高密度脂蛋白中胆甾醇的测定方法

专利名称：高密度脂蛋白中胆甾醇的测定方法
技术领域：
本发明涉及检测样品中高密度脂蛋白中胆甾醇的测定方法、测定用试剂及测定用试剂盒。
背景技术：
生物体中的脂蛋白根据比重分成高密度脂蛋白(以下缩写为HDL)、低密度脂蛋白(以下缩写为LDL)、极低密度脂蛋白(以下缩写为VLDL)、乳糜微粒(以下缩写为CM)，各自由于载脂蛋白的种类不同在生物体内起的作用非常不同，脂质的成分也各式各样。已经了解到，其中HDL由于会接受来自包括动脉血管壁在内的各种组织的胆甾醇，因而和清除积累在细胞内的胆甾醇的作用有关，是预防以冠状动脉硬化为主的各种动脉硬化症等危险的因子，它在血液中的水平作为预测动脉硬化性疾病的有用指标。
现有的测定HDL中的胆甾醇(以下简称HDL胆甾醇)的方法，包括经超速离心法、免疫化学法、电泳法、沉淀法等分离操作和定量胆甾醇的两步。然而分离操作手续烦杂，需时长，在可靠性方面也存在问题。因此这种要同时进行分离操作的测定方法效率很低，在实际应用中不合适。
为了解决上述问题，近来报道了各种测定方法。例如已知有将血清或血浆放在含有胆甾醇酯水解酶、胆甾醇氧化酶，以及胆汁酸盐或胆汁酸衍生物或二辛基磺基琥珀酸盐的缓冲液中，使的与相应的酶反应，VLDL和LDL中的胆甾醇先于HDL发生反应，测定所生成的过氧化氢后，向反应液中加入含有非离子系列的聚氧化乙烯基的表面活性剂，使HDL胆甾醇与相应的酶反应，特异地分别定量HDL胆甾醇的方法(参见专利文献1)，还有一种方法是在特定pH和特定的温度条件下，使血清和含有来自胰脏的胆甾醇酯水解酶、胆甾醇氧化酶、胆汁酸类表面活性剂以及非离子系列的表面活性剂的缓冲液中使的与相应的酶反应，测定HDL胆甾醇的方法(参见专利文献2)。在专利文献2所述方法中，首先LDL胆甾醇与相应的酶反应，然后HDL胆甾醇与相应的酶反应，可以测定HDL胆甾醇。然而，这些测定方法需要较长的测定时间，而且未必是特异测定HDL胆甾醇的方法。
作为使HDL以外的脂蛋白凝集然后测定HDL胆甾醇的方法，已知有采用硫酸葡聚糖等使HDL以外的脂蛋白凝集的试剂、二价金属盐及经化学修饰的酶进行测定的方法(参见专利文献3)；有用聚合阴离子等与HDL以外的脂蛋白形成复合体的试剂、聚氧化乙烯聚氧丙烯缩合物等不溶解脂蛋白的表面活性剂的测定方法(参见专利文献4)；有采用硫酸葡聚糖等聚合阴离子、二价金属盐、特定的非离子性表面活性剂及可与来自样品的白蛋白不同的白蛋白进行测定的方法(参见专利文献5)；以及测定血清或血浆中HDL胆甾醇的方法，其特征在于，将血清或血浆用含有脂蛋白分离剂(硫酸葡聚糖等聚合阴离子与锰离子等二价阳离子相组合而成)的溶液处理，将所得的混合液不进行固体和液体的分离处理，在阴离子性表面活性剂(烷基磺酸或胆汁酸及其衍生物)存在的条件下，使其和胆甾醇酯水解酶及胆甾醇氧化酶反应，测定生成的过氧化氢的方法(参见专利文献6)等。
但是，这些使HDL以外的脂蛋白凝集来测定HDL胆甾醇的方法，与以往的标准方法有良好的相关性，但还存在问题，诸如反应产生的凝集物造成的混浊造成不准确性，用碱洗涤反应池时，由于与反应液中的金属盐反应生成的金属氢氧化物析出，造成自动分析装置的负荷过量等。
使HDL以外的脂蛋白不凝集来测定HDL胆甾醇的方法，已知还有例如使生物样品和来自胰脏的胆甾醇酯水解酶及胆甾醇氧化酶，在胆汁酸或其盐以及白蛋白存在的条件下进行反应，测定相应的酶反应消耗的或生成的化合物，从而测定生物样品中HDL胆甾醇的方法(参见专利文献7)；在对HDL部分有反应选择性的HLB为16以上的非离子性表面活性剂存在条件下，使检测样品与优先作用于HDL部分的脂蛋白酯酶和/或胆甾醇酯水解酶，以及胆甾醇氧化酶反应，测定检测样品中的HDL胆甾醇的方法(参见专利文献8)等。另外，已知还有用酰基化聚氧化乙烯山梨聚糖酯优先将HDL以外的脂蛋白中的胆甾醇转变为过氧化氢，除去生成的过氧化氢后，通过添加聚氧化乙烯烷基醚来进行HDL胆甾醇测定的酶测定法(参见专利文献9)。
但是，在这些不使HDL以外的脂蛋白凝集而测定HDL胆甾醇的方法中，有时存在由于HDL以外的脂蛋白中的胆甾醇消除得不完全，及对HDL以外的脂蛋白中的胆甾醇会发生非特异反应产生的测定数据不准确的问题。
专利文献1特开昭62-69999号公报专利文献2特开昭63-126498号公报专利文献3特开平8-131197号公报专利文献4特开平8-201393号公报专利文献5特开平9-285298号公报专利文献6特开平8-116996号公报专利文献7国际公开第97/40376号快报专利文献8国际公开第00/52480号快报专利文献9特开平9-299号公报发明内容发明所解决的问题本发明的目的在于，提供可以简便且准确地进行测定的HDL胆甾醇测定方法、测定用试剂和测定用试剂盒。
解决问题的手段本发明涉及以下[1]～[19]项。
一种测定检测样品内高密度脂蛋白中胆甾醇的方法，该方法包含使检测样品与(i)胆甾醇酯水解酶和胆甾醇氧化酶，或(ii)胆甾醇酯水解酶、氧化型辅酶及胆甾醇脱氢酶，在含有选自烷基胺聚氧化乙烯聚氧化丙烯缩合物、聚氧化乙烯烷基胺硫酸盐、聚氧化乙烯苄基烷基季铵盐、聚氧化乙烯酸酰胺、氧化烷基胺和烷基丙烯二胺衍生物等构成的族中的至少一种物质的水溶性介质中进行反应生成过氧化氢或还原型辅酶；以及测定所生成的过氧化氢或还原型辅酶。
第[1]项所述的方法，水溶性介质还包含选自聚合阴离子、胆汁酸衍生物、乙二胺四聚氧化烯烃、聚氧化乙烯烷基胺和聚氧化乙烯链烯基胺等构成的族中的至少一种物质。
第[2]项所述的方法，聚合阴离子是硫酸葡聚糖或其盐。
第[2]或[3]项所述的方法，胆汁酸衍生物是选自胆酸或其盐、牛磺胆酸或其盐、甘氨胆酸或其盐、石胆酸或其盐、脱氧胆酸或其盐、鹅脱氧胆酸或其盐、熊脱氧胆酸或其盐、7-氧代石胆酸或其盐、12-氧代石胆酸或其盐、12-氧代鹅脱氧胆酸或其盐、7-氧代脱氧胆酸或其盐、猪胆酸或其盐、猪脱氧胆酸或其盐、脱氢胆酸或其盐、通式(I)[化1]R1-CH2-CH(R2)-CH2-SO3-(I)[此通式中，R1表示3-(3-胆丙酰胺基)二甲氨基，R2表示氢原子或羟基]表示的化合物和通式(II)[化2] [此通式中，X表示氢原子或羟基，R3和R43可以相同或相异，表示取代或未取代的烷基，或取代或未取代的烷酰基]表示的化合物构成的族中的至少一种物质。
第[2]～[4]任一项所述的方法，水性介质还包括白蛋白。
测定高密度脂蛋白中胆甾醇的试剂，其特征在于，含有选自烷基胺聚氧化乙烯聚氧化丙烯缩合物、聚氧化乙烯烷基胺硫酸盐、聚氧化乙烯苄基烷基季铵盐、聚氧化乙烯酸酰胺、氧化烷基胺和烷基丙烯二胺衍生物构成的族中的至少一种物质，胆甾醇酯水解酶，胆甾醇氧化酶及过氧化氢的测定用试剂。
测定高密度脂蛋白中胆甾醇的试剂，其特征在于，含有选自烷基胺聚氧化乙烯聚氧化丙烯缩合物、聚氧化乙烯烷基胺硫酸盐、聚氧化乙烯苄基烷基季铵盐、聚氧化乙烯酸酰胺、氧化烷基胺和烷基聚氧丙烯二胺衍生物构成的族中的至少一种物质，胆甾醇酯水解酶，胆甾醇脱氢酶及氧化型辅酶。
第[7]项所述的试剂，还含有测定还原型辅酶的试剂。
第[6]～[8]任一项所述的试剂，还含有选自聚合阴离子、胆汁酸衍生物、乙二胺四聚氧化烯烃、聚氧化乙烯烷基胺和聚氧化乙烯链烯基胺构成的族中的至少一种物质。
第[9]项所述的试剂，聚合阴离子是硫酸葡聚糖或其盐。
第[9]或[10]所述的试剂，胆汁酸衍生物是选自胆酸或其盐、牛磺胆酸或其盐、甘氨胆酸或其盐、石胆酸或其盐、脱氧胆酸或其盐、鹅脱氧胆酸或其盐、熊脱氧胆酸或其盐、7-氧代石胆酸或其盐、12-氧代石胆酸或其盐、12-氧代鹅脱氧胆酸或其盐、7-氧代脱氧胆酸或其盐、猪胆酸或其盐、猪脱氧胆酸或其盐、脱氢胆酸或其盐、通式(I)[化3]R1-CH2-CH(R2)-CH2-SO3-(I)[此通式中，R1表示3-(3-胆丙酰胺基)二甲氨基，R2表示氢原子或羟基]表示的化合物和通式(II)[化4]
[此通式中，X表示氢原子或羟基，R3和R4可以相同或相异，表示取代或未取代的烷基，或取代或未取代的烷酰基]表示的化合物构成的族中的至少一种物质。
第[9]～[11]任一项所述的试剂，还含有白蛋白。
测定高密度脂蛋白中胆甾醇的试剂盒，其特征在于，含有第一试剂及第二试剂，在第一试剂及第二试剂中含有测定过氧化氢的试剂，在第二试剂中含有胆甾醇氧化酶，在第一试剂和第二试剂二者中或其中之一中含有选自烷基胺聚氧化乙烯聚氧化丙烯缩合物、聚氧化乙烯烷基胺硫酸盐、聚氧化乙烯苄基烷基季铵盐、聚氧化乙烯酸酰胺、氧化烷基胺和烷基丙烯二胺衍生物构成的族中的至少一种物质，以及胆甾醇酯水解酶。
测定高密度脂蛋白中胆甾醇的试剂盒，其特征在于，含有第一试剂及第二试剂，在第一试剂中含有氧化型辅酶，在第二试剂中含有胆甾醇脱氢酶，在第一试剂和第二试剂二者中或其中之一中含有选自烷基胺聚氧化乙烯聚氧化丙烯缩合物、聚氧化乙烯烷基胺硫酸盐、聚氧化乙烯苄基烷基季铵盐、聚氧化乙烯酸酰胺，氧化烷基胺和烷基丙烯二胺衍生物构成的族中的至少一种物质，以及胆甾醇酯水解酶。
第[14]项所述的试剂盒，在第一试剂和第二试剂二者中或其中之一中还含有还原型辅酶测定用试剂。
第[13]～[15]任一项所述的试剂盒，在第一试剂和第二试剂二者中或其中之一中还含有选自聚合阴离子、胆汁酸衍生物、乙二胺四聚氧化烯烃、聚氧化乙烯烷基胺和聚氧化乙烯链烯基胺构成的族中的至少一种物质。
第[16]项所述的试剂盒，聚合阴离子是硫酸葡聚糖或其盐。
第[16]或[17]项所述的试剂盒，胆汁酸衍生物是选自胆酸或其盐、牛磺胆酸或其盐、甘氨胆酸或其盐、石胆酸或其盐、脱氧胆酸或其盐、鹅脱氧胆酸或其盐、熊脱氧胆酸或其盐、7-氧代石胆酸或其盐、12-氧代石胆酸或其盐、12-氧代鹅脱氧胆酸或其盐、7-氧代脱氧胆酸或其盐、猪胆酸或其盐、猪脱氧胆酸或其盐、脱氢胆酸或其盐、通式(I)的[化5]R1-CH2-CH(R2)-CH2-SO3-(I)[此通式中，R1表示3-(3-胆丙酰胺基)二甲氨基，R2表示氢原子或羟基]表示的化合物和通式(II)[化6] [此通式中，X表示氢原子或羟基，R3和R4可以相同或相异，表示取代或未取代的烷基，或取代或未取代的烷酰基]表示的化合物构成的族中的至少一种物质。
第[6]～[18]任一项所述的试剂盒，在第一试剂和第二试剂二者中或其中之一中还含有白蛋白。
发明效果根据本发明，提供简便且准确地进行HDL胆甾醇测定的方法、测定用试剂和测定用试剂盒。
具体实施例方式
本发明的HDL胆甾醇测定方法，是不去除HDL以外的脂蛋白中的胆甾醇而测定HDL胆甾醇的方法。
本发明的测定方法中所用的检测样品例如有全血、血浆、血清、脊髓液、唾液、羊水、尿、汗、胰液等，优选血浆和血清。
本发明中的胆甾醇酯水解酶，并无特别限制，只要是有水解胆甾醇酯能力的酶即可，例如除来自动物、植物或微生物的胆甾醇酯水解酶，脂蛋白脂肪酶的外等，也可以用通过基因工程手段制造的胆甾醇酯水解酶，脂蛋白脂肪酶等。
胆甾醇酯水解酶既可用未经修饰的胆甾醇酯水解酶，也可用经化学修饰过的胆甾醇酯水解酶。还可以用市售品作为胆甾醇酯水解酶。
市售的胆甾醇酯水解酶，例如有胆甾醇酯水解酶“Amano”2(CHE2；天野酶制剂公司制)、胆甾醇酯水解酶“Amano”3(CHE3；天野酶制剂公司制)、脂蛋白脂肪酶(LPL311；东洋纺织公司制)、脂蛋白脂肪酶“Amano”6(LPL6；天野酶制剂公司制)、43kDa脂蛋白脂肪酶(天野酶制剂公司制)、胆甾醇酯水解酶[COE313(化学修饰的胆甾醇酯水解酶)；东洋纺织公司制]等。另外，本发明中，也可以将两种以上的胆甾醇酯水解酶进行组合应用。
胆甾醇酯水解酶化学修饰时，用以修饰该酶的基团(化学修饰基团)例如有例如以聚乙二醇为主要成分的基团、以聚丙二醇为主要成分的基团、具有聚乙二醇和聚丙二醇共聚物的基团、含水溶性多糖类的基团、磺丙基、磺丁基、聚氨酯基、有螯合功能的基团等，优选以聚乙二醇为主要成分的基团。水溶性多糖例如有例如葡聚糖、茁霉多糖、可溶性淀粉等。
化学修饰胆甾醇酯水解酶所用的试剂(化学修饰剂)，例如有同时具有上述化学修饰基，和可以与酶的氨基、羧基、巯基等反应的功能基或结构的化合物等。能与酶中氨基反应的功能基或结构，例如有羧基、活性酯基(N-羟基琥珀酰亚胺基等)、酸酐、酸性氯化物、醛、环氧化物基、1，3-丙基磺内酯、1，4-丁基磺内酯等。能与酶中羧基反应的功能基或结构，例如有氨基等。与酶的巯基具有反应性的功能基或结构，例如有马来酰亚胺基、二硫化物、α-卤代酯(α-碘代酯等)。
化学修饰剂也可以使用市售产品。市售的化学修饰剂，例如有具有以聚乙二醇为主要成分的基团和N-羟基琥珀酰亚胺基团的サンブライト(阳光)VFM-4101、サンブライト(阳光)ME-050AS、サンブライト(阳光)DE-030AS(均为日本油脂公司制造)；具有以聚亚烷基二醇为主要成分的基团和酸酐结构的サンブライト(阳光)AKM系列(例如サンブライトAKM-1510等)、サンブライト(阳光)ADM系列、サンブライト(阳光)ACM系列(均为日本油脂公司制造)；具有以聚乙二醇为主要成分的基团和环氧基的EPOX-3400、M-EPOX-5000(均为Sheawater Polymers公司制造)；具有螯合功能的基团和酸酐结构的二乙烯基三胺基-N，N，N’，N”-五无水二乙酸(无水DTPA同仁化学公司制造)等。
胆甾醇酯水解酶的化学修饰可以用例如以下方法进行，但并不仅限于这种方法。首先，将胆甾醇酯水解酶溶解在pH8.0以上的缓冲液(例如HEPES缓冲液)中，在0～55℃，以0.01～500倍摩尔量添加化学修饰剂，搅拌5分钟～5小时。在实际的酶反应中，化学修饰过的胆甾醇酯水解酶，不仅是这种反应液本身，也可以使用必要时采用超滤膜等除去未反应的化学修饰剂等的酶。
在本反应的方法中所用的胆甾醇酯水解酶的浓度没有特别限定，只要可以进行本发明的HDL胆甾醇测定即可，不过反应液中浓度优选0.01～400U/mL，更优选0.02～200U/mL。
