大环内酯及其生产方法

专利名称：大环内酯及其生产方法
背景技术：
本发明一方面涉及神经保护性和神经再生性组合物及其衍生物和类似物。更具体地说，本发明涉及用于生产神经保护性以及神经再生性组合物的放线菌菌株，包含神经保护性以及神经再生性组合物及其类似物的药物组合物，制备神经保护性以及神经再生性组合物的方法及其使用方法。
亲免蛋白是在不同细胞类型，例如细菌，酵母，和许多不同种类的哺乳动物细胞的免疫系统和神经系统中所发现的蛋白质。亲免蛋白的种类包括亲环蛋白和FK506-结合蛋白(例如，FKBPs)。环孢菌素A是一种结合到亲环蛋白上的大环内酯亲免蛋白配体。其他的大环内酯亲免蛋白配体，比如meridamycin，FK506，以及雷帕霉素被认为是结合到FKBPs上的。描述亲免蛋白的细胞内功能的一种方法是通过鉴别其酶活性。FKBPs的功能，例如可以通过其旋转异购酶活性(即肽基-脯氨酰顺反异构酶活性)来进行描述。
FK506和雷帕霉素是免疫抑制的亲免蛋白配体。相反，meridamycin是非免疫抑制的。Salituro，等，Tetrahedron Letters，Vol.36，No.7，997-1000(1995)。事实上，meridamycin是FK506和雷帕霉素两者的拮抗剂。(WO 94/18207)。
Steiner等(美国专利6,500,843)描述了其他非免疫抑制的亲免蛋白，他们探讨了使用对于FKBP-型亲免蛋白具有亲合力的神经营养性六氢吡啶羧酸衍生化合物作为与亲免蛋白有关的酶活性的抑制剂，并且特别作为肽基-脯氨酰异构酶或旋转异构酶活性的抑制剂以刺激或促进神经元生长或再生。
已经确认meridamycin例如可以用作用于过量macrophilin-结合-免疫抑制剂例如FK506或雷帕霉素的解毒剂，类固醇增效剂，和/或用于由生产MIP(巨噬细胞感染性增效剂)或Mip类因素的有机体所引起的感染或传染性疾病的抗感染剂。(WO94/18207)。另外，meridamycin还可用于治疗炎症性/高增生性皮肤病。(WO94/18207)。
人们期望找到神经营养性化合物，例如神经保护性和/或神经再生性化合物。本领域中存在着提供化合物，以及包含这类化合物的治疗药物的需求。
发明概述一方面，本发明涉及式(I)的化合物或其药学上可接受的盐 本发明可用于制备组合物，其包含药物，还包含一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
另一方面，本发明提供了新颖的放线菌菌株LL-C31037以及BD240，其可在能够生产大环内酯及产生的其他化合物的条件下进行培养。放线菌菌株LL-C31037和BD240的发酵例如可用于生产式(I)以及meridamycin(式(II))的新颖的化合物。
另一方面，本发明提供由本发明的新颖的放线菌菌株LL-C31037和BD240培养物中分离经纯化的式(I)和(II)化合物的方法。本发明还提供了包含由本发明新颖的菌株生产的化合物的药物组合物。
另一方面，本发明提供治疗哺乳动物的方法，其包括向所述哺乳动物施用本发明的化合物或组合物，特别用于治疗神经病学障碍。
由下列发明详述中显而易见本发明的其他方面和优点。
附图简述

图1是400mHz时式(I)化合物在CD3OD中的质子核磁共振光谱(NMR)。
发明详述本发明部分涉及大环内酯化合物，包含其的神经保护性以及神经再生性组合物，以及生产所述化合物的放线菌菌株。本发明还涉及在放线菌菌株中生产所述化合物的方法。
更具体地讲，本发明提供式(I)的化合物或其药学上可接受的盐。
术语“药学上可接受的盐类”以及″药学上可接受的盐″是指衍生自有机及无机酸的盐，例如，乙酸、乳酸、柠檬酸、肉桂酸、酒石酸、琥珀酸，富马酸、马来酸、丙二酸、扁桃酸、苹果酸、草酸、丙酸、盐酸，氢溴酸、磷酸、硝酸、硫酸、乙醇酸、丙酮酸、甲磺酸、乙磺酸、甲苯磺酸、水杨酸、安息香酸以及类似的已知可接受的酸。
虽然式(I)和(II)中未体现出立体化学，但式(I)或(II)化合物可能包含一或多个手性中心。“式(I)化合物”或“式(II)化合物”应该理解成包含结构式所涉及的包括其所有立体异构体在内的任何化合物。
式(I)化合物的物理化学特性如下表观分子式C44H73NO12分子量阳离子电喷雾m/z＝830.9(M+Na)+；阴离子电喷雾MSm/z＝807.4(M-H)-；高分辨率傅里叶变换MS m/z＝830.50021(M+Na)+。
紫外吸收光谱λmax纳米(乙腈/水)＝210纳米，末端吸收。
旋光度[α]25D-1.1(c 1.0，甲醇)质子核磁共振光谱(400MHz CD3OD)例如参见图1。
对于神经保护性式(I)化合物的生产来说，本发明不局限于特定的有机体，例如称作LL-C31037和BD240的链霉菌属(Streptomyces)菌种。事实上，其需要并倾向于包括使用所述有机体天然存在的突变体，以及由该有机体通过本领域技术人员所知的各种诱变方法，例如，暴露于氮芥子气、X光照射、紫外照射，N’-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍，或放线菌噬菌体来生产的诱变突变体。也需要且倾向于包括通过本领域技术人员所知的遗传技术，例如，结合作用、转导以及基因工程技术生产的种间和种内遗传重组体。
