专利名称：犬的冷和薄荷醇敏感受体1的制作方法
技术领域：
本发明涉及热受体离子通道蛋白。具体地说，本发明涉及新型犬的冷和薄荷醇敏感受体CMR1的分离核酸分子和多肽及其用途。
背景技术：
为阐明涉及神经元组织中热感和冷感检测、转导和传送的生物机制，已付出了相当大的努力。热刺激活化位于感觉神经元(例如来源于背根神经节(DRG)和三叉神经节(TG)的感觉神经元)上的特化受体。当这些刺激在伤害范围(即非常热或非常冷)内时，其活化称为疼痛感受器的感觉神经元亚群(疼痛感受神经元)上的某一小类热受体。在活化时，热受体(例如离子通道)将有伤害刺激转导为电信号，该电信号沿着感觉神经元传播至脊髓，在脊髓中其被转播至脑，最终产生痛感。因此，这些热受体代表用于开发各种疼痛病症治疗药物的高度有前景的靶。
几种温度活化型受体参与感受热。TRPV1(VR1一种辣椒素和热活化通道)在接近43℃-大部分哺乳动物感受为伤害的温度时被活化。与TRPV1的氨基酸水平同一性高于40％的其它TRPV通道也已被克隆，并表征为热传感器。这些通道在不同热阈值被活化，由TRPV3的39℃(温热)至TRPV2/VRL1的55℃(高阈值伤害热)之间变动(参见Story等，Cell，2003，112819-829，以及其中的参考文献)。相反，TRPV4于室温组成型开启，在高于约27℃的温度被活化(Güler等，J.Neurosci.2002)。这些温度活化受体属于非选择性阳离子通道的瞬时受体电位(TRP)家族，其在秀丽隐杆线虫(C.elegans)和黑腹果蝇(D.melanogaster)中参与机械调节和渗透调节。TRP通道被分为3个亚家族，称为TRPC(阳离子或电容性亚家族)、TRPV(香草酸亚家族)和TRPM(促黑素抑制素亚家族)。全部亚家族都具有6个推定的跨膜结构域，在跨膜结构域5和6之间提出具有孔区。TRP通道被认为具有胞质N-和C-端(参见Story等，出处同上，以及其中的参考文献)。
新近，已发现属于TRP蛋白家族并调节对冷刺激反应的蛋白。大鼠CMR1蛋白(代表“冷和薄荷醇敏感受体”；McKemy，D.D.等，Nature，41652-58，2002)和小鼠TRPM8蛋白(代表“瞬时受体电位通道，促黑素抑制素亚家族，8型”；Peier，A.M.等，Cell 108705-715，2002)似乎起兴奋性离子通道的作用，此兴奋性离子通道在接触相对低温时被活化。TRPM8活化的域值约为23℃。大鼠CMR1和小鼠TRPM8还对激起冷感的化合物敏感，例如薄荷醇和Icilin。令人感兴趣的是，大鼠CMR1和小鼠TRPM8在其全长氨基酸序列中共有90％以上的序列同一性。
有需要鉴别其它的热受体，因为其是治疗疼痛的潜在靶。还有需要鉴别不同物种中的热受体，因为其可用作研究测试化合物作用的模型系统。具体地说，需要可用于测试化合物的系统，该化合物潜在地增加或降低热受体对冷刺激的反应活性。这种化合物的鉴别和测试应能治疗各种与慢性疼痛相关的疾病或用于其中需要组织冷却的其它病症。
发明概述现在已经发现，本文称为犬CMR1(cCMR1)的犬蛋白调节对冷刺激的反应，属于TRP蛋白家族。
在一个一般方面，本发明提供分离的核酸分子，其包含的核苷酸序列编码的多肽能够检测和转导冷刺激，与SEQ ID NO2具有至少96％的序列同一性。在一个实施方案中，本发明提供分离的核酸分子，其包含的核苷酸序列编码的cCMR1蛋白具有SEQ ID NO2的氨基酸序列。本发明还提供含本发明核酸分子的表达载体或重组宿主细胞。本发明进一步提供在严格杂交条件下与本发明的核酸分子选择性杂交的核酸探针，以及含这种探针的试剂盒。
在另一个一般方面，本发明提供基本纯化的多肽，其能够检测和转导冷刺激，并与SEQ ID NO2具有至少96％的序列同一性。在一个实施方案中，本发明提供基本纯化的多肽，其包含的cCMR1蛋白具有SEQ ID NO2的氨基酸序列。本发明还提供表达本发明多肽的方法，其包括以下步骤a)将能够编码本发明多肽的表达载体导入细胞中；和b)在允许表达载体表达该多肽的条件下培养细胞。本发明进一步提供选择性结合本发明多肽的抗体和包含这种抗体的试剂盒。
本发明提供检测本发明的核酸分子或多肽的方法，其包括以下步骤使核酸分子或多肽与能够特异性结合该核酸分子或多肽的物质接触。
本发明提供增加或降低cCMR1蛋白表达的化合物的鉴别方法，其包括以下步骤(a)使测试化合物与含cCMR基因表达调节机制的细胞接触；和(b)测定测试化合物是否增加或降低细胞的所述机制控制的基因表达。
本发明还提供增加或降低cCMR1离子通道电导率的化合物的鉴别方法，其包括以下步骤(a)使测试化合物与离子通道接触；和(b)测定测试化合物是否增加或降低离子通道的电导率。
本发明的其它方面包括增加或降低哺乳动物CMR1离子通道电导率的化合物的鉴别方法，其包括以下步骤(a)在含亚失活量钙的缓冲溶液中温育离子通道；(b)活化离子通道；(c)使离子通道与测试化合物接触；(d)增加缓冲溶液中的钙量；和(e)测定胞内钙量，并将该量与其中离子通道未接触测试化合物的对照的胞内钙量对比。
另外，本发明提供用于治疗疼痛的化合物的鉴别方法，其包括以下步骤(a)使测试化合物与cCMR1离子通道接触；和(b)测定测试化合物是否增加或降低离子通道的电导率。在某些实施方案中，该方法进一步包括以下步骤(a)给予动物测试化合物；和(b)测定测试化合物改变动物的伤害感受/伤害防御反应的程度。
由以下的公开内容，包括本发明的详述及其优选实施方案和所附权利要求书，本发明的其它方面、特征和优势是显而易见的。
附图简述
图1图示了用犬CMR1表达载体稳定转染的重组细胞的细胞型钙内流实验的结果。在10μM Icilin(实心圆)或100μM(-)-薄荷醇(空心圆)作用下，细胞显示钙介导的荧光增加。于200秒的时间点向细胞加入化合物。当将单独的缓冲液加入细胞中时(空心三角)，未观测到钙内流。
图2图示了使用基本无钙的荷载缓冲液的细胞型钙内流实验的结果。用大鼠CMR1表达载体稳定转染的重组细胞(实心圆)在加入4mM Ca2+时显示出钙介导的荧光增加。未转化细胞(空心圆)在加入4mM Ca2+时Ca2+内流较少。在10秒的时间点向细胞中加入C2+。
图3图示了用刺激性化合物芥子油活化cCMR1。当力加入1mM芥子油(划线)或作为阳性对照的100nM Icilin(实线)时，用cCMR1稳定转染的重组细胞显示出钙介导的荧光增加。单独的缓冲液用作阴性对照(点线)。
图4表明，cCMR1强外向整流，对阳离子是非选择性的。实线代表在100μM薄荷醇存在下进行的cCMR1全细胞膜片钳记录，而虚线代表缓冲液对照。
图5图示了cCMR1的温度敏感性。通过细胞的电流随着cCMR1表达细胞灌注溶液温度的降低而显著增加，这表明活化域值约为17℃。
图6表明胞外Ca2+脱敏cCMR1通道。最低的轨迹代表在100μM薄荷醇存在下及没有胞外Ca2+时的cCMR1全细胞膜片钳记录，而最上部对无Ca2+轨迹归一化以显示清晰性的黑色轨迹代表在1.8mM胞外Ca2+存在下由100μM薄荷醇活化的电流。
图7表明胞外Ca2+浓度依赖性抑制cCMR1通道的电流幅度。通道的电压钳位为-80mV，由1mM薄荷醇活化。虚线是代表对数据最佳拟合的逻辑函数，IC50值为1.6mM。
图8表明胞外Ca2+电压依赖性抑制cCMR1通道的电流幅度。通道由1mM薄荷醇活化。
发明详述本文提及的所有出版物通过引用结合到本文中。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语所具有的含义都和本发明所属领域一般技术人员通常理解的含义相同。
本文使用的术语“包含”、“含有”、“具有”和“包括”以其开放无限制的意义使用。
以下是在本说明书中时常使用的缩写词Bp＝碱基对cDNA＝互补DNACMR1＝冷和薄荷醇敏感受体1；cCMR1＝犬的冷和薄荷醇敏感受体1；DRG＝背根神经节ELISA＝酶联免疫吸附测定FLIPR＝荧光成像读板仪kb＝千碱基对，1000个碱基对nt＝核苷酸PAGE＝聚丙烯酰胺凝胶电泳
PCR＝聚合酶链反应RT-PCR＝反转录聚合酶链反应SDS＝十二烷基硫酸钠SSC＝氯化钠/柠檬酸钠TG＝三叉神经节TRPM8＝瞬时受体电位通道，促黑素抑制素亚家族，8型UTR＝非翻译区多肽或核酸的“活性”、“生物活性”或“功能活性”指多肽或核酸分子产生的活性，其按照标准技术体内或体外测定。这种活性可为直接活性，例如离子通道活性、与第二种蛋白结合或对第二种蛋白的酶活性，或者可为间接活性，例如由蛋白与一种或多种其它蛋白或其它分子相互作用(包括但不限于在多步系列融合中发生的相互作用)而介导的细胞信号转导活性。
本文使用的“生物样品”指含细胞或组织物(例如分离自受试者的细胞或生物液体)或由其组成的样品。所述“受试者”可为已成为治疗、观测或实验对象的哺乳动物，例如大鼠、小鼠、猴或人。生物样品的实例包括例如痰、血液、血细胞(例如白细胞)、羊水、血浆、精液、骨髓、组织或细针活检样品、尿、腹膜液、胸膜液和细胞培养物。生物样品还可包括组织切片，例如为组织学用途而制作的冷冻切片。测试生物样品是已成为分析、监测或观察目标的生物样品。对照生物样品可为测试生物样品阳性对照或阴性对照中的任一种。对照生物样品经常包含与测试生物样品相同类型的目标组织、细胞和/或生物液体。
“细胞”指适于检测方法灵敏度的至少一个细胞或多个细胞。适于本发明的细胞可为细菌，但优选真核细胞，最优选哺乳动物细胞。
“克隆”是由单个细胞或共同祖先通过有丝分裂产生的一群细胞。“细胞系”是初级细胞，其产生克隆扩充的细胞，并能够在体外稳定生长许多代。
“冷和薄荷醇敏感受体”、“CMR1”、“瞬时受体电位通道，促黑素抑制素亚家族，8型”或“TRPM8”蛋白均指能够感觉和转导冷刺激的蛋白，所述冷刺激例如为低温或激起冷感的化合物，包括但不限于薄荷醇和Icilin。“CMR1”可形成兴奋性离子通道CMR1通道，其可由低温或激起冷感的化合物活化。活化的CMR1通道门控Ca++离子经该通道内流，引起膜去极化。CMR1蛋白可(1)与SEQ ID NO2所示犬CMR1(cCMR1)蛋白具有约80％以上的氨基酸序列同一性；或(2)结合针对SEQ ID NO2所示cCMR1蛋白产生的抗体，例如多克隆或单克隆抗体。在某些实施方案中，CMR1与SEQ ID NO2具有约85％、90％或95％以上的氨基酸序列同一性。代表性的CMR1包括cCMR1，其包括SEQ ID NO2所示cCMR1蛋白的结构和功能多态性。“多态性”指在群的个体中的特定遗传基因座上的一组遗传性变体。CMR1还包括犬CMR1在其它动物(包括人、大鼠、小鼠、猪、狗和猴)中的直向同源物，例如大鼠CMR1(GenBank蛋白IDNP_599198)或小鼠TRPM8(GenBank蛋白IDNP_599013)的结构和功能多态性。CMR1基因在某些神经元组织(例如DRG和TG)中天然表达。
“CMR1活化温度”是CMR1通道表现出的电导率和基线相比增加至少10％的温度。本领域技术人员可用实验方法确定CMR1通道的活化温度。在某些实施方案中，“CMR1活化温度”是CMR1通道表现出的电导率和基线相比增加至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％的温度。“CMR1活化温度”通常为约6℃-28℃。在某些实施方案中，CMR1活化温度约为15℃-28℃、19℃-28℃、23℃-28℃或19℃-24℃。
“CMR1非活化温度”是处于“CMR1活化温度”范围以外的温度。代表性的CMR1非活化温度为37℃。
“基因”是涉及生产肽、多肽或蛋白的DNA节段以及编码此蛋白种类的mRNA，包括编码区、编码区之前的非编码区(“5′UTR”)和之后的非编码区(“3′UTR”)。“基因”还可包括各个编码节段(“外显子”)之间的间插非编码序列(“内含子”)。“启动子”指涉及RNA聚合酶结合以启动基因转录的DNA调节序列。启动子经常位于基因转录起始位点的上游(“5′”)。“调节序列”指可控制基因表达的基因部分。“调节序列”可包括启动子、增强子和其它表达控制元件，例如聚腺苷酸化信号、核糖体结合位点(用于细菌表达)和/或操作子。“增强子”指可以以距离或方向依赖性方式调节基因表达的DNA调节序列。“编码区”指通过三联体碱基密码子编码氨基酸以及用于对应多肽翻译的起始和终止信号的基因部分。
“核酸序列”或“核苷酸序列”指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸残基以单链或双链形式在聚合物中的排列。核酸序列可由以下碱基的天然核苷酸和/或合成类似物组成胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶；分别缩写为T、A、C、G和U。
