专利名称：纳米粒子成像系统和方法
技术领域：
本发明涉及金属纳米粒子的检测。更特别地，本发明提供用于检测金胶体粒子和准确地向操作者汇报的方法和装置。
背景技术：
随着科学家揭开疾病的基因基础并利用该新信息来改善医学诊断和治疗，序列选择性的DNA检测已经变得日益重要。对低聚核苷酸改性的基片的DNA杂交测试通常被用来检测溶液中特定DNA序列的存在情况。用于探测基因信息的组合DNA阵列的发展前景显示了这些异类序列检验(assay)对未来科学的重要性。
一般，样品被放置在帮助进行杂交测试的基片材料(substrate material)上或放置于其中。这些材料可以是玻璃或聚合物的显微镜载片或者玻璃或聚合物的微量滴定片。在大多数检验中，荧光团标记的目标与表面结合探针(surface bound probe)的杂交通过荧光显微镜或密度分析法(densitometry)来监视。但是，荧光检测受到实验设备费用和来自大多数常用基片的背景发光的限制。另外，相对于个别碱基不匹配情况，被标记的低聚核苷酸目标对于完全互补的探针的选择性可能是比较差的，这限制了表面杂交测试在检测单核苷酸多态性中的使用。一种提高了荧光法的简单性、灵敏度和选择性的检测机制可以帮助充分实现组合序列分析的潜力。
采用探针的芯片基DNA检测法(chip based DNA detection method)就是这样一种技术。探针可以使用与特定目标互补的合成DNA链(strand)。附着到该合成DNA链上的是信号机构(signal mechanism)。如果出现信号(即出现该信号机构)，则合成链已经结合到样品中的DNA上，从而可以断定目标DNA存在于样品中。类似地，不出现信号结果(即没有出现信号机构)表明在样品中不存在目标DNA。因此，需要一个系统来可靠地检测所述信号并准确汇报检测结果。
信号机构的一个例子是具有较小直径(10到40nm)、经低聚核苷酸改性的金纳米粒子探针，用于以三组分夹层检验形式(three component sandwichassay format)指示是否有特定DNA序列被杂交在基片上。参见题为“Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefore”的美国专利No.6361944，其全部内容通过引用结合于此；同时，参见T.A.Taton、C.A.Mirkin以及R.L.Letsinger于2000年发表于Science第289期1757页的文章。由于纳米粒子与阵列表面的独特明显的离解(dissociation)(或“融化(melting)”)，这些杂交的纳米粒子探针相对于不匹配的DNA序列对互补DNA序列的选择性固有地高于荧光团标记的探针。另外，通过金促进的银(I)的还原来放大阵列结合的(array bound)纳米粒子，允许阵列通过平台扫描仪进行黑白成像，其灵敏度高于对荧光标记的基因芯片进行共焦荧光成像通常可观察到的灵敏度。扫描度量(scanometric)法被成功地应用到DNA不匹配识别中。
但是，目前的系统和方法在复杂性、可靠地检测信号以及准确汇报结果方面还存在一些不足。现有技术的系统经常包括大的光学组件。例如，普通成像系统会具有距离物平面(样品所在位置)超过2英尺的照相机。照相机与物平面之间的这一大的距离会导致成像装置很庞大。不幸的是，大的成像系统会在实验室的有限空间中占据很大一部分。为了满足大小紧凑的要求，其它现有技术的成像装置减小了照相机与物平面之间的距离。尽管这减小了系统的大小，但是照相机与物平面之间的小距离会导致所获得的图像畸变很大，在透镜的中心处畸变较小而在所获得的图像的外侧部分附近则发生很大的畸变。为了避免严重的畸变以及提高所获得图像的分辨率，移动照相机(或移动基片)，使得照相机透镜的中心处于基片的不同部分。在基片的这些不同部分获得图像，之后剪裁图像发生畸变的图像外侧区域。为了重构基片的完整图像，经剪裁的图像被拼接在一起以形成整个基片的一个合成图像。例如，基片可以分为100个不同的区，通过移动照相机或基片使得透镜的中心居于这100个不同区的每一个的中央来拍摄100幅图像。然后，剪裁100幅图像中的每一幅以仅保留特定区的图像。之后，通过将100幅图像中的每一个贴在一起来重构整个图像，从而形成整个基片的一个合成图像。此类现有技术系统操作和设计上非常复杂。需要马达来移动照相机或基片，增加了成本和复杂度。此外，由于基片或者照相机是移动的，所以系统容易产生对准问题。最后，由于拍摄一系列图像，所以获得一幅合成图像需要若干分钟。
此外，成像系统需要与个人计算机结合的成像模块。个人计算机包括具有处理器、存储器和监视器等的标准桌面个人计算机设备。成像模块包括照相机、基片座、控制器和存储器。个人计算机发送控制指令给成像模块的控制器并接收图像以进行处理。不幸的是，此分布式系统由于个人计算机的额外成本而较为昂贵，且由于个人计算机需要独立的空间而变得较大。
此外，在获得基片图像之后，在识别基片上的位点(spot)或阱(well)方面存在一些困难。“阱”是用于标识基片上或基片中一个独立测试或实验的术语。每个阱可包含不同样品或相同样品的不同测试。至于位点，现有技术系统会难以区别基片背景和基片上的位点。对于识别阱，现有技术系统和方法需要操作者识别载片的区域以识别成像系统会分析的阱。但是，要求操作者识别载片上的阱是效率较低的，而且易于出错。
此外，目前的系统和方法不能检测小于50nm的纳米粒子探针(尤其是金纳米粒子探针)的小浓度。因此，现有技术被迫采用大于50nm的探针。但是，从处理角度来看，这些大于50nm的探针非常难于使用。作为替代，现有技术方法尝试通过例如使用银粒子来放大50nm以下的纳米粒子探针，从而对不能检测较小纳米粒子的情况进行补偿。但是，已经证实这种放大纳米粒子的尝试不起作用。例如，在银放大的情况下，其已被证实很难使用，因为银会随光和温度而反应(产成储备和封装问题)，其相当昂贵而且非常难以准确地再现结果。因此，现有技术经常拒绝使用银放大法。
因此，现有技术的方案没有解决以特定方式检测纳米粒子的问题。
发明内容
本发明涉及基片上金属纳米粒子的检测。所述基片可具有包含一种或多种目标分析物的特定结合补体的多个位点。基片上的位点之一可以是测试位点，出现一种或多种目标分析物时金属纳米粒子将络合于其上。位点中的另一个可以包含控制位点或第二测试位点。根据正在进行的测试的类型，可以使用控制或第二测试位点。例如，当测试传染病时，可以使用控制位点(优选使用阳性控制位点和阴性控制位点)与测试位点比较，以检测在测试样品中是否存在核酸序列。该核苷酸序列可以代表特定的细菌或病毒。阳性(positive)控制位点可以是经由核酸捕捉链直接配对到基片上的金属纳米粒子、直接印刷在基片上的金属纳米粒子、或络合到设置于独立的阱中的已知分析物上的金属纳米粒子的阳性结果(positive result)。当测试遗传特性(例如存在哪种基因序列)时可以使用第二测试位点。例如，可以使用两个测试位点来比较基因序列，例如单核苷酸多态。
一方面，提供一种具有或不具有金属纳米粒子的化学信号放大的用于检测金属纳米粒子的装置。该装置包括用于保持基片的基片保持架、处理器和存储器、成像模块、照明模块、电源模块、输入模块以及输出模块。在一个实施例中，该装置可以具有固定的基片保持架和成像模块。这允许基片通过成像模块成像而不需要马达来移动基片、成像模块或者两者。此外，该装置可以具有与基片保持架接近的成像模块。为了减小成像装置的尺寸，成像模块(例如光电传感器)靠近基片保持架(其保持基片)设置。例如，成像模块可以在距基片30mm到356mm的范围。由于这样靠近设置，所获取的图像会发生畸变，特别是在所获取图像的边缘处。为了将所获取的图像处理得更好，所述装置对该畸变进行补偿。例如，该装置利用灰度畸变模型补偿灰度畸变。作为另一个示例，该装置利用空间畸变模块补偿空间畸变。通过该方式，减小所获取图像中的畸变影响。
在本发明的另一方面，提供一种自动检测基片上的至少一些位点的方法。获取基片表面上包括金属纳米粒子的多个位点的图像。可选地，基于重复过程，得到最佳图像。对所获得的图像进行畸变校正，所述畸变例如为灰度畸变和空间畸变。灰度畸变校正可以基于补偿图像亮度降低的模型。空间畸变校正可以基于补偿图像空间畸变的模型。基于被补偿的图像，在所获取的被补偿图像中检测基片上的至少一部分位点。可选地，可以进行阈值处理(优选地适应性阈值处理)以区分图像中的位点。
在本发明的再一方面中，提供一种自动检测基片上的至少一个阱的方法。该方法包括以下步骤自动检测基片上的至少一部分位点；以及基于对所述至少一部分位点的自动检测，自动确定所述阱。分析被检测的位点，从而由检测到的位点的无序集合确定位点是如何组织成阱的。分析的一种方式是检测位点之间的空间差。基于该空间差，可以将位点组织成阱。此外，可以分析位点的特征的图案(例如由于间距差异造成的特征)从而检测位点是如何组织成阱的。
在本发明的又一方面中，提供一种检测基片上测试位点中是否存在一种或多种目标分析物的方法。该基片具有包含一种或多种目标分析物的特定结合补体的多个位点。其中一个位点是测试位点，存在一种或多种目标分析物时金属纳米粒子络合于该测试位点上。另一位点是控制位点或第二测试位点，出现第二或更多种目标分析物时金属纳米粒子络合于该第二测试位点上。所述方法包括以下步骤获取所述测试位点和所述控制或第二测试位点的多个图像，所述多个图像以不同的曝光取得；以及，基于所获取的位点的多个图像，确定络合于所述测试位点中的所述金属纳米粒子的存在，作为存在所述目标分析物中的一种或多种的指示。所述多次曝光可以基于图像的一部分的“最佳”曝光时间(优选对于基片上的一个阱是最佳的)以及比该最佳曝光时间短的曝光时间进行。
因此，本发明的一个优点是提供一种囊括在紧凑外壳内的成像系统。
本发明的另一个优点是不需要利用复杂的机动系统来在基片上移动照相机。
本发明的再一个优点是能够不通过昂贵或复杂的实现方式检测基片上的位点和/或阱。
本发明的上述以及其它目的、优点和特点将在下文中变得显见，因此参照以下对本发明的详细描述、所附权利要求以及附图中示出的若干示图，可以更清楚地理解本发明。