在一实施方案中，化合物以及生产该化合物的方法涉及通过16SrDNA序列比较分类在链霉菌属中的放线菌菌株的分离物(细胞)。所述放线菌菌株分离物当在琼脂介质上生长时不产生气生菌丝体，产生棕褐色菌丝体，不带可溶色素，所述琼脂介质例如No.172或174(ATCCMedia Handbook，第1版，1984)所述的ATCC琼脂介质。或者，其他合适的介质可通过商业途径购得，例如Sigma(St.Louis，MO)。在另一实施方案中，所述放线菌菌株的分离物产生至少一种式(I)或式(II)化合物。在另一实施方案中，所述放线菌菌株的分离物同时产生式(I)和式(II)化合物。
普通转让的标题为“Non-Immunosuppressive ImmunophilinLigands As Neuroprotective And/Or Neuroregenerative Agents”的美国临时申请，其代理卷号为AM101605/WYNC-0803，2004年3月2日提交的美国专利申请60/569,430提供了涉及式(II)化合物及其用途的其他公开内容。
所述方法优选包括放线菌菌株LL-C31037和BD240在发酵中生长。在另一实施方案中，提供了包括在合适条件下培养放线菌菌株来生产具有式(I)和/或式(II)结构的化合物的方法。
在一实施方案中，本发明提供了放线菌菌株LL-C31037，其依据布达佩斯条约的规定于2004年3月1日保藏在位于1815 NorthUniversity Avenue，Peoria，Illinois 61604的农业研究所培养物保藏中心(Agricultural Research Service Culture Collection)(NRRL)，其指定的NRRL编号为30721。在另一实施方案中，本发明提供了放线菌菌株BD240，其依据布达佩斯条约的规定于2005年1月19日保藏在位于1815 North University Avenue，Peoria，Illinois 61604的农业研究所培养物保藏中心(NRRL)，其指定的NRRL编号为30810。本发明还提供了特征为能够生产式(I)和/或式(II)化合物的本发明新颖菌株的分离物及其衍生物、突变体，重组体以及经修饰形式。在某一实施方案中，所述衍生物、突变体、重组体及其经修饰形式的另一特征在于具有下列一种或多种如下特性不产生气生菌丝体，产生棕褐色的基内菌丝体，不产生可溶色素。
可在烧瓶中实施发酵条件以培养用于生产包括新颖的式(I)和/或式(II)化合物的大环内酯化合物的链霉菌属菌种LL-C31037以及BD240。或者，在类似的条件下在发酵罐中进行更大容量的生产。
用于培养链霉菌属菌种的LL-C31037和BD240以及用于生产所述大环内酯化合物的介质包括，可同化碳源，例如，葡萄糖、蔗糖、甘油、糖蜜，淀粉半乳糖、果糖、玉米淀粉、麦芽提取物及其组合；可同化氮源，例如，氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、硝酸钠、氨基酸、蛋白质水解产物、玉米浆、酪蛋白氨基酸、酵母提取物、胨、胰胨及其组合；以及无机阴离子和阳离子，例如，钾、钠、硫酸根、钙、镁、氯离子；补充微量元素，例如，锌、钴、铁、硼、钼以及铜作为介质其他成分的混杂物。通过使无菌空气流过发酵介质或在发酵介质表面上来对罐或瓶进行通风。用一机械叶轮在罐中提供进一步搅动。如果需要的话可加入例如聚丙二醇的消泡剂。
在生长介质中，采用在控制条件下培养放线菌菌株的发酵条件来生产神经保护性和神经再生性式(I)化合物。
在一实施方案中，发酵生产介质是通过合并如下物质制备的重量百分数为约1％至约2％的葡萄糖；约1％至约3％的大豆源，约0.25％至约1％的酵母，约0.1％的钙源，约5％至约10％、优选6％至8％的麦芽糖糊精，以及任选0至0.5％的脯氨酸。任选地，可包含其他组分。适当地，将所述介质的pH值调至约6.5至7.5，优选约6.8至7。一般地，所述培养物容许在适当的搅动和通风下进行发酵。或者，本领域技术人员可用其他合适的碳源或其他组分代替来制备和/或通过商业途径来购得其他合适的发酵介质。一般地，例如参见Sigma Aldrich(St.Louis，MO)；G.J.Tortora e tal，MicrobiologyAn IntroductionMedia Update(Benjamin Cummings Publishing Co；Oct.1，2001)；Maintaining Cultures for Biotechnology and Industry，编辑J.C.Hunter-Cevera和A.Bet(Academic Press，Jan 25，1996)。