术语“寡核苷酸”指相对较短长度的单链DNA或RNA序列，例如少于100个残基长。对于许多方法，长度约16-25个核苷酸的寡核苷酸是有用的，尽管有时可使用约25个核苷酸以上的较长寡核苷酸。某些寡核苷酸可用作合成互补核酸链的“引物”。例如，DNA引物可在使用DNA聚合酶的反应中与互补核酸序列杂交，以引发互补DNA链的合成。寡核苷酸还在几种核酸检测方法(例如RNA印迹或原位杂交)中用于杂交。
“多肽序列”或“蛋白序列”指氨基酸残基在聚合物中的排列。多肽序列可由标准的20种天然氨基酸组成，还可加上稀有氨基酸和合成氨基酸类似物。较短的多肽一般称为肽。
“分离的”核酸分子是与该核酸天然来源中的其它核酸分子分离的核酸分子。“分离的”核酸分子可为例如没有至少一种核苷酸序列的核酸分子，该核苷酸序列在为该核酸来源的生物体基因组DNA中天然位于核酸分子侧翼的5′和3′末端。分离核酸分子包括但不限于独立于其它序列的分离核酸分子(例如通过PCR或限制性核酸内切酶处理产生的cDNA或基因组DNA片段)，以及整合到载体、自主复制质粒、病毒(例如逆转录病毒、腺病毒或疱疹病毒)中或整合到原核或真核生物基因组DNA中的核酸分子。另外，分离核酸分子可包括为杂合或融合核酸分子一部分的核酸分子。分离核酸分子可为(i)通过例如聚合酶链反应(PCR)体外扩增的核酸序列；(ii)通过例如化学合成而合成的核酸序列；(iii)通过克隆重组产生的核酸序列；或(iv)通过切割和电泳或层析分离而纯化的核酸序列。
“分离的”或“纯化的”蛋白或其生物活性部分基本没有获得该蛋白的细胞或组织来源的细胞物质或其它杂蛋白，或者基本没有化学合成时的化学前体或其它化学物质。表述“基本没有细胞物质”包括其中蛋白与分离或重组生产该蛋白的细胞的细胞组分分离的蛋白制备物。因此，基本无细胞物质的蛋白包括异源蛋白(在本文也称为“杂蛋白”)少于约30％、20％、10％或5％(干重)的蛋白制备物。当蛋白或其生物活性部分重组生产时，还优选其基本无培养基，即培养基占蛋白制备物体积少于约20％、10％或5％。当蛋白通过化学合成生产时，优选其基本无化学前体或其它化学物质，即其与参与合成该蛋白的化学前体或其它化学物质分离。因此，在这种蛋白制备物中，目的多肽以外的化学前体或化合物少于约30％、20％、10％、5％(干重)。分离的生物活性多肽可具有几种不同的物理形式。分离的多肽可作为全长的新生或未加工多肽存在，或作为部分加工的多肽存在，或作为加工多肽的组合存在。全长新生多肽可通过导致形成全长新生多肽片段的特异性蛋白水解切割事件翻译后修饰。片段或物理结合的片段可具有与全长多肽相关的生物活性；但是，与单个片段相关的生物活性程度可能有所不同。分离的或基本纯化的多肽可为由分离核酸序列编码的多肽，以及通过例如化学合成法合成的多肽，和由生物材料分离的多肽，然后使用常规蛋白分析或制备步骤将其纯化至允许按照本文所述方法使用的程度。
“重组体”指已使用分子生物学技术修饰为不同于其天然状态的核酸、由核酸编码的蛋白、细胞或病毒颗粒。例如，重组细胞可包含不存在于天然(非重组)形式细胞中的核苷酸序列，或者可表达在其它情况下异常表达、低表达或根本不表达的天然基因。重组细胞还包含存在于天然形式细胞中的基因，其中所述基因通过人工方法被修饰并再导入细胞中。该术语还包括含未由细胞中取出核酸就已被修饰的内源核酸的细胞；这种修饰包括例如通过基因置换和位点特异性突变获得的修饰。
“重组宿主细胞”是其中已导入重组DNA序列的细胞。可使用任何合适的方法，包括例如电穿孔、磷酸钙沉淀、显微注射、转化、基因枪和病毒感染，将重组DNA序列导入到宿主细胞中。重组DNA可整合或不整合(共价连接)入组成细胞基因组的染色体DNA中。例如，重组DNA可保持在游离型元件(例如质粒)上。或者，对于稳定转化或转染的细胞，重组DNA已整合入染色体中，使得其通过染色体复制遗传给子细胞。此稳定性由稳定转化或转染细胞建立由含外源DNA的子细胞群组成的细胞系或克隆的能力证实。重组宿主细胞可为原核或真核细胞，包括细菌，例如大肠杆菌；真菌细胞，例如酵母；哺乳动物细胞，例如人、牛、猪、猴和啮齿动物来源的细胞系；以及昆虫细胞，例如果蝇和蚕源细胞系。更要理解的是，术语“重组宿主细胞”不仅指具体的所述细胞，而且指该细胞的子代或潜在子代。因为某些修饰可由于突变或环境影响而在以后的各代中出现，所以这种子代可能实际上与亲代细胞不完全相同，但仍包括在本文使用的术语范围内。
本文使用的“有效连接”指两个核酸序列之间的功能关联。例如，控制编码序列表达(例如转录)的启动子序列有效连接至该编码序列。有效连接的核酸序列可为连续的，以许多启动子序列为代表，或者可为非连续的，例如核酸序列编码阻抑蛋白的情况。在重组表达载体中，“有效连接”意指例如在体外转录/翻译系统中或在宿主细胞(当载体导入到宿主细胞中时)中，目的编码序列以允许编码序列表达的方式连接至一个或多个调节序列。
“载体”或“构建物”指异源核酸可插入或已插入其中的核酸分子。某些载体可导入到允许载体复制或由允许载体或构建物编码的蛋白表达的宿主细胞中。载体通常具有选择标记(例如所编码蛋白提供药物抗性的基因)、复制序列起点和允许插入异源序列的多克隆位点。载体通常为质粒型，以小写字母“p”后接字母和/或数字的组合表示。本文公开的起始质粒可市售获得、在无限制基础上公开地获得或可通过应用本领域已知的方法由可获得的质粒构建。可按照本发明使用的许多质粒和其它克隆和表达载体对本领域技术人员来说是众所周知的，并可容易地获得。而且，技术人员可容易地构建许多适用于本发明的其它质粒。根据本文公开内容，技术人员显而易见这种质粒以及其它载体在本发明中的特性、结构和用途。
“序列”指其中单体在聚合物中存在的线性顺序，例如氨基酸在多肽中的顺序或核苷酸在多核苷酸中的顺序。
本领域已知的“序列同一性或相似性”是通过对比序列确定的两个或更多个多肽序列或两个或更多个多核苷酸序列之间的关系。在两个或更多个核酸序列或两个或更多个多肽序列之间关系的上下文下，本文使用的“同一性”分别指在序列最优比对和分析时相同的核苷酸或氨基酸残基的百分率。为对比查询序列和例如氨基酸序列SEQ IDNO 2，将查询序列与SEQ ID NO 2最优比对，获得在全长SEQ ID NO2(1104个氨基酸)中的最佳局部比对。
可人工或使用序列比较算法进行分析。对于序列比较，通常一个序列起参比序列的作用，查询序列与其比较。当使用序列比较算法时，将测试和参比序列输入到计算机中，指定子序列坐标，如果有需要，指定序列算法程序参数。
例如，可通过使用Needleman & Wunsch，J Mol.Biol.，48443(1970)的同源性比对算法，对比较的序列进行最优比对。Needleman &Wunsch分析的软件可通过巴斯德研究所(法国)生物学软件站点http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/needle.html公开地获得。NEEDLE程序使用Needleman-Wunsch全局比对算法，以在考虑其全长时获得两个序列的最优比对(包括空位)。按照所报告的比对区域(包括在长度中的任何空位)内两个序列之间的相同匹配百分率计算同一性。还提供相似性记分，其中按照所报告的比对区域(包括在长度中的任何空位)内两个序列之间的匹配百分率计算相似性。标准比较利用用于蛋白序列的EBLOSUM62矩阵和用于核苷酸序列的EDNAFULL矩阵。空位开放罚分是建立空位时减去的记分；默认设置使用的空位开放罚分为10.0。对于空位延伸，罚分加入空位中每个碱基或残基的标准空位罚分；默认设置为0.5。
杂交还可用作测试，以表明两个多核苷酸彼此基本相同。共有高度同一性的多核苷酸在严格杂交条件下彼此杂交。“严格杂交条件”具有本领域已知的含义，如Sambrook等，Molecular CloningALaboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，New York，(1989)所述。代表性的严格杂交条件包括约45℃下在6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，接着根据杂交多核苷酸共有互补性的长度，50-65℃下在0.2x SSC和0.1％SDS中进行一次或多次漂洗。
“报告基因”指编码报告基因产物的核酸序列。如本领域所知，报告基因产物通常易于通过标准方法检测。代表性的合适报告基因包括但不限于编码荧光素酶(lux)、β-半乳糖苷酶(lacZ)、绿色荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-葡糖醛酸酶、新霉素磷酸转移酶和鸟嘌呤黄嘌呤磷酸核糖基转移酶蛋白的基因。
“增加CMR1通道电导率的化合物”包括导致通过CMR1通道的离子增加的任何化合物。在一个实施方案中，这种化合物是结合CMR1通道以增加其电导率的CMR1通道激动剂。在另一个实施方案中，这种化合物是正别构调节物，其与CMR1通道在不同于激动剂结合位点的变构部位相互作用，但加强了通道对激动剂的反应。
“降低CMR1通道电导率的化合物”包括导致通过CMR1通道的离子减少的任何化合物。在一个实施方案中，这种化合物是结合CMR1通道以竞争或非竞争方式阻遏、降低或限制激动剂作用的CMR1通道拮抗剂。在另一个实施方案中，这种化合物是负别构调节物，其与CMR1通道在不同于激动剂或拮抗剂结合位点的变构部位相互作用，并降低通道对激动剂的反应。在又一实施方案中，这种化合物是结合CMR1通道并在没有任何其它化合物(例如激动剂)存在下降低通道电导率的反向激动剂。
本文使用的“膜电位”、“跨膜电位”或“跨膜电位差”均指跨越质膜(细胞的外界脂双层膜)的电位差。几乎所有的动物细胞内部都是负电位，静息电位在-20至-100mV的范围内。本文使用的“静息电位”指当细胞静止时细胞内部相对于其外界环境的电位。
本文使用的“去极化”指细胞膜电位变成为更正电的趋势，例如由-90mV至-50mV。
本文使用的“超极化”指细胞膜电位变成更负电的趋势，例如由-50mV至-90mV。在实施本发明时，使用分子生物学、微生物学和重组DNA中的许多常规技术。这些技术是众所周知的，阐述于例如CurrentProtocols in Molecular Biology，I、II和III卷，F.M.Ausubel编辑，(1997)；和Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(2001)。
在一个方面，本发明涉及新cCMR1(cCMR1)核酸、由这些核酸编码的多肽、重组cCMR1物质以及涉及这些物质的生产、检测和使用的方法。
CMR1命名法由McKemy，D.D.等，(Nature，41652-58，2002)建立，用于描述在大鼠的DRG和TG中表达的冷和薄荷醇敏感受体。人CMR1(也称为人TRPM8)与大鼠CMR1的氨基酸序列92％相同，先前已被鉴定为前列腺特异性转录物，还已发现其在各种肿瘤组织中表达，包括前列腺癌、黑素瘤、结直肠癌和乳癌(Tsavaler，L.等，Cancer Res.613760-3769，2002)。小鼠CMR1(也称为小鼠TRPM8)由小鼠DRG cDNA制备物克隆，已表明其与人CMR1氨基酸序列93％相同(Peier，A.M.等，Cell 108705-715，2002)。
在本发明中，由从犬DRG组织制备的cDNA文库克隆犬cCMR1基因。对cCMR1 cDNA测序，包括对应mRNA的cCMR1可读框(ORF)以及5′和3′非翻译区。cCMR1 cDNA序列如SEQ ID NO1(表1)所示。SEQ ID NO1编码一个1104个残基的多肽(SEQ ID NO2)，也示于表1，其与人、小鼠和大鼠的CMR1蛋白序列进行比对(参见表2)。基于此比对，cCMR1多肽与人CMR1共有95.23％的最高氨基酸同一性。
在本发明中，还将cCMR1核酸亚克隆入表达载体中，并转化入用于表达cCMR1蛋白的宿主细胞中。已表明，此重组cCMR1细胞系统表达功能性cCMR1蛋白，当重组cCMR1细胞于低温温育或接触薄荷醇或Icilin时，该功能性cCMR1蛋白允许Ca++离子内流。重组cCMR1系统用于筛选和鉴别调节cCMR1功能或表达的化合物。调节cCMR1功能或表达的化合物在治疗上可能是有用的。这些化合物可使用例如表达cCMR1蛋白的重组系统鉴别，然后在狗或任何其它合适的哺乳动物中体内测试，以确定可用于人的给药参数。