图1a是成像系统的一个实施例的透视图。
图1b是图1a所示成像系统的正视图，其中前盖被移除。
图1c是图1a所示成像系统的侧透视图，其中前盖被移除。
图2是图1a-c所示系统的框图。
图3是成像系统的根据系统的另一实施例的另一示图。
图4是图1a-c所示成像系统的流程图。
图5是如图4所论述的基片上位点检测的一个实施例的流程图。
图6是如图4所论述的基片上阱识别的一个实施例的流程图。
图7是如图4所论述的基片上位点量化的一个实施例的流程图。
图8是如图4所论述的判定统计(decision statistics)的一个实施例的流程图。
图9a和9b是灰度校正之前和之后的载片图像。
图10是用于校正灰度畸变的横穿视场在一个维度上的亮度补偿模型的图表。
图11a-c是用于图10所示补偿模型的二阶多项式的常数的图表，图11a示出二阶常数的图表，图11b示出一阶常数的图表，图11c示出零阶常数的图表。
图12a是存在空间畸变的载片图像。
图12b是由上图直接得到的图像或数据文件中的数据的打印输出，其中直观表现出了从畸变点移动到非畸变点所需的x和y平移。
图13a和13b是灰度和空间畸变校正之前和之后的载片图像。
图14是位点检测方法的图像的一个示例，其中已经检测了图像中的亮位点。
图15是在光电传感器设定了特定的曝光时间情况下得到的一组样品照片。
图16a-16d是通过改变记录在样品上的光的量得到的数据的示例。
图17是一系列控制位点和目标测试位点的示图。
图18是载片上各个阱的多个曝光时间与像素值之间关系的实验数据的图表。
图19是对于基片上一个阱中的位点的曝光时间与传感器记录下来的像素强度值之间关系的图表。
具体实施例方式
本发明的方法和装置涉及检测金属纳米粒子。在一优选实施例中，本发明提供了用于检测金胶体粒子和用于向操作者准确汇报的方法和装置。
这里所描述的示例涉及用于检测纳米粒子，特别是金属纳米粒子的成像系统和方法。在一优选实施例中，纳米粒子是金胶体纳米粒子(或者完全由金构成或者至少一部分(例如外壳)由金构成)并且采用在杂交之后沉积在金纳米粒子上的银或金放大。本发明还可以用于其它应用，所述应用包括但不限于没有银或金沉积的金纳米粒子检测。
如本发明背景技术中所论述的，当检测基片上的纳米粒子时存在若干问题，例如包括大尺寸系统占据了实验室中的宝贵空间；跨基片移动照相机的复杂机动化系统；在检测基片上的位点和/或阱方面的问题，这通常需要昂贵且复杂的设备。本发明解决了检测纳米粒子中的这些以及其它问题，其实现成本显著小于目前的系统(小于10000美元)并且设备占据空间不大于18″×12″×12″。
定义这里使用的“分析物”或“目标分析物”是利用本发明在测试样品中待检测的物质。分析物可以是对于它自然地存在特定结合成分(例如抗体、多肽、DNA、RNA、细胞、病毒等)或者可以为其准备特定结合成分的任何物质，并且分析物可以在检验中结合到一个或多个特定结合成分上。“分析物”还包括任何抗原物质、半抗原、抗体、以及其组合物。分析物可以包括蛋白质、缩氨酸、氨基酸、碳水化合物、荷尔蒙、类固醇、维生素、包括用于治疗目的管制品以及用于违禁目的的管制品的药物、细菌、病毒以及任何上述物质的代谢物或抗体。
这里使用的“捕捉探针”是能够与分析物结合的特定结合成分，其直接或间接地附着到基片。捕捉探针的一个示例包括具有与目标核酸的至少一部分互补的序列的低聚核苷酸，其可以包括间隔物(例如聚A尾(polyA tail))和将低聚核苷酸附着到支承体上的功能团。捕捉探针的另一示例包括通过到支承体表面上的共价附接或吸附而结合到支承体的抗体。例如在PCT/US01/10071(Nanosphere Inc.)中描述了捕捉探针的示例，该申请全部内容通过引用结合于此。
这里使用的“特定结合成分”表示特定结合对(即两个不同分子，其中一个分子通过化学或物理方式特定地结合到第二个分子)中的一成分。除了抗原和抗体特定结合对以外，其它特定结合对包括生物素和抗生物素蛋白、碳水化合物和植物凝血素、互补的核苷酸序列(包括使用在DNA杂交检验中以检测目标核苷酸序列的探针和被捕获核苷酸序列)、互补的缩氨酸序列、效应器分子和接受器分子、辅酶和酶、酶抑制剂和酶、细胞、病毒等。此外，特定结合对可以包括是原特定结合成分的类似物的成分。例如，分析物的衍生物或碎片，即分析物类似物，可以被使用，只要其具有与分析物相同的至少一个表位(epitope)。免疫活性的特定结合成分包括抗原、半抗原、抗体、及其络合物，包括通过重组DNA法或缩氨酸合成法形成的络合物(complex)。
这里使用的“测试样品”表示包含将要利用本发明检测和检验的分析物的样品。测试样品可以包含分析物以外的其它组分，可以具有液体或固体的物理特性，并且可以是任何大小或体积的，例如包括运动的液体流。除了分析物以外，测试样品可以包含任何物质，只要该其它物质不干扰特定结合成分的特定结合或分析物。测试样品的示例包括但不限于血清、血浆、唾液、精液、尿液、其它体液、以及诸如地下水或废水、土壤浸出液、空气和农药残留物之类的环境样品。
“低聚核苷酸类(type of oligonucleotide)”指的是具有相同序列的多个低聚核苷酸分子。附着有低聚核苷酸的一“类”纳米粒子、配对物等指的是其上附着有相同类的低聚核苷酸的多个个体。
“附着有低聚核苷酸的纳米粒子”有时也称为“纳米粒子-低聚核苷酸配对”，或者在本发明的检测方法的情况下，称为“纳米粒子-低聚核苷酸探针”、“纳米粒子探针”、“检测探针”，或仅称为“探针”。结合到纳米粒子上的低聚核苷酸可以具有识别特性，例如可以与目标核酸互补，或者可以用作系链(tether)或间隔物(spacer)且可以逆着特殊目标分析物例如配对基进一步结合到特定结合对成分例如接受器(receptor)。在PCT/US01/10071(Nanosphere Inc.)中描述了对于目标分析物具有较广范围的特定结合对成分的纳米粒子基检测探针的示例，该申请的全部内容通过引用结合于此。
基片和纳米粒子本发明的方法和装置可以从允许观察到可检测变化的任何基片检测利用银或金增强方案放大的金属纳米粒子。合适的基片包括透明或不透明的固体表面(例如玻璃、石英、塑料和其它聚合物TLC硅石板、滤纸、玻璃纤维过滤器、硝酸纤维素膜、尼龙膜)、以及导电固体表面(例如铟锡氧化物(ITO、二氧化硅(SiO2)、氧化硅(SiO)、氮化硅等))。基片可以是任何形状或厚度，但是一般是象显微镜载片那样平且薄的，或者成形为象微量滴定片一样的阱室。
在实施本发明时，结合到目标分子的一种或多种不同类型的捕捉探针通常固定到基片表面上。捕捉探针和目标分子可以是特定结合对，例如抗体-抗原、接受器-配对物、以及互补的核酸分子。参见PCT/US01/10071(Nanosphere Inc.)，其全部内容通过引用结合于此。然后利用纳米粒子探针检测被结合到基片上的任何目标分子-捕捉探针络合物的存在。PCT/US01/10071(Nanosphere Inc.)和PCT/US01/01190(Nanosphere Inc.)中描述了制备纳米粒子和低聚核苷酸以及将低聚核苷酸附着到纳米粒子上的方法，所述申请的全部内容通过引用结合于此。杂交条件是本领域公知的，并且可以容易地根据所使用的具体系统来优化。
捕捉探针可以通过任何传统方式结合到基片上，包括通过捕捉探针和表面之间的一个或多个键合(linkage)或通过吸附。在一个实施例中，作为捕捉探针的低聚核苷酸附着到基片上。低聚核苷酸可以如文献中所述那样附着到基片上，所述文献例如Chrisey等人，Nucleic Acids Res.，24，3031-3039(1996)；Chrisey等人，Nucleic Acids Res.，24，3040-3047(1996)；Mucic等人，Chem.Commun.，555(1996)；Zimmermann和Cox，Nucleic Acids Res.，22，492(1994)；Bottomley等人，J.Vac.Sci.Technol.A，10，591(1992)；以及Hegner等人，FEBS Lett.，336，452(1993)。多种不同类型的捕捉探针可以以阵列形式布置在表面上在离散的区域或位点处，这样可以检测多种不同的目标分子或相同目标分子的不同部分。
结合到基片表面上的捕捉探针特定地结合到其目标分子上从而形成络合物。目标分子可以是核酸，捕捉探针可以是附着到基片上、具有与待检测核酸的序列的第一部分互补的序列的低聚核苷酸。纳米粒子-低聚核苷酸配对物具有与所述核酸序列的第二部分互补的序列。所述核苷酸在允许低聚核苷酸在基片上与核酸杂交、或者允许核酸与纳米粒子-低聚核苷酸配对物杂交的条件下与基片接触。在另一方法中，在基片上核酸与低聚核苷酸以及核酸与纳米粒子-低聚核苷酸配对物的杂交可以设置成同时发生。以所述方式中的一种，核酸被结合到基片上。在测量DNA杂交测试结果之前，从基片上洗去所有未被结合的核酸和未被结合的纳米粒子-低聚核苷酸配对物。
可检测变化可以通过银着色(silver staining)来增强。银着色可以利用能催化银的还原的任何类型纳米粒子进行。优选的是由贵金属(例如金和银)制成的纳米粒子。参见以下文献Bassell等人，J.Cell Biol.，126，863-876(1994)；Braun-Howland等人，Biotechniques，13，928-931(1992)。如果用来检测核酸的纳米粒子不催化银的还原，则银离子可以络合到核酸上从而催化还原反应。参见以下文献Braun等人，Nature，391，775(1998)。此外，银着色剂(silver stain)是已知的，其可以与核酸上的磷酸盐基团反应。
银着色可以用来增强在基片上进行的包括金属纳米粒子的检验中的可检测的变化，包括上面描述的那些检验。具体而言，已发现银着色能极大地提高采用单类纳米粒子的检验的灵敏度。为了更大地增强可检测变化，可以使用一个或多个层的纳米粒子，每层都用银着色剂处理，如PCT/US01/21846(Northwestern University)中所述。
