不同的培养基中20micro-g/毫升的乳清酸，20micro-g/毫升的尿嘧啶，20micro-g/毫升的5-氟代乳清酸(FOA)，5micro-g/毫升的红霉素，将5micro-g/毫升的氯霉素加到乳球菌(lactococci)的培养基中而20micro-g/毫升加到大肠杆菌的培养基中，100micro-g/毫升的氨苄青霉素。
转化根据Holo和Nes(1989)，L.lactis的转化是通过电穿孔法实现的。为了将所有的质粒制备物转化到L.lactic ED79.1175中，采用含有SA-培养基，1％葡萄糖，250mM蔗糖，2.5micro-M CaCl2，2.5micro-M MgCl2和100micro-g/毫升乳清酸的补充的基本培养基(SA-葡萄糖)琼脂平板代替Holo和Nes(1989)所描述的培养基。
利用氯化钙方法(Mandel和Higa，1970)和热休克方法(Volckaert等人1984)对大肠杆菌细胞进行转化。
按下列方法(Boylan等人，1972)进行B.subtilis细胞的转化将3ml的在GM1培养基中过夜培养的培养物加到10ml新鲜的GM1培养基中并在37℃下培养4小时以制备感受态的B subtilis感受态细胞。随后在GM2培养基中将细菌培养稀释1/10并在37℃培养1小时。对于HH180细胞，在GM1和GM2培养基中加入20micro-g/毫升的尿嘧啶。为了进行转化，将1毫升感受态(competent)的培养物与10或30微升的线性质粒溶液混合，并在37℃下将该混合物培养35分钟。将细胞离心4分钟，然后用200微升的0.9％NaCl溶液再悬浮该细胞沉淀(pellet)，再平铺到含有5micro-g/毫升新霉素的选择LB平板上。将该平板在37℃下培养过夜。
分子克隆技术和寡聚核苷酸来自乳球菌和B.subtilis的染色体DNA用Johansen和Kibenich(1992)描述的方法来制备。根据Qiagen所描述的程序，通过Qiagen阴离子交换柱纯化得到质粒DNA。采用Sambrook等人(1989)的标准分子克隆技术。限制性核酸内切酶购自Fermentas，虾碱性磷酸酶和T4 DNA连接酶都购自Roche。Elongase酶混合物获自Life Technologies，AmpliTaq DNA聚合酶获自Perkin Elmer，而克隆的Pfu DNA聚合酶和TaqPlusprecision PCR系统来自Stratagene。TOPO TA Cloning试剂盒购自Invitrogen Inc.。用于从琼脂糖凝胶上纯化DNA片段的Gene Clean试剂盒获自BIO101 Inc.。
实例中使用的合成的寡聚核苷酸列于表2中。寡聚核苷酸购自TAGCopenhagen A/S.。
表2.实例中使用的合成的寡聚核苷酸.


DNA的PCR扩增在染色体的或质粒DNA上进行DNA扩增，终体积为50微升，包含每种脱氧核糖核苷三磷酸200mM，每种寡聚核苷酸200nM，和Taq聚合酶。AmpliTaqTMDNA聚合酶(2.5U)用在验证实验中。出于克隆目的，PfuDNA聚合酶，TaqPlus Precision聚合酶混合物或Elongase是根据制造商的推荐而选用的。扩增主要是按照95℃50秒，50℃50秒和72℃1-5分钟，25-30循环而进行的。
DNA测序DNA序列的确定是利用热测序酶和20微居(micro-Ci)的[alpha-35S]dATP(都获自Amersham Pharmacia Biotech)，通过酶催化的双脱氧核糖核酸链终止法(Sanger等人1977)。双链的碱变性质粒DNA用作模板DNA，而合成寡核苷酸用作引物。
B.subtilis中α-淀粉酶活性的检测B.subtilis中α-淀粉酶活性检测是通过将0.5％的碘溶液和1％碘化钾溶液添加到生长在含有1％淀粉的LB琼脂平板菌落上来进行的。产生α-淀粉酶的菌落产生了清晰的晕圈(halo)，而α-淀粉酶阴性(negative)的菌落则没有。
实例1
L.lactis ssp.cremoris菌株ED79.1175的构建概述L.lactis ssp.cremoris菌株ED79.1175是MG1363 ΔpyrDa ΔpyrDb的突变体，含有在pyrDa和pyrDb基因上的缺失处理。这两种缺失导致产生嘧啶需求型的菌株，可以通过将尿嘧啶添加到该菌株的生长培养基中而避免(bypass)。亲本菌株MG1363(Gasson，1983)是嘧啶原养型的。pyrDa和pyrDb都编码功能性的二氢乳清酸脱氢酶，它催化二氢乳清酸向乳清酸的转化，在重新的嘧啶生物合成中的第四步显示在图1中Andersen等人1994，1996)。pyrDa和pyrDb的开放读框的长度都是933碱基对(bp)，而且它们各自的基因产物每个都包含311个氨基酸(aa)残基。
在MG1363中，pyrDa基因C-末端的部分删去261bp的DNA片段从而产生截短的且不完全的仅仅224aa残基的ΔpyrDa基因产物。然后从pyrdb上删掉内部的780bp的DNA片段，而后留下编码原始的蛋白的28个N-末端和24个C-末端的氨基酸残基的DNA。
如同下面详细描述的，将MG1363的带有经缺失的pyrDa和pyrDb基因克隆进载体pCR2.1-TOPO(Invitrogen)中，然后产生的构建体融合到pGhost+4载体中(Maguin等人，1993)以便在L.lactis中进行连续的基因取代。产生的MG1363 ΔpyrDa突变体用ED58.82表示，而双-突变体MG1363 ΔpyrDa ΔpyrDb用ED79.1175表示。
质粒pRL101，pED102和pED202的构建质粒pIP61含有完整的pyrDa基因(Andersen等人，1994)。质粒pRL101含有通过组合PCR和BamHI-NcoI消化将pyrDa基因C-末端的一部分缺失261bp DNA片段的经缺失的pyrDa(在位置653到914之间)。用引物pyrDaBamHI(SEQ ID NO3)和pyrDaNcoI(SEQ ID NO4)在pIP61质粒DNA上进行PCR。pIP61和PCR产物都用BamHI和NcoI消化，连接在一起后转化到在37℃下具有100micro-g/毫升的氨苄青霉素选择性的XL1-Blue的大肠杆菌宿主产生pRL101(Larsen 1997)中。