调节CMR1蛋白的功能或表达可能有利于治疗各种疼痛病症。因为CMR1受体响应于冷以及模拟冷样感觉的化合物如薄荷醇和Iicilin，所以预期调节cCMR1活性也适用于其中冷或薄荷醇治疗用作疼痛缓解或其它缓解方法的治疗适应症，例如充血性鼻炎、咳嗽或气喘性支气管炎。例如，调节CMR1蛋白的功能或表达可用于患真皮和粘膜病症的患者，所述病症例如为皮肤炎症和真皮灼伤(包括晒伤和刮伤)，或咽喉痛。调节CMR1活性还可适用于对冷高灵敏度而引起冷痛觉超敏的患者。调节CMR1活性还可适用于治疗急性疼痛，例如牙痛(齿痛)和其它三叉神经分布式疼痛，例如三叉神经痛(ticdouleureux)和颞下颌关节痛。
另外，因为人CMR1已被鉴别为与肿瘤生长相关的标记物(Tsavaler，L.等，Cancer Res.613760-3769，2002)，所以cCMR1还可用于在狗中诊断各种细胞增殖疾病。
在克隆cCMR1同系物的尝试中，使用基于PCR的策略。按照SEQ ID NO3(cmr1-23)和SEQ ID NO4(cmr1-26)所示序列合成寡核苷酸引物。这些引物能够成功地扩增SEQ ID NO1的1761位至2886位的部分cCMR1序列。纯化大小约1.1 kb的PCR产物，然后亚克隆入测序载体中。基于1.1kb cCMR1片段的序列开发新引物，并同RACE(cDNA末端快速扩增)-修饰的犬DRG cDNA一起用于单独的PCR反应。获得cCMR1 cDNA的完整序列(SEQ ID NO1)，包括5′和3′非翻译区。cCMR1的可读框编码如表1所示的1104个残基的多肽(SEQ ID NO2)。
因此，在一个实施方案中，本发明提供含SEQ ID NO1的69-3380位序列的分离核酸序列。SEQ ID NO1的69-3380位是可读框序列(编码区)，其可编码SEQ ID NO2的CMR1多肽。本发明还提供对应于cCMR1可读框上游区域(例如SEQ ID NO1的1-69)的分离核酸序列，以及对应于cCMR1可读框下游区域(例如SEQ ID NO1的3380-3815)的分离核酸序列。因此，在另一个实施方案中，本发明提供分离的核酸序列，其包含SEQ ID NO1的1-69位序列，在另一个实施方案中，其包含SEQ ID NO1的3380-3815位序列。
含SEQ ID NO1片段的分离核酸用于各种用途。例如，这些序列可用作检测CMR1核酸或检测CMR1核酸侧翼序列的寡核苷酸探针。它们可用作扩增CMR1核酸的寡核苷酸引物。它们还可用于制备嵌合核酸，其编码融合至另一多肽序列的部分或全部cCMR1多肽，例如cCMR1序列的一个或多个基序或结构域与一种或多种异源序列的一个或多个基序或结构域重组。此外，它们可用于操作cCMR1基因的结构。
在再另一个实施方案中，本发明提供分离的核酸，其包含的核酸序列编码含SEQ ID NO2的多肽。由于遗传密码的简并性，可使用一种以上的密码子编码特定氨基酸，因此，cCMR1氨基酸序列(例如SEQ ID NO2)可由多种核酸序列中的任一种编码。分离的核酸包括序列中一个或多个密码子被不同序列的、但编码相同氨基酸残基的密码子取代的序列(在本文被称为“保守密码子置换”)。因此，本发明包含具有一个或一个以上保守密码子置换的SEQ ID NO2编码核酸序列。本领域技术人员基于本文提供的序列信息，应能够测定具有一个或一个以上保守密码子置换并编码SEQ ID NO2的特定核酸序列。保守密码子置换可在编码CMR1多肽的核酸序列中进行，例如密码子TTT和TTC(统称为TTT/C)可编码Phe(苯丙氨酸)残基；其它密码子置换如下TTA/G和CTT/C/A/GLeu；ATT/CIle；ATGMet；GTT/C/A/GVal；TCT/C/A/GSer；CCT/C/A/GPro；ACT/C/A/GThr；GCT/C/A/GAla；TAT/CTyr；CAT/CHis；CAA/GGln；AAT/CAsn；AAA/GLys；GAT/CAsp；GAA/GGlu；TGT/CCys；CGT/C/A/GArg；AGT/CSer；AGA/GArg；GGT/C/A/GGly。保守密码子置换可在cCMR1多肽编码核酸序列中的任何位置进行。
如本文所示，SEQ ID NO1的69位至3380位编码1104个氨基酸残基的多肽(SEQ ID NO2)，其是天然表达的犬CMR1的预测序列。如表2所示，SEQ ID NO2与人、小鼠和大鼠CMR1蛋白序列比对。通过比对，cCMR1多肽序列(SEQ ID NO2)与人CMR1蛋白序列的同一性最高，在1104个残基中共有1052个残基(95.23％同一性)。cCMR1蛋白序列与小鼠(1042/110494.38％同一性)和大鼠(1043/110494.47％同一性)CMR1多肽序列共有的同一性程度较低。
正如所示，表2所示的狗、人、小鼠和大鼠CMR1序列一般共有90％以上的氨基酸同一性。但是，在某些氨基酸位点，犬序列与人、小鼠和大鼠序列中的一种或多种不同。其中犬残基与一种或多种其它物种不同的氨基酸位点比其中残基在人、狗、小鼠和大鼠序列中相同的位点更可变。例如，根据序列比对，SEQ ID NO2的1、2和3位的氨基酸残基与人、小鼠和大鼠序列相同。但是，SEQ ID NO2的4和5位的氨基酸残基相对于人序列是不同的，SEQ ID NO2的28位的氨基酸残基相对于人、小鼠和大鼠序列是不同的。其中犬序列和任一种人、小鼠和大鼠CMR1序列之间存在至少一个不同的氨基酸位点在本文被称为“CMR家族变体位点”。表3提供了CMR家族变体位点的清单。
基于此分析，预期具有一个或多个CMR家族变体氨基酸置换的cCMR1多肽具有CMR1生物活性。也就是说，可在一个或多个CMR家族变体氨基酸位点，用选自存在于人、小鼠或大鼠序列中相同位置的氨基酸残基的氨基酸或等价氨基酸置换SEQ ID NO2。置换cCMR1氨基酸的氨基酸在本文被称为“CMR家族变体氨基酸”。“CMR家族变体氢基酸”由不同于cCMR1氨基酸并存在于其它哺乳动物(例如人、小鼠或大鼠)CMR1序列中的氨基酸组成。合适的CMR家族变体氨基酸的清单也可见于表3，其中任一个均可用于替换原cCMR1氨基酸残基。例如，适于替换SEQ ID NO2的谷氨酸(E)的4位CMR家族变体氨基酸为精氨酸(R，其存在于人CMR1中)。
在某些CMR家族变体氨基酸位点，犬、人、小鼠和大鼠氨基酸残基共有相同的化学特性。例如，在SEQ ID NO2的18和34位的CMR家族变体氨基酸可包括疏水氨基酸残基，例如甲硫氨酸(M)或亮氨酸(L)。其它的疏水氨基酸包括甘氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和脯氨酸。其它氨基酸分组包括“碱性氨基酸”，其包括组氨酸、赖氨酸和精氨酸；“酸性氨基酸”，其包括谷氨酸和天冬氨酸；“芳香族氨基酸”，其包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸；“小氨基酸”，其包括甘氨酸和丙氨酸；“亲核氨基酸”，其包括丝氨酸、苏氨酸和半胱氨酸；和“酰胺氨基酸”，其包括天冬酰胺和谷氨酰胺。
因此，在另一方面，本发明提供编码SEQ ID NO2的CMR1多肽的核酸，其包含CMR家族变体氨基酸。在某些实施方案中，cCMR1多肽含有的CMR家族变体氨基酸不到原始cCMR1氨基酸残基的4％。优选cCMR1多肽包含的CMR家族变体不到原始cCMR1氨基酸残基的约2％，最优选不到原始cCMR1氨基酸残基的约1％。
本发明还提供与本文描述的任何分离核酸分子互补的分离核酸分子。
本发明的分离核酸还可包含编码具有额外氨基酸残基的cCMR1多肽的核酸序列。在某些实施方案中，额外氨基酸存在于cCMR1序列的氨基端、羧基端、内部或这些位置的组合。具有这些类型的额外氨基酸序列的cCMR1多肽可称为“cCMR1融合蛋白”。在某些情况下，根据额外氨基酸序列的性质，将它们另外称为“嵌合”或“标记”cCMR1蛋白等可能更合适。尽管如此，在已知本文提供的序列信息的情况下，人们还是能够辨别具有额外氨基酸序列的CMR1多肽。额外氨基酸残基可为短的，例如1至约20个额外氨基酸残基，或为较长的，例如超过约20个额外氨基酸残基。额外氨基酸残基可提供一种或多种功能或用途，包括例如用作蛋白(例如抗体)或小分子结合的表位；用作胞内和胞外运输的标记；提供额外酶活性或其它活性；或提供检测信号。
例如，核酸序列可编码cCMR1融合蛋白，其可包含额外氨基酸残基，提供用于键合(例如离子、共价、配位、氢键或范德华键合或其组合)有机或无机化合物的坐标。有用的额外氨基酸序列包括例如通过Ni+-偶合残基用于蛋白纯化的聚组氨酸残基、免疫球蛋白(IgA、IgE、IgG、IgM)的恒定结构域或其部分(CH1、CH2、CH3)、白蛋白、用于形成检测或纯化用免疫复合物的血凝素(HA)或myc亲和表位标记(抗这些部分的抗体可市售获得)、检测用多肽如绿色荧光蛋白(GFP)、酶(例如β-半乳糖苷酶(B-Gal)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、荧光素酶和碱性磷酸酶(A))、用于蛋白运输的信号序列和如果有需要的话用于分离额外氨基酸序列与cCMR1序列的蛋白酶切割序列。
在另一方面，提供能够检测cCMR1(例如cCMR1蛋白或核酸)表达的诊断实验。cCMR1蛋白的表达可通过可检测标记或可随后标记的探针检测。通常，探针是如上所述识别表达蛋白的抗体，尤其是单克隆抗体。因此，在一个实施方案中，能够检测cCMR1蛋白表达的实验包括使犬组织样品与一种或多种结合cCMR1的单克隆和/或多克隆抗体接触。
可用可检测试剂标记cCMR1核酸和蛋白、抗CMR1的抗体和含任何这些组分的生物系统，或者可用可检测试剂标记对cCMR1具有特异性的化合物，并使用该化合物检测cCMR1实体。可检测试剂包括可通过显微镜、生物化学、光化学、生物电子、免疫化学、电学、光学或化学技术检测的化合物和组合物。可检测部分的实例包括但不限于放射性同位素(例如32P、33P、35S)、化学发光化合物、标记的结合蛋白、重金属原子、光谱标记物(例如荧光标记物和染料)、连接酶、质谱标记物和磁性标记。
使用抗体的免疫检测法包括但不限于点印迹、蛋白质印迹、竞争性和非竞争性蛋白结合实验、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫组织化学、荧光激活细胞分选(FACS)、免疫-PCR、免疫沉淀和通常使用的其它方法。
可使用常用的分子生物学方法，例如RNA印迹、原位杂交、核酸酶保护实验、RT-PCR(包括实时、定量PCR)、高密度阵列和其它杂交方法，检测对应于cCMR1基因的mRNA的表达水平。因此，在另一个实施方案中，提供能够检测犬组织样品中一种或一种以上cCMR1基因的表达的实验，其包括使犬组织样品与能够和cCMR1核酸杂交的寡核苷酸接触。用于PCR/引物延伸实验的寡核苷酸引物一般长10-20个核苷酸。约40-50个核苷酸的较长寡核苷酸更通常用于原位或印迹杂交。即便长于50个核苷酸的序列也可用于检测实验。可通过本领域技术人员众所周知的方法，例如描述于Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，Inc.(1996)的方法，由组织样品中分离RNA。检测由cCMR1基因转录的mRNA水平的一个优选方法是利用RT-PCR。RT-PCR技术的细节众所周知，本文也有描述。
检测由一种以上的公开基因获得的mNA转录物水平的另一个优选方法包括标记mRNA与寡核苷酸或组织的有序阵列杂交。这种方法允许同时测定多种这些基因的转录水平，以产生基因表达谱或基因表达模式。
用于此杂交方法的寡核苷酸通常结合至固相支持体。固相支持体的实例包括但不限于膜、滤膜、载玻片、纸、尼龙、晶原、纤维、磁珠或非磁珠、凝胶、管、聚合物、聚氯乙烯平皿等。可使用任何寡核苷酸可直接或间接、共价或非共价结合的固体表面。特别优选的固体基质是高密度阵列或DNA芯片。这些高密度阵列在阵列上的预先选定位置包含特定的寡核苷酸探针。各个预先选定位置都可包含一个以上的特定探针分子。因为寡核苷酸在基质上的特定位置，所以可依据特定基因的表达水平解释杂交模式和强度(其一起产生特有的表达谱或表达模式)。
优选寡核苷酸探针足够长，以仅可与以上鉴别的目的基因的互补转录物特异性杂交。
任选全部或部分cCMR1核酸序列可用于探测其它物种的核酸制备物，以测定相似序列的存在情况。例如，全部或部分cCMR1核酸可用作探针，以鉴别其它物种中类似于cCMR1序列的cDNA或基因组核酸序列。可将与cCMR1探针杂交的克隆确定为阳性克隆。
另外，可在计算机辅助程序中使用本发明提供的全部或部分cCMR1核酸或多肽序列，以鉴别其它有用的信息，例如与cCMR1序列具有同源性的蛋白或结合cCMR1序列的分子。例如，可使用全部或部分cCMR1序列筛选各种电子数据库，以确定电子数据库成员是否与cCMR1序列具有同源性。可使用本文列出的犬核酸或多肽序列的任何部分查询众多种特异性的遗传数据库。可进行核酸和蛋白检索中的任一项或二者。