本发明中的胆甾醇氧化酶没有特别限定，只要是有氧化胆甾醇产生过氧化氢能力的酶即可，例如除来自动物、植物或微生物的胆甾醇氧化酶的外，还可以采用通过基因工程手段制备的胆甾醇氧化酶等，也可以用市售的商品，如胆甾醇氧化酶“Amano”1(CHOD1；天野酶制剂公司制造)、胆甾醇氧化酶(CO-PE；KIKKOMAN公司制造)、胆甾醇氧化酶(COO321；东洋纺织公司制造)、胆甾醇氧化酶协和(协和发酵公司制造)等。另外，在本发明中，也可以将两种以上的胆甾醇氧化酶组合使用。
胆甾醇氧化酶可以是未经修饰的酶，也可以是经化学修饰的酶。经化学修饰的胆甾醇氧化酶可以用例如上述化学修饰剂，通过上述化学修饰方法制备。
在本反应的方法中的胆甾醇氧化酶的浓度，没有特别限定，只要是能够进行本发明的HDL胆甾醇测定的浓度即可，不过反应液中浓度优选0.01～400U/mL，更优选0.02～200U/mL。
本发明中的胆甾醇脱氢酶没有特别限定，只要是当存在氧化型辅酶时有氧化胆甾醇产生还原型辅酶能力的酶即可，除例如来自动物、植物或微生物的胆甾醇脱氢酶以外，还可以采用通过基因工程手段制备的胆甾醇脱氢酶等。也可以用市售的商品，如胆甾醇脱氢酶“Amano”5(CHDH5；天野酶制剂公司制造)等。另外，在本发明中，也可以将两种以上的胆甾醇脱氢酶组合使用。胆甾醇脱氢酶可以是未经修饰的酶，也可以是经化学修饰的酶。经化学修饰的胆甾醇脱氢酶可以用上述化学修饰剂，通过上述化学修饰方法制备。
在本反应的方法中所用的胆甾醇脱氢酶浓度，没有特别限定，只要是能够进行本发明的HDL胆甾醇测定的浓度即可，不过反应液中浓度优选0.01～400U/mL，更优选0.02～200U/mL。
在本发明的采用胆甾醇脱氢酶的测定方法中，采用氧化型辅酶。氧化型辅酶有例如NAD、NADP、thio-NAD和thio-NADP等。
本发明中采用的烷基胺聚氧乙烯聚氧丙烯缩合物、聚氧乙烯烷基胺硫酸盐、聚氧乙烯苄基烷基季铵盐、聚氧乙烯酸酰胺、烷基丙烯二胺衍生物并非特别限定，只要能用作本发明的HDL胆甾醇测定即可。
氧化烷基胺，有如氧化烷基二甲胺、氧化二羟基乙烷基胺、氧化聚氧化乙烯二甲胺等。烷基丙烯二胺衍生物例如有烷基丙烯二胺、聚氧化乙烯烷基丙烯二胺等。
在烷基胺聚氧化乙烯聚氧化丙烯缩合物，聚氧化乙烯烷基胺硫酸酯、聚氧化乙烯苄基烷基季铵盐、聚氧化乙烯酸酰胺、氧化烷基胺及烷基丙烯二胺衍生物中的烷基是，直链或支链状的碳原子数6～30个的烷基，例如己烷基、庚烷基、辛烷基、异辛烷基、壬烷基、癸烷基、十一烷基、十二烷基(月桂烷基)、十三烷基、十四烷基(肉豆蔻烷基)、十五烷基、十六烷基(棕榈烷基)、十七烷基、十八烷基(硬脂烷基)、十九烷基、二十烷基、二十一烷基、二十二烷基(山嵛烷基)、二十三烷基、二十四烷基、二十五烷基、二十六烷基、二十七烷基、二十八烷基、二十九烷基、三十烷基等。
烷基胺聚氧化乙烯聚氧化丙烯缩合物，聚氧化乙烯烷基胺硫酸酯、聚氧化乙烯苄基烷基季铵盐、聚氧化乙烯酸酰胺、氧化聚氧化乙烯二甲胺及聚氧化乙烯烷基丙烯二胺中，氧化乙烯链的聚合度优选1～100的，更优选为1～50。
烷基胺聚氧化乙烯聚氧丙烯缩合物的具体物质(包括制剂)，有BLAUNON SAP3004、BLAUNON SAP3010(牛油胺聚氧化乙烯聚氧化丙烯缩合物；均为青木油脂公司制造)、C16EO30PO10[十六胺聚氧化乙烯聚氧化丙烯缩合物(氧化乙烯链的聚合度30，氧化丙烯链聚合度10)，日本油脂公司制造]、C16EO30PO20[十六胺聚氧化乙烯聚氧化丙烯缩合物(氧化乙烯链的聚合度30，氧化丙烯链的聚合度20)，日本油脂公司制造]、C16EO40PO10[十六胺聚氧化乙烯聚氧化丙烯缩合物(氧化乙烯链的聚合度40，氧化丙烯链的聚合度10)，日本油脂公司制造]、C16EO20PO10[十六胺聚氧化乙烯聚氧化丙烯缩合物(氧化乙烯链的聚合度20，氧化丙烯链的聚合度10)，日本油脂公司制造]等。
聚氧化乙烯烷基胺硫酸酯的具体物质(制剂)，有レベロンA-625X(一方公司油脂公司制造)、ミグノ-ルPA-30(一方公司油脂公司制造)ニユ-ポ-ルPE-61(三洋化成公司制造)等。
聚氧化乙烯苄基烷基季铵盐的具体物质(制剂)，有ビスノ-ルSK(一方公司油脂公司制造)等。
聚氧化乙烯酸酰胺的具体物质(制剂)，有ニツコ-ルTAMDS15(日光化学公司制造)、ナイミツドMT-215(日本油脂公司制造)等。
氧化烷基胺的具体物质(制剂)，有ユニセ-フA-LE(氧化二羟基乙基月桂基胺；日本油脂公司制造)、ユニセ-フA-LM(氧化烷基二甲基胺；日本油脂公司制造)、ユニセ-フA-LY(氧化聚氧化乙烯椰油烷基二甲基胺；日本油脂公司制造)等。
烷基丙烯二胺衍生物的具体物质(制剂)，有BLAUNON DT03、BLAUNON DT15(烷基丙烯二胺；均为青木油脂公司制造)アスフアゾ-ル#10(聚氧化乙烯牛油丙烯二胺；日本油脂公司制造)等。
另外，在本发明中，使用选自烷基胺聚氧化乙烯聚氧化丙烯缩合物、聚氧化乙烯烷基胺硫酸酯、聚氧化乙烯苄基烷基季铵盐、聚氧化乙烯酸酰胺、氧化烷基胺及烷基丙烯二胺衍生物构成的族中的至少一种即可，也可以任意组合使用多种。在本发明的HDL胆甾醇测定方法中，选自烷基胺聚氧化乙烯聚氧化丙烯缩合物、聚氧化乙烯烷基胺硫酸酯、聚氧化乙烯苄基烷基季铵盐、聚氧化乙烯酸酰胺、氧化烷基胺及烷基丙烯二胺衍生物构成的族中的至少一种物质，其浓度并无特别限定，只要是能够测定本发明中的HDL胆甾醇的浓度即可，反应液中的浓度优选0.0001～1％，更优选0.001～0.1％。
本发明中使用的聚合阴离子没有特别限定，只要是可以进行本发明的HDL胆甾醇测定的聚合阴离子即可，例如有硫酸葡聚糖或其盐、肝素或其盐、磷钨酸或其盐、硫酸化环糊精或其盐、硫酸化寡糖或其盐等，但以硫酸葡聚糖或其盐为最佳。硫酸葡聚糖例如有分子量为4万、8万、20万、50万、100万、200万等的硫酸葡聚糖。硫酸化寡糖例如有例如硫酸化琼脂糖、硫酸化海藻糖、硫酸软骨素等。盐例如有钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、锰盐等。此外，本发明中也可以使用两种以上的聚合阴离子。在本发明的HDL胆甾醇测定中聚合阴离子的浓度没有特别限定，只要是可以进行本发明的HDL胆甾醇测定的浓度即可，但反应液中的浓度优选0.001～10％，更优选0.01～1％。
在本发明中的胆汁酸衍生物没有特别限定，只要是可以进行本发明的HDL胆甾醇测定的胆汁酸衍生物即可，例如有具有阴离子性表面活性作用的胆汁酸衍生物、具有两性表面活性作用的胆汁酸衍生物、具有非离子性表面活性作用的胆汁酸衍生物等。
有阴离子性表面活性作用的胆汁酸衍生物、例如胆酸或其盐、牛磺胆酸或其盐、甘氨胆酸或其盐、石胆酸或其盐、脱氧胆酸或其盐、鹅胆酸或其盐、熊胆酸或其盐、7-氧代石胆酸或其盐、12-氧代石胆酸或其盐、12-鹅脱氧胆酸或其盐、7-氧代脱氧胆酸或其盐、猪胆酸或其盐、猪脱盐胆酸或其盐、脱氢胆酸或其盐等。盐则有例如铵盐、锂盐、钠盐、钾盐、锰盐、钙盐等。有阴离子表面活性作用的胆汁酸衍生物的浓度没有特别限定，只要是可以进行本发明的HDL胆甾醇测定的浓度即可，但反应液中的浓度优选0.001～10％，更优选0.01～1％。
有两性表面活性作用的胆汁酸衍生物、有如通式(I)[化7]R1-CH2-CH(R2)-CH2-S03-(I) 表示的化合物(以下简称化合物(I))R2是氢原子的化合物(I)，以下称为CHAPS，R2是羟基的化合物(I)，以下称为CHAPSO。有两性表面活性作用的胆汁酸衍生物的浓度没有特别限定，只要是可以进行本发明的HDL胆甾醇测定的浓度即可，但反应液中的浓度优选0.001～10％，更优选0.01～1％。
有非离子性表面活性作用的胆汁酸衍生物，有如以通式(II)[化8] [此通式中，X表示氢原子或羟基，R3和R4可以相同或相异，表示取代或未取代的烷基，或取代或未取代的链烷酰基]表示的化合物(以下简称化合物(II))等。烷基、链烷酰基中的烷基，为1～10个碳原子的直链或支链的基团，如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、新戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基等。取代烷基或链烷酰基中的取代基团，有羟基、卤素原子等。卤素原子指氟、氯、溴、碘等各原子。化合物(II)中，R3和R4同时是[化9]COCH(OH)CH(OH)CH(OH)CH(OH)CH2(OH)(以下称为取代基A)的化合物。下文中，把X、R3和R4分别是氢原子、取代基A和取代基A的化合物称为deoxy-BIGCHAP；分别是羟基、取代基A和取代基A的化合物称为BIGCHAP。有非离子性表面活性作用的胆汁酸衍生物浓度没有特别限定，只要是可以进行本发明的HDL胆甾醇测定的浓度即可，但反应液中的浓度优选0.001～10％，更优选0.01～1％。本发明中也可以采用两种以上的胆汁酸衍生物。
乙二胺四聚氧化烯烃，有乙二胺聚氧化丙烯聚氧化乙烯缩合物、乙二胺四聚氧化乙烯、乙二胺聚氧化丙烯等。乙二胺四聚氧化烯烃的具体物质(包括制剂)，有アデカプルロニツクTR704、アデカプルロニツクTR701、アデカプルロニツクTR913R(均为乙二胺聚氧化乙烯聚氧化丙烯缩合物；旭电化公司制造)ユニル-ブ32TY-65BI(乙二胺四聚氧化烯烃日本油脂公司制造)乙二胺PO52EO60(氧化乙烯链的聚合度的总和60；氧化丙烯链的聚合度的总和52；日本油脂公司制造)等。乙二胺四聚氧化烯烃的聚合度优选1～100，更优选1～60。本发明中，也可以采用两种以上的乙二胺四聚氧化烯烃。乙二胺四聚氧化烯烃的浓度没有特别限定，只要是可以进行本发明的HDL胆甾醇测定的浓度即可，但反应液中的浓度优选0.001～10％，更优选0.01～1％。聚氧化乙烯烷基胺及聚氧化乙烯链烯基胺，有例如通式(III)[化10] [式中R表示直链或支链的烷基或链烯基，X表示氢原子或(CH2CH2O)nH，m和n表示相同或不同的1～100的整数，m+n为2～200的整数]表示的化合物[以下称为化合物(III)]，化合物(III)中，烷基为直链或支链的6～30个碳原子的化合物，例如己基、庚基、辛基、异辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基(月桂烷基)、十三烷基、十四烷基(肉豆蔻烷基)、十五烷基、十六烷基(棕榈烷基)、十七烷基、十八烷基(硬脂烷基)、十九烷基、二十烷基、二十一烷基、二十二烷基(山嵛烷基)、二十三烷基、二十四烷基、二十五烷基、二十六烷基、二十七烷基、二十八烷基、二十九烷基、三十烷基等。化合物(IN)中的烯基例如有直链或支链上的碳原子6～30的，例如己烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基、癸烯基、香茅基、十一烯基、十二烯基(月桂烷基)、十三烯基、十四烯基、十五烯基、十六烯基、十七烯基、油烯基、十九烯基、二十烯基、二十一烯基、二十二烯基、二十三烯基、二十四烯基、二十五烯基、二十六烯基、二十七烯基、二十八烯基、二十九烯基、三十烯基等。
聚氧化乙烯烷基胺或聚氧化乙烯链烯胺的具体物质(制剂)，例如有ナイミ-ンL201(氧化乙烯十二烷胺；日本油脂公司制造)、ナイミ-ンL207(聚氧化乙烯十二烷胺；日本油脂公司制造)、ナイミ-ンS204、ナイミ-ンS210(聚氧化乙烯十八烷胺；日本油脂公司制造)、ニユ-コ-ルOD420(聚氧化乙烯十八烷胺；日本乳化剂公司制造)、パイオニンD3104(聚氧化乙烯月桂胺；竹本油脂公司制造)、パイオニンD3110(聚氧化乙烯月桂胺；竹本油脂公司制造)、パイオニンD3605[(聚氧化乙烯烷基(大豆)胺；竹本油脂公司制造)]パイオニンD3615T[(聚氧化乙烯烷基(牛油)胺；竹本油脂公司制造)]、BLAUNON O209(聚氧化乙烯油烯基氨基醚；青木油脂公司制造)等聚氧化乙烯烷基胺和聚氧化乙烯链烯胺中氧化乙烯链的聚合度优选1～100，更优选1～60。在本发明中，可以采用两种以上的聚氧化乙烯烷基胺或聚氧化乙烯链烯胺。聚氧化乙烯烷基胺或聚氧化乙烯链烯胺的浓度没有特别限定，只要是可以进行本发明的HDL胆甾醇测定的浓度即可，但反应液中的浓度优选0.0001～1％，更优选0.01～1％。
本发明中采用的白蛋白，没有特别限定，只要是可以进行本发明的HDL胆甾醇测定的浓度即可，例如来自牛、马、羊或人的白蛋白等，优选牛血清白蛋白(BSA)。另外，也可以用基因工程手段制造的白蛋白。本发明中，也可以组合使用两种以上的白蛋白。本发明的HDL胆甾醇测定中白蛋白浓度没有特别限定，只要是可以进行本发明的HDL胆甾醇测定的浓度即可，但反应液中的浓度优选0.001～10％，更优选0.01～1％。
本发明的HDL胆甾醇测定方法中使用的水性介质，有诸如去离子水、蒸馏水、缓冲液等，优选缓冲液。缓冲液中所用的缓冲剂，有诸如三(羟甲基)氨基甲烷缓冲剂、磷酸缓冲剂、硼酸缓冲剂、优良缓冲剂等。优良缓冲剂，例如有2-(N-吗啉基)-乙基磺酸(MES)、双(2-羟乙基)氨基三(羟甲基)-甲烷(Bis-Tris)、N-(2-乙酰胺基)-亚氨二乙酸(ADA)、哌嗪-N，N’-双(2-乙磺酸)(PIPES)、N-(2-乙酰胺基)-2-氨乙基磺酸(ACES)、3-吗啉代)-2-羟丙基磺酸(MOPSO)、N，N-双(二羟乙基)-2-氨基乙烷磺酸(BES)、3-(N-吗啉代)丙烷磺酸(MOPS)、N-[3(羟甲基)甲基]-2-氨基乙烷磺酸(TES)、2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙烷磺酸(HEPES)、3-[N，N-双(2-羟乙基)氨基]-2-羟基丙烷磺酸(DIPSO)、N-[3(羟甲基)甲基]-2-羟基-3-氨基丙烷磺酸(TAPSO)、哌嗪-N，N’-双(2-羟基丙烷磺酸)(POPSO)、3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]-2-羟基丙烷磺酸(HEPPSO)、3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙烷磺酸[(H)EPPS]、N-[3(羟甲基)甲基]甘氨酸(Tricine)、N，N’-双(2-羟乙基)甘氨酸(Bicine)、N-3(羟甲基)甲基-3-氨基丙烷磺酸(TAPS)、N-环己基-2-氨基乙烷磺酸(CHES)、N-环己基-3-氨基-2-羟基丙烷磺酸(CAPSO)、N-环己基-3-氨基丙烷磺酸(CAPS)等。缓冲液的浓度没有特别限定，只要适合测定的浓度即可，优选0.001～2.0mol/L，更优选0.005～1.0mol/L。