质粒pED102含有ΔpyrDa基因。如前所述，该缺失基因用引物pyrDaHindIII(SEQ ID NO5)和pyrDaBamHI(SEQ ID NO3)通过TaqPlusPrecision PCR系统扩增，然后亚克隆到载体pCR2.1-TOPO(Invitrogen)中。用TaqPlusPrecision再扩增，产生一个2249bp特异的片段，该片段是克隆前从琼脂糖凝胶上纯化得到的。克隆到pED102的DNA片段分别含有缺失位点上游933bp和下游的1316bp，是MG1363中基因取代必需的(Biswas等人，1993)。通过DNA测序分析对pED102中完整克隆的DNA片段的DNA序列进行验证。
质粒pED202的制备是将pED102和pGhost+4通过两个构建体所独有的XbaI-位点连接到一起的制备的。转化到大肠杆菌宿主XL1-Blue后，在37℃，含有100micro-g/ml氨卞青霉素和150micro-g/ml红霉素的LB平板上对融合构建体进行挑选。只有含有该融合构建体的细胞才能在LB选择平板上生存。
第一次基因的取代-野生菌株MG1363中的pyrDa通过电穿孔将pED202的QIAGENTM纯化的质粒DNA导入到感受态MG1363细胞中。在28℃，含有5micro-g/ml红霉素的M17-葡萄糖(Terzaghi和Sandine，1975)平板上挑选和纯化带有pED202质粒的转化体。在含有5micro-g/ml红霉素和1％NaCl的M17-葡萄糖平板上划出含有pED202的转化体，并在37℃培养过夜，以对整合到染色体上的进行筛选。在同样的平板上再划出菌落，并在37℃培养过夜。在不含红霉素的M17-葡萄糖平板上划出菌落并在28℃下培养过夜以便通过重组有利于去除质粒。再在同样类似的平板上划出菌落，并在28℃培养过夜。通过在含有1％NaCl的M17-葡萄糖平板上划出细胞并在37℃培养过夜，以从细胞中处理质粒。再在含有1％NaCl的M17-葡萄糖平板上划出菌落并在37℃培养过夜。在有和没有5micro-g/ml红霉素的M17-葡萄糖平板上划出菌落并在28℃培养过夜，从而筛选出这些对红霉素敏感的菌落。通过染色体DNA的提取和用引物PSA17和PSA20进行PCR，筛选出经缺失处理的pyrDa的菌株。菌株ED58.82能提供有期望的pyrDa经缺失处理的PCR片段。菌株ED58.82是嘧啶原养型(prototrophic)的，所以必须进行第二次基因取代或pyrDb的缺失处理以产生嘧啶营养缺陷(auxotrophic)的菌株。
质粒pED105和pED204的构建通过SOE进行pyrDb基因中780bp内部片段的缺失。该SOE片段由在缺失位点上游1013bp和下游980bp的片段构成，含1993bp。
第一次PCR时，两个PCR片段，PCR1和PCR2，分别用Pfu DNA聚合酶，以MG1363染色体DNA为模板进行扩增。PCR1所用的引物是pyrDbIF(SEQ ID NO8)和pyrDbIR(SEQ ID NO9)。PCR2所用的引物是pyrDbIIF(SEQ ID NO10)和pyrDbIIR(SEQ ID NO11)。用琼脂糖凝胶纯化PCR片段。在SOE反应中，利用TaqPlusPrecision和引物pyrDbIF(SEQID NO8)和pyrDbIIR(SEQ ID NO11)，PCR1和PCR2作为模板对两个PCR产物进行拼接。产生的PCR片段用琼脂糖凝胶纯化并克隆到如前所述的pCR2.1-TOPO(Invitrogen)载体中。产生的质粒被称为pED105，通过过DNA序列测定对其完全的克隆的DNA片段进行DNA序列验证。
然后，通过pED105和pGhost+4两个结构中特有的XbaI-位点将它们连接在一起制备出质粒pED204。对大肠杆菌宿主XL1-Blue转化后，在37℃，含有100micro-g/ml氨苄青霉素和150micro-g/ml红霉素的LB平板上进行融合构建体的挑选。只有含有该融合构建体的细胞才能在这些LB选择平板上生存。
在菌株ED58.82(MG1363 ΔpyrDa)中第二次基因的取代-pyrDb将pED105的QIAGENTM纯化的质粒DNA通过电穿孔法导入感受态的ED58.82细胞中。在28℃，含有5micro-g/ml红霉素的M17-葡萄糖平板上挑选和纯化出带有质粒pED105的转化体。在含有5micro-g/ml红霉素和1％NaCl的M17-葡萄糖平板上划出含有pED105的转化体，并在37℃培养过夜，以挑选出在染色体上整合的转化体(integration in the chromsome)。在同样类似的平板上再划出菌落，并在37℃培养过夜。为了便于通过重组去除质粒，在不含红霉素的M17-葡萄糖平板上划出菌落并在28℃下培养过夜。再在同样类似的平板上划出菌落，并在28℃培养过夜。通过在含有1％NaCl的M17-葡萄糖平板上划出细胞并在37℃培养过夜，从细胞中处理质粒(cured from the plasmid)。再在含有1％NaCl的M17-葡萄糖平板上划出菌落并在37℃培养过夜。在有和没有5micro-g/ml红霉素的M17-葡萄糖平板上划出菌落并在28℃培养过夜，从而筛选出这些对红霉素敏感的菌落。
在对红霉素敏感的菌落中，在SA-葡萄糖平板(Jensen和Hammer，1993)和含尿嘧啶(20micro-g/ml)作为唯一嘧啶源的SA-葡萄糖平板上划出pyrDa和pyrDb都经缺失处理的菌株。缺失正确的菌株不能重新合成嘧啶，因此在SA-葡萄糖平板上不能生长。