第一类纳米粒子上的低聚核苷酸可以全部具有相同的序列，或者可以具有与待检测核酸的不同部分杂交的不同序列。当使用具有不同序列的低聚核苷酸时，每个纳米粒子可具有附着到其上的不同低聚核苷酸的全部，或者优选地，不同的低聚核苷酸附着到不同的纳米粒子上。PCT/US01/10071(Nanosphere Inc.)中的图17示出了设计来与核酸的多个部分杂交的纳米粒子-低聚核苷酸配对物的使用。供选地，第一类纳米粒子的每一个上的低聚核苷酸可以具有多个不同序列，其中的至少一个序列必须与待检测核酸的一部分杂交(参见PCT/US01/10071(Nanosphere Inc.)中的图25B)。
供选地，结合到基片的第一类纳米粒子-低聚核苷酸配对物与附着有低聚核苷酸的第二类纳米粒子接触。这些低聚核苷酸具有与附着到第一类纳米粒子上的低聚核苷酸的序列的至少一部分互补的序列，且所述接触发生在能够允许第一类纳米粒子上的低聚核苷酸与第二类纳米粒子上的低聚核苷酸杂交的条件下。在纳米粒子被结合之后，优选清洗基片以移除所有未被结合的纳米粒子-低聚核苷酸配对物。然后进行银着色处理。
杂交的组合与后面的银着色产生增强的可检测变化。可检测变化与上面描述的相同，只是多重杂交导致可检测变化的信号放大。具体而言，由于每个第一类纳米粒子附着有多个低聚核苷酸(具有相同或不同的序列)，所以每个第一类纳米粒子-低聚核苷酸配对物可以与多个第二类纳米粒子-低聚核苷酸配对物杂交。此外，第一类纳米粒子-低聚核苷酸配对物可以与待检测核酸的不止一个部分杂交。多重杂交所实现的放大可以使变化第一时间被检测到，或者可以增大可检测变化的幅度。该放大提高了检验的灵敏度，使得能够检测小量的核酸。
如果需要，可以通过逐步增添第一类和第二类纳米粒子-低聚核苷酸配对物来构建更多层的纳米粒子。以此方式，目标核酸的每个分子上固定的纳米粒子的数量可以进一步增加，相应地增大信号强度。
此外，除了使用设计成彼此直接杂交的第一类和第二类纳米粒子-低聚核苷酸配对物之外，还可以使用载有低聚核苷酸的纳米粒子，其通过与结合的低聚核苷酸杂交而将纳米粒子结合在一起。
成像系统现在将参照
本发明的当前优选实施例，附图中相似的元件用相似的附图标记表示。参照图1a，示出了成像系统的一个实施例的透视图。成像系统50包括显示屏52和用于在成像期间接近保持基片的托架(tray)的操作部(handle)54。整个成像系统大约宽12″，高12″，深18″(如图1a中靠近成像系统50的显示屏放置的12″标尺所示)。如在本发明的背景技术中所论述的，现有技术的系统尺寸上较大，占据了实验室空间的很大一部分。相比之下，本成像系统由于一些原因而较为紧凑。将在下面详细论述的这些原因的示例包括传感器(例如光电传感器)被设置成靠近或接近基片/基片保持架；使用软件来补偿传感器所获取的图像的畸变；以及处理器/存储器以及所有控制功能部件都设置在成像系统50中。
参照图1b，示出了图1a所示成像系统的正视图，其中前盖被移除。基片被放置在基片保持架中，该基片保持架具有底座58和至少一个侧壁60(优选两个侧壁)。一般地，基片可以具有标准显微镜载片的尺寸(25mm×75mm)。更大或更小的基片也可以使用。基片被照明模块照明，如参照图2详细描述的那样。一种类型的照明模块使用光纤线缆从侧面照明基片。如图1b所示，多个光纤线缆62进入至少一个侧壁60(优选进入两个侧壁中，如图1b所示)。因此，当基片放置在底座58上，处于两个侧壁60之间时，光经由光纤线缆62被送到基片的侧面。基片被照明，使得基片上的纳米粒子对光进行散射，传感器捕捉被散射的光，如参照图2详细论述的那样。
一种类型的传感器是光电传感器(图1b中未示出)和至少一个透镜54。在一个优选实施例中，光电传感器是静止的。此外，光电传感器可以是型号为Silicon Video 2112的CMOS光电传感器。Silicon Video 2112型号的CMOS光电传感器的尺寸是对角线为12.3mm的矩形(1288像素×1032像素)。透镜54的8.5mm焦距透镜。光电传感器经由电缆56将成像数据发送给处理器，这将在下文中说明。如图1b所示，透镜54接近基片/基片保持架。在一个实施例中，传感器/透镜置于距离基片/基片保持架356mm的位置。在一个优选实施例中，光电传感器的外壳放置在距离基片/基片保持架大约68mm处。工作距，即物体与像之间的距离，是基片尺寸的函数。预期根据不同的商业应用，例如药物基因组学(pharmacogenomics)、临床研究、农业企业、基因组学等，将使用不同的基片尺寸。优选实施例将是这样的，即，工作距可以在30mm和356mm之间在工厂里方便地调节，以得到不同的视场。透镜定位架(lens spacer)的使用使得工作距可以具有这么大的范围。此外，如图1b所示，传感器和透镜相对于被成像的基片是静止的。由于传感器和基片之间距离较近，同时由于传感器/基片是静止的，所以会出现大量的畸变，尤其是在视场的边缘。如以下将说明的，传感器所获得的图像要被修正以补偿该畸变。这与背景技术部分论述的某些现有技术的设备相反，那些现有技术设备移动照相机或基片或者移动两者来补偿畸变。在一个实施例中，成像系统50还可包括传送系统，例如基于圆盘传送带(carousel)的系统，从而可以将基片旋转或平移进出视场，以实现对多个基片的批处理，从而实现设备的高处理量。例如，可以在圆盘传送带上放置多个基片。圆盘传送带可以通过马达(例如步进马达)旋转，使得基片被移动进出传感器的视场。但是，在成像期间不需要移动基片。
参照图1c，示出了图1a所示成像系统的侧透视图，其中前盖被移除。在一个实施例中，成像系统包括位于成像模块的外壳内的微处理器和存储器，这将参照图2详细说明。如图1c所示，在成像系统内有各种电路板64，包括单板计算机(其包括微处理器、存储器和一些电子I/O)、光电传感器捕获板(其捕获来自传感器的图像并将图像缓存以备处理器访问)、定制输入/输出板(其接收传感器数据，控制用户输入/输出设备和一些电子输入/输出设备)。
参照图2，其示出图1a-c所示系统的框图。成像系统50包括计算机66。计算机包括位于成像模块50的外壳内的印刷电路板(如图1c所示)上的处理器和存储器设备。现有技术的系统使用与独立桌面计算机连接的成像模块。此类分布式系统由于设计用于很多功能的整个个人计算机的额外成本而较为昂贵，并且由于个人计算机需要独立的空间而效率较低。相比之下，本发明的一个方面将处理器68/存储器70功能部件嵌入在成像模块中，并设计成专用于其特定功能，这样可以大大降低成本和复杂性。处理器68可以包括微处理器、微控制器或者任何执行算术、逻辑或控制操作的器件。存储器70可以包括诸如ROM之类的非易失性存储器和/或诸如RAM之类的易失性存储器。存储器70可以存储用于位点检测/阱识别和/或图像分析的程序，这将与大量DNA杂交测试结果一起在下文中说明。处理器68可以访问存储器70以执行程序。通过这种方式，图1a-c所示的成像模块成为独立和紧凑的设备。
成像系统还包括照明模块76。照明模块76利用电磁辐射照明样品。在一个实施例中，照明模块用可见光谱内的电磁辐射照射样品。供选地，可以使用例如红外和紫外的其它波长的光。此外，照明模块可以通过激光生成而产生特定波长的光，或者产生一定光谱范围的波长的光，例如白光。
可以使用各种照明模块，例如侧面照明、正面照明和背面照明。还可以使用偏振器和滤波器来改变入射光。当侧面照明时，照明模块可以将光耦合到基片的至少一侧，以利用玻璃或其它适合基片的波导能力。照明模块到支承介质或基片的耦合可以以各种方式来实现，例如可以通过光纤束、固体波导、激光束或掠过基片(或放置在其边缘)的LED。
图1b示出利用光纤线缆将光耦合到基片侧面的侧面照明的示例。利用任何上述实施例的侧面照明可以在基片内产生全内反射。在这些条件下，当光以大于由公式θc＝arcsin(n2/n1)定义的临界角θc的角度照射在界面上时，基片(其折射率为n1)中的内反射光遇到与具有更低折射率n2的另一介质(例如围绕基片的流体或空气)的界面。处于或者非常接近基片表面的纳米粒子对光发生散射，该散射是可以通过光学方法检测到的。
作为另一示例，照明模块可以采用正面照明。当正面照明时，传感器一般设置在基片正上方，照明模块设置在一位置处，使得镜面反射不落在传感器上，而光电传感器检测从金属纳米粒子散射的光。根据系统的应用，照明模块可以相对于基片表面以各种角度设置。作为另一个示例，照明模块可以采用背面照明。传感器可以设置在基片的正上方(就如采用正面照明时一样)，照明模块可以设置在基片背后(优选位于基片正后方)。由于纳米粒子不会使光透射(即，背向散射(backscatter)光)穿过它们，所以基片的包括纳米粒子的部分会相对于基片的其它部分呈现出暗的或更暗的位点。在另一个示例中，照明模块可以采用偏振器。彼此成大约90°放置的两个偏振器可以与正面或背面照明组合使用，从而检测被金属纳米粒子散射的光的折射率变化，所述金属纳米粒子还导致偏振角的改变。在该实施例中，透射穿过基片透射或被基片镜面反射的光被偏振器滤掉，而被金属纳米粒子散射的光可以容易地检测到。使用漫射轴向照明(diffuse axial illumination)的一个实施例已经显示出应用性，而无论是否采用偏振器。在该方法中，光优选沿法向被引导到基片上，并检测所得到的来自纳米粒子位点的反射光。如果需要，偏振器或具有抗反射涂层的不透明基片材料可以用来抑制基片的镜面反射。
成像模块还包括至少一个光电传感器74。经常使用的光电传感器是基于CCD或CMOS的传感器。光电传感器探测电磁辐射，将所探测到的电磁辐射转换成数据格式并将该数据发送给处理器68。在一个优选实施例中，传感器探测可见光谱中的光。供选地，传感器可以探测电磁频谱中其它频带中的光，例如红外和紫外频带的光。光电传感器由多个像素(例如120万像素)构成，当然也可以使用其它尺寸规格。照射到每个像素上的可见光的量被转换成数据格式。一种这样的数据格式是分配给照射到像素上的光量的数值。例如，如果像素的数据输出的数值范围为0到1023(210位数据每像素)，则0表示没有光照射到像素上，1023表示像素饱和。以此方式，如果光照射在已经饱和的像素上，则所分配的数值不会改变。例如，即使额外的光照射在已经饱和的像素上，数值也会保持在1023。如以下将说明的，处理器68可以控制传感器的操作(例如通过控制曝光时间)，以改变传感器记录的光量。