以下具体说明本发明的HDL胆甾醇测定方法、测定用试剂和测定用试剂盒。
(HDL胆甾醇的测定方法)现举以下所述方法为例说明本发明的HDL胆甾醇的测定方法。
测定方法(1)使检测样品与胆甾醇酯水解酶和胆甾醇氧化酶，或胆甾醇酯水解酶、氧化型辅酶及胆甾醇脱氢酶，在至少含有选自烷基胺聚氧化乙烯聚氧化丙烯缩合物、聚氧化乙烯烷基胺硫酸盐、聚氧化乙烯苄基烷基季铵盐、聚氧化乙烯酸酰胺、氧化烷基胺和烷基丙烯二胺衍生物构成的族中的一种物质，根据需要含有聚合阴离子、胆汁酸衍生物、乙烯二氨基四聚氧化烯烃、聚氧化乙烯烷基胺、聚氧化乙烯链烯胺和白蛋白构成的族中的一种物质的水溶性介质中，进行反应使其生成过氧化氢或还原型辅酶；(2)测定生成的过氧化氢或还原型辅酶；(3)根据(2)测定的值和事先制备的标准曲线，通过计算出检测样品中HDL胆甾醇的浓度，可以测定出检测样品的HDL胆甾醇。
本测定方法中，反应(1)可在10～50℃，优选20～40℃下，反应1～60分钟，优选2～30分钟。
生成的过氧化氢的量，可以用诸如过氧化氢测定用试剂进行测定。过氧化氢测定用试剂，是为了把生成的过氧化氢转换成能够检测的物质的试剂。能够检测的物质有例如色素、发光等，优选色素。能够检测的物质是色素时，检测过氧化氢用的试剂含有氧化发色型生色体和过氧化氢酶等过氧化活性物质。氧化发色型生色体有例如下述氧化发色型生色体。当能够检测的物质会发光时，检测过氧化氢用的试剂含有化学发光物质。化学发光物质有如鲁米那、异鲁米那、光泽精、吖啶基酯等。
检测过氧化氢用的试剂，在采用含有氧化发色型生色体和过氧化氢酶等过氧化活性物质时，过氧化氢在过氧化活性物质存在时会和氧化发色型生色体发生反应而生成色素，通过定量所生成的色素，能定量过氧化氢。另外，在采用含有化学发光物质的检测过氧化氢用的试剂时，过氧化氢与化学发光物质反应生成光子，通过定量生成的光子，即能定量过氧化氢。
氧化发色型生色体，例如有无色型生色体、氧化偶合发色型生色体等。无色型生色体在有过氧化氢和过氧化氢酶等过氧化活性物质存在时，单独地向色素转换的物质。具体物质有10-N-羧甲基氨基甲酰基-3，7-双(二甲胺基)-10H-吩噻嗪(CCAP)、10-N-甲基氨基甲酰基-3，7-双(二甲胺基)-10H-吩噻嗪(MCDP)、N-(羧甲基氨基甲酰基)-4，4’-双(二甲胺基)联苯胺钠盐(DA-64)、4，4’-双(二甲胺基)联苯胺、双[3-双(4-氯苯)甲基-4-二甲氨基苯基]胺(BCMA)等。
氧化偶合发色型生色体，是在有过氧化氢和过氧化氢酶等过氧化活性物质存在下，两种化合物通过氧化偶合生成色素的物质。两种化合物的组合，例如有偶合剂和苯胺类的组合、偶合剂和酚类的组合等。偶合剂有例如4-氨基-安替比林(4-AA)、3-甲基-2-苯并噻唑酮肼等。苯胺类则有N-(3-磺基丙烷基)苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺基丙烷基)-3-甲基苯胺(TOOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺基丙烷基)-3，5-二甲基苯胺(MAOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺基丙烷基)-3，5-二甲氧基苯胺(DAOS)、N-乙基-N-(3-磺基丙烷基)-3-甲基苯胺(TOPS)、N-(2-羟基-3-磺基丙烷基)-3，5-二甲氧基苯胺(HDAOS)、N-N-二甲基-3-甲基苯胺、N-N-二(3-磺基丙烷基)-3，5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺基丙烷基)-3-甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺基丙烷基)苯胺、N-乙基-N-(3-磺基丙烷基)-3，5-二甲氧基苯胺、N-(3-磺基丙烷基)-3，5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺基丙烷基)-3，5-二甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺基丙烷基)-3-甲氧基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺基丙烷基)苯胺、N-乙基-N-(3-甲苯基)-N’-琥珀酰乙烯二胺(EMSE)、N-乙基-N-(3-甲苯基)-N’-乙酰乙烯二胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺基丙烷基)-4-氟-3，5-二甲氧基苯胺(F-DAOS)等。酚类有苯酚、4-氯酚、3-甲基酚、3-羟基-2，4，6-三碘苯甲酸(HTIB)等。
在过氧化氢测定中，过氧化活性物质的浓度没有特别限定，只要是适合测定的浓度即可，在用过氧化氢酶作为过氧化活性物质时，优选1～100kU/L。另外，氧化发色型生色体的浓度没有特别限定，只要是适合测定的浓度即可，优选0.01～10g/L。
还原型辅酶的测定方法，例如有测定所生成的还原型辅酶吸光度的方法、采用测定还原型辅酶用试剂的方法等。测定还原型辅酶吸光度的方法中的吸光度，优选300～500nm，更优选330～400nm间，特别优选340nm附近。测定还原型辅酶用的试剂，是为了把还原型辅酶转变成可检测的物质的制剂。可以检测的物质例如有色素等。可检测的物质是色素时还原型辅酶测定用试剂，例如有含有心肌黄酶、电子载体和还原发色型生色体的试剂。电子载体有如1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-Methoxy-5-methylphenazinium methylsulfate)等。在采用含有心肌黄酶、电子载体和还原发色型生色体的试剂作为测定还原型辅酶试剂时，通过定量转换还原发色型生色体而生成的色素，即可定量还原型辅酶。
还原发色型生色体，有例如3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-联苯基-2H-溴代四唑鎓(MTT)、2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基酚)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓单钠盐(WST-1)、2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基酚)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓单钠盐(WST-3)等。
(HDL胆甾醇测定用试剂)本发明的HDL胆甾醇测定用试剂含有选自烷基胺聚氧化乙烯聚氧化丙烯缩合物、聚氧化乙烯烷基胺硫酸盐、聚氧化乙烯苄基烷基季铵盐、聚氧化乙烯酸酰胺、氧化烷基胺和烷基丙烯二胺衍生物构成的族中的一种物质，以及胆甾醇酯水解酶，胆甾醇氧化酶和过氧化氢检测用试剂，必要时还含有选自聚合阴离子、胆汁酸衍生物、乙二胺四聚氧化烯烃、聚氧化乙烯烷基胺和聚氧化乙烯链烯基胺构成的族中的至少一种物质。
另外，本发明的HDL胆甾醇测定用试剂含有选自烷基胺聚氧化乙烯聚氧化丙烯缩合物、聚氧化乙烯烷基胺硫酸盐、聚氧化乙烯苄基烷基季铵盐、聚氧化乙烯酸酰胺、氧化烷基胺和烷基丙烯二胺衍生物构成的族中的一种物质，胆甾醇酯水解酶，胆甾醇脱氢酶及氧化型辅酶，必要时还含有聚合阴离子、胆汁酸衍生物、乙二胺四聚氧化烯烃、聚氧化乙烯烷基胺和聚氧化乙烯链烯基胺构成的族中的至少一种物质，或者测定还原型辅酶用的试剂。
本发明的HDL胆甾醇测定用试剂例如有以下形式的试剂，但对本发明的范围没有任何限定。
此外，烷基胺聚氧化乙烯聚氧化丙烯缩合物、聚氧化乙烯烷基胺硫酸盐、聚氧化乙烯苄基烷基季铵盐、聚氧化乙烯酸酰胺，氧化烷基胺和烷基丙烯二胺衍生物构成的族中的一种物质，以下称为[化合物A]。
另外，聚合阴离子、胆汁酸衍生物、乙二胺四聚氧化烯烃、聚氧化乙烯烷基胺和聚氧化乙烯链烯基胺等化合物构成的族中的至少一种物质，以下称为[化合物B]。在本发明的测定试剂中，化合物A可以使用一种或多种，化合物B可以使用一种或多种。
试剂1含有化合物A、胆甾醇酯水解酶、胆甾醇氧化酶和过氧化氢检测用试剂的试剂。
试剂2含有化合物A、化合物B、胆甾醇酯水解酶、胆甾醇氧化酶和过氧化氢检测用试剂的试剂。
试剂3含有化合物A、化合物B、白蛋白、胆甾醇酯水解酶、胆甾醇氧化酶和过氧化氢检测用试剂的试剂。
试剂4含有化合物A、胆甾醇酯水解酶、胆甾醇脱氢酶和氧化型辅酶的试剂。
试剂5含有化合物A、化合物B、胆甾醇酯水解酶、胆甾醇脱氢酶和氧化型辅酶的试剂。
试剂6含有化合物A、化合物B、白蛋白、胆甾醇酯水解酶、胆甾醇脱氢酶和氧化型辅酶的试剂。
试剂7含有化合物A、胆甾醇酯水解酶、胆甾醇脱氢酶、氧化型辅酶和测定还原型辅酶用试剂的试剂。
试剂8含有化合物A、化合物B、胆甾醇酯水解酶、胆甾醇脱氢酶、氧化型辅酶和测定还原型辅酶用试剂的试剂。
试剂9含有化合物A、化合物B、白蛋白、胆甾醇酯水解酶、胆甾醇脱氢酶、氧化型辅酶和测定还原型辅酶用试剂的试剂。
本发明的HDL胆甾醇测定用试剂，可以使用已经在上述本发明的HDL胆甾醇测定方法中列举的烷基胺聚氧化乙烯聚氧化丙烯缩合物、聚氧化乙烯烷基胺硫酸盐、聚氧化乙烯苄基烷基季铵盐、聚氧化乙烯酸酰胺、氧化烷基胺和烷基丙烯二胺衍生物、胆甾醇酯水解酶、胆甾醇氧化酶、胆甾醇脱氢酶、聚合阴离子、胆汁酸衍生物、乙二胺四聚氧化烯烃、聚氧化乙烯烷基胺和聚氧化乙烯链烯基胺、白蛋白、过氧化氢测定用试剂、氧化型辅酶、还原型辅酶测定用试剂。
(HDL胆甾醇测定用试剂盒)本发明的HDL胆甾醇测定用试剂，可用试剂盒形式保存、流通和使用。试剂盒的形式并无特别限制，二试剂系统和三试剂系统等均可，但优选二试剂系统。
由第一试剂和第二试剂组成的二试剂系统HDL胆甾醇测定用试剂盒中，胆甾醇酯水解酶和胆甾醇氧化酶或胆甾醇脱氢酶，可以分别含在第一试剂和第二试剂中，也可以全部含在第二试剂中。当分别含在第一试剂和第二试剂中时，最好的形式是胆甾醇酯水解酶可以含在第一试剂中，胆甾醇氧化酶或胆甾醇脱氢酶含在第二试剂中。烷基胺聚氧化乙烯聚氧化丙烯缩合物、聚氧化乙烯烷基胺硫酸盐、聚氧化乙烯苄基烷基季铵盐、聚氧化乙烯酸酰胺、氧化烷基胺和烷基丙烯二胺衍生物、胆汁酸衍生物、乙二胺四聚氧化烯烃、聚氧化乙烯烷基胺、聚氧化乙烯链烯基胺和白蛋白含于第一试剂或第二试剂二者的一或二者的中均可。在采用胆甾醇脱氢酶的测定方法中使用的氧化型辅酶，含于第一试剂或第二试剂二者的一或二者的中均可。
过氧化氢测定用试剂含于第一试剂或第二试剂二者的一或二者的中均可，但在该试剂含有氧化偶联型发色体时，优选的形式是将各种氧化偶合型发色体各种化合物含在不同的试剂中。测定还原型辅酶用的试剂可以含于第一试剂或第二试剂二者的一或二者的中均可，优选含于第一试剂和第二试剂二者的中。
本发明的HDL胆甾醇测定用试剂盒，例如有以下形式的试剂盒，但这些对本发明的范围没有任何限定。
试剂盒1第一试剂胆甾醇酯水解酶第二试剂胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂、化合物A试剂盒2第一试剂胆甾醇酯水解酶第二试剂胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂、化合物A、化合物B试剂盒3第一试剂胆甾醇酯水解酶第二试剂胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂、化合物A、化合物B、白蛋白试剂盒4第一试剂胆甾醇酯水解酶、化合物B第二试剂胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂、化合物A试剂盒5第一试剂胆甾醇酯水解酶、化合物B、白蛋白第二试剂胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂、化合物A试剂盒6第一试剂胆甾醇酯水解酶、化合物B第二试剂胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂、化合物A、化合物B试剂盒7
第一试剂胆甾醇酯水解酶、化合物B、白蛋白第二试剂胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂、化合物A、化合物B试剂盒8第一试剂胆甾醇酯水解酶、化合物A第二试剂胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂试剂盒9第一试剂胆甾醇酯水解酶、化合物A第二试剂胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂、化合物B试剂盒10、第一试剂胆甾醇酯水解酶、化合物A第二试剂胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂、化合物B、白蛋白试剂盒11第一试剂胆甾醇酯水解酶、化合物A、化合物B第二试剂胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂试剂盒12