从嘧啶-需求型的菌株中提取染色体DNA，用引物PSA17(SEQ IDNO6)和PSA20(SEQ ID NO7)以及引物pyrDbseql(SEQ ID NO12)和pyrDbseq3(SEQ ID NO14)分别进行pyrDa和pyrDb的PCR扩增，从而鉴定出各个基因中的缺失情况。产生的用ED79.1175表示的菌株在SA-葡萄糖平板上不能生长，除非添加嘧啶源，那么该菌株携带了染色体中正确的缺失。由于ED79.1175菌株具有催化二氢乳清酸还原成乳清酸的基因中的缺失，因此该菌株可被用于分析乳清酸的利用情况。另外，该ED79.1175菌株对类似物FOA也有抗性。
ysbC基因的克隆-pED112和pED210的构建负责将乳清酸转运到细胞中的ysbC基因编码一种307个氨基酸残基的蛋白。利用TMHMM Server v.2.0软件程序可以预测推定的ysbC基因产物的氨基酸序列的跨膜螺旋结构，其显示膜蛋白的整体结构由九个跨膜区域组成。
采用可分离较大的BAC和PAC质粒克隆的QIAGEN程序来分离基因组文库。将由此制备的总共2microliters的质粒通过电转化法转移到嘧啶auxothropic的ED79.1175菌株中，利用100micro-g/ml的乳清酸作为选择试剂。
根据ED79.1175中乳清酸的利用而进行的质粒挑选是以菌株嘧啶auxothrophy的互补作用为基础的。因此，被用于转化的琼脂平板是补充有100micro-g/ml乳清酸作为唯一嘧啶源的鉴定培养基(SA-葡萄糖)平板。两天后，在选择培养基上发现生长出1000多个转化菌落。在无乳清酸补充的SA-葡萄糖平板上没有长出菌落，说明获得的转化体已经获得了编码乳清酸利用或吸收的基因信息。
分别在含有100，50和20微克(micro-g)/ml乳清酸的SA葡萄糖培养基上再划出三十六个转化体。在所有的乳清酸浓度下，转化体以野生型的生长率生长。对五个转化体的质粒情况进行分析，它们都仅仅隐含一个单质粒，用pDBORO表示。
利用ELONGASETM聚合酶，从QIAGENTM纯化的质粒pDBORO模板上PCR扩增出含有在引物DBORO2(SEQ ID NO15)和引物DBORO8(SEQID NO16)之间的ysbC gene(3688bp)的DNA片段。利用TOPO TA克隆系统将产生的PCR片段克隆到载体pCR2.1-TOPO(Invitrogen)中，然后在37℃，含有100micro-g/ml氨苄青霉素的LB平板上对重组的质粒进行筛选。为了区别重组克隆，将0.1mM的IPTG和40micro-g/ml的5-溴基4-氯基-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷(galactopyranoside)(X-Gal)添加到平板中。产生的重组质粒用pED112表示。
随后用EcoRI-消化，将DNA片段从质粒pED112上切下，再连接到pCI3440独有的EcoRI-位点上(Hayes等人，1990)，并且在37℃，在具有抗20micro-g/ml氯霉素的筛选特性的大肠杆菌宿主菌株DH5α中增殖。产生的质粒被称为pED210。
在L.lactis中，ysbC作为选择标记该实例证明ED79.1175菌株对乳清酸的利用是通过ysbC介导的。
将pED210或pCI3440(负调控)的纯化的质粒DNA通过电穿孔法导入感受态的ED79.1175中，并在30℃，补充有5micro-g/ml氯霉素的SR平板(Holo和Nes，1989)上筛选出携带有pED210或pCI3440质粒的转化体。
通过在含有5micro-g/ml氯霉素的SA-葡萄糖平板上，在有或没有20micro-g/ml乳清酸或者尿嘧啶时，划出菌落，从而筛选出这些利用乳清酸的、含有pED210或pCI3440的转化体。在30℃时培养过夜。
含有载体pCI3440(对照)的ED79.1175菌株只能在补充有20micro-g/ml尿嘧啶的SA-葡萄糖培养基上生长。但是，含有pED210的ED79.1175菌株，由于细胞中含有自pED210的ysbC基因产物从而获得了利用乳清酸作为唯一(sole)嘧啶来源的特性，且该菌株在两种平板上都能生长。
从两种菌株中提取DNA并用限制性核酸内切酶EcoRI进行消化，以此验证ysbC基因仅仅在利用乳清酸，即含有pED210的菌株中存在。只有带有pED210的菌株产生出含DNA限制性内切酶酶切片段的ysbC。
结果显示，ysbC适用于作为通常是嘧啶营养缺陷的细胞的选择标记，即乳清酸，这表明已经变成原养型的那些细胞获得了想要的含有ysbC标记的多核苷酸构建体。
在L.lactis中ysbC作为筛选标记该实例证明菌株NCDO712和MG1363对乳清酸类似物5-氟代乳清酸(FOA)敏感是由ysbC介导的。
菌株L.lactis NCDO712(Gasson，1983)和MG1363(Gasson，1983)都是嘧啶原养型，且抗FOA的L.lactis ssp.cremoris菌。
将pED210或pCI3440的QIAGENTM纯化的质粒DNA通过电穿孔法导入感受态的NCDO712和MG1363中，并在30℃，补充有5micro-g/ml氯霉素的SR平板(Holo和Nes，1989)上筛选出携带有pED210或pCI3440质粒的转化体。通过在30℃培养过夜，含有20micro-g/ml FOA的SA-葡萄糖平板上划出菌落，而筛选出FOA敏感型的含有pED210或者pCI3440的转化体。
含有载体pCI3440(对照)的菌株抗FOA，而含有质粒pED210的那些由于含有ysbc基因而变成了FOA敏感型的。为了验证对FOA敏感是由于质粒pED210的存在，如上所述从对FOA敏感和不敏感的菌株中提取质粒DNA，然后用限制性核酸内切酶EcoRI酶切。只有从FOA敏感的菌株中分离的DNA产生带有来自pED210的ysbC限制性内切酶酶切片段。
该结果显示ysbC适合作为通常耐FOA的细胞中的筛选标记，其中它表示那些已经变成对FOA敏感的细胞获得了想要的含有ysbC标记的多核苷酸构建体。
以前曾预测ysbC基因在L.lactis菌的基因组序列中，但其功能未被证实。根据上面描述的实验，我们断定ysbC很可能编码乳清酸转运蛋白蛋白。