经过约5至10天、更优选约7天发酵以后，通过离心作用使来自培养物的细胞成团粒。在一实施方案中，用合适的溶剂例如乙酸乙酯提取所述细胞。将提取物真空浓缩，并用最小体积的合适溶剂例如甲醇再悬浮。将溶液装入反相二氧化硅柱并用20％-100％溶于水的甲醇进行洗脱。将用60％甲醇至100％甲醇洗脱的级分真空浓缩。使用合适的方法例如色谱法将所述含脯氨酰meridamycin的级分进行分离。
在另一实施方案中，将上层清液与合适的树脂混合，并放置约8至16小时。其后，用合适的溶剂例如甲醇冲洗所述树脂，并收集滤液。向细胞团粒加入乙酸乙酯-甲醇混合物。重复摇动并进行离心，并收集上层清液。合并所述的细胞上层清液以及培养液甲醇滤液并真空浓缩。将粗提取物吸附到二氧化硅上，并使用真空液相色谱(VLC)进行分级分离。用合适的溶剂如溶于二氯甲烷的甲醇来洗脱所述化合物。浓缩该提取物，将其吸附到二氧化硅上并装入快速二氧化硅柱。将所述化合物用合适的溶剂洗脱，浓缩并进一步用柱色谱进行纯化。
可通过常规方法，例如，级分的液相色谱质谱(LCMS)分析来证实粗品或半纯化材料中式(I)化合物的存在。将这些级分集中并进一步用色谱法进行纯化，且任选地如在真空下进行浓缩。
所得到的纯化的化合物不含细胞以及细胞物质、副产品、试剂、及其他为实验室和/或临床目的对所述化合物进行处理和配制所需的外来物质。用于本发明的化合物的纯度优选为按重量计大于80％；更优选按重量计至少90％，更优选按重量计大于95％；还更优选按重量计至少99％。在一实施方案中，本发明提供含有本发明化合物的组合物，不论这类化合物是如何生产的。
虽然不意图限制其治疗用途，还是期望将式(I)化合物用于治疗中枢神经系统病症、神经病学障碍和外周神经系统障碍。影响中枢神经系统的病症包括，但不局限于，癫痫症、中风、大脑局部缺血、脑性麻痹、多发性硬化、阿尔珀氏病(Alper’s disease)、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿舞蹈病、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、带卢伊体(Lewy body)的痴呆、Rhett综合征、神经性疼痛、脊髓创伤、或创伤性脑损伤。
本发明的神经病学障碍包括，但是不局限于，与神经变性有关的各种外周神经病变性和神经病学障碍，其包括，但是不局限于，三叉神经痛、舌咽神经痛、面神经麻痹、重症肌无力、肌营养不良、肌萎缩性侧索硬化、渐进性肌萎缩、渐进性延髓遗传肌萎缩、突出的、破裂的或下垂的椎盘综合征、颈部脊椎强硬症、丛障碍、胸廓出口毁坏综合征、外周神经病例如由如下引起的那些铅、丙烯酰胺类、γ-二酮(glue-sniffer′s神经病)、二硫化碳、氨苯砜、扁虱、卟啉症、Gullain-Barre综合征、痴呆(dimentia)、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病以及亨廷顿舞蹈病。
指示需要进行神经营养性治疗的特殊情形包括，但是不局限于，中枢神经系统障碍、阿尔茨海默氏病、老化、帕金森氏病、亨廷顿舞蹈病、多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化、创伤性脑损伤、脊髓损伤、癫痫症、炎症性障碍、类风湿性关节炎、自身免疫疾病、呼吸窘迫、气肿、牛皮癣、成人呼吸窘迫综合征、中枢神经系统创伤以及中风。
本文所用的术语“受试者”或“患者”，是指哺乳动物，其可能是人或非人动物。
本文所用的术语“用药”、“施用”或“给药”是指将化合物或组合物直接施用给患者，或将在患者体内会形成当量的活性化合物或物质的所述化合物的前药衍生物或类似物施用给患者。
本发明的化合物也可用于预防、治疗或抑制老年性痴呆、带卢伊体的痴呆、轻微认知缺损、阿尔茨海默病、认知衰退、关联的神经变性障碍，还可用于提供神经保护或认知改进。
本文所用的术语“有效量”和“治疗有效量”是指当施用于患者时能有效地至少部分改善患者被认为患有的病症的式(I)化合物数量。
应理解，当针对治疗或抑制特殊疾病状态或障碍用药时，有效剂量可能取决于所用的特定化合物、给药模式、所治疗病症及其严重程度，以及各种与所治疗的个体受试者有关的物理因素而有所改变。所述的剂量可通过任何可用于将本文所述的活性化合物导向受纳者血流的方式给药，包括口服、经植入物给药、非肠道给药(包括静脉内，腹膜内和皮下注射)、直肠给药，鼻腔给药、阴道给药以及透皮给药。
本发明的化合物可以月、周或日或按其他合适的间隔进行有效的给药。例如，可以周为基准进行非肠道给药，剂量为每周约10毫克至约1000毫克，约50毫克至约500毫克，或约100毫克至约250毫克。合适的口服剂量可为大于约0.1毫克/天。优选地，给药量大于约10毫克/天，更具体地大于约50毫克/天，单次给药或分成两次或多次给药。所述口服剂量通常不超过约1000毫克/天，且更具体地不超过约600毫克/天。计划的日剂量预期会随给药途径而变化。