第一试剂胆甾醇酯水解酶、化合物A、化合物B、白蛋白第二试剂胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂试剂盒13、第一试剂胆甾醇酯水解酶、化合物A、化合物B第二试剂胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂、化合物B试剂盒14第一试剂胆甾醇酯水解酶、化合物A、化合物B、白蛋白第二试剂胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂、化合物B试剂盒15第一试剂胆甾醇酯水解酶、化合物A第二试剂胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂、化合物A试剂盒16第一试剂胆甾醇酯水解酶、化合物A第二试剂胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂、化合物A、化合物B试剂盒17
第一试剂胆甾醇酯水解酶、化合物A第二试剂胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂、化合物A、化合物B、白蛋白试剂盒18第一试剂胆甾醇酯水解酶、化合物A、化合物B第二试剂胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂、化合物A试剂盒19第一试剂胆甾醇酯水解酶、化合物A、白蛋白、化合物B第二试剂胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂、化合物A试剂盒20第一试剂胆甾醇酯水解酶、化合物A、化合物B第二试剂胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂、化合物A、化合物B试剂盒21第一试剂胆甾醇酯水解酶、化合物A、化合物B、白蛋白第二试剂胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂、化合物A、化合物B
试剂盒22第一试剂胆甾醇酯水解酶、过氧化氢检测用试剂第二试剂胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂、化合物A试剂盒23第一试剂胆甾醇酯水解酶、过氧化氢检测用试剂第二试剂胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂、化合物A试剂盒24第一试剂胆甾醇酯水解酶、过氧化氢检测用试剂第二试剂胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂、化合物A、化合物B、白蛋白试剂盒25第一试剂胆甾醇酯水解酶、过氧化氢检测用试剂、化合物B第二试剂胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂、化合物A试剂盒26第一试剂胆甾醇酯水解酶、过氧化氢检测用试剂、化合物B、白蛋白第二试剂胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂、化合物A
试剂盒27第一试剂胆甾醇酯水解酶、过氧化氢检测用试剂、化合物B第二试剂胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂、化合物A、化合物B试剂盒28第一试剂胆甾醇酯水解酶、过氧化氢检测用试剂、化合物B、白蛋白第二试剂胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂、化合物A、化合物B试剂盒29第一试剂胆甾醇酯水解酶、过氧化氢检测用试剂、化合物A第二试剂胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂试剂盒30第一试剂胆甾醇酯水解酶、过氧化氢检测用试剂、化合物A第二试剂胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂、化合物B试剂盒31第一试剂胆甾醇酯水解酶、过氧化氢检测用试剂、化合物A第二试剂胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂、化合物B、白蛋白试剂盒32第一试剂胆甾醇酯水解酶、过氧化氢检测用试剂、化合物A、化合物B第二试剂胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂试剂盒33第一试剂胆甾醇酯水解酶、过氧化氢检测用试剂、化合物A、化合物B、白蛋白第二试剂胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂试剂盒34第一试剂胆甾醇酯水解酶、过氧化氢检测用试剂、化合物A、化合物B第二试剂胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂、化合物B试剂盒35第一试剂胆甾醇酯水解酶、过氧化氢检测用试剂、化合物A、化合物B、白蛋白第二试剂胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂、化合物B试剂盒36第一试剂胆甾醇酯水解酶、过氧化氢检测用试剂、化合物A
第二试剂胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂、化合物A试剂盒37第一试剂胆甾醇酯水解酶、过氧化氢检测用试剂、化合物A第二试剂胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂、化合物A、化合物B试剂盒38第一试剂胆甾醇酯水解酶、过氧化氢检测用试剂、化合物A第二试剂胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂、化合物A、化合物B、白蛋白试剂盒39第一试剂胆甾醇酯水解酶、过氧化氢检测用试剂、化合物A、化合物B第二试剂胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂、化合物A试剂盒40第一试剂胆甾醇酯水解酶、过氧化氢检测用试剂、化合物B、白蛋白、化合物A第二试剂胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂、化合物A试剂盒41
第一试剂胆甾醇酯水解酶、过氧化氢检测用试剂、化合物A、化合物B第二试剂胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂、化合物A、化合物B试剂盒42第一试剂胆甾醇酯水解酶、过氧化氢检测用试剂、化合物A、化合物B、白蛋白第二试剂胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂、化合物A、化合物B试剂盒43第一试剂化合物B第二试剂胆甾醇酯水解酶、胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂、化合物A试剂盒44第一试剂化合物B、白蛋白第二试剂胆甾醇酯水解酶、胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂、化合物A试剂盒45第一试剂化合物B第二试剂胆甾醇酯水解酶、胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂、化合物A、化合物B试剂盒46第一试剂化合物B、白蛋白第二试剂胆甾醇酯水解酶、胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂、化合物A、化合物B试剂盒47第一试剂化合物A第二试剂胆甾醇酯水解酶、胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂试剂盒48第一试剂化合物A第二试剂胆甾醇酯水解酶、胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂、化合物B试剂盒49第一试剂化合物A第二试剂胆甾醇酯水解酶、胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂、化合物B、白蛋白试剂盒50第一试剂化合物A、化合物B第二试剂胆甾醇酯水解酶、胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂试剂盒51第一试剂化合物A、化合物B、白蛋白第二试剂胆甾醇酯水解酶、胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂试剂盒52第一试剂化合物A、化合物B第二试剂胆甾醇酯水解酶、胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂、化合物B试剂盒53第一试剂化合物A、化合物B、白蛋白第二试剂胆甾醇酯水解酶、胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂、化合物B试剂盒54第一试剂化合物A第二试剂胆甾醇酯水解酶、胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂、化合物A试剂盒55第一试剂化合物A第二试剂胆甾醇酯水解酶、胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂、化合物A、化合物B试剂盒56第一试剂化合物A第二试剂胆甾醇酯水解酶、胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂、化合物A、化合物B、白蛋白试剂盒57第一试剂化合物A、化合物B第二试剂胆甾醇酯水解酶、胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂、化合物A试剂盒58第一试剂化合物A、化合物B、白蛋白第二试剂胆甾醇酯水解酶、胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂、化合物A
试剂盒59第一试剂化合物A、化合物B第二试剂胆甾醇酯水解酶、胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂、化合物A、化合物B试剂盒60第一试剂化合物A、化合物B、白蛋白第二试剂胆甾醇酯水解酶、胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂、化合物A、化合物B试剂盒61第一试剂过氧化氢检测用试剂第二试剂胆甾醇酯水解酶、胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂、化合物A试剂盒62第一试剂过氧化氢检测用试剂第二试剂胆甾醇酯水解酶、胆甾醇氧化酶、过氧化氢检测用试剂、化合物A、化合物B试剂盒63
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试剂盒151第一试剂氧化型辅酶、胆甾醇酯水解酶、还原型辅酶测定用试剂、化合物B、白蛋白第二试剂胆甾醇脱氢酶、还原型辅酶测定用试剂、化合物A、化合物B试剂盒152第一试剂氧化型辅酶、胆甾醇酯水解酶、还原型辅酶测定用试剂、化合物A第二试剂胆甾醇酯水解酶、胆甾醇脱氢酶、还原型辅酶测定用试剂试剂盒153第一试剂氧化型辅酶、胆甾醇酯水解酶、还原型辅酶测定用试剂、化合物A第二试剂胆甾醇脱氢酶、还原型辅酶测定用试剂、化合物B试剂盒154第一试剂氧化型辅酶、胆甾醇酯水解酶、还原型辅酶测定用试剂第二试剂胆甾醇脱氢酶、还原型辅酶测定用试剂、化合物B、白蛋白试剂盒155第一试剂氧化型辅酶、胆甾醇酯水解酶、还原型辅酶测定用试剂、化合物A、化合物B第二试剂胆甾醇脱氢酶、还原型辅酶测定用试剂试剂盒156第一试剂氧化型辅酶、胆甾醇酯水解酶、还原型辅酶测定用试剂、化合物A、化合物B、白蛋白第二试剂胆甾醇脱氢酶、还原型辅酶测定用试剂试剂盒157第一试剂氧化型辅酶、胆甾醇酯水解酶、还原型辅酶测定用试剂、化合物A、化合物B第二试剂胆甾醇脱氢酶、还原型辅酶测定用试剂、化合物B试剂盒158第一试剂氧化型辅酶、胆甾醇酯水解酶、还原型辅酶测定用试剂、化合物A、化合物B、白蛋白第二试剂胆甾醇脱氢酶、还原型辅酶测定用试剂、化合物B试剂盒159第一试剂氧化型辅酶、还原型辅酶测定用试剂、化合物A第二试剂胆甾醇酯水解酶、胆甾醇脱氢酶、还原型辅酶测定用试剂、化合物A试剂盒160第一试剂氧化型辅酶、胆甾醇酯水解酶、还原型辅酶测定用试剂、化合物A第二试剂胆甾醇脱氢酶、还原型辅酶测定用试剂、化合物A、化合物B试剂盒161第一试剂氧化型辅酶、胆甾醇酯水解酶、还原型辅酶测定用试剂、化合物A第二试剂胆甾醇脱氢酶、还原型辅酶测定用试剂、化合物A、化合物B、白蛋白试剂盒162第一试剂氧化型辅酶、胆甾醇酯水解酶、还原型辅酶测定用试剂、化合物A、化合物B第二试剂胆甾醇脱氢酶、还原型辅酶测定用试剂、化合物A试剂盒163第一试剂氧化型辅酶、胆甾醇酯水解酶、还原型辅酶测定用试剂、化合物A、化合物B、白蛋白第二试剂胆甾醇脱氢酶、还原型辅酶测定用试剂、化合物A
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第一试剂胆甾醇酯水解酶、化合物A、化合物B、白蛋白第二试剂氧化型辅酶、胆甾醇脱氢酶、化合物A试剂盒185第一试剂胆甾醇酯水解酶、化合物A、化合物B第二试剂氧化型辅酶、胆甾醇脱氢酶、化合物A、化合物B试剂盒186第一试剂胆甾醇酯水解酶、化合物A、化合物B、白蛋白第二试剂氧化型辅酶、胆甾醇脱氢酶、化合物A、化合物B试剂盒187第一试剂胆甾醇酯水解酶、还原型辅酶测定用试剂第二试剂氧化型辅酶、胆甾醇脱氢酶、还原型辅酶测定用试剂、化合物A试剂盒188第一试剂胆甾醇酯水解酶、还原型辅酶测定用试剂第二试剂氧化型辅酶、胆甾醇脱氢酶、还原型辅酶测定用试剂、化合物A、化合物B