在另一方面，可确定cCMR1多肽的三维模型，并使用其鉴别结合蛋白结构的各部分的分子。例如，使用本文描述的分离的cCMR1核酸，可在细胞系统中表达cCMR1蛋白并纯化，然后结晶，以获得有关蛋白结构的信息。可通过进行例如X射线衍射或核磁共振光谱获得结构信息。氨基酸残基及其侧链的位置可在三维模型中以坐标表示。然后可将此信息提供给计算机程序。
分子建模程序可用于确定小分子是否能适合cCMR1多肽的功能相关部分，例如活性位点。关于分子建模的基础信息提供于例如M.Schlecht，Molecular Modeling on the PC，1998，John Wiley & Sons；Gans等，Fundamental Principals of Molecular Modeling，1996，Plenum Pub.Corp.；N.C.Cohen(编辑)，Guidebook on Molecular Modeling in DrugDesghign，1996，Academic Press；和W.B.Smith，Introduction to TheoreticalOrganic Chemistry and Molecular Modeling，1996。提供分子建模详细信息的美国专利包括美国专利第6,093,573号、6,080,576号、5,612,894号和5,583,973号。
可用于分子建模研究的程序包括例如可得自Oxford University，Oxford，UK的GRID(Goodford，P.J.，“A Computational Procedure forDetermining Energetically Favorable Binding Sites on BiologicallyImportant Macromolecules”J.Med.Chem.，28，849-857页，1985)；可得自Molecular Simulations，Burlington，Mass.的MCSS(Miranker，A.和M.Karplus，“Functionality Maps of Binding SitesA Multiple CopySimultaneous Search Method.”ProteinsStructure，Function and Geneties，11，29-34页，1991)；可得自Scripps Research Institute，La Jolla，Calif.的AUTODOCK(Goodsell，D.S.和A.J.Olsen，“Automated Docking ofSubstrates to Proteins by Simulated Annealing”ProteinsStructure.Function，and Genetics，8，195-202页，1990)；和可得自University ofCalifomia，San Francisco，CA.的DOCK(Kuntz，I.D.等，“A GeometricApproach to Macromolecule-Ligand Interactions”J.Mol.Biol.，161，269-288页，1982)。
除了编码cCMR1多肽的核酸序列以外，本发明还包括cCMR1多肽、cCMR1多肽变体、cCMR1多肽片段和具有额外氨基酸的cCMR1多肽。本文描述了由核酸编码的cCMR1多肽的多个方面，这些方面也可应用于cCMR1多肽。
在一个实施方案中，本发明提供分离的多肽，其包含SEQ ID NO2的序列。
在另一个实施方案中，本发明提供分离的多肽，其包含的SEQ IDNO2序列所具有的CMR家族变体氨基酸少于原始cCMR1氨基酸残基的4％。优选cCMR1多肽包含的CMR家族变体少于原始cCMR1氨基酸残基的约2％，最优选少于原始cCMR1氨基酸残基的约1％。
如本文所述，cCMR1多肽在其氨基端、羧基端或两端还可具有额外氨基酸残基。这种额外残基用于各种用途，包括例如免疫检测、纯化、细胞运输、酶活性等。
本发明还提供cCMR1多肽片段。cCMR1多肽片段可用于多种目的，包括例如抗体生产。cCMR1多肽序列的部分或其整个序列可用于产生抗CMR1抗体。
在另一方面，本发明涉及特异性识别SEQ ID NO2的氨基酸序列中的表位的抗体。有用的抗体包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、人源化或嵌合抗体，以及能够结合部分cCMR1蛋白的生物功能抗体片段。对前述序列编码蛋白有特异性的抗体可用于几类用途。这些抗体可用于诊断试剂盒，例如用于其中需要检测cCMR1的任何种类实验。其还可用于制备治疗性物质，例如其中抗cCMR1抗体自身是治疗性的，或其中抗cCMR1抗体偶联治疗性物质。预期抗cCMR1抗体可用于治疗疼痛。在这些情况下，抗cCMR1抗体可调节cCMR1活性，例如提供激动(例如催化)或拮抗活性。
本发明还提供生产犬特异性单克隆抗CMR1抗体的方法。为生产这些单克隆抗体，可使用提供独特抗cCMR1决定簇的肽。单克隆抗体是针对特定抗原(即表位)的抗体的同源克隆群。为制备抗cCMR1单克隆抗体，使用具有cCMR1特异性序列或“cCMR1表位”的肽。cCMR1序列是在相对于狗、小鼠和大鼠CMR1序列的一个或多个位置不同的序列。为测定cCMR1特异性序列，人们可查阅本文提供的表2。
可通过利用培养的连续细胞系提供抗体分子生产的任何技术获得单克隆抗体(mAb)。这些技术包括例如杂交瘤技术术(ohler和Milstein，Nature，256495-497，1975)；人B细胞杂交瘤技术(Kosbor等，Immunology Today，472，1983)和EBV杂交瘤技术(Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，77-96页，1985)。这种抗体可为任何免疫球蛋白型，例如IgG、IgM、IgE、IgA、IgD或其任何亚型。生产本发明的单克隆抗体的杂交瘤可在体外或体内培养。
为生产CMR1蛋白的抗体，可通过用cCMR1多肽或其部分注射免疫各种宿主动物。如果使用完整的cCMR1多肽，则可产生cCMR1特异性抗体以及与不同物种的其它CMR1蛋白交叉反应的抗CMR抗体。例如，多克隆抗体制备物是来源于抗原(例如CMR1多肽)免疫动物血清的异质抗体分子群。在此多克隆群中，抗体与CMR1多肽的不同部分交叉反应，这些抗体中有一些与cCMR1特异性反应，另一些与其它物种的CMR1多肽交叉反应。为生产多克隆抗体，通常重复地用cCMR1蛋白或其部分免疫宿主动物，以加强动物中的抗体滴度，并通常补加本文所述的佐剂。常用于生产抗CMR1抗体的宿主动物包括兔、小鼠和大鼠；但是，如果有需要的话，可使用其它动物。根据宿主物种，可使用各种佐剂增强免疫应答，例如弗氏(完全和不完全)佐剂和矿物凝胶，例如氢氧化铝。还可将缀合物(例如KLH)纳入免疫，尤其是对于将较短的cCMR1肽用于免疫和抗体生产用途的情况。
可使用任何类型的合成或分子生物学技术产生cCMR1多肽或cCMR1多肽片段。可使用标准合成肽技术产生较小的cCMR1多肽片段，例如长30个氨基酸或更短的肽片段。合成肽片段的技术众所周知，描述于例如Barany和Merrifield，Solid-Phase Peptide Synthesis；3-284页，载于The PeptidesAnalysis，Synthesis，Biology.第2卷Special Methods in Peptide Synthesis，Part A.，Merrifield等，J.Am.Chem.Soc.，852149-2156(1963)，和Stewart等，Solid Phase Peptide Synthesis，第2版，Pierce Chem.Co.，Rockford，III.(1984)。
重组技术可用于表达cCMR1，包括例如cCMR1的部分、来源于用cCMR1核酸转化的原核或真核宿主细胞的变体和融合蛋白。这些方法包括例如体外重组DNA技术和体内遗传重组(参见例如描述于Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第3版，ColdSpring Harbor Press，NY(2001)；和Ausubel等编辑，Short Protocols inMolecular Biology，第4版，John Wiley & Sons，Inc.，NY(1999)的技术)。
因此，可通过(a)提供含cCMR1序列的核酸，(b)将核酸插入到宿主细胞中，和(c)在允许cCMR1多肽表达的情况下保持宿主细胞，生产cCMR1。当需要纯化的cCMR1多肽时，还可进行一个步骤，以分离和纯化(如果有需要的话)cCMR1多肽。
在另一个实施方案中，本发明提供异源核酸构建物，其包含有效连接至调节序列的全部或部分cCMR1编码序列。这些异源核酸构建物包含适于在宿主细胞中表达cCMR1核酸的重组表达载体。重组表达载体包含一个或多个有效连接至cCMR1核酸序列的调节序列，其可基于用于cCMR1表达的宿主细胞类型来选择。调节序列包括启动子、增强子和其它表达控制元件，例如poly(A)+序列。调节序列可为原核细胞(例如细菌细胞，例如大肠杆菌)或真核细胞(例如酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞(例如HEK、CHO或COS细胞))特异性的。调节序列可相对于cCMR1核酸序列以顺式或反式定位。调节序列可包括组成型表达序列、组织特异性调节序列和可诱导调节序列，组成型表达序列通常在广泛的生长条件下和广泛的宿主细胞中驱动核酸表达，组织特异性调节序列在特定宿主细胞或组织中驱动表达，可诱导调节序列在继发性因素作用下驱动表达。可根据使用的具体宿主细胞和需要的多肽表达水平之类的因素选择和设计表达载体。其它表达载体元件可包括但不限于以下的一种或多种信号序列、复制起点、一个或多个选择基因和转录终止序列。选择基因编码的蛋白(a)赋予对抗生素或其它毒素(例如氨苄青霉素、新霉素、氨甲喋呤或四环素)的抗性，(b)补充营养缺陷或(c)提供由复合培养基无法获得的关键营养物。
用于表达cCMR1多肽的异源核酸构建物还可包括可被体外转录和翻译的构建物，例如具有T7启动子调节序列的构建物。
适于表达cCMR1的载体是本领域已知的，可市售获得。合适的载体包括例如pET-14b、pCDNAlAmp和pVL1392，其可由Novagen和Invitrogen获得，分别可用于在大肠杆菌、COS细胞和杆状病毒感染的昆虫细胞中表达。
在另一个实施方案中，本发明提供含cCMR1核酸的重组细胞。重组细胞包括其中已导入核酸序列的细胞。通常，通过使用分子生物学技术将特定核酸导入细胞中建立重组细胞。但是，重组细胞还包括已以其它方式操作来促进目的核酸序列表达的细胞。例如，可改变邻近靶核酸序列的区域，以促进靶核酸的表达，或者可将起调节靶核酸表达作用的基因导入到细胞中。
重组细胞在生长和分裂期后可能与起始亲代细胞不同；但是，这些细胞仍被称为重组细胞，并包含在本文使用的术语范围内。
适于携带和提供用于cCMR1表达的细胞机器的宿主细胞既原核细胞和真核细胞两者。原核宿主细胞的合适实例为真细菌，例如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，例如埃希氏菌属(Escherichia)(例如大肠杆菌)、肠杆菌属(Enterobacter、沙门氏菌属(Salmonella)(例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium))，以及芽孢杆菌属(Bacilli)(例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、假单胞菌属(Pseudomonas)和链霉菌属(Streptomycea)。
真核细胞，例如丝状真菌或酵母，是适于cCMR1表达载体的克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，也称为面包酵母，是常用的表达系统，提供各种启动子和选择标记序列。其它用作宿主细胞的真菌或酵母包括粟酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、毕赤氏巴斯德酵母(Pichia Pastors)、念珠菌属(Candida)、粗糙脉孢菌(Neurospora crasssa)和构巢曲霉(Asspergillus nidulans)。