包含本发明活性化合物的口服制剂可包括任何常用的口服剂型，其包括片剂、胶囊剂、口腔剂型、锭剂、糖锭和口服液体、悬浮液或溶液。胶囊剂可包含一种和多种活性化合物与惰性填料和/或稀释剂，例如药学上可接受的淀粉(例如，玉蜀黍、马铃薯或木薯淀粉)、糖、人造甜味剂、粉状纤维素比如结晶或微晶纤维素、面粉、明胶类、树胶等等。有用的片剂制剂可通过常规压缩、湿法成粒或干法成粒方法制备，使用药学上可接受的稀释剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、表面改性剂(包括表面活性剂)、悬浮或稳定剂，包括但不限于，硬脂酸镁、硬脂酸、滑石、月桂基硫酸钠、微晶纤维素、羧甲基纤维素钙、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、藻酸、阿拉伯胶、黄原胶、柠檬酸钠、复合硅酸盐、碳酸钙、甘氨酸、糊精、蔗糖、山梨糖醇、磷酸二钙、硫酸钙、乳糖、高岭土、甘露糖醇、氯化钠、滑石、干淀粉和糖粉。优选的表面改性剂包括非离子和阴离子表面改性剂。表面改性剂的代表实例包括，但是不局限于，泊洛沙姆188、苯扎氯铵、硬脂酸钙、十六醇十八醇混合物、聚西托醇乳化蜡、山梨聚糖酯、胶态二氧化硅、磷酸盐、十二烷基硫酸钠、铝硅酸镁以及三乙醇胺。本文的口服制剂可使用标准延迟或定时释放制剂来改变所述活性化合物的吸收。所述口服制剂还可包括在水中或果汁中施用活性成分，如果需要的话包含合适的增溶剂或乳化剂。
有时可能需要将所述化合物以气雾剂的形式直接施用到气道中。
本发明的化合物还可以通过非肠道或腹膜内给药。可在适当地与例如羟丙基纤维素的表面活性剂混合的水中制备游离碱形式或药学上可接受的盐形式的这些活性化合物的溶液或悬浮液。还可在甘油，液体聚乙二醇及其在油中的混合物中制备悬浮液。在普通的储存和使用条件下，这些制剂包含防腐剂以阻止微生物的生长。
适用于注射的药用形式包括无菌水溶液或悬浮液以及用于临时制备无菌注射溶液或悬浮液的无菌粉末。就一切情况而论，所述形式必须是无菌的且必须具有足够的流动性以便于注射。其在生产和储存的条件下应该是稳定的，且必须防微生物例如细菌和真菌的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，含例如水、乙醇、多元醇(如，丙三醇、丙二醇和液体聚乙二醇)、其合适的混合物，以及植物油。
对于本公开的目的而言，透皮给药理解为包括所有穿过身体表面和包括上皮和粘膜组织在内的身体通道内层的给药方式。可以使用洗液、乳膏、泡沫、贴片、悬浮液、溶液以及栓剂(直肠和阴道栓剂)形式的本发明化合物或其药学上可接受的盐进行该类给药。
可通过使用包含活性化合物和载体的透皮贴片来完成透皮给药，其中所述载体对活性化合物呈惰性，对皮肤无毒，且能够经由皮肤将所述试剂递送至血流中来进行全身吸收。所述载体可为各种形式，例如，乳膏和软膏、糊状物、凝胶以及闭塞装置。乳膏和软膏可以是粘性液体，或者水包油型或油包水型半固体乳状液。由包含活性成分的分散在石油产品(petroleum)或亲水石油产品中的吸附性粉末组成的糊状物也是适合的。许多闭塞装置都可以用来将所述活性成分释放进血流中，例如覆盖包含活性成分且含或不含载体的储器或者包含活性成分的基质的半透膜。其他的闭塞装置在文献中已知。
栓剂制剂可由常规材料(包括可可脂)制成，加入或不加入蜡(以改变栓剂的熔点)，以及甘油。还可使用水溶性的栓剂基底，比如各种分子量的聚乙二醇。
本发明还提供产品，包括包装，其包含配制用于递送的化合物。另一方面，本发明提供成套用具，其例如包括针头、注射器及其他包装用于递送本发明化合物。任选地，这种成套用具可包括关于施用所述药物、稀释剂和/或载体用于本发明化合物固态形式的混合的说明书。
用于本发明化合物制备的试剂可商业购得或通过文献中描述的标准方法制备。
下述实施例中描述了本发明代表性实例的制备。
实施例1 放线菌菌株LL-C31037的发酵条件在生长介质中，采用在控制条件下培养称作LL-C31037的放线菌菌株的发酵条件来生产神经保护性和神经再生性式(I)化合物。
所述放线菌菌株作为培养物LL-C31037供养在培养物保藏中心Wyeth Research，Pearl River，New York 10965。该微生物的存活培养物已经按照布达佩斯的规定保藏于专利培养物保藏中心NorthernRegional Research Laboratory(NRRL)，U.S.Department ofAgriculture，Peoria，IL 61604，并加入其永久保藏。培养物LL-C31037于2004年3月1日保藏，其指定的NRRL登录号为30721。
在琼脂平板，例如，ATCC琼脂介质No.172上培养放线菌菌株LL-C31037不产生气生菌丝体。基内菌丝体为棕褐色且不产生可溶色素。扩增基因分离和直接测序后，对菌株LL-C31037确定16S rDNA序列。所述核苷酸序列与之前研究的链霉菌序列进行比对，使用二相邻-结合树算法(two neighbor-joining tree algorithms)生成系统树。所述16S rDNA序列支持了该菌株在链霉菌属中的分类。
在烧瓶中实施培养链霉菌属菌种LL-C31037来生产式(I)化合物的发酵条件。或者，在类似的条件下在发酵罐中进行更大容量的生产。