试剂盒189第一试剂胆甾醇酯水解酶、还原型辅酶测定用试剂第二试剂氧化型辅酶、胆甾醇脱氢酶、还原型辅酶测定用试剂、化合物A、化合物B、白蛋白试剂盒190第一试剂胆甾醇酯水解酶、还原型辅酶测定用试剂、化合物B第二试剂氧化型辅酶、胆甾醇脱氢酶、还原型辅酶测定用试剂、化合物A试剂盒191第一试剂胆甾醇酯水解酶、还原型辅酶测定用试剂、化合物B、白蛋白第二试剂氧化型辅酶、胆甾醇脱氢酶、还原型辅酶测定用试剂、化合物A试剂盒192第一试剂胆甾醇酯水解酶、还原型辅酶测定用试剂、化合物B第二试剂氧化型辅酶、胆甾醇脱氢酶、还原型辅酶测定用试剂、化合物A、化合物B试剂盒193第一试剂胆甾醇酯水解酶、还原型辅酶测定用试剂、化合物B、白蛋白第二试剂氧化型辅酶、胆甾醇脱氢酶、还原型辅酶测定用试剂、化合物A、化合物B试剂盒194第一试剂胆甾醇酯水解酶、还原型辅酶测定用试剂、化合物A第二试剂氧化型辅酶、胆甾醇酯水解酶、胆甾醇脱氢酶、还原型辅酶测定用试剂试剂盒195第一试剂胆甾醇酯水解酶、还原型辅酶测定用试剂、化合物A第二试剂氧化型辅酶、胆甾醇脱氢酶、还原型辅酶测定用试剂、化合物B试剂盒196第一试剂胆甾醇酯水解酶、还原型辅酶测定用试剂、化合物A第二试剂氧化型辅酶、胆甾醇脱氢酶、还原型辅酶测定用试剂、化合物B、白蛋白试剂盒197第一试剂胆甾醇酯水解酶、还原型辅酶测定用试剂、化合物A、化合物B
第二试剂氧化型辅酶、胆甾醇脱氢酶、还原型辅酶测定用试剂试剂盒198第一试剂胆甾醇酯水解酶、还原型辅酶测定用试剂、化合物A、化合物B、白蛋白第二试剂氧化型辅酶、胆甾醇脱氢酶、还原型辅酶测定用试剂试剂盒199第一试剂胆甾醇酯水解酶、还原型辅酶测定用试剂、化合物A、化合物B第二试剂氧化型辅酶、胆甾醇脱氢酶、还原型辅酶测定用试剂、化合物B试剂盒200第一试剂胆甾醇酯水解酶、还原型辅酶测定用试剂、化合物A、化合物B、白蛋白第二试剂氧化型辅酶、胆甾醇脱氢酶、还原型辅酶测定用试剂、化合物B试剂盒201第一试剂胆甾醇酯水解酶、还原型辅酶测定用试剂、化合物A第二试剂氧化型辅酶、胆甾醇酯水解酶、胆甾醇脱氢酶、还原型辅酶测定用试剂、化合物A
试剂盒202第一试剂胆甾醇酯水解酶、还原型辅酶测定用试剂、化合物A第二试剂氧化型辅酶、胆甾醇脱氢酶、还原型辅酶测定用试剂、化合物A、化合物B试剂盒203第一试剂胆甾醇酯水解酶、还原型辅酶测定用试剂、化合物A第二试剂氧化型辅酶、胆甾醇脱氢酶、还原型辅酶测定用试剂、化合物A、化合物B、白蛋白试剂盒204第一试剂胆甾醇酯水解酶、还原型辅酶测定用试剂、化合物A、化合物B第二试剂氧化型辅酶、胆甾醇脱氢酶、还原型辅酶测定用试剂、化合物A试剂盒205第一试剂胆甾醇酯水解酶、还原型辅酶测定用试剂、化合物A、化合物B、白蛋白第二试剂氧化型辅酶、胆甾醇脱氢酶、还原型辅酶测定用试剂、化合物A
试剂盒206第一试剂胆甾醇酯水解酶、还原型辅酶测定用试剂、化合物A、化合物B第二试剂氧化型辅酶、胆甾醇脱氢酶、还原型辅酶测定用试剂、化合物A、化合物B试剂盒207第一试剂胆甾醇酯水解酶、还原型辅酶测定用试剂、化合物A、化合物B、白蛋白第二试剂氧化型辅酶、胆甾醇酯水解酶、还原型辅酶测定用试剂、化合物A、化合物B用于本发明HDL胆甾醇测定的试剂盒，可以采用上述本发明HDL胆甾醇测定方法中所列举的试剂胆甾醇酯水解酶、胆甾醇氧化酶、胆甾醇脱氢酶、烷基胺聚氧化乙烯聚氧化丙烯缩合物、聚氧化乙烯烷基胺硫酸盐、聚氧化乙烯苄基烷基季铵盐、聚氧化乙烯酸酰胺，氧化烷基胺、烷基丙烯二胺衍生物、聚合阴离子、胆汁酸衍生物、乙二胺四聚氧化烯烃、聚氧化乙烯烷基胺、聚氧化乙烯链烯基胺、白蛋白、过氧化氢测定用试剂、氧化型辅酶、还原型辅酶测定用试剂等。
本发明的HDL胆甾醇测定用试剂和测定用试剂盒中，可根据必要，也可以含有水性介质、稳定剂、防腐剂、干扰物质消除剂、反应促进剂等。水性介质例如有上述水性介质等；稳定剂有如乙二胺四乙酸(EDTA)、蔗糖、氯化钙等；防腐剂例如有如叠氮化钠、抗生素等；干扰物质消除剂例如有消除抗坏血酸干扰的抗坏血酸氧化酶等；反应促进剂例如有共脂肪酶和磷酸酯酶等酶、硫酸钠和氯化钠等盐类等。
本发明的HDL胆甾醇测定用试剂和测定用试剂盒，可以是冷冻干燥状态，也可以是溶解在水性介质的状态。采用冷冻干燥状态的制剂测定检测样品中HDL胆甾醇时，要将该试剂溶解在水性介质中使用。
本发明的HDL胆甾醇测定用试剂和测定用试剂盒中，胆甾醇酯水解酶、胆甾醇氧化酶、胆甾醇脱氢酶的含量，在以水性介质溶解状态下的浓度优选配成0.01～1200U/mL，更优选0.02～600U/mL。本发明的HDL胆甾醇测定用试剂和测定用试剂盒中，烷基胺聚氧化乙烯聚氧化丙烯缩合物、聚氧化乙烯烷基胺硫酸盐、聚氧化乙烯苄基烷基季铵盐、聚氧化乙烯酸酰胺，氧化烷基胺和烷基丙烯二胺衍生物的含量，在以水性介质溶解状态下的浓度优选配成0.0001～3％，更优选0.001～0.3％；本发明的HDL胆甾醇测定用试剂和测定用试剂盒中，聚合阴离子的含量，在以水性介质溶解状态下的浓度优选配成0.001～30％，更优选0.01～3％。
本发明的HDL胆甾醇测定用试剂和测定用试剂盒中，胆汁酸衍生物的含量，在以水性介质溶解状态下的浓度优选配成0.001～30％，更优选0.01～3％。
本发明的HDL胆甾醇测定用试剂和测定用试剂盒中，乙二胺四聚氧化烯烃的含量，在以水性介质溶解状态下的浓度优选配成0.001～30％，更优选配成0.01～3％。
本发明的HDL胆甾醇测定用试剂和测定用试剂盒中，聚氧化乙烯胺或聚氧化乙烯链烯胺的含量，在以水性介质溶解状态下的浓度优选配成0.0001～3％，更优选配成0.001～0.3％。
本发明的HDL胆甾醇测定用试剂和测定用试剂盒中，白蛋白的含量，在以水性介质溶解状态下的浓度优选配成0.001～30％，更优选配成0.01～3％。
下面用实施例详细说明本发明，但这些实施例对本发明的范围的没有任何限定。另外，在本实施例中，使用了下述制造商的试剂和酶制剂。
HEPES(BDH Laboratory公司制)、EMSE(ダイト化学公司制)、硫酸葡聚糖钠(分子量50万)(Phamaica公司制)、牛血清白蛋白(BSA；东洋纺织公司制)、4-氨基安替比林(埼京化成公司制)、过氧化氢酶(东洋纺织公司制)、COO321(胆甾醇氧化酶；东洋纺织公司制)、CHODI(胆甾醇氧化酶；天野酶制剂公司制)、CHOD协和(胆甾醇氧化酶；协和发酵公司制)、LPL311(胆甾醇酯水解酶；东洋纺织公司制)、LPL6(胆甾醇酯水解酶；天野酶制剂公司制)、43kDa酯酶(胆甾醇酯水解酶；天野酶制剂公司制)、BLAUONON SAP3010、BLAUONON SAP3004(均为牛油胺聚氧化乙烯聚氧化丙烯缩合物；青木油脂公司制)、C16EO30PO10、C16EO30PO20、C16EO40PO10、C16EO20PO10(均为十六烷基聚氧化乙烯聚氧化丙烯缩合物；日本油脂公司制)、ビスノ-ル(Bisnol)SK(聚氧化乙烯苄基烷基季铵盐；一方公司油脂公司制)、ミゲノ-ル(Mignol)PA-30(聚氧化乙烯烷基胺硫酸盐；一方公司油脂公司制)、ニツコ-ル(Nicol)TAMDS15(聚氧化乙烯硬脂酸酰胺；日光化学公司制)、ナイミツド(Naimizdo)MT-215(聚氧化乙烯酸酰胺；日光化学公司制)、BLAUONON DT03、BLAUNON DT15(均为烷基丙烯二胺；青木油脂公司制)、ユニセ-フ(Unisef)A-LM(氧化烷基二甲胺；日本油脂公司制)、ユニセ-フA-LY(聚氧化乙烯椰子油烷基二甲基氧化胺；日本油脂公司制)、アスフアゾ-ル(Asphazol)#10(聚氧化乙烯牛油丙烯二胺；日本油脂公司制)、乙二胺PO52EO60(乙二胺四聚氧化烯烃；日本油脂公司制)、アデカプルロニツク(Adecarnic)TR704(乙二胺聚氧化乙烯聚氧化丙烯缩合物；旭电化公司制)、ナイミ-ン(Naimin)L207(聚氧化乙烯十二烷基胺；日本油脂公司制)、胆酸钠(阴离子性胆汁酸衍生物；ACROS公司制)、CHAPS(两性胆汁酸衍生物；同仁化学公司制)、BIGCHAP(非离子性胆汁酸衍生物；同仁化学公司制)。
参考例1化学修饰LPL311(经化学修饰的LPL311)的制备在HEPES缓冲液(pH8.5 0.15mol/L)中加入LPL311使其浓度为33g/L，冷却到5℃后，加入サンブライト(Sanbride)VFM-4101(日本油脂公司制)使其浓度为330g/L，再反应3小时。所得到的修饰酶溶液无需纯化即直接作为化学修饰的LPL311使用。
实施例1制备了由以下第一试剂(试剂A)和第二试剂(试剂a)组成的HDL胆甾醇测定用试剂盒。
第一试剂(试剂A)HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L第二试剂(试剂a1)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林0.3g/L过氧化氢酶20kU/L化学修饰的LPL311 0.2kU/LCOO3215.0kU/LBLAUNON SAP3004 0.1g/L实施例2制备了由以下第一试剂(试剂A)和第二试剂(试剂a2)组成的HDL胆甾醇测定用试剂盒。
第一试剂(试剂A)HEPES(pH7.5) 10mmol/L
EMSE 0.3g/L第二试剂(试剂a2)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林0.3g/L过氧化氢酶20kU/L化学修饰的LPL311 0.2kU/LCOO3215.0kU/LBLAUNON SAP3010 0.5g/L实施例3制备由以下第一试剂(试剂A)和第二试剂(试剂a3)组成的HDL胆甾醇测定用试剂盒。
第一试剂(试剂A)HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L第二试剂(试剂a3)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林0.3g/L过氧化氢酶20kU/L化学修饰的LPL311 0.2kU/LCOO3215.0kU/LC16EO30PO10 0.5g/L实施例4制备由以下第一试剂(试剂A)和第二试剂(试剂a4)组成的HDL胆甾醇测定用试剂盒。
第一试剂(试剂A)HEPES(pH7.5) 10mmol/L
EMSE 0.3g/L第二试剂(试剂a4)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林0.3g/L过氧化氢酶20kU/L化学修饰的LPL311 0.2kU/LCOO3215.0kU/LC16EO40PO10 1.0g/L实施例5制备由以下第一试剂(试剂A)和第二试剂(试剂a5)组成的HDL胆甾醇测定用试剂盒。
第一试剂(试剂A)HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L第二试剂(试剂a5)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林0.3g/L过氧化氢酶20kU/L化学修饰的LPL311 0.2kU/LCOO3215.0kU/LC16EO30PO20 0.5g/L实施例6制备由以下第一试剂(试剂A)和第二试剂(试剂a6)组成的HDL胆甾醇测定用试剂盒。
第一试剂(试剂A)HEPES(pH7.5) 10mmol/L
EMSE0.3g/L第二试剂(试剂a6)HEPES(pH7.0)10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L过氧化氢酶 20kU/L化学修饰的LPL3110.2kU/LCOO321 5.0kU/LC16EO20PO10 0.5g/L实施例7制备由以下第一试剂(试剂A)和第二试剂(试剂a7)组成的HDL胆甾醇测定用试剂盒。
第一试剂(试剂A)HEPES(pH7.5)10mmol/LEMSE0.3g/L第二试剂(试剂a7)HEPES(pH7.0)10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L过氧化氢酶 20kU/L化学修饰的LPL3110.2kU/LCOO321 5.0kU/Lビスノ-ルSK 0.3g/L实施例8制备由以下第一试剂(试剂A)和第二试剂(试剂a8)组成的HDL胆甾醇测定用试剂盒。
第一试剂(试剂A)HEPES(pH7.5)10mmol/L
EMSE 0.3g/L第二试剂(试剂a8)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L过氧化氢酶 20kU/L化学修饰的LPL311 0.2kU/LCOO321 5.0kU/Lミゲノ-ルPA-30 0.5g/L实施例9制备由以下第一试剂(试剂A)和第二试剂(试剂a9)组成的HDL胆甾醇测定用试剂盒。
第一试剂(试剂A)HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L第二试剂(试剂a9)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L过氧化氢酶 20kU/L化学修饰的LPL311 0.2kU/LCOO321 5.0kU/Lニツコ-ルTAMDS15 0.1g/L实施例10制备由以下第一试剂(试剂A)和第二试剂(试剂a10)组成的HDL胆甾醇测定用试剂盒。
第一试剂(试剂A)HEPES(pH7.5) 10mmol/L
EMSE 0.3g/L第二试剂(试剂a10)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林0.3g/L过氧化氢酶20kU/L化学修饰的LPL311 0.2kU/LCOO3215.0kU/LBLAUNONDT03 0.5g/L实施例11制备由以下第一试剂(试剂A)和第二试剂(试剂a11)组成的HDL胆甾醇测定用试剂盒。