实例2pED301-在载体pDG268中ysbC基因的克隆载体pDG268(C.W.Price)是一种用于枯草芽孢杆菌的整合载体，利用双元杂交重组通过位于pdg268的amyE的氨基末端和amyE的羧基末端部分该载体能特别地整合到染色体amyE基因中。该质粒也含有大肠杆菌的起点，新霉素和氨苄青霉素抗性标记，以及用于在大肠杆菌中用蓝色/白色区分重组克隆的LacZ操纵子。用作ysbC基因分子克隆的克隆位点的是位于LacZ氨基末端端点的BamHI和EcoRI。KpnI位点用于线性化以增强染色体整合。
利用ELONGASETM聚合酶和QIAGENTM纯化的质粒pDBORO的质粒DNA进行PCR，扩增出含有引物DBORO22BamHI(SEQ ID NO17)和引物DBORO23EcoRI(SEQ ID NO18)间的ysbC基因(2048bp)的DNA片段。PCR片段用BamHI和EcoRI酶切，然后连接到载体pDG268(C.W.Price)中。
产生的用pED301表示的重组质粒在大肠杆菌宿主菌株XL-blue和KUR1351(Baker等人，1996)中，在37℃含100micro-g/ml氨苄青霉素的LB平板上增殖。
在E.coli菌株KUR1351中ysbC作为选择标记用质粒pED112(ysbC)和质粒pED301(ysbC)来检查乳清酸利用情况。亲代质粒pCR2.1-TOPO和pDG268分别用作阴性对照。
通过热休克方法(Mandel和Higa，1970)将QIAGENTM纯化的重组质粒或载体的质粒DNA导入的大肠杆菌KUR1351感受态细胞中。在37℃，补充有100micro-g/ml氨苄青霉素的LB平板上挑选出含质粒DNA的转化体。在含或不含20micro-g/ml乳清酸或者20micro-g/ml尿嘧啶作为嘧啶来源的ABTG平板(Clark和Maale，1967)上划出转化体对其进行进一步的乳清酸利用情况的筛选。
为了检验乳清酸的利用是否是由于细胞中质粒pED112或pED301的存在，从乳清酸利用和非利用的菌株中提取质粒DNA，然后分别用限制性核酸内切酶EcoRI(切下含有ysbC的3688bp的DNA片段)，和BamHI-EcoRI(切下含有ysbC的2048bp的DNA片段)进行酶切。结果证明，由多拷贝的以游离质粒形式存在的ysbC基因编码的L.lactis乳清酸转运蛋白，是将乳清酸转运到革兰氏阴性细菌大肠杆菌中所需的，而且转入的乳清酸可以满足大肠杆菌KUR1351菌株对嘧啶的需求。此外，ysbC的基因产物的功能独立于背景载体。
在大肠杆菌XL1-Blue中ysbC作为筛选标记大肠杆菌XL1-Blue通常用作实验室菌株，它是嘧啶原养型的，并且抗FOA。
将pED301(ysbC)或pDG268(负调控)的QIAGENTM纯化的质粒DNA通过热休克方法导入的XL1-Blue感受态细胞中，在37℃，补充有100micro-g/ml氨苄青霉素的LB平板上挑选出含有质粒pED301或pDG268的转化体。通过在37℃培养过夜的，有或没有20micro-g/ml氟代乳清酸的ABTG平板上划出菌落从而筛选氟代乳清酸敏感的转化体。
为了检验FOA敏感是否是由于质粒pED301的存在，从FOA敏感的和不敏感的菌株中提取质粒DNA，然后用限制性核酸内切酶BamHI和EcoRI酶切(切下含有ysbC的2048bp的DNA片段)。只有对FOA敏感菌株的消化才有清楚的表明ysbC存在的片段。可以断定，L.lactis的由ysbC编码的乳清酸转运蛋白也使得大肠杆菌XL1-Blue细胞对FOA敏感。
实例3
质粒pED307(ysbC)的构建用引物DBORO24 EcoRI(SEQ ID NO19)代替引物DBORO23 EcoRI(SEQ ID NO18)作为下游引物，结果扩增出更长的2693bp的ysbC PCR片段，除此之外，重组质粒pED307的构建也像pED301一样(参见实例2)。
在枯草芽孢杆菌中ysbC作为选择标记枯草芽孢杆菌HH180是一种嘧啶需求型的168pyrB菌株(Potvin等人，1975)。
用KpnI裂解使得pED307(ysbC)的QIAGENTM纯化的质粒DNA线性化。完全如在材料和方法中描述的，进行具有线性pED307/KpnI的HH180细胞的转化。为了满足HH180细胞的嘧啶需求，在GM1和GM2培养基中加入20micro-g/ml的尿嘧啶。
通过在1％的淀粉平板上划出转化体来验证pED307通过双元杂交同源重组入HH180的amyE基因。将平板培养在37℃下，在随后的日子里，将2ml的碘化钾溶液覆盖到平板表面。产生由amyE编码的功能性α-淀粉酶的转化体可以降解平板中的淀粉，在碘化物着色后可以观察到菌落周围清晰的晕圈。而带有amyE基因被整合入pED307拷贝的转化体仍是紫色的，没有晕圈显示。
在DNA水平上也进行了验证。从含有整合pED307(ysbC)或pDG268(阴性对照)的转化体中分离出染色体DNA，并用引物组268neo(SEQ IDNO22)和DBORO20(SEQ ID NO21)及引物组268neo(SEQ ID NO22)和DBORO4(SEQ ID NO20)进行PCR扩增，结果分别产生出大约2070bp和1200bp的PCR片段(数据未显示)。挑选出菌株ED364(HH180amyE::pDG268；对照)和ED358(HH180amyE::pED307)用于乳清酸利用的筛选。
在含或不含20micro-g/ml乳清酸或者20micro-g/ml尿嘧啶作为唯一嘧啶来源的、含有5micro-g/ml neomycine的MM选择平板上划出菌株ED364(ysbC)和ED358(对照)。将该筛选板在37℃下培养过夜。
结果证明，由在整合体染色体中是以单基因拷贝形式存在的ysbC编码的L.lactis乳清酸转运蛋白能将乳清酸转运到革兰氏阳性细菌枯草芽孢杆菌中。而且转入的乳清酸可以满足HH180菌株对嘧啶的需求。
在枯草芽孢杆菌中ysbC作为筛选标记枯草芽孢杆菌HH263是一种抗FOA的实验室菌株168(trpC2)，购自“Institut National de la Recherche Agronomique”(INRA)，法国。