A.烧瓶发酵通过合并如下物质制备下述制剂的种子介质1％葡萄糖(高压蒸气灭菌后加入)；2％可溶性淀粉；0.5％酵母提取物；0.5％N-Z胺A型(Sheffield)；0.1％碳酸钙；pH值为7.0。
向25×150毫米的玻璃管中的10毫升种子介质中接种在ATCC琼脂介质#172上培养的二全环的LL-C31037细胞团块。来自琼脂培养物的充足接种物(inoculum)用来提供72小时生长后的不透明种子。在28℃，200rpm下用具有2英寸轨道的陀螺旋转振荡器将初级种子管培养72小时。然后将所述初级种子(7毫升)用于接种含有30毫升种子介质的250毫升锥形烧瓶中。在28℃，200rpm下用陀螺旋转振荡器(2英寸轨道)将二级种子烧瓶培养24小时。
通过合并如下物质制备下述制剂的发酵生产介质1％葡萄糖(高压蒸气灭菌后加入)；6％maltrin M180；1％大豆粉；0.6％酵母提取物；0.1％Gamaco(CaCO3)；pH值为7.0。
向250毫升锥形烧瓶中的50毫升发酵生产介质中接种1毫升二级种子培养物。在26℃，200rpm下用陀螺旋转振荡器(2英寸轨道)将这些生产烧瓶培养7天。
B.发酵罐发酵通过合并如下物质制备下述制剂的种子介质2％的葡萄糖(高压蒸气灭菌后加入)；2％可溶性淀粉；0.3％酵母提取物(Difco)；0.5％小麦水解产物WGE80M(DMV International)；1.5％大豆水解产物SE50MAF(DMV International)；pH值为6.8至7.0。
向4升锥形烧瓶中的1升种子介质中接种1毫升冷冻种子培养物。在30℃，在250rpm下用陀螺旋转振荡器(2英寸轨道)将该种子烧瓶培养72小时。
通过合并如下物质制备下述制剂的发酵生产介质2％葡萄糖(高压蒸气灭菌后加入)；8％maltrin M500；1％nutrisoy(GPC)；0.6％酵母提取物(Difco)；0.1％Gamaco(CaCO3)；0.2％Macol p2000；pH值为6.8至7.0。
向70升发酵罐中的60升发酵生产介质中接种1升种子培养物。在26℃，将所述发酵体系培养5天，350-550rpm搅动，以0.5-0.75volvol-1min-1(VVM)通风。
实施例2 纯化来自LL-C31037的式(I)化合物通过离心作用使来自8升实施例1中制备的培养物LL-C31037的发酵体系的细胞成团粒，并用3×3升乙酸乙酯进行提取。将所述提取物真空浓缩并用最小体积的甲醇再悬浮。将所述溶液装入C18反相二氧化硅(Bondesil C18 40μ)并用20％-100％溶于水的甲醇进行洗脱。将由60％甲醇至100％甲醇洗脱的级分真空浓缩。然后将包含脯氨酰meridamycin的级分用制备HPLC(YMC ODS-A 50×250mm，10u柱，A水B甲醇，梯度20分钟内50％B至80％B，之后保持80％甲醇10分钟，20毫升/分钟)进行层析。通过LCMS分析级分(tR＝22分钟)鉴别了式(I)化合物。将这些级分集中以生成30毫克粗脯氨酰meridamycin，并用制备HPLC(YMC ODS-A 10×250mm，10μA水B乙腈，2毫升/分钟，梯度10分钟内40％B至60％B，保持10分钟，之后在10分钟内至70％B)进一步纯化。将通过LCMS分析发现含有式(I)化合物的级分(tR＝18分钟)集中，并真空浓缩产生纯脯氨酰meridamycin(14.8毫克，1.85毫克/升回收)。
实施例3 放线菌菌株BD240的发酵条件在生长介质中，采用在控制条件下培养称作BD240的放线菌菌株的发酵条件来生产神经保护性和神经再生性式(I)化合物。
所述放线菌菌株作为培养物BD240供养在培养物保藏中心WyethResearch，Pearl River，New York 10965。该微生物的存活培养物已经按照布达佩斯的规定保藏于专利培养物保藏中心Northern RegionalResearch Laboratory(NRRL)，U.S.Department of Agriculture，Peoria，IL 61604，并被加入其永久保藏。培养物BD240于2005年1月19日保藏，其指定的NRRL登录号为30810。
在琼脂平板例如ATCC琼脂介质No.174上培养放线菌菌株BD240不产生气生菌丝体。基内菌丝体为棕褐色且不产生可溶色素。在扩增基因分离和直接测序后，确定菌株BD240的16S rDNA序列。所述核苷酸序列与之前研究的链霉菌序列进行比对，并使用二相邻-结合树算法生成系统树。所述16S rDNA序列支持了该菌株在链霉菌属中的分类。
在烧瓶中实施培养链霉菌属菌种BD240来生产式(I)化合物的发酵条件。或者，在类似的条件下在发酵罐中进行更大容量的生产。
A.烧瓶发酵通过合并如下物质制备下述制剂的种子介质1％的葡萄糖(高压蒸气灭菌后加入)；2％可溶性淀粉；0.3％酵母提取物(Difco)；0.5％小麦水解产物WGE80M(DMV International)；1.5％大豆水解产物SE50MAF(DMV International)；pH值为6.8至7.0。