可使用许多高等真核宿主细胞，包括昆虫细胞，例如果蝇S2和夜蛾Sf9细胞；哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、猴肾(COS)细胞、犬肾(MDCK)细胞、人宫颈癌(HeLa)细胞和人胚胎肾(HEK)细胞；以及植物细胞。
转化宿主细胞的生长可在本领域已知的条件下发生。所述条件一般取决于宿主细胞和所用载体类型。可使用合适的诱导条件，例如温度和化学物质，这取决于使用的启动子类型。合适培养基的实例包括最小必需培养基(MEEM)、RPMI-1640和Dulbecco改良型Eagle培养基(DMEM)。
可通过常规转化或转染技术将核酸(包括表达构建物)导入原核或真核细胞中。本文使用的术语“转化”和“转染”意指本领域公认的各种将外源核酸分子(例如DNA)导入宿主细胞中的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染、基因枪或电穿孔。适于转化或转染宿主的方法可见于Sambrook等(出处同上)和其它实验室手册。
可用具有选择标记和目的基因的表达构建物稳定转染哺乳动物细胞。通常用于哺乳动物细胞的选择标记包括抗生素抗性基因，例如在化合物(例如G418、潮霉素或氨甲蝶呤)存在下允许转化细胞生长的基因。
重组细胞可用于生产cCMR1多肽，用于纯化用途或涉及cCMR1多肽的功能研究。例如，重组cCMR1细胞可用于测试多种化合物改变cCMR1多肽活性的能力。重组cCMR1细胞还可用于测试如何改变cCMR1多肽的各种特性，例如如何改变cCMR1多肽的氨基酸序列、如何影响cCMR1活性。
具有cCMR1核酸序列的重组细胞还可用于生产非人转基因动物。转基因是整合入细胞(由该细胞发育成转基因动物)基因组中的外源DNA，并保留在成熟动物的基因组中，由此引导编码基因产物在转基因动物的一种或多种细胞类型或组织中表达。例如，可使用合适的技术，例如显微注射，将含cCMR1核酸序列的核酸导入宿主细胞中，例如受精的卵母细胞或胚胎干细胞。然后，这些含cCMR1的宿主细胞可用于创建非人转基因动物。特别有用的动物包括具有cCMR1基因的转基因小鼠或大鼠，其还可具有物理或遗传特征，使其例如作为疼痛模型用于研究。
cCMR1转基因动物可用于鉴别、筛选或测试调节cCMR1功能或表达的潜在有用化合物或已知化合物。这些转基因动物还可通过改变其氨基酸序列用于研究cCMR1多肽的功能。
利用胚胎操作和显微注射产生转基因动物(具体地说是小鼠之类的动物)的方法已成为本领域常规方法，描述于例如美国专利第4,736,866和4,870,009号、美国专利第4,873,191号，以及Hogan，Manipulating the Mouse Embryo(Cold SPpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。构建同源重组载体和同源重组动物的方法进一步描述于Bradley(Current Opinion in Bio/Technology，2823-829，1991)和PCT公开WO 90/11354、WO 91/01140、WO 92/0968和WO 93/04169。还可按照Wilmt等(Nature，385810-813，1997)以及PCT公开WO 97/07668和WO 97/07669描述的方法生产本文描述的非人转基因动物的克隆。
在某些情况下，例如为了测试推测为CMR1调节剂的化合物的特异性，可能需要减少系统中存在的CMR1的量。可操作如本文所述的重组细胞或转基因动物，以便减少在其表面上表达或存在的CMR1的量。例如，细胞可包含减少细胞中存在的cCMR1 RNA量的分子，由此降低cCMR1蛋白表达。合适的分子包括反义核苷酸、核酶、双链RNA、干扰RNA(iRNA)以及拮抗剂或激动剂。
可使用各种方法纯化cCMR1多肽。例如，可使用硫酸铵沉淀、离心或其它已知技术进行粗纯化。可通过合适的层析技术实现高度纯化，包括例如阴离子交换、阳离子交换、高效液相层析(HPLC)、凝胶过滤、疏水相互作用层析和亲和层析，例如使用抗cCMR1蛋白的抗体的亲和层析。当蛋白在胞内合成、分离或纯化过程中变性时，如果有必要，可使用重折叠cCMR1蛋白的步骤，以获得蛋白的活性构象。
本发明还包括检测生物样品(测试样品)中本发明多肽或核酸存在情况的试剂盒。这种试剂盒优选包含适于密闭保持在至少一个容器中的区室化载体。载体可包含检测工具，例如标记抗原或酶底物等。例如，该试剂盒可包含能够检测多肽或多肽编码mRNA的标记化合物或物质，以及测定样品中多肽或mRNA量的工具(例如结合多肽的抗体或结合多肽编码DNA或mRNA的寡核苷酸探针)。该试剂盒还可包含说明书，用于确定如果多肽或多肽编码mRNA的量高于或低于正常水平，测试者是否患有或有风险患与多肽异常表达相关的疾病。
对于抗体型试剂盒，该试剂盒可包含例如(1)第一种抗体(例如附着至固体支持体的抗体)，其选择性结合所含氨基酸序列与SEQ IDNO2具有至少96％序列同一性的多肽；和任选的(2)第二种抗体，其结合第一种抗体或第一种抗体结合的多肽(但在不同表位结合)，并缀合至可检测物质；和(3)作为阳性对照的纯化重组cCMR1蛋白。优选第一种抗体仅结合cCMR1，但不结合其它物种(例如人、大鼠或小鼠)的CMR1。
对于寡核苷酸型试剂盒，该试剂盒可包含例如(1)寡核苷酸，例如可检测的标记寡核苷酸，其在严格条件下与SEQ ID NO1杂交，或(2)一对用于扩增编码多肽(其与SEQ ID NO2具有至少96％的序列同一性)的核酸分子的引物。该试剂盒还可包含例如缓冲剂、防腐剂或蛋白稳定剂。该试剂盒还可包含检测可检测物质必需的组分(例如酶或底物)。该试剂盒还可包含可被检测并与测试样品对比的对照样品或一系列对照样品。试剂盒的各个组分通常都封装在单个容器中，各种容器优选全部包含在单个包装中。
因为CMR1在凉爽至寒冷的温度被活化并在神经组织中表达，所以该基因可用作治疗靶，用于鉴别可用于治疗疼痛、炎症和皮肤病(例如与晒伤和其它敏化状态相关的疾病)的药物。因此，在另一个一般方面，本发明涉及cCMR1核酸和蛋白在治疗性化合物鉴别方法中的用途，所述治疗性化合物例如为用于治疗疼痛、调节对低温的反应的化合物和为皮肤提供冷感的化合物。可使用含cCMR1多肽或cCMR1核酸的系统鉴别这些类型的化合物。还可在动物模型系统(例如大鼠、小鼠或犬模型系统)体内直接测试化合物。特别有用的系统包括疼痛动物模型。这些方法包括测定各种化合物增加或降低cCMR1蛋白表达、cCMR1通道电导率或动物伤害感受行为的能力。
可使用常规实验室形式或以适于高通量的实验进行化合物鉴别方法。术语“高通量”指允许多个样品同时和/或快速连续地简易筛选的实验设计，其可包含机器人操作能力。高通量实验的另一个需要特征是优化实验设计，减少试剂使用或最小化操作次数来实现预期分析。实验形式的实例包括96孔或384孔板、悬浮液滴(levitatingdroplet)和用于液体处理实验的“芯片实验室”微通道芯片。本领域技术人员众所周知，随着小型化塑料模具和液体处理装置的发展，或者随着设计出改良的实验装置，可使用本发明的设计处理较大量的样品。
候选化合物包含众多化学类别，包括但不限于小有机或无机化合物、天然或合成分子，例如抗体、蛋白或其片段、反义核苷酸、干扰RNA(iRNA)和核酶。优选地，其为小有机化合物，即分子量大于50但低于约2500的化合物。候选化合物包含对于与多肽的结构性相互作用必需的功能化学基团，通常包括至少酰胺、羰基、羟基或羧基，优选包括这些功能化学基团中的至少两个，更优选包括这些功能化学基团中的至少3个。候选化合物可包含用一个或多个上述官能团取代的环状碳或杂环结构和/或芳香族或多芳香族结构。候选化合物还可为生物分子，例如肽、糖、脂肪酸、甾醇、类异戊二烯、嘌呤、嘧啶、上述物质的衍生物或结构类似物或其组合等。当化合物为核酸时，化合物通常为DNA或RNA分子，尽管也设想了具有非天然键或亚单位的修饰核酸。
候选化合物得自各种来源，包括合成或天然化合物库。例如，可利用众多工具，随机和定向合成各种有机化合物和生物分子，包括表达随机寡核苷酸、合成有机组合文库、随机肽的噬菌体展示文库等。还可使用任何本领域已知组合文库方法中的众多方案，包括生物文库、空间可定位平行固相或液相文库、需要去卷积的合成文库法、“一珠一化合物”文库法和使用亲和层析选择的合成文库法(Lam(1997)Anticancer Drug Des.12145)，获得候选化合物。或者，可获得或容易地生产细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物文库。另外，可通过常规化学、物理和生物化学方法容易地修饰天然和合成产生的文库和化合物。
而且，已知的药用物质可进行定向或随机的化学修饰，例如酰化、烷基化、酯化、酰胺化等，以生产该物质的结构类似物。候选化合物可随机选择，或者以结合和/或调节CMR1活性功能的现有化合物为基准。因此，候选物的来源是基于一种或多种增加或降低CMR1通道电导率的已知化合物的一种或多种分子文库，其中已知化合物的结构在分子的一个或多个位置改变，以包含或多或少的化学部分或不同化学部分。在创建类似物活化剂/抑制剂文库时对分子进行的结构改变可以是定向、随机的置换和/或添加，或为定向和随机置换和/或添加二者的组合。在制备组合文库时，本领域一般技术人员可基于现有的化合物容易地制备这种文库。
混合物中还可包含各种其它试剂。这些试剂包括例如盐、缓冲液、中性蛋白(例如白蛋白)、变性剂等，其可用于促进优化的蛋白-蛋白和/或蛋白-核酸结合。这种试剂还可降低反应组分的非特异性或背景相互作用。还可使用其它促进实验效力的试剂，例如核酸酶抑制剂、抗微生物剂等。
合成分子文库的方法实例可见于本领域，例如载于Zuckermann等(1994).J Med.Chem.372678。化合物文库可存在于溶液中(例如Houghten(1992)Biotechniques 13412-421)或珠(Lam(1991)Nature35482-84)、芯片(Fodor(1993)Nature 364555-556)、细菌(美国专利第5,223,409号)、孢子(专利第5,571,698号)、质粒(Cull等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 891865-1869)或噬菌体(参见例如Scott和Smith(1990)Science 249386-390)上。
在一个方面，本发明提供增加或降低cCMR1蛋白表达的化合物的鉴别方法，其包括以下步骤(a)使测试化合物与含cCMR基因表达调节机制的细胞接触；和(b)测定测试化合物是否增加或降低由细胞的所述机制控制的基因表达。调节cCMR基因表达的机制包括核、胞质或胞内因子在转录或翻译水平上影响基因作用控制的机制。例如，该机制包括基因活化或基因抑制。含cCMR基因表达调节机制的细胞可为内源表达cCMR的天然宿主细胞，例如犬DRG细胞。该细胞还可为含重组DNA序列的重组细胞，其中所述重组DNA序列具有cCMR基因调节序列，所述调节序列与基因(优选报告基因)有效连接。
可通过各种方法检测化合物对CMR1调节序列控制的基因表达的作用。例如，可通过细胞中基因的mRNA或蛋白的量或通过细胞的基因产物的活性检测该作用。当使用报告基因时，可由细胞的报告基因产物水平检测作用。例如，当CMR1调节序列有效连接至GFP基因时，可使用荧光计，以化合物对细胞的绿色荧光发射的作用检测化合物对基因表达的作用。当使用内源cCMR1细胞时，可使用上文描述的方法(即RNA印迹、RT-PCR、SDS-PAGE、蛋白质印迹、免疫组织化学或免疫细胞化学、放射性受体配体结合等)，以细胞内cCMR1 mRNA或蛋白的量检测化合物对基因表达的作用。或者，可使用cCMR1通道的电导率检测化合物对cCMR1蛋白表达的作用。
本文描述的细胞型方法不仅鉴别通过结合一种或多种cCMR1基因调节序列直接调节cCMR1表达的化合物，而且鉴别通过结合其活性影响cCMR1表达或蛋白稳定性的其它细胞组分间接调节cCMR1表达的化合物。例如，可使用本文描述的方法鉴别调节cCMR1基因转录活化剂或抑制剂的活性的化合物。还可鉴别调节体内降解cCMR1蛋白的蛋白酶活性的化合物。
本发明还提供增加或降低cCMR1离子通道电导率的化合物的鉴别方法，其包括以下步骤(a)使测试化合物与离子通道接触；和(b)测定测试化合物是否增加或降低离子通道的电导率。在某些实施方案中，cCMR1离子通道表达在宿主细胞表面上。细胞可为内源表达cCMR1的cCMR1天然宿主细胞，例如狗DRG或TG细胞。细胞还可为cCMR1的重组宿主细胞，例如重组表达cCMR1的CHO或COS细胞。