用KpnI裂解QIAGENTM纯化的pED301(ysbC)质粒DNA使之线性化，然后完全用材料和方法中描述的方法精确将线性的pED301/KpnI转化到HH263细胞中。完全如上所述，在1％淀粉平板上对pED301质粒拷贝整合入染色体进行验证，并且也在DNA水平上进行验证。分别用引物组268neo(SEQ ID NO22)和DBORO20(SEQ ID NO21)及引物组268neo(SEQ ID NO22)和DBORO4(SEQ ID NO20)进行PCR扩增，结果产生出大约1425bp和560bp的PCR片段(数据未显示)。
产生的菌株用ED344(HH263amyE::pDG268)和ED348(HH263amyE::pED301)表示。ED344和ED348是在含5micro-g/ml neomycine的MM选择平板上划出的，一个有20micro-g/ml FOA而一个则没有。将该筛选板在37℃下培养过夜。
结果证明ED344抗FOA，而ED348对FOA敏感，所以由ysbC编码的L.lactis乳清酸转运蛋白能够介导FOA对革兰氏阳性细菌枯草芽孢杆菌的转运。这种所赋予FOA敏感性的表明ysbC基因在枯草芽孢杆菌细胞中负责5-氟代乳清酸的吸收。
参考文献Andersen，P.S.，Gildsig Jansen，P.J.and Hammer，K.(1994).Twodifferent dihydroorotate dehydrogenases in Lactococcus lactis.J.Bacteriol.176，3975-3982.
Andersen，P.S.，Martinussen，J.and K.Hammer，K.(1996).Sequenceanalysis and identification of the pyrKDbF operon from Lactococcus lactisincluding a novel gene，pyrK，involved in pyrimidine biosynthesis.J.Bacteriol.178，5005-5012.
Baker，K.E，.Ditullio，K.P.，Neuhard，J.and Kelln，R.A.(1996).Utilizationof orotate as a pyrimidine source by Salmonella typhimurium and Escherichiacoli requires the dicarboxylate transport protein encoded by dctA.J.Bacteriol.178，7099-7105.
Biswas，I.，Gruss，A.，Erhlich，S.D.and Maguin，E.(1993).High-efficiencygene inactivation and replacement system for gram-positive bacteria.J.Bacteriol.175，3628-3635.
Boylan，R.J.，Mendelson，N.H.，Brooks，D.and Young，F.E.(1972).Regulation of the bacterial cell wall.Analysis of a mutant of Bacillus subtilisdefective in biosynthesis of techoic acid.J.Bacteriol.110，281-290.
Clark，D.J.and Maale，O.(1967).DNA replication and the cell cycle inEscherichia coli.J.Mol.Biol.23，99-112.
Gasson，M.J.(1983).Plasmid complements of Streptococcus lactis NCDO712 and other streptococci after protoplast-induced curing.J.Bacteriol.154，1-9.
Grimberg，J.，Maguire，S.and Belluscio，L.(1989).A simple method for thepreparation of plasmid and chromosomal E.coli DNA.Nucleic Acids Res.17，8893.
Hayes，F.，Daly，C.and Fitzgerald，G.F.(1990).Identification of the minimalreplicon of Lactococcus lactis subsp.lactis UC317 plasmid pCI305.Appl.Environ.Microbiol.56，202-209.
Holo，H.and Nes，I，F.(1989).High-frequency transformation，byelectroporation，of Lactococcus lactis subsp.cremoris grown with glycine inosmotically stabilized media.Appl.Environ.Microbiol.55，3119-3123.
Horton，R.M.，Ho，S.N.，Pullen，J.K.，Hunt，H.D.，Cai，Z.，Pease，L.R.(1993).Gene splicing by overlap extension.Methods Enzymol.217，270-279.
Johansen，E.and Kibenich，A.(1992).Characterisation of Leuconostocisolates from commercial mixed strain mesophilic starter cultures.J.Dairy Sci.75，1186-1191.