向25×150毫米玻璃管中的10毫升种子介质中接种0.2毫升BD240冷冻种子培养物。在30℃，200rpm下用具有2英寸轨道的陀螺旋转振荡器将种子管培养48小时。
通过合并如下物质制备下述制剂的发酵生产介质1％葡萄糖(高压蒸气灭菌后加入)；6％maltrin M180；1％大豆粉；0.6％酵母提取物；0.1％Gamaco(CaCO3)；0.4％L-脯氨酸；20.9克/升3-(N-吗啉代)丙磺酸；pH值为7.0。
向250毫升锥形烧瓶中的25毫升发酵生产介质中接种种子培养物(0.5毫升)。在26℃，250rpm下用陀螺旋转振荡器(2英寸轨道)将这些生产烧瓶培养5天。
B.发酵罐发酵通过合并如下物质制备下述制剂的种子介质1％葡萄糖(高压蒸气灭菌后加入)；2％可溶性淀粉；0.3％酵母提取物(Difco)；0.5％小麦水解产物(WGE80M，DMV International)；1.5％大豆水解产物SE50MAF(DMV International)；pH值为6.8至7.0。
向2升锥形烧瓶中的250毫升种子介质中接种冷冻种子培养物(0.5毫升)。在30℃，在200rpm下用陀螺旋转振荡器(2英寸轨道)将该种子烧瓶培养48小时。
通过合并如下物质制备下述制剂的发酵生产介质1％葡萄糖(高压蒸气灭菌后加入)；6％maltrin M180；1％大豆粉；0.6％酵母提取物(Difco)；0.1％Gamaco(CaCO3)；0.4％L-脯氨酸；0.1％MacolP2000；pH值为6.8至7.0。
向10升发酵罐中的8升发酵生产介质中接种250ml种子培养物。将所述发酵体系在26℃下培养7天，以480-650rpm搅动，以1.0volvol-1min-1(VVM)通风。
实施例4 纯化来自BD240的式(I)化合物通过离心作用使来自10升实施例3制备的BD240培养物的细胞成团粒。向上层清液中加入5％于水中的Diaion-HP20树脂，并在室温下搅拌过夜。用甲醇冲洗所述树脂并收集滤液。向细胞团粒加入8020的乙酸乙酯-甲醇。重复摇动并进行离心，并收集上层清液。合并所述的细胞上层清液以及培养液甲醇滤液并真空浓缩。
将粗提取物吸附到二氧化硅(32-63μ，60)上，并通过真空液相色谱(VLC)进行分级分离。用5％溶于二氯甲烷的甲醇洗脱所述化合物。然后将该材料真空浓缩，吸附到二氧化硅(32-63μ，60)上，并装入快速二氧化硅柱(60毫米×250毫米)。用2％溶于二氯甲烷的甲醇洗脱所述化合物。然后将该材料真空浓缩并装入Sephadex LH-20(60×400毫米，甲醇)。最初用300毫升甲醇冲洗柱子，并收集30毫升级分，用LCMS监测。收集并浓缩包含所关心化合物的初期级分。将该半纯化物质通过制备HPLC(YMC ODS-A 50×250毫米10μ柱，A水B甲醇，梯度200分钟内55％B至70％B，30毫升/分钟)进行层析。通过LCMS分析级分鉴别了式(I)化合物。将这些所关心的级分集中，真空浓缩以得到纯的式(I)化合物(tR＝130分钟，138毫克)。
实施例5 纯化来自BD240的式(II)化合物通过离心作用使来自10升BD240培养物的细胞成团粒。向上层清液中加入5％于水中的Diaion-HP20树脂，并在室温下搅拌过夜。用甲醇冲洗所述HP20树脂并收集滤液。向细胞团粒加入80∶20的乙酸乙酯-甲醇。重复摇动并进行离心，并收集上层清液。合并所述的细胞上层清液以及培养液甲醇滤液并真空浓缩。
将粗提取物吸附到二氧化硅(32-63μ，60)上，并通过VLC进行分级分离。用5％溶于二氯甲烷的甲醇洗脱所述化合物。将该物质真空浓缩，吸附到二氧化硅(32-63μ，60)上，并装入快速二氧化硅柱(60毫米×250毫米)。用2％溶于二氯甲烷的甲醇洗脱所述化合物。然后将该物质真空浓缩并装入Sephadex LH-20(60×400毫米，甲醇)。最初用300毫升甲醇冲洗柱子，收集30毫升级分并用LCMS监测。收集并浓缩包含所关心的化合物的初期级分。将该半纯化物质用制备HPLC(YMC ODS-A 50×250毫米10μ柱，A水 B甲醇，梯度200分钟内55％B至70％B，30ml/分钟)进行层析。通过LCMS分析级分辨别了化合物II。将这些所关心的级分集中，真空浓缩以得到纯的化合物II(tR＝150分钟，220毫克)。
可使用类似的方法从放线菌菌株LL-C31037中纯化化合物II。
实施例6 神经元细胞培养中化合物(I)的神经保护性如先前Pong等，J Neurochem.69986-994(1997)所述制备中脑多巴胺能神经元培养物。胚胎期第15天(E15)时收集大鼠胎，并在冰冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中进行解剖。将危及中脑多巴胺能区域的腹侧组织碎片解剖下来。将解剖的组织碎片集中到一起，并转入含有20IU/毫升溶于Earle′s平衡盐溶液(Worthington Biochemical，Freehold，NJ，U.S.A.)的木瓜蛋白酶的酶促离解介质中，并在37℃下培养60分钟。酶促离解之后，将所述木瓜蛋白酶溶液吸出，并用火琢玻璃巴斯德吸管在含有2000IU/毫升脱氧核糖核酸酶和10毫克/毫升卵类粘蛋白的蛋白酶抑制剂的完全介质[等体积的极限必需培养基(MEM)和F-12营养物混合物(Gibco BRL)，补加有0.1毫克/毫升脱铁运铁蛋白和2.5微克/毫升胰岛素]中对所述组织进行机械研磨。