此外，透镜或一系列透镜可以连接或耦合到传感器以捕捉更多的散射或反射光波。在一个优选实施例中，传感器与单个静止透镜协同工作，如图1b所示。供选地，多个透镜和反射镜(mirror)可以用来折射和反射入射到图像上的光以及从纳米粒子位点散射或反射的光。
成像系统50还可以包括用户输入/输出(I/O)设备78。用户I/O 78包括显示屏和触屏模块以及类似条形码读入器的输入扫描器。替代地或额外地，用户I/O可包括键盘。成像模块50还包括电子I/O 80。电子I/O 80可包括能够连接诸如LAN的网络或者能够连接诸如打印机的电子设备的数据端口55。成像系统包括电源模块，如框72所示。电源模块72为成像系统中的各种模块供电，所述模块包括计算机、光电传感器74、照明模块76、用户I/O 78和电子I/O 80。
参照图3，示出了根据系统的另一个实施例的成像系统的另一个示图。类似于图1b，样品放置在基片82上。基片82用发射器(transmitter)84照明。发射器84由处理器68控制，处理器68发送功率和关于束设置的命令(在一个实施例中，处理器68通过发出关于发射器84的平移对准以及/或者发射器84的反射镜86的旋转对准的命令来控制发射器)。然后束可以被送到基片82，于是光或IR辐射在遇到金粒子的位点时被散射。来自发射器的束可以被导向基片82的任何部分。在一个实施例中，束通过反射镜86旋转地对准，并利用可移动平台88平移地对准。任何装置都可以被用来沿三个维度中的任何一个移动发射器84。供选地，可以沿三个维度中的任何一个移动基片82，而不是移动发射器84。从而，被散射的光可以被至少一个传感器探测到。如图3所示，传感器采取了设置在载片任一侧的接收器90的形式。可以使用更多或更少的接收器。从而，来自接收器90的信号92可以被发送给处理器68用于分析，这将随后说明。
图1a-c的成像系统自动检测基片上的位点/阱，自动量化基片上的位点，并基于判定统计自动解释(interpret)位点。参照图4，示出了图1a-c所示成像系统的流程图。在基片被放置在成像系统50中之后，至少检测到基片上的一些位点，如框94所示。该位点检测步骤将在图5的流程图中更加详细地说明。基于所检测到的一些或所有位点，识别出一些或全部的阱，如框96所示。该阱识别步骤将在图6的流程图中更详细地说明。如框98所示，为各个位点/阱分配测试和样品标识。测试标识可以表明特殊位点是目标位点还是控制位点，并且如果是目标位点，则可以标示出测试的功能。样品标识可以指示出位点的来源(例如特定患者标识)。这些测试和样品标识数据可以例如由操作者手动输入或者例如利用基片上的图标自动输入。图标可以包括利用基片上的代码(例如条形码)。如前所述，用户I/O 78可以包括条形码读入器。条形码读入器可以设置在成像系统50内或与其相邻。条形码读入器可以读取设置在基片上的条形码。替代地或附加地，标示测试以及/或者样品标识的代码可以设置在用于处理的载片上。如以下将进一步详细说明的，基片可以包括多个位点。位点的序列(优选呈一条线)可以表示指示测试以及/或者样品标识数据的数据。例如，位点序列中的数据可以是二进制格式(出现纳米粒子＝1，没有出现纳米粒子＝0)，以表示特定数字。
此外，分配测试和样品标识的步骤可以在位点检测、阱识别以及/或者位点量化这些步骤之前或者与之并行执行。供选地，分配测试和样品标识的步骤可以在位点检测、阱识别以及/或者位点量化这些步骤之后执行。如框100所示，确定位点的数量。该位点量化步骤将在图7的流程图中更加详细地说明。如框102所示，执行判定统计步骤。位点量化和分配测试和样品标识的步骤的输出被分析从而基于统计分析解释这些结果。该判定统计步骤将在图8的流程图中更加详细地说明。如框104所示，汇报判定统计的结果。这些结果可以利用如图2中的框78所示的用户I/O输出。
如上所述，本发明的一个方面是自动检测支承介质上的位点/阱。在一个优选实施例中，软件自动检测图像中阱的位置，并识别阱中沉积和杂交有DNA位点的特定区域的位置。检测阱的一种方法是使用一系列图像处理技术以首先提取图像中的一些或全部可探测位点。然后，利用对位点位置的分析，例如几何分析，来确定阱的位置。
位点检测对基片上的一个、一些或全部位点的检测在执行上是比较困难的。位点的表面积会是整个图像的非常小的部分，导致位点检测困难。例如，在由像素构成图像的情况下，在由120万像素构成的整个像素面积内，位点可以在100像素或更少左右。此外，污物、灰尘等会在所获得的图像中造成噪声。可选地，可以获取基片上的至少一些(优选是全部)杂交位点的“最佳”图像。该“最佳”图像可以可选地被修正以校正图像中的畸变。在此之后，可以通过阈值处理(thresholdding)来分析图像，从而确定背景(例如图像的黑部分)和前景物体(例如图像的白部分)。作为该背景/前景分析的一个示例，自适应阈值处理(adaptive thresholding)基于图像数据值的局部邻域计算前景/背景间隔。结果一般是相对黑背景的白区域的集合。但是，它也可以是相对于较白背景的暗位点前景。然后，可以分析通过阈值分析得到的图像的前景区域，从而确定这些区域是否符合预定的位点区域。例如，前景区域的特征，诸如前景区域的面积、质量、形状、周长等，可以与诸如面积、质量、形状、周长等的预定位点特征比较。如果前景区域的特征与位点的特征相当，则前景区域被视为用于阱检测的位点。
在基于像素测量光的传感器的情况下，像素图像(优选是“最佳”像素图像)经历阈值分析以区分前景像素和背景像素。此后，可以扫描图像以识别定义物体的像素群。然后，这些物体可以被布置成“块(blob)”，这些块被分析以确定它们的特征，例如面积、质量、形状、周长等。然后，将块的特征与预期的DNA位点的特征比较以滤掉噪声。参照图14，示出了被施行了所述位点检测法以识别一般的DNA杂交位点的图像的一个示例。
参照图5，示出了如图4所示的检测基片上的位点的一个实施例的流程图。在本发明的一个方面，获取基片的至少一部分的图像。在一个优选实施例中，所获取的图像包括基片上的所有位点。供选地，所获取的图像可以仅包括基片上的一部分位点(例如通过获取所有位点的图像而仅处理图像的一部分)。在分析图像以检测位点之前，可以重复以确定“最佳”图像。“最佳”可以定义为基于传感器的特性最有利于检测基片上的位点的被传感器所记录的电磁辐射量。例如，“最佳”图像可以定义为传感器的饱和百分比。如上所述，当照射在传感器(或部分传感器)上的额外光不产生额外数据时，传感器饱和。在使用像素的光电传感器的情况下，当像素值达到最大值时发生饱和。不同的饱和百分比可以被选择为最佳图像，例如0.5％、1％、5％、10％等。“最佳”图像的另一种定义是返回最大数量的被识别位点的图像。该定义中，可调节传感器的读取时间或曝光时间直到检测到最大数量的位点。
以下将详细说明改变传感器记录的光量的方法。在一个方面，传感器记录的光量可以通过改变控制传感器操作的参数来控制。传感器参数的示例包括但不限于曝光时间和传感器增益。在曝光时间的情况下，传感器曝光于照射光的时间量直接影响传感器记录的光量。缩短/增长曝光时间将减小/增大光量。如果传感器是光电传感器，则曝光时间通过调节读取光电传感器像素的时间来改变。一般，对于数字传感器，曝光时间控制积分时间(integrationtime)。传感器单元值，即像素在积分时间完结之时读取。例如，如果希望曝光时间为60毫秒，则光电传感器被初始化并且像素值在初始化之后的60毫秒时被读取。在另一个方面，传感器记录的光量可以通过改变控制照明模块的参数来控制。类似于传感器，每个照明模块具有控制其操作的参数。照明模块参数的示例包括但不限于照明模块开启的时间量、照明模块的强度等。
参照框106、108和110，该流程重复直到获得“最佳”图像。选择传感器的曝光时间的初始值。基于该初始曝光时间，光电传感器读取图像，如框106所示。由于污物、灰尘等在系统中造成噪声，可以可选地对图像进行除斑处理(despeckle)，如框108所示。除斑可以通过采用滤波器，例如可配置的中值滤波器或均值滤波器来实现，以便对图像除斑并移除任何锐利的信号尖峰。中值滤波器依次考虑图像中的每个像素，并关注其附近的邻域，以判定其是否代表了其周围区域。中值滤波器将像素值替换为相邻像素值的中值。相反，均值滤波器将像素值替换为相邻像素值的均值。中值是通过以下方式计算得到的首先将周围邻域的所有像素值排列成数值队列，然后将所考虑的像素替换为中间像素值。(如果考虑中的邻域包括偶数个像素，则使用两个中间像素值的平均值。)在对图像除斑之后，读取像素，如框110所示。根据读取的像素，处理器68分析像素以确定图像是否是“最佳”的。如果“最佳”的确定是根据图像中像素的饱和度百分比，则处理器68对图像中饱和的数量求和(例如确定图像中饱和的像素的数量)。如果百分比计算结果小于“最佳”量(即饱和的像素比“最佳”情况的少)，则增长曝光时间。供选地，如果百分比计算结果大于“最佳”量(即饱和的像素比“最佳”情况的多)，则缩短曝光时间。通过改变曝光时间重复该过程，直到获得最佳图像。
一旦获得了最佳图像，则分析该图像以确定基片上一个、一些或全部位点的位置。为了在非常小的设备占用空间中实现成像系统，成像系统工作于较短的光学工作距下(即传感器非常靠近基片)。但是，这种短的光学工作距导致所获得的图像发生畸变，尤其是在视场的边缘。如在本发明的背景技术中所论述的，不希望限制视场，因为它会导致需要在物体图像上移动照相机、剪裁和拼接一系列图像，而这是不希望有的。优选并且可选地，对所获得的图像进行补偿。畸变的示例包括但不限于灰度畸变和空间畸变。
在光学系统被迫使用比适合于给定传感器规格和视场的工作距短的工作距的时候，发生畸变。当市场要求低成本系统时会被迫使用这种实施方式，其要求使用与其它市场需求(即较小的设备占用空间)相结合的离架(off-the-shelf)、大体积的部件。在一种优选实施方式中，具有9.7mm水平线(horizontal)的低成本、大体积光电传感器被迫以30mm到356mm之间的工作距对65mm的水平视场成像。随着工作距减小，所产生的畸变增大。