在某些其它实施方案中，cCMR1离子通道与分离的膜制备物结合。膜制备物可分离自在其细胞表面上表达cCMR1的天然宿主细胞，或分离自在其细胞表面上表达cCMR1的重组宿主细胞。其还可由生物膜制备，例如含cCMR1通道的组织膜、质膜、细胞膜或内部细胞器膜。本领域技术人员已知分离和制备生物膜制备物的方法。例如，这种方法可包括以下步骤机械或酶破裂组织或细胞，离心以分离膜和其它组分，将膜碎片或囊泡重悬浮在合适的缓冲溶液中。或者，含膜制备物还可来源于人工膜。纯化的cCMR1蛋白可重构入脂双层中，以形成人工膜囊泡(参见Chen等，1996，J. Gen.Physiol.108237-250)。此类膜囊泡对目的通道的特异性可非常高，避免了其它通道污染的问题。本领域技术人员已知制备人工膜囊泡的方法。
在某些实施方案中，含cCMR1的膜囊泡可提供较简单形式的本发明实验和方法，因为实验过程中的细胞裂解和/或剪切没有很大关系。但是，在其它实施方案中，优选表达cCMR1的细胞，例如，当细胞膜制备步骤破坏或失活目的通道时。
可评价测试化合物增加或降低cCMR1通道的离子电导率的能力。本领域技术人员已知测定CMR1通道电导率的方法，例如通过刺激细胞去极化或增加胞内钙离子水平。可使用钙离子敏感型荧光指示剂，例如钙离子敏感型荧光染料，评价胞内钙水平。合适的钙离子敏感型荧光染料包括例如quin-2(参见例如Tsien等，J Cell BioL，94325，1982)、fura-2(参见例如Grynkiewicz等，J BioL Chem.，2603440，1985)、fluo-3(参见例如Kao等，J BioL-43 Chem.，2648179，1989)和rhod-2(参见例如Tsien等，J Biol.Chem.，Abstract 89a，1987)。合适的钙离子敏感型荧光染料可由例如Molecular Probes(Eugene，OR)市售获得。还可使用荧光计或具有荧光灯和检测仪的流式细胞仪监测细胞荧光。
cCMR1阳离子通道不仅起转运二价阳离子(例如Ca++)的作用，而且起转运单价阳离子如Na+或K+的作用。因此，还可进行测定单价阳离子转运中的变化的实验，以监测cCMR1通道电导率。Na+和K+敏感型染料是本领域已知的，可由例如Molecular Probes(Eugene，OR)市售获得。
还可通过电生理学技术(例如膜片钳)检测cCMR1通道的电导率。膜片钳技术常规地用于研究细胞、细胞膜和分离组织中的电活性。其包括在微电极和质膜之间形成电密封高阻封接。然后可检测通过质膜中的各个离子通道的电流。不同的技术变化允许质膜的不同表面暴露于培养基(bathing medium)。4种最常见的方案包括细胞贴附式膜片、内面向外式膜片、外面向内式膜片和全细胞钳。
膜片钳法常用控制跨膜电压并检测电流的电压钳。在电压钳方法中，将微电极插入到细胞中，电流通过电极注入，以便将细胞膜电位保持在某一预定水平。膜片钳法还可使用与电流钳法，其中控制电流并检测电压。
优选在其中特定离子通道活化的条件下进行实验，鉴别降低cCMR1通道电导率的化合物。例如，这种实验可在CMR1活化的温度下进行。全细胞膜片钳记录研究表明，cCMR1在约17℃或以下的低温活化(实施例7，见下文)。或者，这种实验可在活化cCMR1的化合物(例如冷化合物薄荷醇或Icilin，或刺激性化合物芥子油)存在下进行。另外，这种实验可在cCMR1通道去极化的条件下进行，例如通过在去极化电位下钳住通道。
相反地，在设法鉴别增加cCMR1通道电导率的化合物时，优选调整测试条件，其中cCMR1通道无活性或以另外的方式封闭。例如，可在CMR1非失活温度进行这种实验。与在室温仍有活性的大鼠CMR1不同，cCMR1在室温失活(实施例7，见下文)。或者，可在降低cCMR1通道电导率的化合物存在下进行这种实验。另外，可在足以脱敏cCMR1通道的胞外Ca2+存在下进行这种实验。本领域一般技术人员能够通过常规实验测定足以脱敏cCMR1通道的合适胞外Ca2+浓度。而且，这种实验可在cCMR1通道超极化的条件下进行，例如通过在超极化电位下钳住通道。
可人工或使用自动化系统进行cCMR1调节物鉴别实验。如果进行高通量筛选，则优选自动化系统。例如，一类自动化系统使用多孔培养板，例如96孔、384孔或1536孔培养板，其中各个孔包含具有cCMR1蛋白编码核酸的重组细胞。将板装入荧光计中，例如FlexStationTM(得自Molecular Devices Corp.，Sunnyvale，CA)，其可检测各个孔中细胞的钙通量和/或膜电位。含钙离子敏感型荧光指示剂染料或测试化合物的溶液可自动化加至各个孔中。荧光计中的温度可按照所进行实验的类型来控制，例如可将温度调节至CMR活化温度以上的温度(例如28℃以上)，以测试疑为CMR1激动剂的化合物。同样，可将温度调节至CMR活化温度，例如28℃或以下，以测试疑为CMR1拮抗剂的化合物。
在活化CMR1通道并允许阳离子(例如Ca++离子)内流后，Ca++离子的胞内累积促进负反馈和CMR1通道失活。在通过例如将Ca++泵出细胞外或吸收入胞内细胞器降低胞内Ca++水平后，CMR1被再活化。
尽管CMR1通道可允许Ca++离子在凉爽至寒冷温度作用下内流，但其是轻度的漏离子通道。某些CMR1通道即使在非活化温度(例如在28℃以上)也允许Ca++离子内流。在常规实验系统中，通常使用mM范围的胞外Ca++浓度，其甚至在非活化温度也可导致胞内钙累积，引起CMR1负反馈失活。
因此，本发明的另一方面是增加或降低哺乳动物CMR1离子通道电导率的化合物的鉴别方法，其包括以下步骤(a)在含亚失活量钙的缓冲溶液中温育离子通道；(b)活化离子通道；(c)使离子通道与测试化合物接触；(d)增加缓冲溶液中的钙量；和(e)测定胞内钙量，并比较该量与其中离子通道未接触测试化合物的对照的胞内钙量。“亚失活量钙”是应不引起Ca++离子胞内累积至促进负反馈和CNR1通道失活程度的胞外Ca++量。本领域技术人员可用实验方法确定具体CMR1通道的“亚失活量钙”。在某些实施方案中，“亚失活量钙”为缓冲溶液中的钙基本为0。在其它实施方案中，“亚失活量钙”为缓冲溶液中的钙在μM范围内。本发明方法包括含本文所述步骤(a)-(e)的方法，其中步骤(c)在步骤(b)之前。
在已鉴别出满足调节CMR1活性或表达的要求标准的化合物之后，接着可将化合物给予活体动物。这可用于确定对建立给药方案很重要的毒性和其它药理学参数。例如，在使用含cCMR1多肽的离体系统鉴别化合物之后，可将化合物给予狗，以检测该化合物在狗中的各药理学方面。本文所述的cCMR1系统对鉴别和建立人类中的给药方案特别有优势，因为狗，具体地说是大型繁殖动物，在体重上比大鼠和小鼠更接近人，因此提供了更合适的推定人给药剂量的动物模型。
该化合物也可给予动物，以评价该化合物改变伤害感受过程的能力。存在各种疼痛动物模型，例如神经损伤的脊神经结扎(SNL)模型，其是由Kim和Chung (Pain，50355-363，1992)开发的大鼠神经性疼痛模型。
其它合适的疼痛动物模型可结合本文的教导一起使用。通常研究的神经性疼痛啮齿动物动物模型包括慢性压迫性损伤(CCI)或Bennett模型；神经瘤或轴索切断模型；以及部分坐骨神经横断或Seltzer模型(Shir等，Neurosci.Lett.，11562-67，1990)。示例性神经性疼痛模型包括几种外伤性神经损伤标本(Bennett等，Pain 3387-107，1988；Decosterd等，Pain 87149-58，2000；Kim等，Pain 50355-363，1992；Shir等，Neurosci Lett 11562-7，1990)、神经炎症模型(Chacur等，Pain 94231-44，2001；Milligan等，Brain Res 861105-16，2000)、糖尿病性神经病(Calcutt等，BrJPharmacol1221478-82，1997)、病毒诱导的神经病(Fleetwood-Walker等，J Gen Virol 802433-6，1999)、长春新碱神经病(Aley等，Neuroscience 73259-65，1996；Nozaki-Taguchi等，Pain 9369-76，2001)和紫杉醇神经病(Cavaletti等，Exp Neurol 13364-72，1995)，以及急性伤害感受测试模型和炎症模型(Brennan，T.J.等Pain 64493，1996；D’Amour，F.E.和Smith，D.L.J Pharmacol 7274-79，1941；Eddy，N.B.等J Pharmacol Exp Ther98121，1950；Haffner，F.Dtsch Med Wochenschr 55731，1929；Hargreaves，K等Pain 3277-88，1988；Hunskaar，S.等J Neurosci Meth 1469，1985；Randall，L.O.和Selitto，J.J.Arch.Int.Pharmacodyn 111409-419，1957；Siegmund，E.等Proc Soc Exp Bio Med 95729，1957)。
因此，在另一个实施方案中，本发明提供用于治疗疼痛的化合物的鉴别方法，其包括以下步骤(a)使测试化合物与cCMR1离子通道接触；和(b)测定测试化合物是否增加或降低离子通道的电导率。在某些实施方案中，该方法进一步包括以下步骤(a)给予动物测试化合物；和(b)测定测试化合物改变动物的伤害感受/伤害防御反应的程度。
在某些实施方案中，疼痛动物模型包括啮齿动物，例如大鼠或小鼠；在另一方面，疼痛动物模型包括狗，例如皮肤抽搐测试(Kamerling等Pharmacol.Biochem.Behav.17733-740，1982；另参见Burns JC等Perspect BiolMed. Autumn；35(1)68-73，1991)。
可利用标准药学方法，通过计算例如ED50(对群体的50％治疗有效的剂量)和LD50(使群体的50％致死的剂量)，在细胞培养物或实验动物中测定治疗效力和毒性。毒性和治疗作用之间的剂量比率是治疗指数，其可表示为比率LD50/ED50。在配制人用剂量范围时，使用由使用重组CMR1的细胞培养实验和动物研究(例如犬研究)获得的数据。在这种组合物中包含的剂量优选产生一定范围的循环浓度，其包含基本无毒或无毒的ED50。在此范围内的剂量变化取决于使用的剂型、患者敏感度和给予途径。确切的剂量由给予剂量的人按照与需要治疗的对象相关的因素确定。调整剂量和给予，以提供足够水平的活性物质或保持需要的作用，例如有效的疼痛缓解。可考虑的因素包括疼痛的严重性和其它因素，包括对象的身体状况、对象的年龄、体重和性别、膳食、给予的时间和频率、药物组合、反应敏感性和对治疗的耐受/响应。
可通过任何各种途径给予含已鉴别为调节CMR1活性的化合物的药用组合物，所述途径包括但不限于口服、静脉内、肌内、关节内、动脉内、髓内、鞘内、硬膜外、心室内、经皮、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下、吸入、眼内、耳内或直肠途径。
除了活性成分以外，这些药用组合物还可包含合适的药物可接受载体，包括便于将活性化合物加工入药学上可使用的制品中或便于吸收或分散活性化合物的赋形剂和辅助剂。配制和给予技术的更多细节可参见Remington′s Pharmaceutical Sciences，Maack PublishingCo.，Easton，PA。
可使用本领域众所周知的药物可接受载体，以适于口服给予的剂量，配制用于口服给予的药用组合物。这种载体能够使药用组合物被配制成为片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊剂、溶液剂、凝胶剂、糖浆、浆剂、悬浮剂等，以由患者摄取。