A.高亲合性多巴胺摄取试验为进行多巴胺摄取实验，将完全介质中的单一细胞悬浮液接种在聚-L-鸟氨酸和层粘连蛋白涂布的24孔板上。在实验前，将所述培养物维持7天。用不同浓度的式(I)化合物将培养物预处理(用PBS冲洗并用介质稀释至浓度为1nM至1000nM)24小时，之后将其暴露于10μM神经毒素1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)1小时以评价细胞培养物中式(I)化合物的神经保护性效果。进行1小时培养后，将介质交换三次并加入新鲜化合物再进行48小时。
更具体地讲，暴露于MPP+后，中脑多巴胺能神经元培养物经过48小时的培养后，使用Prochiantz等人，Nature 293570-572(1981)所述的改进方法进行高亲合性3H-多巴胺摄取。将培养物用预热的含有5.6mM葡萄糖和1mM抗坏血酸的磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗。然后在37℃下用50nM3H-多巴胺(31 Ci/mmol，Du Pont-NEN，Wilmington，DE，U.S.A.)将培养物培养15分钟。将所述培养物用缓冲液冲洗两次并用0.5N的氢氧化钠溶菌。将所述溶菌产物转入包含Ultima Gold闪烁混合液的闪烁管中并用液体闪烁计数器测定其放射性。或者，将培养物溶菌产物用缓冲液冲洗两次，室温下用Optiphase Supermix闪烁混合液(Wallac Scintillation Products，Gaithersburg，MD，USA)培养2小时，并用液体闪烁计数器测定其放射性。
表1在MPP+诱导毒性后在培养的多巴胺能神经元中的3H-多巴胺摄取(％未处理对照)处理3H-多巴胺摄取(％未处理对照)未处理对照 100％10μM MPP+40％1nM化合物(I)45％10nM化合物(I) 52％100nM化合物(I) 61％1000nM化合物(I) 72％如表1所示，式(I)化合物，脯氨酰meridamycin，在培养的多巴胺能神经元中具有对抗MPP+诱导的神经毒性的神经保护性，相对于由10ng/毫升神经胶质细胞系衍生神经营养因子(GDNF)提供的最大保护(84％摄取)，其EC50值为110nM。对meridamycin进行类似的试验显示，该试验中脯氨酰meridamycin比meridamycin更有效力。
实施例7 神经元细胞培养中化合物(I)的神经再生性按前述[Pong等人，Exp Neurol.2001 Sep；171(1)84-97(2001)]制备离解的皮层神经元培养物。简要地说，胚胎期第15天时收集大鼠胎，并在冰冷的PBS中进行解剖。将解剖的皮层集中到一起并转入含木瓜蛋白酶的酶促离解介质中。30分钟后，用火琢玻璃巴斯德吸管将所述组织机械研磨。将完全介质中的单一细胞悬浮液接种在涂布有聚-L-鸟氨酸和层粘连蛋白的96孔板上。24小时后，用各种浓度的式(I)化合物处理培养物72小时。然后将所述培养物固定并用神经丝一级抗体和过氧化物酶标记的二级抗体沾染。加入过氧化物酶底物(K-BlueMax)并在比色板读数器上测定其色度变化。
表2培养的皮层神经元中的神经丝含量(相对于未处理对照的成倍增加)处理 神经丝含量(相对于未处理对照的成倍增加)未处理对照1.010nM化合物(I) 1.54100nM化合物(I)2.221μM化合物(I) 2.3410μM化合物(I)2.26如表2所示，在培养的皮层神经元中，向神经元细胞中加入所述化合物增加了神经元的存活，其EC50为21nM。对meridamycin进行类似的试验显示，该试验中脯氨酰meridamycin比meridamycin更有效力。
实施例8 培养的皮层神经元中化合物(I)的神经再生性如前述(Pong等人，如上引用，2001)制备离解的皮层神经元培养物。简要地说，胚胎期第15天(E15)时收集大鼠胎，并在冰冷的PBS中进行解剖。将解剖的皮层集中到一起并转入含木瓜蛋白酶的酶促离解介质中。30分钟后，用火琢玻璃巴斯德吸管将所述组织机械研磨。将完全介质中的单一细胞悬浮液接种在涂布有聚-L-鸟氨酸和层粘连蛋白的96孔板上。24小时后，用各种浓度的式(I)化合物处理培养物72小时。然后将所述培养物固定并用抗微管蛋白一级抗体(TUJ-1)和荧光标记的二级抗体沾染。使用增强轴突突起(Enhanced NeuriteOutgrowth，ENO)算法和Cellomics ArrayScan测定轴突突起并表示为每个细胞的总轴突长度。