所述优选实施例中的畸变表现为图像的空间变形和图像的亮度变差两方面。空间和亮度上的畸变作为距透镜中心的距离的函数而增大。图9a中示出了灰度畸变的一个示例。图9b示出了经灰度畸变校正的图像的另一个示例。在一方面，灰度畸变可以利用灰度校正模型校正，如框112所示。该模型可以包括某些输入因子，以确定所需的补偿量。这样的因子的示例包括但不限于距图像中心的距离和图像亮度。参照图10，示出了用于校正灰度畸变的视场上亮度补偿模型的图表。该模型的一个示例与成像系统的光学装置一起构建，以获取图10所示用于视场上亮度的补偿公式。该模型通过利用恒定光源和经标定的滤光镜组(例如3％透射滤光镜(3％的光透过)；10.13％；17.25％；24.38％；31.50％；38.63％；等)来构建，以达到(arrive at)不同亮度值曲线。传感器利用x-y平移工作台移动，以获取光电传感器阵列上的数据点。
积聚在图10所示的9条曲线上的数据点可以拟合成一条曲线。可以用二阶多项式以足够的准确度来达到显示在透镜中心处透镜畸变为最小值时像素值会如何的公式。利用这些公式，可以调节传感器上各个位置上的各个像素值。
如所述数据所示，曲线是亮度的函数。信号越亮，则灰度畸变对亮度的影响越显著。在一个实施例中，可以采集亮度值范围(例如，216，即65536)上的曲线。在一个优选实施例中，通过在亮度范围上建立2阶次的多项式公式模型，可以确定2和1阶常数是线性的，0阶常数是对数相关的。图11a-c是图10所示补偿模型的二阶多项式的常数的图表，图11a示出了2阶常数的图表，图11b示出了1阶常数的图表，图11c示出了0阶常数的图表。已知这些关系，给定基片上的初始位置和初始亮度可以求解任何a、b和c。尽管图10所示模型中的曲线仅将x方向的畸变表达为因式，但是该灰度畸变模型还可以将y方向的畸变表达为因式。此外，也可以构建用于灰度畸变补偿的其他模型。
由透镜引起的畸变还会造成图像和物体之间的空间畸变。这种畸变严重至足以使得不能对图像进行可靠的分析。在一个方面，空间畸变具有压缩图像边缘的负(桶形(barrel))畸变，如图9a和图12a所示。边缘处的位点非真实地更小，因此更加难以发现。可以建立一个模型来补偿空间畸变。该模型可以用来校正空间畸变，如框114所示。这种模型的一个示例是基于具有相隔1mm的垂直线的经标定的栅格。在成像系统中对该栅格成像可以得到畸变图片。假设图像的中心是没有畸变的，可以得到线条的垂直栅格应该表现出的无畸变的空间图像。
由图12a所示图像创建含有从畸变点移动到未畸变点所需的x和y平移的数据文件。由于大多数像素位于栅格节点之间，所以畸变校正程序利用双线性插值法由所给出的畸变图像构建无畸变的图像。算法的输入是节点矩阵，其中每个节点描述畸变和无畸变图像两者的直线限定区域。利用已知的限定每个节点的坐标点，可以计算得到在无畸变点之间进行插值的系数。假设f(x，y)是原始畸变图像，g(x’，y’)是经校正的图像，则我们得到以下关系x’＝a1x+b1xy+c1y+d1y’＝a2x+b2xy+c2y+d2g(x’，y’)＝f(x，y)给定限定每个节点的八个已知坐标就可以得到八个未知的系数。除了计算经校正的坐标之外，还可以对灰度值进行插值，因为经校正的坐标不是整数值。由于数字图像是离散的，所以非整数坐标不存在。诸如选择最接近相邻整数灰度之类的解决该问题的简单方案在所得到的图像中引入了许多不希望的人为因素。另一方面，诸如双三次插值法之类的最佳解决方案会带来无法承受的计算需求。因此，通过估测，利用四个最接近的相邻灰度值进行另一双线性插值，如以下关系式中那样v(x’，y’)＝ax’+bx’y’+cy’+d其中，v是畸变图像中的理论灰度值。利用四个已知坐标和四个已知灰度值，可以求解四个系数。一旦软件有了这四个系数，其可以计算出四个整数像素值之间的插值像素值。
在对所得到的图像进行了畸变校正之后，应该分析经校正图像中的形状。对二进制图像进行形状分析，在这种情况下，前景物体是白的而背景是黑的。但是，在不同照明技术下，相反的情况也是可以的。在一个实施例中，使用阈值处理模型来区分灰度图像中的前景和背景物体，以生成适合于形状检测和分析的二进制图像。阈值处理模型试图找到前景和背景物体之间的可全体适用的区别(globally applicable separation)，以便生成适合于形状检测和分析的简单二进制图像。
但是，由于基片图像经常包含不均匀的背景和由于灰尘、擦痕等造成的噪声不规则性以及照明的不规则性，所以一个优选的实施例采用自适应阈值处理算法，如框116所示。自适应阈值处理基于像素值的局部邻域(localneighborhood)来计算前景/背景间隔，而非试图基于柱状图分析来找到可全体适用的区别点(separation point)。
自适应阈值处理可以以各种方式来建模。一种这样的方法是利用以下的公式，其中考虑将foriginal(x，y)变换成gbinary(x，y)Iavg=(1(k+1)2)Σi,j=-kkforiginal(x+i,y+i)]]>
IΔ=(q100·Iavg)]]>
一旦利用该自适应阈值处理模型从背景像素中区分出了前景像素，就可以扫描图像并识别定义物体的像素群。如框118所示，进行腐蚀(erosion)和膨胀(dilation)处理，从而通过分开连接在一起的像素群的块，去除前景物体之间的不希望有的连接。
在已经检测出像素群并将之定义为各个实体(entity)之后，块检测建立将连接的前景像素的每个群描述为“块”的数据结构，如框120所示。块检测算法遍历像素群数据结构，建立两个附加的数据结构，然后基于新的数据结构计算块量度(blob metrics)。
然后计算块特征，如框122所示。这些物体(即与位点相关的图像部分)被布置成“块”，其允许进行空间确定以滤掉噪声和不具有期望的DNA位点特征的块。因此，可以计算块的不同特征，以便接受有效的DNA位点并舍弃无效的噪声。所述不同特征包括但不限于块的统计形状矩(moment)、块的像素面积、块的像素质量(像素值的总和)、块的质心(centroid)坐标、块的周长以及块的圆度系数。
块的统计形状矩可以通过考虑块的形状来表示两个变量的函数并计算统计矩而得到。矩是很多随后的块量度的基础。连续函数f(x，y)的矩为mpq=∫-∞∞∫-∞∞xpyqf(x,y)dxdy]]>但是，对于数字图像，这些可以离散地进行加和mpq=Σx=0MΣy=0Nxpyqfbinary(x,y)]]>一旦计算得到基础矩，就可以计算中心矩。中心矩通过块的位置来归一化。
x‾=m10m00,y‾=m01m00]]>μpq=Σx=0MΣy=0N(x-x‾)p(y-y‾)qfbinary(x,y)]]>计算矩时，对块的扫描分块序列(scan segment list)的遍历被用来表示函数fbinary(x，y)的范围和域。
块的另一个特征是像素面积。块的像素面积是块中像素的数量。这通过对块的扫描分块序列所给出的像素进行计数而计算得到。该值为矩m00。
另一个特征是块的像素质量(像素值的总和)。块的像素质量是块中的像素值的总和 其中，foriginal是原始的16位灰度图像，而不是经过阈值处理的gbinary图像。
另一个特征是块的质心坐标。块的坐标位置通过利用关于x和y轴的矩来计算，以确定块的平均位置x‾=m10m00,]]>y‾=m01m00]]>所得到的坐标是利用块的总面积归一化的块的x和y轴值。这表示块的平均位置或质心。
另一个特征是块的周长。块的周长是通过对块的周边点序列中的像素之间的距离求和得到的，所述像素用(xi，yi)表示c=Σi=1N(xi-xi-1)2+(yi-yi-1)2]]>N是周边点序列的长度。
最后一个块特征是块的圆度系数。一旦知道了周长和总面积，圆度系数可以如下计算得到C=c24π(m00)]]>其中，完全圆形的块具有C＝1.0。可以接受的圆度是可配置的(configurable)参数，并且仅在块具有一定的最小面积时有效。
基于这些块特征中的一个、一些或全部，可以对图像中所记录的块进行分析和过滤，以确定哪些是有效DNA位点，哪些是噪声，如框124所示。
阱识别位点检测步骤提供了检测到的位点和检测到的位点的特征(例如面积、周长等)。基于此，对检测到的位点中的至少一部分进行分析(优选是几何分析)，以由所检测到的位点的无序集合确定位点是如何组织成阱和排(row)的。
阱识别取得了已经检测到的位点的无序集合(如上文所述)，并试图自动识别构成阱的位点。该自动识别不需要操作人的干预，而这种干预在现有技术的设备中则是需要的。确切的说，阱的识别是基于检测到的位点的特征(例如间距、图案等)。
如上所述，基片可以包括多个阱。每个阱可以包含至少两个位点(优选多个位点)。特定阱中的位点一般包括一个实验，使得位点与对特定目标或一系列目标的测试相关。阱识别分析检测到的位点的某些特点，例如一些或全部检测到的位点之间的间距、检测到的位点的图案等，以试图获取有关阱的特征，例如阱中的位点数量、所获得图像中位点的位置(例如在像素的情况下，哪些像素组对应于特定位点)、阱的几何形状等。阱的一般示例是位点的矩阵。根据具体基片，该矩阵可以包括3×3位点(阱中总共9个位点)、4×4位点(阱中总共16个位点)等。例如，图14示出了具有十个阱的基片，每个阱包括多个位点。
阱中的特性可以通过对检测到的位点的分析以及/或者通过比较阱的已知特性来得到。在一个方面，分析无序位点以确定阱中的阳性控制(positivecontrol)位点。在第二个方面中，对位点之间距离的动态测量被用来区分阱中的位点以及区分不同阱中的位点。