表1SEQ1 ACGCGGGGAAGGCCGGCAGGATCTTTCCAGGGAAAGCAAATCCTGCCTCACAAACCTCAA1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60TGCGCCCCTTCCGGCCGTCCTAGAAAGGTCCCTTTCGTTTAGGACGGAGTGTTTGGAGTTCCGGAGAGATGTCCTTCGAGGGGGCCAGGCTCAGCATGAGGAACAGAAGGAACGGCACGC61 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 120GGCCTCTCTACAGGAAGCTCCCCCGGTCCGAGTCGTACTCCTTGTCTTCCTTGCCGTGCGSEQ2 M S F E G A R L S M R N R R N G T L -TGGACAGCACCCGGACCCTGTACTCCAGCACGTCTCGGAGCACCGACGTGTCCTACAGCG121 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 180ACCTGTCGTGGGCCTGGGACATGAGGTCGTGCAGAGCCTCGTGGCTGCACAGGATGTCGCD S T R T L Y S S T S R S T D V S Y S E -AAAGCGACTTGGTGAATTTTATTCAAGCAAATTTTAAGAAACGAGAATGTGTCTTCTTCA181 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 240TTTCGCTGAACCACTTAAAATAAGTTCGTTTAAAATTCTTTGCTCTTACACAGAAGAAGTS D L V N F I Q A N F K K R E C V F F T -CCAAAGATTCCAAGGCCACGGAAAATGTGTGCAAGTGTGGCTATGCCCAGAGCCAGCACA241 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 300GGTTTCTAAGGTTCCGGTGCCTTTTACACACGTTCACACCGATACGGGTCTCGGTCGTGTK D S K A T E N V C K C G Y A Q S Q H I -TAGAAGGCACCCAGATCAACTCAAACGAGAAATGGAATTACAAGAAACACACCAAGGAAT301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 360ATCTTCCGTGGGTCTAGTTGAGTTTGCTCTTTACCTTAATGTTCTTTGTGTGGTTCCTTAE G T Q I N S N E K W N Y K K H T K E F -TTCCGACTGACGCCTTTGGGGATATTCAGTTTGAGACTCTGGGGAAGAAAGGGAAGTATA361 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 420AAGGCTGACTGCGGAAACCCCTATAAGTCAAACTCTGAGACCCCTTCTTTCCCTTCATATP T D A F G D I Q F E T L G K K G K Y I -TCCGCCTGTCCTGTGACACGGATGCGGAGACCCTCTATGAGCTGCTGACCCAGCACTGGC421 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 480AGGCGGACAGGACACTGTGCCTACGCCTCTGGGAGATACTCGACGACTGGGTCGTGACCGR L S C D T D A E T L Y E L L T Q H W H -ACCTGAAAACGCCCAACCTGGTCATATCTGTCACCGGCGGCGCCAAGAACTTCGCCCTGA481 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 540TGGACTTTTGCGGGTTGGACCAGTATAGACAGTGGCCGCCGCGGTTCTTGAAGCGGGACTL K T P N L V I S V T G G A K N F A L K -AGCCGAGGATGCGCAAGATCTTCAGCCGCCTCATCTACATCGCGCAGTCCAAAGGTGCTT541 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 600TCGGCTCCTACGCGTTCTAGAAGTCGGCGGAGTAGATGTAGCGCGTCAGGTTTCCACGAAP R M R K I F S R L I Y I A Q S K G A W -GGATTCTCACTGGAGGAACCCATTATGGCCTGATGAAGTACATCGGGGAGGTGGTGAGAG601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 660CCTAAGAGTGACCTCCTTGGGTAATACCGGACTACTTCATGTAGCCCCTCCACCACTCTCI L T G G T H Y G L M K Y I G E V V R D -ACAACACCATCAGCAGGAATTCAGAGGAGAACATTGTGGCCATTGGCATAGCGGCTTGGG661 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 720TGTTGTGGTAGTCGTCCTTAAGTCTCCTCTTGTAACACCGGTAACCGTATCGCCGAACCCN T I S R N S E E N I V A I G I A A W G -GCATGGTCTCCAACAGGGACACTCTCCTCAGGAATTGCGATGCTGAGGGATATTTTTCAG721 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 780CGTACCAGAGGTTGTCCCTGTGAGAGGAGTCCTTAACGCTACGACTCCCTATAAAAAGTCM V S N R D T L L R N C D A E G Y F S A -CTCAGTACATAATGGATGACTTCAAGAGAGACCCTCTGTATATCTTGGACAACAACCACA781 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 840
GAGTCATGTATTACCTACTGAAGTTCTCTCTGGGAGACATATAGAACCTGTTGTTGGTGTQ Y I M D D F K R D P L Y I L D N N H T -CCCATCTGCTGCTTGTGGACAACGGCTGCCATGGACATCCTACAGTTGAAGCAAAACTCC841 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 900GGGTAGACGACGAACACCTGTTGCCGACGGTACCTGTAGGATGTCAACTTCGTTTTGAGGH L L L V D N G C H G H P T V E A K L R -GGAATCAGCTGGAGAAGTACATCTCCGAGCGCACTATTCAAGATTCCAACTATGGTGGCA901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 960CCTTAGTCGACCTCTTCATGTAGAGGCTCGCGTGATAAGTTCTAAGGTTGATACCACCGTN Q L E K Y I S E R T I Q D S N Y G G K -AGATCCCCATTGTGTGTTTTGCCCAAGGAGGTGGCAGAGAAACTTTGAAAGCCATCAACA961 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1020TCTAGGGGTAACACACAAAACGGGTTCCTCCACCGTCTCTTTGAAACTTTCGGTAGTTGTI P I V C F A Q G G G R E T L K A I N T -CCTCCATCAAAAGCAAAATCCCCTGTGTGGTGGTGGAAGGCTCAGGGCAGATTGCAGACG1021 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1080GGAGGTAGTTTTCGTTTTAGGGGACACACCACCACCTTCCGAGTCCCGTCTAACGTCTGCS I K S K I P C V V V E G S G Q I A D V -TGATCGCGAGCCTGGTGGAGGTGGAGGACGTCCTGACGTCATCTGTGGTCAAGGAGAAGT1081 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1140ACTAGCGCTCGGACCACCTCCACCTCCTGCAGGACTGCAGTAGACACCAGTTCCTCTTCAI A S L V E V E D V L T S S V V K E K L -TGGTGCGCTTCTTACCCCGCACAGTGTCCCGGCTGCCTGAGGAGGAGACCGAGAGTTGGA1141 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1200ACCACGCGAAGAATGGGGCGTGTCACAGGGCCGACGGACTCCTCCTCTGGCTCTCAACCTV R F L P R T V S R L P E E E T E S W I -TCAAATGGCTCAAAGAAATTCTCGAAAGTTCTCACCTATTAACAGTTATTAAAATGGAAG1201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1260AGTTTACCGAGTTTCTTTAAGAGCTTTCAAGAGTGGATAATTGTCAATAATTTTACCTTCK W L K E I L E S S H L L T V I K M E E -AAGCTGGAGACGAAATTGTGAGCAATGCTATTTCTTATGCTTTGTACAAAGCCTTTAGCA1261 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1320TTCGACCTCTGCTTTAACACTCGTTACGATAAAGAATACGAAACATGTTTCGGAAATCGTA G D E I V S N A I S Y A L Y K A F S T -CCAATGAACAAGATAAGGATAACTGGAATGGGCAGCTGAAGCTTCTGCTGGAATGGAACC1321 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1380GGTTACTTGTTCTATTCCTATTGACCTTACCCGTCGACTTCGAAGACGACCTTACCTTGGN E Q D K D N W N G Q L K L L L E W N Q -AGCTGGACCTAGCCAATGAGGAGATATTCACCAACGACCGCCGATGGGGGTCTGCTGATC1381 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1440TCGACCTGGATCGGTTACTCCTCTATAAGTGGTTGCTGGCGGCTACCCCCAGACGACTAGL D L A N E E I F T N D R R W G S A D L -TGCAAGAGGTCATGTTTACAGCTCTCATAAAGGACAGACCCAAGTTTGTCCGCCTCTTCC1441 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1500ACGTTCTCCAGTACAAATGTCGAGAGTATTTCCTGTCTGGGTTCAAACAGGCGGAGAAGGQ E V M F T A L I K D R P K F V R L F L -TGGAGAATGGGTTGAACCTGCGCAAGTTTCTCACCAATGACGTCCTCACTGAACTCTTCT1501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1560ACCTCTTACCCAACTTGGACGCGTTCAAAGAGTGGTTACTGCAGGAGTGACTTGAGAAGAE N G L N L R K F L T N D V L T E L F S -CCAACCACTTCAGCACCCTTGTCTACCGGAACCTGCAGATTGCCAAGAATTCCTATAACG1561 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1620GGTTGGTGAAGTCGTGGGAACAGATGGCCTTGGACGTCTAACGGTTCTTAAGGATATTGCN H F S T L V Y R N L Q I A K N S Y N D -ATGCCCTCCTCACATTCGTCTGGAAACTGGTGGCCAACTTCCGGAGAGGCTTCCGAAAGG1621 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1680TACGGGAGGAGTGTAAGCAGACCTTTGACCACCGGTTGAAGGCCTCTCCGAAGGCTTTCCA L L T F V W K L V A N F R R G F R K E -AAGACAGAAGTAGCAGGGATGACATAGATGTAGAACTTCACGATGTGTCTCCTATCACTC1681 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1740TTCTGTCTTCATCGTCCCTACTGTATCTACATCTTGAAGTGCTACACAGAGGATAGTGAGD R S S R D D I D V E L H D V S P I T R -GGCACCCGCTGCAAGCACACTTCATCTGGGCCATTCTTCAGAACAAGAAGGAACTGTCCA