第一试剂(试剂A)HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L第二试剂(试剂a11)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林0.3g/L过氧化氢酶20kU/L化学修饰的LPL311 0.2kU/LCOO3215.0kU/LBLAUNON DT15 0.1g/L实施例12制备由以下第一试剂(试剂A)和第二试剂(试剂a12)组成的HDL胆甾醇测定用试剂盒。
第一试剂(试剂A)HEPES(pH7.5) 10mmol/L
EMSE 0.3g/L第二试剂(试剂a12)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林0.3g/L过氧化氢酶20kU/L化学修饰的LPL311 0.2kU/LCOO3215.0kU/Lアスフアゾ-ル#10 0.1g/L对照例1制备由以下第一试剂(试剂A)和第二试剂(试剂a)组成的HDL胆甾醇测定用试剂盒。
第一试剂(试剂A)HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L第二试剂(试剂a)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林0.3g/L过氧化氢酶20kU/L化学修饰的LPL311 0.2kU/LCOO3215.0kU/L实施例13用实施例1的试剂盒测定人血清30检测样品中的HDL胆甾醇。
(1)标准曲线的制备用实施例1的试剂盒，用生理盐水(HDL胆甾醇浓度0.0mg/dL)和血清(HDL胆甾醇浓度80.0mg/dL)作为标准液，在日立7170S型自动分析装置上，制备表示HDL胆甾醇浓度和吸光度的间关系的标准曲线。
此处所谓的「吸光度」，表示根据通过以下反应测定的两个吸光度值(E1和E2)，从E2中扣除E1所得的数值。
在反应池中加入标准液(2μL)和第一试剂(0.15mL)，37℃保温5分钟，用主波长600nm、副波长700nm测定反应液的吸光度(E1)，然后在反应液中加入第二试剂(0.05mL)，再在37℃保温5分钟，用主波长600nm、副波长700nm测定反应液的吸光度(E2)(2)根据人血清检测样品与实施例1或对照例1的试剂盒反应，算出该检测样品中的吸光度除用人血清检测样品代替(1)中制备标准曲线使用的标准液外，用计算(1)的吸光度同样的方法，算出该检测样品中的吸光度。
(3)人血清检测样品中的HDL胆甾醇浓度的测定根据由(2)算出的「吸光度」与由(1)制备的标准曲线，测定各检测样品中HDL胆甾醇的浓度。
实施例14除用实施例2的试剂盒代替实施例1的试剂盒外，用与实施例13相同的测定方法，在日立7170型自动分析装置上，测定人血清30检测样品中的HDL胆甾醇。
实施例15除用实施例3的试剂盒代替实施例1的试剂盒外，用与实施例13相同的测定方法，在日立7170型自动分析装置上，测定人血清30检测样品中的HDL胆甾醇。
实施例16除用实施例4的试剂盒代替实施例1的试剂盒外，用与实施例13相同的测定方法，在日立7170型自动分析装置上，测定人血清30检测样品中的HDL胆甾醇。
实施例17除用实施例5的试剂盒代替实施例1的试剂盒外，用与实施例13相同的测定方法，在日7170型自动分析装置上，测定人血清30检测样品中的HDL胆甾醇。
实施例18除用实施例6的试剂盒代替实施例1的试剂盒外，用与实施例13相同的测定方法，在日立7170型自动分析装置上，测定人血清30检测样品中的HDL胆甾醇。
实施例19除用实施例7的试剂盒代替实施例1的试剂盒外，用与实施例13相同的测定方法，在日立7170型自动分析装置上，测定人血清30检测样品中的HDL胆甾醇。
实施例20除用实施例8的试剂盒代替实施例1的试剂盒外，用与实施例13相同的测定方法，在日立7170型自动分析装置上，测定人血清30检测样品中的HDL胆甾醇。
实施例21除用实施例9的试剂盒代替实施例1的试剂盒外，用与实施例13相同的测定方法，在日7170型自动分析装置上，测定人血清30检测样品中的HDL胆甾醇。
实施例22除用实施例10的试剂盒代替实施例1的试剂盒外，用与实施例13相同的测定方法，在日立7170型自动分析装置上，测定3人血清30检测样品中的HDL胆甾醇。
实施例23除用实施例11的试剂盒代替实施例1的试剂盒外，用与实施例13相同的测定方法，在日立7170型自动分析装置上，测定人血清30检测样品中的HDL胆甾醇。
实施例24除用实施例12的试剂盒代替实施例1的试剂盒外，用与实施例13相同的测定方法，在日立7170型自动分析装置上，测定人血清30检测样品中的HDL胆甾醇。
对照例2除用对照例1的试剂盒代替实施例1的试剂盒外，用与实施例13相同的测定方法，在日立7170型自动分析装置上，测定人血清30检测样品中的HDL胆甾醇。
然后，用在实施例13～24和对照例2中使用的人血清30样品，按Clinical Chemisty第45卷10期(1999年)所述的DCM法(DesignatedComparison Method)测定该检测样品中的HDL胆甾醇，并比较各实施例和对照例中的数据。将各实施例和对照例分别的测定，与用DCM法测定所得相关系数，表示在第1表1中。
第1表

根据实施例13～24和对照例2的比较，得知采用了化合物A(特别是乙烯胺聚氧化乙烯聚氧化丙烯缩合物、聚氧化乙烯烷基胺硫酸盐、聚氧化乙烯苄基烷基季铵盐、聚氧化乙烯酸酰胺或烷基丙烯二胺衍生物)的试剂盒中，可以得到与用DCM法进行的测定具有有良好的相关系数。
制备由以下成分组成的第一试剂(试剂B)。
实施例25制备由以下第一试剂(试剂B)和第二试剂(试剂a2)组成的HDL胆甾醇测定用试剂盒。
第一试剂(试剂B)HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L硫酸葡聚糖钠盐 1.0g/L第二试剂(试剂a2)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L过氧化氢酶 20kU/L化学修饰的LPL311 0.2kU/LCOO321 5.0kU/LBLAUNON SAP3010 0.5g/L实施例26制备由以下第一试剂(试剂B)和第二试剂(试剂a5)组成的HDL胆甾醇测定用试剂盒。
第一试剂(试剂B)HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L硫酸葡聚糖钠盐1.0g/L第二试剂(试剂a5)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林0.3g/L过氧化氢酶20kU/L化学修饰的LPL311 0.2kU/LCOO3215.0kU/LC16EO30PO20 0.5g/L实施例27制备由以下第一试剂(试剂B)和第二试剂(试剂a7)组成的HDL胆甾醇测定用试剂盒。
第一试剂(试剂B)HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L硫酸葡聚糖钠盐1.0g/L第二试剂(试剂a7)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林0.3g/L过氧化氢酶20kU/L化学修饰的LPL311 0.2kU/LCOO3215.0kU/L(Bisnol)ビスノ-ルSK 0.3g/L实施例28制备由以下第一试剂(试剂B)和第二试剂(试剂a9)组成的HDL胆甾醇测定用试剂盒。
第一试剂(试剂B)HEPES(pH7.5)10mmol/LEMSE0.3g/L硫酸葡聚糖钠盐 1.0g/L第二试剂(试剂a9)HEPES(pH7.0)10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L过氧化氢酶 20kU/L化学修饰的LPL3110.2kU/LCOO321 5.0kU/Lニツコ-ルTAMDS150.1g/L实施例29制备由以下第一试剂(试剂B)和第二试剂(试剂a13)组成的HDL胆甾醇测定用试剂盒。
第一试剂(试剂B)HEPES(pH7.5)10mmol/LEMSE0.3g/L硫酸葡聚糖钠盐 1.0g/L第二试剂(试剂a13)HEPES(pH7.0)10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L过氧化氢酶 20kU/L化学修饰的LPL3110.2kU/LCOO321 5.0kU/Lユニセ-フA-LM 0.5g/L
实施例30制备由以下第一试剂(试剂B)和第二试剂(试剂a10)组成的HDL胆甾醇测定用试剂盒。
第一试剂(试剂B)HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L硫酸葡聚糖钠盐 1.0g/L第二试剂(试剂a10)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L过氧化氢酶 20kU/L化学修饰的LPL311 0.2kU/LCOO321 5.0kU/LBLAUNON DT03 0.5g/L对照例3制备由以下第一试剂(试剂B)和第二试剂(试剂a)组成的HDL胆甾醇测定用试剂盒。
第一试剂(试剂B)HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L硫酸葡聚糖钠盐 1.0g/L第二试剂(试剂a)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L过氧化氢酶 20kU/L化学修饰的LPL311 0.2kU/LCOO321 5.0kU/L
实施例31除用实施例25的试剂盒代替实施例1的试剂盒外，用与实施例13相同的测定方法，在日立7170型自动分析装置上，测定人血清30检测样品中的HDL胆甾醇。
实施例32除用实施例26的试剂盒代替实施例1的试剂盒外，用与实施例13相同的测定方法，在日立7170型自动分析装置上，测定人血清30检测样品中的HDL胆甾醇。
实施例33除用实施例27的试剂盒代替实施例1的试剂盒外，用与实施例13相同的测定方法，在日立7170型自动分析装置上，测定人血清30检测样品中的HDL胆甾醇。
实施例34除用实施例28的试剂盒代替实施例1的试剂盒外，用与实施例13相同的测定方法，在日立7170型自动分析装置上，测定人血清30检测样品中的HDL胆甾醇。
实施例35除用实施例29的试剂盒代替实施例1的试剂盒外，用与实施例13相同的测定方法，在日立7170型自动分析装置上，测定人血清30检测样品中的HDL胆甾醇。
实施例36除用实施例30的试剂盒代替实施例1的试剂盒外，用与实施例13相同的测定方法，在日立7170型自动分析装置上，测定人血清30检测样品中的HDL胆甾醇。
对照例4除用对照例3的试剂盒代替实施例1的试剂盒外，用与实施例13相同的测定方法，在日立7170型自动分析装置上，测定人血清30检测样品中的HDL胆甾醇。
将实施例31～36和对照例4分别的测定与用DCM法的测定的相关系数，表示在第2表中。
第2表

由第2表可知，采用含有化合物A的试剂盒进行测定时，即使同时加有化合物B(聚合阴离子)，也未见与DCM测定的相关性。从第2表还得知，采用了化合物A(特别是烷基胺聚氧化乙烯聚氧化丙烯缩合物、聚氧化乙烯苄基烷基季铵盐、聚氧化乙烯酸酰胺，氧化烷基胺或烷基丙烯二胺衍生物)及化合物B(聚合阴离子)的试剂盒，与DCM法进行的测定具有良好的相关性。另外还得知，比较实施例31和实施例14、实施例32和实施例17、实施例33和实施例19、实施例34和实施例21以及实施例36和实施例22，通过采用化合物A和化合物B(聚合阴离子)，提高了与DCM法测定的相关系数。
实施例37制备由以下第一试剂(试剂A)和第二试剂(试剂b1)组成的HDL胆甾醇测定用试剂盒。
第一试剂(试剂A)HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L第二试剂(试剂b1)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L过氧化氢酶 20kU/LBIGCHAP 3.0g/L化学修饰的LPL311 0.2kU/LCOO321 5.0kU/LC16EO30PO20 0.24g/L对照例5制备由以下第一试剂(试剂A)和第二试剂(试剂b)组成的HDL胆甾醇测定用试剂盒。
第一试剂(试剂A)HEPES(pH7.5)10mmol/LEMSE0.3g/L第二试剂(试剂b)HEPES(pH7.0)10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L过氧化氢酶 20kU/LBIGCHAP 3.0g/L化学修饰的LPL3110.2kU/LCOO321 5.0kU/L实施例38除用实施例37的试剂盒代替实施例1的试剂盒外，用与实施例13相同的测定方法，在日立7170型自动分析装置上，测定人血清30检测样品中的HDL胆甾醇。
对照例6除用对照例5的试剂盒代替实施例1的试剂盒外，用与实施例13相同的测定方法，在日立7170型自动分析装置上，测定人血清30检测样品中的HDL胆甾醇。
将对照例6和实施例38各自的测定与上述DCM法进行的测定的相关系数，表示在第3表中。
第3表

由第3表可见，采用含有化合物B(非离子性胆汁酸衍生物)的试剂盒测定时，通过与化合物A并用，可使其与DCM法测定的相关性更好。另外，比较实施例17与实施例38可知，使烷基胺聚氧化乙烯聚氧化丙烯缩合物(化合物A)与非离子性胆汁酸衍生物(化合物B)共存，可使其与DCM法的测定的相关性更好。
实施例39制备由以下第一试剂(试剂A)和第二试剂(试剂c1)组成的HDL胆甾醇测定用试剂盒。
第一试剂(试剂A)HEPES(pH7.5)10mmol/LEMSE0.3g/L第二试剂(试剂c1)HEPES(pH7.0)10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L过氧化氢酶 20kU/L胆酸钠 6.0g/L化学修饰的LPL3110.2kU/L