参照图6，示出了用于识别基片上的阱的一个实施例的流程图。在一个优选实施例中，至少一部分检测到的位点被分析。例如，当实验使用阳性控制位点时，分析检测到的位点以确定所述阳性控制位点。基于对阳性控制位点位置的预先了解，软件可以在识别阱时搜索这些位点。在一个优选实施例中，阳性控制位点位于每个阱的上排(upper row)中。例如，如图14所示，每个阱的上排中的所有位点是检测到的位点。这样，如框126所示，首先确定了上对准排的位点。几何分析可以用来寻找每排阱中的每个阱内的最上排的位点。该排位点应该从左到右大致形成一条线。由于其它要求造成每个阱中除了这些处于最上排的位点以外的位点也许可见也许不可见，所以在一个优选实施例中，软件仅搜索最上排。每个阱的最上排被称为对准排，因为它保证存在并可见，且可以用来对阱中的也许可见也许不可见的其它位点做出几何假设。一个水平排的阱中的各个阱的所有对准排大致形成一条线的位点图案，软件可以将其作为目标。例如这条线穿过图14中的上排。这样，通过分析不同阱中检测到的位点，对阱的自动检测可以基于确定不同阱中非随机位点组的位置来实现，其中所述位点组形成沿着从左到右的一条交线的可辨别图案。
在上述图像分析之后搜索阱的一个方位(aspect)，例如对准排，除非阱的方位涉及比图像处理更抽象的物体。当位点在图像中定义为检测到的“块”时，可以基于块特性例如块面积和块圆度过滤所有检测到的块的当前集(set)。基于预定特性，可以配置块的可接受值范围。这种过滤去除了不可能是有效杂交位点的块。数据集不过度充斥着会随机产生无意识图案的无关物体，这对后续处理是高效且有利的。
符合杂交位点的预定过滤标准的块被集合到新的数据集中，该数据集表示可能的杂交位点的当前集，称为总位点集。一旦确定了总位点集，构建称为索引相交图像(Indexed Intersection Image，I3)的人为图像。利用每个位点的索引值作为组成像素值(constituent pixel value)，软件人工地将位点形状变为I3图像。I3图像使得软件可以有效地计算位点和线之间的交集。
前向排扫描(forward row scan)可以在所获取图像的任何方位开始。在一个优选实施例中，前向排扫描在图像的顶部开始，并向下朝向图像的底部进行。排扫描首先试图确定上排阱的对准位点排的位置，然后试图确定下排阱的对准位点排的位置。
一旦正确地确定了上对准排的位置，可以通过能够基于上对准排特性进行的试探计算来帮助搜索下对准阱。前向排扫描中计算的基本单位是位点集。通过遍历I3图像的从左边缘到右边缘的虚拟线并收集相交的位点来初始定义位点集。只要所得位点集是空，前向排扫描就向前移动指定数量的像素排。一旦初始位点集为非空，可以进行迭代收敛以精选位点集的直线交点(linear intersection)并提高其质量。
有若干位点集收敛的方法可以使用。两个示例性方法包括静态方法和线拟合方法。线拟合方法能够容许输入图像中较高程度的可变性。但是，收敛的线拟合方法本身可能是不稳定的。静态收敛方法不容许很高程度的可变性，但是它非常稳定。因此，优选使用位点集的静态收敛，然后尝试利用线拟合收敛精选位点集。此组合实现了可变性容限和稳定性之间可以接受的妥协。
在静态收敛中，软件认为位点与满足公式y＝mx+b的线相交，但并不试图改变m，仅改变b。另外，仅修改b使得它能增大，而从不减小。为了静态收敛，计算出当前位点集的平均y质心，然后分配新的b项如下bnew=-m(Iwidth2)+bcurrent]]>其中，Iwidth是以像素表示的载片图像的宽度。新的位点集用与新线的交点来定义。重复该过程，直到两个相邻迭代产生相同的位点集。
在线拟合收敛中，软件认为位点与满足公式y＝mx+b的线相交，并试图调节m和b两者来正确地收敛位点集。为了进行线拟合收敛，软件对当前位点集的质心坐标进行最小二乘线拟合。所得线被用来定义新的位点集。重复该过程，直到两个相邻迭代产生相同的位点集。当尝试线拟合收敛时，软件考虑可配置范围的有效线斜率。如果超出该斜率范围则中断收敛。如果中断线拟合收敛，则选择通过静态拟合产生的位点集作为后退选择，并正常地继续所述处理。
在位点集已经通过收敛迭代被精选并稳定之后，对位点集中出现的图案进行定性分析。为了分析位点图案，软件认为位点集不是无序的，而是表示沿着从左到右的线相交的位点。如上所述，可以分析阱的已知特性从而得出与无序位点有关的结论。此线性位点图案的两个特性元素是位点之间的空间隙和位点本身。对特性元素的分析可以采用各种形式。一种形式是将位点集变换成有利于符号图案匹配的抽象符号形式。
如框128所示，计算位点和阱间隙。位点集图案的一个基本元素是沿线的位点之间的间隙。软件可以收集至少一部分(优选全部)间隙距离，并试图将它们分组为间隙类(Gap Class)。间隙类是不同于其它的、测得的、在统计上相近而可以视为相同的位点间间隙的集合。
基于计算得到的间隙，确定阱和/或阱图案中的位点数，如框130所示。例如，基于计算得到的间隙，可以确定具体阱的布局(位点数、阱内位点分布、布局等)。为了实现这一点，收集间隙，利用试探法将其聚结成类，进行排序，然后根据沿线每个间隙类的出现频率分配符号。位点间间隙本身并不分配符号，而是每个间隙类被分配以符号。符号用字符a到f表示。
最频繁出现的间隙类可以分配a，次最频繁出现的间隙类分配b，依此类推。在分配间隙类符号时，可以使用若干次的试探来防止出现错误的位点集。
在一个正确形成的对准排上，阱的对准排中位点之间的间隙应该是最频繁出现的间隙类，其用符号a表示。
一旦分配了间隙类符号，这些符号可以与线性位点图案的另一基本元素，即位点本身组合。位点可以用符号S表示。每个实际的位点间间隙可以用与该实际间隙所属的间隙类对应的符号来表示。
变换成符号形式的线性位点图案可能看上去类似于以下示例cSaSaSaSbScSdScSaSaSaScSaSbScSaSaSaSb上述示例性符号形式表示了三个阱的组，每个阱由横向的四个位点构成。该形式还示出了出现在线性位点集中的各种无关位点，即噪声。
在位点集已经变换成符号形式之后，软件可以基于规则的表达式，利用图案匹配机制来确定当前的位点集是否表示有效的对准排。用来匹配对准排的规则表达式是可设置的，其包括用来描述定义每个阱的符号子集的子组定义。
在建立表示位点、位点集、间隙类和线性位点集的符号形式的数据结构期间，软件保持各种抽象概念之间的链接(link)。这些链接使得能够进行反向遍历，从而由通过规则表达式匹配找到的子串，软件可以基于每个符号的串索引，确定该子串代表的实际位点的集。
假定规则表达式如下(SaSaS)(aS)+图案匹配将如下解构所述示例性符号位点集
c(SaSaSaS)bScSdSc(SaSaSaS)cSaSbSc(SaSaSaS)b括号中的子组每个代表一个检测到的阱。
对于有效的对准排，软件利用保持在各个抽象概念之间的链接来建立表示位点群的数据结构。每个位点群代表在水平方向上沿着构成一个阱的对准排的从左到右的线的一组位点。检测到的阱用可从阱的位点群得到的特性来定义。
如果位点集不是有效的对准排，则软件使当前的前向排扫描向前越过当前的位点集，并再次继续以在另一个位点集上收敛。使当前的前向排扫描向前越过当前的位点集是通过在不调节m项的情况下增长线公式中的b项来实现的。b项增大，直到两个相邻迭代产生不同的位点集。
基于阱中位点数的确定，构建阱掩码(mask)，如框132所示。在已经找到对准排的情况下，软件利用来自对准排中的实际位点的量度数据为每个阱构建所期望位点的掩码。例如，如果预定阱的几何形状是方形，那么在向下方向上就存在与对准排横向上的位点一样多的位点。具体而言，如果基于图案匹配确定阱是3×3阱，并且如果对准排(顶部三个位点)已经找到，则可以找到两个下方的排，因为软件知道两个下方的排会排列在上对准排的下方，每个具有三个位点。
对于对准排中的每个位点，在下方插入一列位点掩码。当计算垂直的一列位点掩码时，软件考虑表示载片上整个对准排的线性公式。插入的位点掩码的圆直径是基于整个载片的对准排位点的平均直径。
每个插入的位点的位置如下计算θmask_column=tan-1(-1m)]]>yi′＝yi-1′+D|sinθ| 其中(xi′，yi′)是每个插入掩码位点的质心坐标，D是整个对准排上的位点之间的平均位点到位点距离。注意，(x0′，y0′)是对准排位点的质心坐标。因此，基于找到对准排并基于图案匹配，软件确定阱内的每个位点。例如，图14用表示上对准排的圆圈和表示基于对准排确定的位点的圆圈示出了阱中检测到的位点。
位点量化在识别了阱之后，确定阱内的个体位点的数量。例如，用于检测纳米粒子的光电传感器可能饱和，限制了可以从图像获得的信息量。图15示出了这个问题的一个例子，该图示出了一组样品的照片，其中光电传感器具有特定曝光时间。图15显示了光电传感器的固有局限。光电传感器利用固定的一组参数(即一个曝光时间)得到该测试“快照”。因此，从不同组的样品提取的数据受到限制。例如，从图15的左上方的样品提取的数据由于光电传感器完全饱和而受到限制。类似地，图15的右下方和左下方区域中的样品提供有限的数据，因为光没有被记录。仅图15的右上方部分的样品提供最佳数据提取。这是由于光电传感器处于传感器的动态范围(即，光被记录下来但是还没有达到显著饱和的程度)。因此，图15所示的该“快照”仅提供了有限的数据，严重影响了在反射光变化较大的情况进行成像的能力，而这种情况在对DNA杂交位点成像时是经常发生的。
为了从样品提取可用信息，传感器的动态范围必须增大，以便能够在图像的感兴趣的区域内获得更多有用信息。此动态范围的增大通过控制传感器记录的电磁辐射的量来实现。如上所述，在一个优选实施例中，控制传感器记录的电磁辐射的量可以通过改变控制入射在传感器上的光的参数，例如曝光时间、孔径大小等来实现。此外，也可以使用影响传感器上记录的光量的其它参数。然后，基于改变了的传感器参数(例如，不同的曝光时间)获取数据，这在下文中将更为详细地说明。随后，分析数据，以检测纳米粒子的记录情况，这将在下文中说明。