Jensen，P.Rand Hammer，K.(1993).Minimal requirements for exponentialgrowth of Lactococcus lactis.Appl.Environ.Microbiol.59，4363-4366.
Larsen，R.(1997).Integration af deletions-mutation i pyrDa genet iLactococcus lactis subsp.cremoris，MG1363.Project-rapport c920822.
Mandel，M.and Higa，A.(1970).Calcium-dependent bacteriophage DNAinfection.J.Mol.Biol.53，154-162.
Potvin，B.W.，Kelleher，R.J.Jr，and Gooder，H.(1975).Pyrimidinebiosynthetic pathway of Baccillus subtilis.J Bacteriol.123，604-615.
Sanger F.S.N.and Coulson，A.R.(1977).DNA sequencing with chainterminating inhibitors.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74，5463-5467.
Terzaghi，B.E.and Sandine，W.E.(1975).Improved medium for lacticstreptococci and their bacteriophages.Appl.Microbiol.29，807-813.
Volckaert，G.，De Vleeschouwer，E.，Blcker，H.and Frank，R.(1984).Anovel type of vectors for ultrarapid chemical degradation sequencing of DNA.Genet.Anal.1，52-59.
序列表<110>诺维信公司<120>编码标记基因的乳清酸转运蛋白<130>10556.204-WO<160>22<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>921<212>DNA<213>Lactococcus lactis<220>
<221>CDS<222>(1)..(921)<223>编码ORF的乳清酸转运蛋白<400>1atg tat att tac cta gct ttt gca tta gtt ggc ggt ttt tta ctt gct48Met Tyr Ile Tyr Leu Ala Phe Ala Leu Val Gly Gly Phe Leu Leu Ala1 5 10 15aat caa aat cca atc aat gcg gat tta cga aaa att gtt ggc tca cca96Asn Gln Asn Pro Ile Asn Ala Asp Leu Arg Lys Ile Val Gly Ser Pro20 25 30ttt ttg gcc tct gga att tcc aac ttt gtt ggt tcg att ttt tta gga144Phe Leu Ala Ser Gly Ile Ser Asn Phe Val Gly Ser Ile Phe Leu Gly35 40 45att atc act tta gtg acc agt caa aca ctt ttt cct agt ttt caa ttt192Ile Ile Thr Leu Val Thr Ser Gln Thr Leu Phe Pro Ser Phe Gln Phe50 55 60gtt ggc tca cac cca gta tgg ata tgg att ggt ggg gtt ctt ggt ggg240Val Gly Ser His Pro Val Trp Ile Trp Ile Gly Gly Val Leu Gly Gly65 70 75 80att ttt cta aca tct aat gtt tta ctt ttc cca aga tta gga gct gtc288Ile Phe Leu Thr Ser Asn Val Leu Leu Phe Pro Arg Leu Gly Ala Val85 90 95caa acg gtg att tta cct att ttg ggt cga ata ttg atg ggg aca ctt336Gln Thr Val Ile Leu Pro Ile Leu Gly Arg Ile Leu Met Gly Thr Leu100 105 110att gat tca ttt ggc tgg ttt cat gcc atg caa ctt ccg atg act ctg384Ile Asp Ser Phe Gly Trp Phe His Ala Met Gln Leu Pro Met Thr Leu115 120 125atg cgc ttt ttg gga gtt atc att act tta gct ggg gtt att gtc gcg432Met Arg Phe Leu Gly Val Ile Ile Thr Leu Ala Gly Val Ile Val Ala130 135 140
gtt gtt ctt cct aat tta aaa gaa aaa gaa gca gaa acg cac caa act480Val Val Leu Pro Asn Leu Lys Glu Lys Glu Ala Glu Thr His Gln Thr145 150 155 160aac tta cta ggc tgg cga att tgg gcg gtc atc gtt ggg gca atg tcg528Asn Leu Leu Gly Trp Arg Ile Trp Ala Val Ile Val Gly Ala Met Ser165 170 175gct gct caa caa gca att aat ggc aga ttg gga gtt tta ctt gaa aac576Ala Ala Gln Gln Ala Ile Asn Gly Arg Leu Gly Val Leu Leu Glu Asn180 185 190act gca caa gca acc ttt gtt tcg ttc ttc att gga ttt tta gct att624Thr Ala Gln Ala Thr Phe Val Ser Phe Phe Ile Gly Phe Leu Ala Ile195 200 205ttt atc gtg tct ctt ttt att gac cgc cgt ttg cca aaa att tca gaa672Phe Ile Val Ser Leu Phe Ile Asp Arg Arg Leu Pro Lys Ile Ser Glu210 215 220tta aaa aaa gca aaa cct tgg aat gga att ggt gga ttt tta gga gcc720Leu Lys Lys Ala Lys Pro Trp Asn Gly Ile Gly Gly Phe Leu Gly Ala225 230 235 240tca atc gtt ttt gca aca gtc gtt gct gtt ccg caa att ggt gca ggg768Ser Ile Val Phe Ala Thr Val Val Ala Val Pro Gln Ile Gly Ala Gly245 250 255ctg aca att atg atg ggc ttg att gga caa att tta