COO3215.0kU/LC16EO30PO20 0.2g/L对照例7制备由以下第一试剂(试剂A)和第二试剂(试剂c)组成的HDL胆甾醇测定用试剂盒。
第一试剂(试剂A)HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L第二试剂(试剂c)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林0.3g/L过氧化氢酶20kU/L胆酸钠6.0g/L化学修饰的LPL311 0.2kU/LCOO3215.0kU/L实施例40除用实施例39的试剂盒代替实施例1的试剂盒外，用与实施例13相同的测定方法，在日立7170型自动分析装置上，测定人血清30检测样品中的HDL胆甾醇。
对照例8除用对照例7的试剂盒代替实施例1的试剂盒外，用与实施例13相同的测定方法，在日立7170型自动分析装置上，测定人血清30检测样品中的HDL胆甾醇。
将对照例6与实施例40各自的测定，与上述DCM法的测定的相关系数，表是在第4表中。
第4表

由第4表可见，采用含有化合物B(阴离子性胆汁酸衍生物)的试剂盒测定时，通过与化合物A并用，可使其与DCM的相关性更好。另外，比较实施例17与实施例40可知，使烷基胺聚氧化乙烯聚氧化丙烯缩合物(化合物A)与阴离子性胆汁酸衍生物(化合物B)共存，可使其与DCM法测定的相关性更好。
实施例41制备由以下第一试剂(试剂A)和第二试剂(试剂d1)组成的HDL胆甾醇测定用试剂盒。
第一试剂(试剂A)HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L第二试剂(试剂d1)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林0.3g/L过氧化氢酶20kU/LCHAPS 6.0g/L
化学修饰的LPL311 0.2kU/LCOO3215.0kU/LC16EO30PO20 0.2g/L对照例9制备由以下第一试剂(试剂A)和第二试剂(试剂d)组成的HDL胆甾醇测定用试剂盒。
第一试剂(试剂A)HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L第二试剂(试剂d)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林0.3g/L过氧化氢酶20kU/LCHAPS 6.0g/L化学修饰的LPL311 0.2kU/LCOO3215.0kU/L实施例42除用实施例41的试剂盒代替实施例1的试剂盒外，用与实施例13相同的测定方法，在日立7170型自动分析装置上，测定人血清30检测样品中的HDL胆甾醇。
对照例10除用对照例9的试剂盒代替实施例1的试剂盒外，用与实施例13相同的测定方法，在日立7170型自动分析装置上，测定人血清30检测样品中的HDL胆甾醇。
将对照例10与实施例42各自的测定，与利用上述DCM法测定的褶关系数，表示在表5中。
第5表

由第5表可见，采用含有化合物B(两性胆汁酸衍生物)的试剂盒测定时，通过与化合物A并用，可使其与DCM法的相关性更好。另外，比较实施例17与实施例42可知，使烷基胺聚氧化乙烯聚氧化丙烯缩合物(化合物A)与两性胆汁酸衍生物(化合物B)共存，可使其与DCM法进行的测定的相关性更好。
实施例43制备由以下第一试剂(试剂B)和第二试剂(试剂c1)组成的HDL胆甾醇测定用试剂盒。
第一试剂(试剂B)HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L硫酸葡聚糖钠盐 1.0g/L第二试剂(试剂c1)HEPES(pH7.0) 10mmol/L
4-氨基安替比林0.3g/L过氧化氢酶20kU/L胆酸钠6.0g/L化学修饰的LPL311 0.2kU/LCOO3215.0kU/LC16EO30PO20 0.2g/L实施例44制备由以下第一试剂(试剂B)和第二试剂(试剂c2)组成的HDL胆甾醇测定用试剂盒。
第一试剂(试剂B)HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L硫酸葡聚糖钠盐1.0g/L第二试剂(试剂c2)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林0.3g/L过氧化氢酶20kU/L胆酸钠6.0g/L化学修饰的LPL311 0.2kU/LCOO3215.0kU/Lビスノ一ルSK 0.3g/L对照例11制备由以下第一试剂(试剂B)和第二试剂(试剂c)组成的HDL胆甾醇测定用试剂盒。
第一试剂(试剂B)HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L
硫酸葡聚糖钠盐 1.0g/L第二试剂(试剂c)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L过氧化氢酶 20kU/L胆酸钠 6.0g/L化学修饰的LPL311 0.2kU/LCOO321 5.0kU/L实施例45除用实施例43的试剂盒代替实施例1的试剂盒外，用与实施例13相同的测定方法，在日立7170型自动分析装置上，测定人血清30检测样品中的HDL胆甾醇。
实施例46除用实施例44的试剂盒代替实施例1的试剂盒外，用与实施例13相同的测定方法，在日立7170型自动分析装置上，测定人血清30检测样品中的HDL胆甾醇。
对照例12除用对照例11的试剂盒代替实施例1的试剂盒外，用与实施例13相同的测定方法，在日立7170型自动分析装置上，测定人血清30检测样品中的HDL胆甾醇。
将对照例12与实施例45和实施例46各自的测定与上述DCM法进行的测定的相关系数，表示在第6表中。
第6表

由第6表可见，采用含有聚合阴离子和阴离子性胆汁酸衍生物(均为化合物B)的试剂盒测定时，通过与化合物A并用，可使其与DCM法的测定的相关性更好。另外，比较实施例17与实施例45，以及实施例19与实施例46可知，使烷基胺聚氧化乙烯聚氧化丙烯缩合物(化合物A)与聚合阴离子和阴离子性胆汁酸衍生物(2个化合物B)共存，或者使聚氧化乙烯苄基烷基季铵盐(化合物A)与聚合阴离子和阴离子性胆汁酸衍生物(2个化合物B)共存，可使其与DCM法进行测定的相关性更好。
实施例47制备由以下第一试剂(试剂C)和第二试剂(试剂c1)组成的HDL胆甾醇测定用试剂盒。
第一试剂(试剂C)HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L
硫酸葡聚糖钠盐 1.0g/LBSA1.0g/L第二试剂(试剂c1)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L过氧化氢酶 20kU/L胆酸钠 6.0g/L化学修饰的LPL311 0.2kU/LCOO321 5.0kU/LC16EO30PO200.2g/L对照例13制备由以下第一试剂(试剂C)和第二试剂(试剂c)组成的HDL胆甾醇测定用试剂盒。
第一试剂(试剂C)HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L硫酸葡聚糖钠盐 1.0g/LBSA1.0g/L第二试剂(试剂c)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L过氧化氢酶 20kU/L胆酸钠 6.0g/L化学修饰的LPL311 0.2kU/LCOO321 5.0kU/L实施例48除用实施例47的试剂盒代替实施例1的试剂盒外，用与实施例13相同的测定方法，在日立7170型自动分析装置上，测定人血清30检测样品中的HDL胆甾醇。
对照例14除用对照例13的试剂盒代替实施例1的试剂盒外，用与实施例13相同的测定方法，在日立7170型自动分析装置上，测定人血清30检测样品中的HDL胆甾醇。
将对照例14与实施例48各自的测定与上述DCM法进行测定的相关系数，表示在第7表中。
第7表

由第7表可见，采用含有聚合阴离子和阴离子性胆汁酸衍生物，以及白蛋白(都是化合物B)的试剂盒测定时，通过与化合物A(烷基胺聚氧化乙烯聚氧化丙烯缩合物)并用，可使其与DCM法的相关性更好。另外，比较实施例17与实施例48可知，使烷基胺聚氧化乙烯聚氧化丙烯缩合物(化合物A)与聚合阴离子和阴离子性胆汁酸衍生物(2个化合物B)、白蛋白共存，可使其与DCM法进行的测定的相关性更好。
实施例49
制备由以下第一试剂(试剂A)和第二试剂(试剂e1)组成的HDL胆甾醇测定用试剂盒。
第一试剂(试剂A)HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L第二试剂(试剂e1)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L过氧化氢酶 20kU/LアデカプルロニツクTR704 5.0g/L化学修饰的LPL311 0.2kU/LCOO321 5.0kU/LBLAUNONSAP3010 0.5g/L实施例50制备由以下第一试剂(试剂A)和第二试剂(试剂e2)组成的HDL胆甾醇测定用试剂盒。
第一试剂(试剂A)HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L第二试剂(试剂e2)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L过氧化氢酶 20kU/LアデカプルロニツクTR704 5.0g/L化学修饰的LPL311 0.2kU/LCOO321 5.0kU/Lミグノ-ルPA-30 0.5g/L
实施例51制备由以下第一试剂(试剂A)和第二试剂(试剂e3)组成的HDL胆甾醇测定用试剂盒。
第一试剂(试剂A)HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L第二试剂(试剂e3)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林0.3g/L过氧化氢酶20kU/LアデカプルロニツクTR704 5.0g/L化学修饰的LPL311 0.2kU/LCOO3215.0kU/Lユニセ-フA-LY 0.5g/L对照例15制备由以下第一试剂(试剂A)和第二试剂(试剂e)组成的HDL胆甾醇测定用试剂盒。
第一试剂(试剂A)HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L第二试剂(试剂e)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林0.3g/L过氧化氢酶20kU/LアデカプルロニツクTR704 5.0g/L化学修饰的LPL311 0.2kU/L
COO321 5.0kU/L实施例52除用实施例49的试剂盒代替实施例1的试剂盒外，用与实施例13相同的测定方法，在日立7170型自动分析装置上，测定人血清30检测样品中的HDL胆甾醇。
实施例53除用实施例50的试剂盒代替实施例1的试剂盒外，用与实施例13相同的测定方法，在日立7170型自动分析装置上，测定人血清30检测样品中的HDL胆甾醇。
实施例54除用实施例51的试剂盒代替实施例1的试剂盒外，用与实施例13相同的测定方法，在日立7170型自动分析装置上，测定人血清30检测样品中的HDL胆甾醇。
对照例16除用对照例15的试剂盒代替实施例1的试剂盒外，用与实施例13相同的测定方法，在日立7170型自动分析装置上，测定人血清30检测样品中的HDL胆甾醇。
将对照例16、实施例52、实施例53和实施例54各自的测定，与上述DCM法进行的测定的相关系数，表示在第8表。
第8表

由第8表可见，采用含有乙二胺四聚氧化烯烃(化合物B)的试剂盒测定时，通过与化合物A(烷基胺聚氧化乙烯聚氧化丙烯缩合物、聚氧化乙烯烷基胺硫酸盐或氧化烷基胺)并用，可使其与DCM法的相关性更好。另外，根据比较实施例14与实施例52可知，使乙二胺四聚氧化烯烃与烷基胺聚氧化乙烯聚氧化丙烯缩合物(化合物A)共存，可使其与DCM法进行的测定的相关系数更好。根据比较实施例20与实施例53可知，乙二胺四聚氧化烯烃(化合物B)与聚氧化乙烯烷基胺硫酸盐(化合物A)共存，与DCM法进行的测定的相关系数得到提高。另外，根据比较实施例53实施例54可知，用氧化烷基胺(化合物A)代替聚氧化乙烯烷基胺硫酸盐，通过使乙二胺四聚氧化烯烃(化合物B)共存，使其与DCM法进行的测定的相关性更好。
第9表

由第9表可见，采用含有聚合阴离子和乙二胺四聚氧化烯烃(均为化合物B)的试剂盒测定时，通过与化合物A(烷基胺聚氧化乙烯聚氧化丙烯缩合物、聚氧化乙烯烷基胺硫酸盐、氧化烷基胺、聚氧化乙烯苄基烷基季铵盐或聚氧化乙烯酸酰胺)并用，使其与DCM法的相关性更好。另外，根据比较实施例14与实施例60可知，使聚合阴离子及乙二胺四聚氧化烯烃2个化合物B)与烷基胺聚氧化乙烯聚氧化丙烯缩合物(化合物A)共存，使其与DCM法进行的测定的相关性更好。根据比较实施例20与实施例61可知，使聚合阴离子及乙二胺四聚氧化烯烃(2个化合物B)与聚氧化乙烯烷基胺硫酸盐(化合物A)共存，使其与DCM法进行的测定的相关性更好。根据比较实施例61和实施例62可知，即使是用氧化烷基胺代替化合物A聚氧化乙烯烷基胺硫酸盐，也使其与DCM法进行的测定的相关性更好。
再根据比较实施例19和实施例63可知，用聚合阴离子和乙二胺四聚氧化烯烃(2个化合物B)与聚氧化乙烯苄基烷基季铵盐(化合物A)共存，使其与DCM法进行的测定的相关性更好。另外，根据比较实施例63和实施例64可知，用聚氧化乙烯酸酰胺代替化合物A聚氧化乙烯苄基烷基季铵盐时，也其使与DCM法进行的测定的相关性更好。
实施例65制备由以下第一试剂(试剂D)和第二试剂(试剂f1)组成的HDL胆甾醇测定用试剂盒。
第一试剂(试剂D)HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L硫酸钠5.0/L硫酸葡聚糖钠盐1.0/L