表3培养的皮层神经元中的总轴突长度(％高于对照)处理总轴突长度(％高于对照)10nM化合物 30％100nM化合物 51％1mM化合物 120％10mM化合物 178％实施例9培养的背侧根神经节中化合物(I)的神经再生性如前述[A.Wood等，″Stimulation of neurite outgrowth byimmunophilin ligandsquantitative analysis by Cellomics Array scan″Society for Neuroscience(2004)，摘要104.3]制备离解的背侧根神经节培养物。简要地说，将出生后第3-5天的幼小大鼠进行安乐死。将脊柱取出并解剖出单个背侧根神经节(DRG)。将解剖的DRG集中到一起并转入含木瓜蛋白酶的酶促离解介质中。60分钟后，用火琢玻璃巴斯德吸管将所述组织机械研磨。将完全介质中的单一细胞悬浮液接种在涂布有聚-L-鸟氨酸和层粘连蛋白的96孔板上。24小时后，用各种浓度的式(I)化合物处理培养物72小时。然后将所述培养物固定并用抗微管蛋白一级抗体(TUJ-1)和荧光标记的二级抗体沾染。使用增强轴突突起算法和Cellomics ArrayScan测定轴突突起并表示为每个细胞的总轴突长度。
表4培养的背侧根神经节中的总轴突长度(％高于对照)处理 总轴突长度(％高于对照)10nM化合物2％100nM化合物 7％1mM化合物 21％10mM化合物44％当本文所使用的范围涉及物理性能比如分子量或化学性质比如化学式时，意图包括本文所述范围和其具体实施方式
的所有组合和亚组合。本说明书中所引用的所有出版物以及所述保藏物，都并入本文作为参考。已经参照特殊的实施方式描述了本发明，但应理解可以在不背离本发明精神的情况下作出改变。这种改变落入所附权利要求的范围内。
关于保藏的微生物的说明(PCT Rule 13bis)
关于保藏的微生物的说明(PCT Rule 13bis)
权利要求
1.式(I)化合物或其药学上可接受的盐
2.NRRL登录号为30721的放线菌菌株LL-C31037或NRRL登录号为30810的放线菌菌株BD240。
3.权利要求2的菌株的分离物以及其衍生物、突变体、重组体及经修饰形式，其能生产式(I)化合物
4.一种生产大环内酯的方法，包括在允许生产所述大环内酯的条件下培养起源于权利要求2或3的放线菌菌株分离物的放线菌接种物。
5.一种生产化合物的方法，包括在适合生产式(I)化合物的条件下培养来自权利要求2或3的放线菌菌株的分离物。
6.权利要求5的方法，还包括分离基本上纯的形式的所述化合物。
7.权利要求6的方法，还包括通过色谱法分离所述化合物。
8.由权利要求4-7任一项的方法所生产的产品。
9.具有图1所示质子核磁共振光谱的化合物。
10.一种组合物，其包含权利要求1、8或9任一项的化合物以及一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
11.一种治疗哺乳动物的方法，包括向所述哺乳动物施用权利要求10的组合物或权利要求1、8或9任一项的化合物。
12.一种治疗神经病学障碍的方法，包括向哺乳动物施用有效量的权利要求2的组合物或权利要求1、8或9任一项的化合物。
13.权利要求12的方法，其中神经病学障碍为癫痫症、中风、大脑局部缺血、脑性麻痹、阿尔珀氏病、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿舞蹈病、多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化、带卢伊体的痴呆、Rhett综合征、神经性疼痛、脊髓创伤、或创伤性脑损伤。
14.根据权利要求12的方法，其中神经病学障碍为老年性痴呆，带卢伊体的痴呆，轻微认知缺损，阿尔茨海默氏病，或认知衰退。
15.权利要求1、8或9任一项的化合物，其用作药物。
16.权利要求1、8或9任一项的化合物，其用于治疗神经病学障碍。
17.权利要求1、8或9任一项的化合物在制备用于治疗神经病学障碍的药物中的应用。
18.权利要求17的应用，其中神经病学障碍为癫痫症、中风、大脑局部缺血、脑性麻痹、阿尔珀氏病、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿舞蹈病、多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化、带卢伊体的痴呆、Rhett综合征、神经性疼痛、脊髓创伤、或创伤性脑损伤。
19.权利要求17的应用，其中神经病学障碍为老年性痴呆，带卢伊体的痴呆，轻微认知缺损，阿尔茨海默氏病，或认知衰退。
全文摘要
本发明部分涉及大环内酯化合物，生产其的放线菌菌株，以及包含它们的药物组合物。
文档编号C12N1/20GK1934117SQ200580007029
公开日2007年3月21日 申请日期2005年2月25日 优先权日2004年3月2日
发明者M·H·Y·萨默斯, E·I·格拉齐阿尼, M·M·赖顿, K·庞, R·A·凯勒, D·P·拉贝达 申请人:惠氏公司