ggc agt atg ttg816Leu Thr Ile Met Met Gly Leu Ile Gly Gln Ile Leu Gly Ser Met Leu260 265 270gtt caa caa ttt ggt tgg tgg cgc tca agt aaa tat ggc att caa att864Val Gln Gln Phe Gly Trp Trp Arg Ser Ser Lys Tyr Gly Ile Gln Ile275 280 285tgg caa att gtt ggg att cta att atg ctg acc gga ata ata ttc att912Trp Gln Ile Val Gly Ile Leu Ile Met Leu Thr Gly Ile Ile Phe Ile290 295 300aaa ttt tta921Lys Phe Leu305<210>2<211>307<212>PRT<213>Lactococcus lactis<400>2Met Tyr Ile Tyr Leu Ala Phe Ala Leu Val Gly Gly Phe Leu Leu Ala1 5 10 15Asn Gln Asn Pro Ile Asn Ala Asp Leu Arg Lys Ile Val Gly Ser Pro20 25 30
Phe Leu Ala Ser Gly Ile Ser Asn Phe Val Gly Ser Ile Phe Leu Gly35 40 45Ile Ile Thr Leu Val Thr Ser Gln Thr Leu Phe Pro Ser Phe Gln Phe50 55 60Val Gly Ser His Pro Val Trp Ile Trp Ile Gly Gly Val Leu Gly Gly65 70 75 80Ile Phe Leu Thr Ser Asn Val Leu Leu Phe Pro Arg Leu Gly Ala Val85 90 95Gln Thr Val Ile Leu Pro Ile Leu Gly Arg Ile Leu Met Gly Thr Leu100 105 110Ile Asp Ser Phe Gly Trp Phe His Ala Met Gln Leu Pro Met Thr Leu115 120 125Met Arg Phe Leu Gly Val Ile Ile Thr Leu Ala Gly Val Ile Val Ala130 135 140Val Val Leu Pro Asn Leu Lys Glu Lys Glu Ala Glu Thr His Gln Thr145 150 155 160Asn Leu Leu Gly Trp Arg Ile Trp Ala Val Ile Val Gly Ala Met Ser165 170 175Ala Ala Gln Gln Ala Ile Asn Gly Arg Leu Gly Val Leu Leu Glu Asn180 185 190Thr Ala Gln Ala Thr Phe Val Ser Phe Phe Ile Gly Phe Leu Ala Ile195 200 205Phe Ile Val Ser Leu Phe Ile Asp Arg Arg Leu Pro Lys Ile Ser Glu210 215 220Leu Lys Lys Ala Lys Pro Trp Asn Gly Ile Gly Gly Phe Leu Gly Ala225 230 235 240Ser Ile Val Phe Ala Thr Val Val Ala Val Pro Gln Ile Gly Ala Gly245 250 255Leu Thr Ile Met Met Gly Leu Ile Gly Gln Ile Leu Gly Ser Met Leu260 265 270Val Gln Gln Phe Gly Trp Trp Arg Ser Ser Lys Tyr Gly Ile Gln Ile275 280 285Trp Gln Ile Val Gly Ile Leu Ile Met Leu Thr Gly Ile Ile Phe Ile290 295 300Lys Phe Leu305<210>3<211>25<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>引物pyrDaBamHI<400>3cgggatccat gaccgcacca acagc25<210>4<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物pyrDaNcoI<400>4catgccatgg ccaaatccat ctttaggc 28<210>5<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物pyrDaHindIII<400>5cgtgaagctt gacaaaatag gctgacctc29<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物PSA17<400>6atgccgcctc atcatttgac 20<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物PSA20<400>7atatcatctc ttttggtaat 20<210>8<211>28<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>引物pyrDbIF<400>8cggaagatct gatgatgaca gttgtcag 28<210>9<211>46<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物pyrDbIR<400>9ctgtactggt ccataagctc ggatccacca aaacaacctg acgctg 46<210>10<211>46<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物pyrDbIIF<400>10cagcgtcagg ttgttttggt ggatccgagc ttatggacca gtacag 46<210>11<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物pyrDbIIR<400>11tcggagatct atccaaggac aagtgcag 28<210>12<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物pyrDbseql<400>12tggtggaatt ggggttc 17<210>13<211>17
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物pyrDbseq2<400>13caaggtctgc gaagatg 17<210>14<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物pyrDbseq3<400>14attgacagaa ctgccag 17<210>15<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物DBORO2<400>15acttatcgtc cggacttg18<210>16<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物DBORO8<400>16cattagaaag cgcacgac18<210>17<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物DBORO22BamHI<400>17caggatccta ctgacagact tgtcag 26<210>18