BSA 2.0/L第二试剂(试剂f1)HEPES(pH7.0)10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L过氧化氢酶 20kU/Lナイミ-ンL207 0.3g/L胆酸钠 1.5g/L化学修饰的LPL3110.1kU/LCOO321 5.0kU/LBLAUNON SAP3004 0.15g/L实施例66制备由以下第一试剂(试剂D)和第二试剂(试剂f2)组成的HDL胆甾醇测定用试剂盒。
第一试剂(试剂D)HEPES(pH7.5)10mmol/LEMSE0.3g/L硫酸钠 5.0/L硫酸葡聚糖钠盐 1.0/LBSA 2.0/L第二试剂(试剂f2)HEPES(pH7.0)10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L过氧化氢酶 20kU/Lナイミ-ンL207 0.3g/L胆酸钠 1.5g/L化学修饰的LPL3110.1kU/LCOO321 5.0kU/LC16EO30PO10 0.3g/L
对照例19制备由以下第一试剂(试剂D)和第二试剂(试剂f)组成的HDL胆甾醇测定用试剂盒。
第一试剂(试剂D)HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L硫酸钠5.0/L硫酸葡聚糖钠盐1.0/LBSA 2.0/L第二试剂(试剂f)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林0.3g/L过氧化氢酶20kU/Lナイミ-ンL207 0.3g/L胆酸钠1.5g/L化学修饰的LPL311 0.1kU/LCOO3215.0kU/L实施例67除用实施例65的试剂盒代替实施例1的试剂盒外，用与实施例13相同的测定方法，在日立7170型自动分析装置上，测定人血清30检测样品中的HDL胆甾醇。
实施例68除用实施例66的试剂盒代替实施例1的试剂盒外，用与实施例13相同的测定方法，在日立7170型自动分析装置上，测定人血清30检测样品中的HDL胆甾醇。
对照例20除用对照例19的试剂盒代替实施例1的试剂盒外，用与实施例13相同的测定方法，在日立7170型自动分析装置上，测定人血清30检测样品中的HDL胆甾醇。
将对照例20、实施例67和68各自的测定，与上述DCM法进行的测定的相关系数，表示在第10表中。
第10表

由第10表可见，采用含有聚合阴离子、聚氧化乙烯烷基胺和胆汁酸衍生物(均为化合物B)以及白蛋白的试剂盒测定时，通过使其与化合物A(烷基胺聚氧化乙烯聚氧化丙烯缩合物)共存，使其与DCM法的相关性更好。
实施例69制备由以下第一试剂(试剂D)和第二试剂(试剂g1)组成的HDL胆甾醇测定用试剂盒。
第一试剂(试剂D)HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L硫酸钠5.0g/L硫酸葡聚糖钠盐1.0g/LBSA 2.0g/L第二试剂(试剂g1)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林0.3g/L过氧化氢酶20kU/Lナイミ-ンL207 0.3g/L乙二胺PO52EO601.0g/L化学修饰的LPL311 0.1kU/LCOO3215.0kU/LBLAUNON SAP3004 0.05g/L实施例70制备由以下第一试剂(试剂D)和第二试剂(试剂g2)组成的HDL胆甾醇测定用试剂盒。
第一试剂(试剂D)HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L硫酸钠5.0g/L硫酸葡聚糖钠盐1.0g/LBSA 2.0g/L第二试剂(试剂g2)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林0.3g/L
过氧化氢酶 20kU/Lナイミ-ンL2070.3g/L乙二胺PO52EO60 1.0g/L化学修饰的LPL311 0.1kU/LCOO321 5.0kU/LC16EO30PO10 0.2g/L实施例71制备由以下第一试剂(试剂D)和第二试剂(试剂g3)组成的HDL胆甾醇测定用试剂盒。
第一试剂(试剂D)HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L硫酸钠 5.0g/L硫酸葡聚糖钠盐 1.0g/LBSA 2.0g/L第二试剂(试剂g3)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L过氧化氢酶 20kU/Lナイミ-ンL2070.3g/L乙二胺PO52EO60 1.0g/L化学修饰的LPL311 0.1kU/LCOO321 5.0kU/LナイミツドMT-215 0.06g/L实施例72制备由以下第一试剂(试剂D)和第二试剂(试剂g4)组成的HDL胆甾醇测定用试剂盒。
第一试剂(试剂D)HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L硫酸钠5.0g/L硫酸葡聚糖钠盐1.0g/LBSA 2.0g/L第二试剂(试剂g4)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林0.3g/L过氧化氢酶20kU/Lナイミ-ンL207 0.3g/L乙二胺PO52EO601.0g/L化学修饰的LPL311 0.1kU/LCOO3215.0kU/Lビスノ-ルSK 0.1g/L对照例21制备由以下第一试剂(试剂D)和第二试剂(试剂g)组成的HDL胆甾醇测定用试剂盒。
第一试剂(试剂D)HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L硫酸钠5.0g/L硫酸葡聚糖钠盐1.0g/LBSA 2.0g/L第二试剂(试剂g)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林0.3g/L
过氧化氢酶 20kU/Lナイミ-ンL2070.3g/L乙二胺PO52EO60 1.0g/L化学修饰的LPL311 0.1kU/LCOO321 5.0kU/L实施例73除用实施例69的试剂盒代替实施例1的试剂盒外，用与实施例13相同的测定方法，在日立7170型自动分析装置上，测定人血清30检测样品中的HDL胆甾醇。
实施例74除用实施例70的试剂盒代替实施例1的试剂盒外，用与实施例13相同的测定方法，在日立7170型自动分析装置上，测定人血清30检测样品中的HDL胆甾醇。
实施例75除用实施例71的试剂盒代替实施例1的试剂盒外，用与实施例13相同的测定方法，在日立7170型自动分析装置上，测定人血清30检测样品中的HDL胆甾醇。
实施例76除用实施例72的试剂盒代替实施例1的试剂盒外，用与实施例13相同的测定方法，在日立7170型自动分析装置上，测定人血清30检测样品中的HDL胆甾醇。
对照例22除用对照例21的试剂盒代替实施例1的试剂盒外，用与实施例13相同的测定方法，在日立7170型自动分析装置上，测定人血清30检测样品中的HDL胆甾醇。
将对照例22与实施例73～76各自的测定，与上述DCM法进行的测定的相关系数，表示在第11表中。
第11表

由第11表可见，采用含有聚合阴离子、聚氧化乙烯烷基胺和胆汁酸衍生物(均为化合物B)以及白蛋白的试剂盒测定时，通过与化合物A(烷基胺聚氧化乙烯聚氧化丙烯缩合物、聚氧化乙烯苄基烷基季铵盐或聚氧化乙烯酸酰胺)共存，使其与DCM法的相关性更好。
工业实用性根据本发明，提供了对诊断动脉硬化等疾病有用的简便而准确的HDL胆甾醇测定方法、测定试剂及测定用试剂盒。
权利要求
1.一种测定检测样品内高密度脂蛋白中胆甾醇的方法，其中，包含使检测样品与(i)胆甾醇酯水解酶和胆甾醇氧化酶，或(ii)胆甾醇酯水解酶、氧化型辅酶及胆甾醇脱氢酶，在含有选自烷基胺聚氧化乙烯聚氧化丙烯缩合物、聚氧化乙烯烷基胺硫酸盐、聚氧化乙烯苄基烷基季铵盐、聚氧化乙烯酸酰胺、氧化烷基胺和烷基丙烯二胺衍生物构成的族中的至少的一种物质的水溶性介质中，进行反应生成过氧化氢或还原型辅酶；以及测定所生成的过氧化氢或还原型辅酶。
2.权利要求1所述的方法，其中，水溶性介质还包含选自聚合阴离子、胆汁酸衍生物、乙二胺四聚氧化烯烃、聚氧化乙烯烷基胺和聚氧化乙烯链烯基胺构成的族中的至少一种物质。
3.权利要求2所述的方法，其中，聚合阴离子是硫酸葡聚糖或其盐。
4.权利要求2或3所述的方法，其中，胆汁酸衍生物是选自胆酸或其盐、牛磺胆酸或其盐、甘氨胆酸或其盐、石胆酸或其盐、脱氧胆酸或其盐、鹅脱氧胆酸或其盐、熊脱氧胆酸或其盐、7-氧代石胆酸或其盐、12-氧代石胆酸或其盐、12-氧代鹅脱氧胆酸或其盐、7-氧代脱氧胆酸或其盐、猪胆酸或其盐、猪脱氧胆酸或其盐、脱氢胆酸或其盐、通式(I)[化11]R1-CH2-CH(R2)-CH2-SO3-(I)[此通式中，R1表示3-(3-胆丙酰胺基)二甲氨基，R2表示氢原子或羟基]表示的化合物和通式(II)[化12] [X表示氢原子或羟基，R3和R4可以相同或相异，表示取代或未取代的烷基，或取代或未取代的烷酰基]表示的化合物构成的族中的至少一种物质。
5.权利要求2～4任一项所述的方法，其中，水性介质还包括白蛋白。
6.测定高密度脂蛋白中胆甾醇的试剂，其特征在于，含有选自烷基胺聚氧化乙烯聚氧化丙烯缩合物、聚氧化乙烯烷基胺硫酸盐、聚氧化乙烯苄基烷基季铵盐、聚氧化乙烯酸酰胺、氧化烷基胺和烷基丙烯二胺衍生物构成的族中的至少一种物质，胆甾醇酯水解酶，胆甾醇氧化酶及过氧化氢测定用试剂。
7.测定高密度脂蛋白中胆甾醇的试剂，其特征在于，含有选自烷基胺聚氧化乙烯聚氧化丙烯缩合物、聚氧化乙烯烷基胺硫酸盐、聚氧化乙烯苄基烷基季铵盐、聚氧化乙烯酸酰胺、氧化烷基胺和烷基聚氧化丙烯二胺衍生物构成的族中的至少一种物质，胆甾醇酯水解酶，胆甾醇脱氢酶及氧化型辅酶。
8.权利要求7所述的试剂，其中，还含有测定还原型辅酶的试剂。
9.权利要求6～8任一项所述的试剂，其中，还含有选自聚合阴离子、胆汁酸衍生物、乙二胺四聚氧化烯烃、聚氧化乙烯烷基胺和聚氧化乙烯链烯基胺构成的族中的至少一种物质。
10.权利要求9所述的试剂，其中，聚合阴离子是硫酸葡聚糖或其盐。
11.权利要求9或10所述的试剂，其中，胆汁酸衍生物是选自胆酸或其盐、牛磺胆酸或其盐、甘氨胆酸或其盐、石胆酸或其盐、脱氧胆酸或其盐、鹅脱氧胆酸或其盐、熊脱氧胆酸或其盐、7-氧代石胆酸或其盐、12-氧代石胆酸或其盐、12-氧代鹅脱氧胆酸或其盐、7-氧代脱氧胆酸或其盐、猪胆酸或其盐、猪脱氧胆酸或其盐、脱氢胆酸或其盐、通式(I)[化13]R1-CH2-CH(R2)-CH2-SO3-(I)[此通式中，R1表示3-(3-胆丙酰胺基)二甲氨基，R2表示氢原子或羟基]表示的化合物和通式(II)[化14] [X表示氢原子或羟基，R3和R4可以相同或相异，表示取代或未取代的烷基，或取代或未取代的烷酰基]表示的化合物构成的族中的至少的一种物质。
12.权利要求9～11任一项所述的试剂，其中，还含有白蛋白。
13.测定高密度脂蛋白中胆甾醇的试剂盒，其特征在于，含有第一试剂及第二试剂，在第一试剂及第二试剂中含有测定过氧化氢的试剂，在第二试剂中含有胆甾醇氧化酶，在第一试剂和第二试剂二者中或其中之一中含有选自烷基胺聚氧化乙烯聚氧化丙烯缩合物、聚氧化乙烯烷基胺硫酸盐、聚氧化乙烯苄基烷基季铵盐、聚氧化乙烯酸酰胺、氧化烷基胺和烷基聚氧丙烯二胺衍生物构成的族中的至少一种物质以及胆甾醇酯水解酶。
14.测定高密度脂蛋白中胆甾醇的试剂盒，其特征在于，含有第一试剂及第二试剂，在第一试剂中含有氧化型辅酶，在第二试剂中含有胆甾醇脱氢酶，在第一试剂和第二试剂二者中或其中之一中含有选自烷基胺聚氧化乙烯聚氧化丙烯缩合物、聚氧化乙烯烷基胺硫酸盐、聚氧化乙烯苄基烷基季铵盐、聚氧化乙烯酸酰胺氧化烷基胺和烷基氧化丙烯二胺衍生物构成的族中的至少一种物质，以及胆甾醇酯水解酶。
15.权利要求14所述的试剂盒，其中，在第一试剂和第二试剂二者中或其中之一中还含有还原型辅酶测定用试剂。
16.权利要求13～15任一项所述的试剂盒，其中，在第一试剂、第二试剂二者中或其中之一中还含有选自聚合阴离子、胆汁酸衍生物、乙二胺四聚氧化烯烃、聚氧化乙烯烷基胺和聚氧化乙烯链烯基胺构成的族中的至少一种物质。
17.权利要求16所述的试剂盒，其中，聚合阴离子是硫酸葡聚糖或其盐。
18.权利要求16或17所述的试剂盒，其中，胆汁酸衍生物是选自胆酸或其盐、牛磺胆酸或其盐、甘氨胆酸或其盐、石胆酸或其盐、脱氧胆酸或其盐、鹅脱氧胆酸或其盐、熊脱氧胆酸或其盐、7-氧代石胆酸或其盐、12-氧代石胆酸或其盐、12-氧代鹅脱氧胆酸或其盐、7-氧代脱氧胆酸或其盐、猪胆酸或其盐、猪脱氧胆酸或其盐、脱氢胆酸或其盐、通式(I)[化15]R1-CH2-CH(R2)-CH2-SO3-(I)[R1表示3-(3-胆丙酰胺基)二甲氨基，R2表示氢原子或羟基]表示的化合物和通式(II)[化16] [X表示氢原子或羟基，R3和R4可以相同或相异，表示取代或未取代的烷基，或取代或未取代的烷酰基]表示的化合物构成的族中的至少一种物质。
19.权利要求16～18任一项所述的试剂盒，其中，在第一试剂和第二试剂二者中或其中之一中还含有白蛋白。
全文摘要
一种测定检测样品内高密度脂蛋白中胆甾醇的方法，该方法包含使检测样品与(i)胆甾醇酯水解酶和胆甾醇氧化酶，或(ii)胆甾醇酯水解酶、氧化型辅酶及胆甾醇脱氢酶，在含有选自烷基胺聚氧化乙烯聚氧化丙烯缩合物、聚氧化乙烯烷基胺硫酸盐、聚氧化乙烯苄基烷基季铵盐、聚氧化乙烯酸酰胺、氧化烷基胺和烷基丙烯二胺衍生物构成的族中的至少一种物质的水溶性介质中进行反应，生成过氧化氢或还原型辅酶；以及测定所生成的过氧化氢或还原型辅酶。
文档编号C12Q1/44GK1918303SQ20058000499
公开日2007年2月21日 申请日期2005年4月15日 优先权日2004年4月15日
发明者片山有基, 藤中真由美 申请人:协和梅迪克斯株式会社