图16a-16d示出了可以通过改变记录在样品上的光量而获得的数据的示例。参照图16a，示出了阱内的三个位点(例如，一个阳性控制测试位点164、一个阴性控制测试位点166和一个目标测试位点168)。如上所述，阱是一种组织方法，其中可以将一组实验设置在一起并可以通过读取阱中的部分或全部信息而得出决定。对图16a中的阱进行记录的传感器具有较短的曝光时间；因此，该传感器没有记录下强度或记录下极小量的强度(位点是黑色的)。图16b至16d延长了传感器的曝光时间，因此使得更多的光传递到传感器。如图16b所示，阳性控制测试位点和目标测试位点开始记录(为灰色的)，而阴性控制测试位点保持黑色。在图16c中曝光时间再次延长，使得阳性控制测试位点和目标测试位点饱和(为白色的)，而阴性控制测试位点开始记录强度。在图16d中曝光时间再次延长，使得所有三个位点都饱和。一系列的图示出了传感器的限制和提取有用信息的可能性。对于图16a-16d所示的示例，可以基于目标测试位点与阳性控制测试位点或阴性控制测试位点的比较，通过检查图16b或16c得出目标测试位点是阳性测试位点的结论。
供选地，如图17所示，对目标测试位点的分析可以以不同方式进行。图中示出了五个控制位点170和一个目标测试位点172。可以改变影响记录在样品上的光的参数，使得目标测试位点可以在传感器的动态范围内。例如，可以改变曝光，使得目标测试位点可以接近传感器的饱和或处于饱和开始之处。然后，可以将目标测试位点与控制测试位点比较，并可以基于比较作出判定。图17示出了总共五个控制位点；但是，也可以使用更少或更多的控制位点。如图17所示，目标测试位点与从顶部开始的第二个控制位点最相象。
如图16和17所示，传感器的动态范围可以通过调节传感器的参数，例如曝光时间，而自动调节。在一个优选实施例中，图像中感兴趣的区域，例如阱，可以利用不同的曝光时间来分析。例如，图14示出了特定阱中用围绕位点的方框画出的感兴趣的区域。在感兴趣区域的暗水平到饱和水平之间(或仅在饱和情况下)可以采取各种曝光时间。通过这种方式，传感器工作在其线性范围中，从而提供更多的有用数据，以供分析阱内的位点以及/或者阱之间的位点。
参照图7，其示出了确定基片上位点数量的一个实施例的流程图。在一个实施例中，图像被分为不同的区域(例如，在阱识别过程中识别的不同阱)。然后，对于不同的区域用不同的曝光时间成像。如框134所示，通过读取光电传感器图像获取图像。可选地，可以对图像进行过滤，例如通过除斑处理，除去图像中的污物、灰尘等，如框136所示。该步骤类似于图5中的除斑步骤(框108)。
然后读取图像，如框138所示。在该步骤中，读取图像中当前感兴趣区域的部分。例如，如果阱#1是第一感兴趣区域，则读取阱#1的像素值(如阱识别过程中所确定的)。如图14所示，基片上阱的强度和清晰度根据阱的位置而变化。例如，阱2的强度/清晰度不同于阱5。因此，集中于一个感兴趣的区域，例如一个特定的阱，会有助于进行处理。
然后，确定是否找到最佳的曝光，如框140所示。在对基片上特定区域多次曝光之前，优选得到“最佳”曝光时间。如上所述，“最佳”曝光时间可以定义为传感器所记录的、基于传感器的特性最有利于检测基片上的位点的电磁辐射的量。在当前示例中，“最佳”曝光时间还可以定义为处于或接近处于传感器线性范围的外边界。在一个优选实施例中，传感器的线性范围的外边界可以定量为图像的百分比饱和度。例如，可以分析读取的像素，以确定是否获得最佳曝光时间，如框142所示。具体而言，分析所读取的像素，以确定是否像素值的某个百分比(例如1％)是饱和值。基于所确定的百分比，增大(如果少于希望数量的像素饱和)或减小(如果多于希望数量的像素饱和)曝光时间。在找到最佳曝光时间之后，图像可以可选地经历灰度和空间畸变校正，如框144和146所示。这些校正模型已经参照图5的框112和114说明了。此后，输出某个感兴趣区域中位点中的经校正的像素值，如框148所示。
由于在传感器的线性范围中寻求多次曝光，所以询问是否寻求对特定区域(例如阱)的附加曝光，如框150所示。例如，如果在线性范围寻求四次曝光，并且“最佳”曝光是100毫秒，则以25毫秒、50毫秒和75毫秒获取对感兴趣区域的三次附加曝光。因此，优选曝光时间均匀分布在0到最佳曝光时间的范围内。供选地，可以在0到最佳曝光时间的范围内选择不同的曝光时间。然后，对于特定感兴趣区域系统以不同曝光时间重复。如框150所示，对于某个感兴趣区域获得全部曝光之后，询问是否存在任何其它感兴趣的区域(即任何其它要被分析的阱)，如框152所述。如存在其它区域，则通过首先获取该感兴趣区域的最佳曝光，然后以不同曝光时间获取图像，来重复所述程序。
参照图18，其示出了载片上阱中的各个位点的多个曝光时间与像素值之间关系的实验数据的图表。x坐标是以毫秒为单位的时间，y坐标是像素值的总和。例如，示出了载片上每十个阱的一排位点的结果。如图所示，需要较宽范围的曝光时间(10-100毫秒)以从图像获取有意义的数据。因此，关注感兴趣的特定区域并在感兴趣的区域内获取不同曝光的图像有助于确定位点的数量。
判定统计判定统计分析位点量化的结果从而得出结论。
基于各个位点的输出像素值，对于预定的曝光时间，通过回归分析可以确定“导出”像素值。在一个优选实施例中，“预定”曝光时间选择为最长的“最佳”曝光时间。其它曝光时间可以被选择作为预定曝光时间。基于该最长的“最佳”曝光时间，可以对阱中每个像素确定“导出”像素值。
图19示出了导出像素值的一个示例，其具有x轴上的曝光时间(t)和y轴上的像素强度值(I)。如图所示，图表的第一部分174中，曝光时间非常小，且像素值强度小。这些曝光时间表明样品还没有开始可察觉地被记录在传感器上。图表中的第二部分176中，强度开始增大，并且可以获得有用的数据。第三部分178中，强度开始趋于稳定。该第三部分178中，传感器饱和，并且有用的数据受到限制。
图19所示的值对应于特定阱内的位点。如上所述，最佳曝光时间优选基于图像的一部分(例如图像中整个阱的部分，例如图14中围绕阱画的方框)来确定。一旦确定了最佳图像，采取优选小于该最佳曝光的不同曝光。例如，如果最佳曝光是100毫秒，则可以采取20毫秒、40毫秒、60毫秒和80毫秒的四个不同曝光。曲线“A”是五次曝光中对特定阱内阳性控制测试样品中的一个像素的读数。曲线“B”是五次曝光中对特定阱内目标测试样品的一个像素的读数。曲线“C”是五次曝光中对特定阱内阴性控制测试样品的一个像素的读数。曲线“A”曝光时间(t＝100毫秒)情况下的像素强度值(I)处于目标阱的第三部分178中，其值为1023。饱和区域中的值(图19中的1023)不值得比较，因为传感器已经停止记录额外的强度。为了比较数据，应该修正处于饱和区域中的像素强度值。在一个实施例中，这是通过如框154所示对位点中的每个像素值进行回归分析，然后如框156所示外推或内插表示处于相同曝光值的所有像素的曲线来进行的。
在一个实施例中，基于对第二区域176中的数据点拟合的曲线函数，确定一曝光时间下的强度。例如，为了确定控制样品的强度，基于图表的第二部分中的值外推所述值。图19中用虚线示出这一情况，该图示出了强度的修正值(图19中约为2000)。这种外推可以采取线性外推的形式，如图19所示。供选地，可以对图表的第二部分进行曲线拟合，然后延伸该曲线至感兴趣的曝光时间，以确定不同的强度。对于曲线“B”和“C”，t＝100毫秒处的值不需要进行外推，因为没有发生深度饱和。因此，可以从读数(曲线“B”和“C”上分别为750和740)直接读取这些值，或者可以内插得到这些值。这样，可以为一个区域中的每个像素导出(或者通过外推或者通过内插数据点)预定曝光时间下的像素强度值。
如框158所示，基于所提供的信息，例如测试和样品标识，可以将阱中的位点组确定为目标、阳性控制或阴性控制。确定位点组的步骤可以在框154中的回归分析、框156中的外推/内插以及/或者框160中的计算之前或之后进行。
由这些导出的像素值，可以进行统计分析，从而确定目标位点是与控制阳性位点更相象还是与控制阴性位点更相象。结果可能是阳性结果或阴性结果的传染病测试可以采用这样的实施例。供选地，目标位点可以直接彼此比较。结果是野生型、变异体或杂合型的遗传特性(genetic disposition)测试可以利用各种目标位点的直接比较。位点可以基于位点中所有导出像素的总和、位点中导出像素的平均值、以及位点中导出像素的标准偏差来进行比较，如框160所示。由这些值，可以进行诸如均值之间差值(differences betweenmeans)之类的统计测试(t-测试、z-测试等)，以比较位点和位点组，如框162所示。供选地，位点可以利用百分比差分计算(percentage differencecalculation)或比率计算(ratio calculation)来彼此比较。
在此已经描述了本发明的优选实施例。当然，应该理解，在不偏离所附权利要求所界定的本发明的真实范围的情况下，可以对实施例做出修改和改变。本实施例优选包括逻辑(logic)从而以软件模块将所描述的方法实现为一组计算机可执行软件指令。处理器实现控制系统中至少一个模块(包括照明模块、电源模块、成像模块和输入/输出模块)的操作的逻辑。处理器运行软件以提供所描述的功能，所述软件可以由本领域技术人员编程得到。
软件可以表现为保存在上述如图2所示存储器设备70之类的计算机可读介质上的二进制位序列。计算机可读介质可以包括磁盘、光盘以及处理器可读的任何其它易失性固件(例如随机存取存储器(“RAM”))或非易失性固件(例如只读存储器(“ROM”))存储系统。保存数据位的存储位置还包括具有与所存储的数据位对应的特定电、磁、光或有机特性的物理位置。处理器利用存储系统将软件指令作为数据位来执行，导致电信号表示的转变，以及数据位在存储系统中在存储位置的维持，从而配置或以其它方式改变单元的操作。可执行软件代码可以实现例如上述的各种方法。
应该理解，硬件实施例可以采取各种不同的形式。硬件可以实现为具有定制的栅(gate)阵列的集成电路或专用集成电路(“ASIC”)。实施例还可以利用分散的硬件部件和电路来实现。特别地，应该理解，流程框图中描述的逻辑结构和方法步骤可以以诸如ASIC之类的专用硬件来实现，或者实现为由微处理器或其它计算装置执行的程序指令。
除非特别说明，权利要求不应视为限制所描述的要素的顺序。另外，任何权利要求中术语“手段(means)”的使用都意图援引U.S.C.35第112条第6款的规定，而所有没有出现词语“手段”的权利要求并不意图如此。因此，落入所附权利要求及其等同物的范围和精神内的所有实施例都作为本发明要求保护。本公开内容意图覆盖本发明相邻技术领域中总体上遵循本发明原理的本发明的所有变形、用途或改用。