<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物DBORO23EcoRI<400>18gagaattctg attcggacaa ggcttc 26<210>19<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物DBORO24EcoRI<400>19gagaattcaa agtcgttcgc ctcaag 26<210>20<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物DBORO4<400>20ttcacgctca ctaccttc18<210>21<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物DBORO20<400>21ggctcaccat ttttggcctc tgg 23<210>22<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物268neo<400>22ctcattccct gatctcg 1权利要求
1.一种编码包含与SEQ ID NO2至少有60％的同一性的氨基酸序列的乳清酸转运蛋白多肽的重组标记基因。
2.权利要求1的标记基因，是一种选择标记，一种筛选标记，一种反向选择标记，和/或一种双向的选择标记。
3.权利要求1或2的标记基因，其中编码的乳清酸转运蛋白多肽也转运一种或多种乳清酸类似物。
4.权利要求1-3中任一项的标记基因，其中编码的乳清酸转运蛋白多肽也转运乳清酸类似物5-氟代乳清酸(FOA)。
5.权利要求1-4中任一项的标记基因，其从至少一个异源的和/或人造的启动子转录。
6.一种多核苷酸构建体，含有至少一个编码含有与SEQ ID NO2至少有60％的同一性的氨基酸序列的乳清酸转运蛋白多肽的重组标记基因。
7.权利要求6的多核苷酸构建体，其中至少一个重组标记基因是选择标记，筛选标记，反向选择标记，或双向选择标记。
8.权利要求6或7的多核苷酸构建体，其中编码的乳清酸转运蛋白多肽也转运一种或多种乳清酸类似物。
9.权利要求6-8中任一项的多核苷酸构建体，其中编码的乳清酸转运蛋白多肽也转运乳清酸类似物5-氟代乳清酸(FOA)。
10.权利要求6-9中任一项的多核苷酸构建体，其中标记基因从至少一个异源的和/或人造的启动子转录。
11.权利要求6-10中任一项的多核苷酸构建体，其中多核苷酸是DNA。
12.权利要求6-11中任一项的多核苷酸构建体，其中该构建体在宿主细胞中是染色体外的并且含有一个或多个提供自动复制和/或自动维持的序列。
13.权利要求6-12中任一项的多核苷酸构建体，该构建体是被整合到宿主细胞基因组的。
14.权利要求6-13中任一项的多核苷酸构建体，它是一种质粒，一种线性化的质粒，或一种多聚体化的(multimerized)质粒。
15.权利要求14的多核苷酸构建体，其中该质粒含有至少一个在宿主细胞中有功能的复制起点。
16.权利要求6-15中任一项的多核苷酸构建体，其进一步含有至少一个编码多肽的选择标记基因，当在宿主细胞中表达时，又赋予对于抗生素的抗性。
17.一种含有至少一个编码含有与SEQ ID NO2至少有60％的同一性的氨基酸序列的乳清酸转运蛋白多肽的外源标记基因的细胞。
18.权利要求17的细胞，其中至少一个标记基因是选择标记，筛选标记，反向选择标记，或双向选择标记。
19.权利要求17或18的细胞，其中至少一个标记基因编码的乳清酸转运蛋白多肽也转运一种或多种乳清酸类似物。
20.权利要求17-19中任一项的细胞，其中至少一个标记基因编码的乳清酸转运蛋白多肽也转运乳清酸类似物5-氟代乳清酸(FOA)。
21.权利要求17-20中任一项的细胞，其中至少一个标记基因从至少一个异源的和/或人造的启动子转录。
22.权利要求17-21中任一项的细胞，其为微生物细胞。
23.权利要求17-21中任一项的细胞，其为细菌细胞。
24.权利要求17-21中任一项的细胞，其为革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌细胞。
25.权利要求17-21中任一项的细胞，其属于乳酸杆菌属，芽孢杆菌属或埃希氏菌属。
26.一种选择或鉴定含有至少一拷贝的重组标记基因的细胞，和/或选择或鉴定已经消除该重组标记基因的细胞的方法，其中所述标记基因编码含有与SEQ ID NO2至少有60％的同一性的氨基酸序列的乳清酸转运蛋白多肽，所述方法包括使用该标记基因作为选择标记，筛选标记，反向选择标记，或双向标记的步骤，由此，在适宜条件下，选择或鉴定出该细胞。
27.权利要求26的方法，其中细胞是嘧啶营养缺陷型的，在该重组标记缺失时缺乏功能性的乳清酸转运蛋白，并且其中将重组标记导入营养缺陷的宿主细胞中，随后在无尿嘧啶但补充有乳清酸的生长培养基中培养该细胞，其中只有含有重组标记的细胞能够生长，其中该标记用作选择标记。
28.权利要求26的方法，其中细胞是嘧啶营养缺陷型的且含有编码功能性的乳清酸转运蛋白的重组标记基因，并且其中将标记基因随后从该细胞中消除，在无尿嘧啶生长培养基中培养该细胞，其中只有消除标记基因的细胞被抑制，其中该标记用作筛选标记。
29.权利要求27或28的方法，其中由于在至少一个编码将二氢乳清酸转化成乳清酸的酶的基因中的突变而使得细胞是嘧啶营养缺陷的。
30.权利要求29的方法，其中由于pyrD，pyrDa，pyrDb和pyrK中一个或多个的突变而使得细胞是嘧啶营养缺陷的。
31.权利要求26的方法，其中细胞在重组标记缺失时缺乏功能性的乳清酸转运蛋白，而且对乳清酸类似物5-氟代乳清酸有抗性，而且其中将重组标记导入细胞中，随后在补充有抑制浓度的FOA的生长培养基中培养该细胞，只有含有重组标记的细胞对FOA敏感且被抑制，其中该标记用作筛选标记。
32.权利要求26的方法，其中细胞含有重组标记基因且对5-氟代乳清酸(FOA)敏感，而且其中随后将该标记基因从细胞中消除，在补充有抑制浓度的FOA的生长培养基中培养该细胞，只有消除重组标记的FOA抗性细胞能够生长，其中该标记用作反向选择标记。
33.权利要求26的方法，其中首先选择或鉴定出含有至少一个重组标记基因拷贝的细胞，随后选择或鉴定出已经消除重组标记基因的细胞，其中该标记用作双向标记。
34.权利要求33的方法，其中细胞对于5-氟代乳清酸(FOA)有抗性，是嘧啶营养缺陷的，并且在缺失重组标记时缺乏功能性的乳清酸转运蛋白，将重组标记首先导入乳清酸营养缺陷的宿主细胞中，随后在补充有乳清酸的生长培养基中培养该细胞，只有含重组标记的细胞能够生长，然后从该细胞中消除标记基因，在补充有抑制浓度的FOA的生长培养基中培养该细胞，只有消除重组标记基因的FOA抗性细胞能够生长，其中该标记用作双向选择标记。
35.权利要求34的方法，其中由于编码将二氢乳清酸转化成乳清酸的酶的基因中的突变而使得细胞是嘧啶营养缺陷的。
36.权利要求34的方法，其中由于pyrD，pyrDa，pyrDb和pyrK中一个或多个的突变而使得细胞是嘧啶营养缺陷的。
全文摘要
一种编码含有氨基酸序列与SEQ ID NO2至少有60％的同一性的乳清酸转运蛋白多肽的重组标记基因，一种含有至少该重组标记基因至少拷贝的多核苷酸构建体，一种含有至少该标记基因一外源拷贝的细胞，和一种挑选或鉴定含有至少该重组标记基因一拷贝的细胞的方法，和/或挑选或鉴定该重组标记基因已经被处理的细胞的方法。
文档编号C12N15/70GK1918301SQ200580004875
公开日2007年2月21日 申请日期2005年2月11日 优先权日2004年2月13日
发明者简·马蒂纳森, 埃尔斯·M·C·德福尔 申请人:诺维信公司