本申请是2002年8月3日提交的题为“Nanoparticle Imaging System andMethod”的申请No.10/210959的部分继续，该在先申请的全部内容通过引用结合于此。申请No.10/210959要求享有2001年8月3日提交的题为“Nanoparticle Imaging System and Method”的美国临时申请No.60/310102的优先权。本申请通过引用将美国专利申请No.60/310102的全部内容结合于此。申请No.10/210959还要求享有2002年3月22日提交的题为“Method andSystem for Detecting Nanoparticles”的美国临时申请No.60/366732的优先权。本申请通过引用将美国专利申请No.60/366732的全部内容结合于此。
权利要求
1.一种用于检测具有光接收边缘的基片上的粒子的设备，所述设备以组合方式包括基片保持架；处理器；与所述处理器通信的存储器；与所述处理器通信的成像模块，该成像模块相对于所述基片保持架具有固定的位置；照明模块，其通过用光照明所述光接收边缘以在所述基片内产生全内反射来照明所述基片；以及一组指令，其存储在所述存储器中，并可由所述处理器执行，以接收来自所述成像模块的输入和提供指示是否检测到粒子的输出。
2.如权利要求1所述设备，其中，所述成像模块和基片保持架彼此相距大于30mm且小于356mm。
3.如权利要求2所述的设备，其中，所述成像模块包括光电传感器，该光电传感器距离所述基片保持架小于70mm。
4.如权利要求1所述的设备，其中，所述处理器、存储器件、成像模块、基片保持架、照明模块、输出模块和输入模块容纳在一外壳内。
5.如权利要求1所述的设备，其中，所述纳米粒子利用化学信号放大被放大。
6.如权利要求1所述的设备，其中，所述存储器件包括补偿模块，所述处理器访问该补偿模块以补偿通过所述成像模块获取的图像中的畸变。
7.如权利要求6所述的设备，其中，所述补偿模块补偿灰度畸变。
8.如权利要求6所述的设备，其中，所述补偿模块补偿空间畸变。
9.如权利要求1所述的设备，其中，所述存储器件包括被构造来执行以下步骤的程序通过所述成像模块获取所述基片保持架中的基片的多个图像，所述基片具有包含测试样品的至少一个测试位点和作为控制位点或第二测试位点的至少另一个位点，所述多个图像以不同的曝光取得；以及基于所述位点的多个图像，确定所述一个测试位点中金属纳米粒子络合物的存在，作为所述目标分析物中的一种或多种存在的指示。
10.如权利要求9所述的设备，其中，确定包含所述测试样品的所述位点中所述金属纳米粒子络合物的存在的步骤包括对所述多个图像中包含所述一个测试位点以及所述控制或第二测试位点的部分进行回归分析，从而为每个位点生成曝光时间与强度的函数；选择曝光时间；基于所生成的函数，确定对于所选择的曝光时间所述一个测试位点以及所述控制或第二测试位点的强度；以及基于所选择的曝光时间下所述一个测试位点的强度与所述控制或第二测试位点的强度的比较，确定包含所述测试样品的所述一个测试位点是否包含金属纳米粒子络合物。
11.如权利要求10所述的设备，其中，所选择的曝光时间是最佳曝光时间。
12.如权利要求1所述的设备，其中，所述存储器件包括配置来执行以下步骤的程序自动检测所述基片保持架中的基片上的位点，所述基片具有多个阱；以及基于对至少一部分位点的自动检测，自动确定所述阱。
13.如权利要求12所述的设备，其中，自动确定所述阱的步骤包括自动确定至少一些被检测到的位点之间的间距；以及基于所述间距，自动确定位于至少一个阱内的位点。
14.如权利要求12所述的设备，其中，自动确定所述阱的步骤包括自动确定至少一部分被检测到的位点的图案；以及将所述图案与用于阱的预定图案自动进行比较。
15.在具有光接收边缘和包含一种或多种目标分析物的特定结合补体的多个位点的基片中，至少一个位点是在出现一种或多种目标分析物时金属纳米粒子将络合于其上的测试位点，另一位点是控制位点或在出现第二种或更多种目标分析物时金属纳米粒子在信号放大或无信号放大情况下络合于其上的第二测试位点，一种用于检测所述测试位点中是否存在所述一种或多种目标分析物的方法，包括以下步骤照明所述基片的光接收边缘以在所述基片内产生全内反射，从而照明所述基片的表面；获取所述测试位点和所述控制或第二测试位点的多个图像，所述多个图像以不同的曝光取得；以及基于所获取的位点的多个图像，确定所述测试位点中所述金属纳米粒子络合物的存在，作为一种或更多所述目标分析物的存在的指示。
16.如权利要求15所述的方法，其中，所述控制位点选自包括经核酸捕捉链直接配对到所述基片的金属纳米粒子、直接印制在所述基片上的金属纳米粒子、以及络合到置于单独阱中的已知分析物上的金属纳米粒子的阳性结果的组。
17.如权利要求15所述的方法，其中，所述测试样品是来自野生型核酸序列的核酸；并且所述比较样品是来自与所述野生型核酸序列相关的变异核酸序列的核酸。
18.如权利要求15所述的方法，其中，所述基片包括多个阱，至少一个阱包含所述测试和比较位点；所述方法还包括确定所述阱的最佳曝光时间的步骤；并且所述获取的图像是在该最佳曝光时间以及比该最佳曝光时间短的至少一个曝光时间下取得的。
19.如权利要求18所述的方法，其中，确定最佳曝光时间的步骤包括确定导致所获取的图像的预定饱和的曝光时间。
20.如权利要求15所述的方法，其中，确定包含所述测试样品的所述位点中所述金属纳米粒子络合物的存在的步骤包括对所述多个图像的包含所述测试位点和比较位点的部分进行回归分析以为每个位点生成曝光时间与强度的函数；选择最佳曝光时间；基于所生成的函数，确定所述最佳曝光时间下所述测试位点和控制位点的强度；以及基于所述最佳曝光时间下所述测试位点的强度与所述比较位点的强度的比较，确定包含测试样品的所述测试位点是否包含金属纳米粒子络合物。
21.如权利要求20所述的方法，其中，所述获取的图像产生为所述比较和测试位点分配的像素，这些像素具有像素值；进行回归分析的步骤包括对所述比较和测试位点中的像素值进行回归分析。
22.如权利要求21所述的方法，其中，选择最佳曝光时间的步骤包括确定导致所获取的图像的包含所述测试和比较位点的部分的预定饱和的曝光时间。
23.如权利要求22所述的方法，其中，基于所生成的函数确定所述最佳曝光时间下所述测试位点和比较位点的强度的步骤包括内插或外推所生成的函数。
24.如权利要求23所述的方法，其中，比较所述最佳曝光时间下所述测试位点的强度与所述控制位点的强度的步骤包括对所述比较和测试位点的强度进行统计分析以确定所述测试位点的强度与所述比较位点是相似还是不相似。
25.如权利要求24所述的方法，其中，进行统计分析的步骤包括进行均值间差值测试。
26.在具有光接收边缘和包含一种或多种目标分析物的特定结合补体的多个位点的基片中，至少一个位点是在出现一种或多种目标分析物时信号放大或没有信号放大的金属纳米粒子络合于其上的测试位点，另一个位点是控制位点或在出现第二种或更多种目标分析物时金属纳米粒子络合于其上的第二测试位点，一种检测所述多个位点的自动方法，包括以下步骤照明所述基片的光接收边缘以在所述基片内产生全内反射，从而照明所述基片的表面；获取所述基片的表面上包括金属纳米粒子的所述多个位点的至少一个图像；补偿所获取图像中的至少一种畸变；以及基于所获取的经补偿的图像，自动确定包括金属纳米粒子的所述多个位点的至少一些的位置。
27.如权利要求26所述的方法，其中，所述获取的步骤由图像模块执行，该图像模块与所述基片的表面相距小于或等于356mm。
28.如权利要求27所述的方法，其中，通过所述图像模块获取的图像包括所述基片的所述表面的全部或基本全部。
29.如权利要求27所述的方法，其中，所述图像模块是光电传感器。
30.如权利要求29所述的方法，其中，所述光电传感器是静止的。
31.如权利要求26所述的方法，其中，所述至少一个图像是利用图像器件获取的；并且所述获取至少一个图像的步骤包括获取所述图像而不相对彼此移动所述图像器件和所述基片。
32.如权利要求26所述的方法，其中，所述获取至少一个图像的步骤包括获取多个图像以得到最佳图像。
33.如权利要求26所述的方法，其中，所述校正至少一种畸变的步骤包括校正灰度畸变。
34.如权利要求33所述的方法，其中，所述至少一个图像是利用具有视场的图像器件获取的；并且校正灰度畸变包括对所述图像器件的视场上的亮度应用补偿模型。
35.如权利要求34所述的方法，其中，通过利用恒定光源在不同亮度值下获取图像，并利用经标定的一组过滤器产生在不同亮度值下获取的图像的曲线，来导出所述补偿模型。
36.如权利要求26所述的方法，其中，所述校正至少一种畸变的步骤包括校正空间畸变。
37.如权利要求36所述的方法，其中，校正空间畸变包括生成由于空间畸变而变形的多个点；生成未由于空间畸变而变形的多个点；基于所述多个变形的和未变形的点生成模型；以及将所述模型应用于所述获取的图像。
38.如权利要求26所述的方法，其中，还包括步骤对所述获取的图像的至少一部分进行自适应阈值处理。
全文摘要
一种用于对金属纳米粒子成像的设备和方法。本发明提供了一种用于检测金胶体粒子并向操作者准确汇报的设备和方法。该设备包括用于保持基片的基片保持架、处理器和存储器、成像模块、照明模块、输入模块和输入模块。该设备可以具有彼此邻近的静态基片保持架和成像模块。该设备提供了一种紧凑系统而不需要复杂的机动器件来跨基片移动照相机。此外，该设备和方法提供了对基片上的位点/阱的自动检测、对基片上位点的自动定量、以及基于判定统计对位点的自动解释。
文档编号C12M1/34GK1934450SQ200580008360
公开日2007年3月21日 申请日期2005年1月12日 优先权日2004年1月15日
发明者威廉·科克, 蒂姆·帕特诺, 马克·韦伯, 戴夫·莫罗, 韦斯利·白金汉 申请人:内诺斯佩尔公司