1741 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1800CCGTGGGCGACGTTCGTGTGAAGTAGACCCGGTAAGAAGTCTTGTTCTTCCTTGACAGGTH P L Q A H F I W A I L Q N K K E L S K -AGGTCATTTGGGAGCAGACCAGGGGCTGCACGTTGGCAGCCCTGGGAGCCAGCAAGCTTC1801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1860TCCAGTAAACCCTCGTCTGGTCCCCGACGTGCAACCGTCGGGACCCTCGGTCGTTCGAAGV I W E Q T R G C T L A A L G A S K L L -TGAAGACTCTGGCCAAGGTGAAGAATGACATCAATGCTGCAGGGGAGTCCGAGGAGCTGG1861 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1920ACTTCTGAGACCGGTTCCACTTCTTACTGTAGTTACGACGTCCCCTCAGGCTCCTCGACCK T L A K V K N D I N A A G E S E E L A -CAAATGAGTATGAGACCCGTGCAGTTGAGCTGTTCACGGAGTGCTACAGCAGCGACGAGG1921 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1980GTTTACTCATACTCTGGGCACGTCAACTCGACAAGTGCCTCACGATGTCGTCGCTGCTCCN E Y E T R A V E L F T E C Y S S D E D -ACCTGGCCGAGCAGCTGCTGGTGTACTCCTGCGAAGCCTGGGGCGGGAGCAACTGCTTGG1981 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2040TGGACCGGCTCGTCGACGACCACATGAGGACGCTTCGGACCCCGCCCTCGTTGACGAACCL A E Q L L V Y S C E A W G G S N C L E -AGCTGGCGGTGGAGGCCACGGACCAGCACTTCATCGCCCAGCCCGGGGTCCAGAATTTTC2041 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2100TCGACCGCCACCTCCGGTGCCTGGTCGTGAAGTAGCGGGTCGGGCCCCAGGTCTTAAAAGL A V E A T D Q H F I A Q P G V Q N F L -TTTCCAAGCAATGGTATGGAGAGATTTCCCGAGACACCAAGAACTGGAAGATTATCCTGT2101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2160AAAGGTTCGTTACCATACCTCTCTAAAGGGCTCTGTGGTTCTTGACCTTCTAATAGGACAS K Q W Y G E I S R D T K N W K I I L C -GTTTGTTTATTATACCCTTGGTGGGCTGTGGCTTTGTATCCTTTAGGAAGAGGCCCATCG2161 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2220CAAACAAATAATATGGGAACCACCCGACACCGAAACATAGGAAATCCTTCTCCGGGTAGCL F I I P L V G C G F V S F R K R P I D -ACAAGCACAAGAAGATCCTGTGGTACTACGTGGCGTTCTTCACCTCCCCCTTTGTGGTCT2221 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2280TGTTCGTGTTCTTCTAGGACACCATGATGCACCGCAAGAAGTGGAGGGGGAAACACCAGAK H K K I L W Y Y V A F F T S P F V V F -TCGCCTGGAACGTGGTCTTCTACATCGCCTTCCTCCTGCTCTTTGCCTACGTGCTGCTCA2281 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2340AGCGGACCTTGCACCAGAAGATGTAGCGGAAGGAGGACGAGAAACGGATGCACGACGAGTA W N V V F Y I A F L L L F A Y V L L M -TGGATTTTCACTCAGTGCCACACTCCCCCGAGCTGGTCCTCTACGCACTGGTCTTTGTCC2341 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2400ACCTAAAAGTGAGTCACGGTGTGAGGGGGCTCGACCAGGAGATGCGTGACCAGAAACAGGD F H S V P H S P E L V L Y A L V F V L -TGTTCTGTGATGAAGTGAGACAGTGGTACATGAATGGGGTGAATTATTTTACCGACCTGT2401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2460ACAAGACACTACTTCACTCTGTCACCATGTACTTACCCCACTTAATAAAATGGCTGGACAF C D E V R Q W Y M N G V N Y F T D L W -GGAATGTCATGGACACACTTGGGCTTTTTTACTTCATAGCAGGCATTGTGTTTCGGCTCC2461 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2520CCTTACAGTACCTGTGTGAACCCGAAAAAATGAAGTATCGTCCGTAACACAAAGCCGAGGN V M D T L G L F Y F I A G I V F R L H -ACCCTTCTAATAAAACCTCTTTGTATTCCGGACGAGTCATCTTTTGCCTGGATTACATTA2521 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2580TGGGAAGATTATTTTGGAGAAACATAAGGCCTGCTCAGTAGAAAACGGACCTAATGTAATP S N K T S L Y S G R V I F C L D Y I I -TATTCACCCTAAGGTTGATCCACATTTTCACCGTAAGCAGAAATTTGGGACCGAAGATTA2581 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2640ATAAGTGGGATTCCAACTAGGTGTAAAAGTGGCATTCGTCTTTAAACCCTGGCTTCTAATF T L R L I H I F T V S R N L G P K I I -TAATGTTGCAGAGGATGCTGATCGACGTGTTTTTCTTCCTGTTTCTGTTTGCCGTGTGGA2641 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2700ATTACAACGTCTCCTACGACTAGCTGCACAAAAAGAAGGACAAAGACAAACGGCACACCTM L Q R M L I D V F F F L F L F A V W M -
TGGTGGCCTTCGGCGTGGCCAGGCAAGGGATCCTCAGGCAAAATGAGCATCGCTGGAGGT2701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2760ACCACCGGAAGCCGCACCGGTCCGTTCCCTAGGAGTCCGTTTTACTCGTAGCGACCTCCAV A F G V A R Q G I L R Q N E H R W R W -GGATATTCCGCTCGGTTATCTACGAGCCCTACCTGGCCATGTTCGGCCAAGTGCCCAGCG2761 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2820CCTATAAGGCGAGCCAATAGATGCTCGGGATGGACCGGTACAAGCCGGTTCACGGGTCGCI F R S V I Y E P Y L A M F G Q V P S D -ACGTGGATGGTACCACATATGACTTTGCCCACTGCACTTTCACTGGGAATGAGTCCAAGC2821 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2880TGCACCTACCATGGTGTATACTGAAACGGGTGACGTGAAAGTGACCCTTACTCAGGTTCGV D G T T Y D F A H C T F T G N E S K P -CGCTGTGTGTGGAGCTGGATGAGCACAACCTCCCCCGGTTCCCCGAGTGGATCACCATCC2881 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2940GCGACACACACCTCGACCTACTCGTGTTGGAGGGGGCCAAGGGGCTCACCTAGTGGTAGGL C V E L D E H N L P R F P E W I T I P -CTCTGGTGTGCATCTACATGCTCTCCACCAACATCCTGCTGGTCAATCTGCTCGTTGCCA2941 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3000GAGACCACACGTAGATGTACGAGAGGTGGTTGTAGGACGACCAGTTAGACGAGCAACGGTL V C I Y M L S T N I L L V N L L V A M -TGTTTGGCTACACAGTGGGAACGGTCCAGGAGAACAACGATCAGGTCTGGAAGTTCCAGA3001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3060ACAAACCGATGTGTCACCCTTGCCAGGTCCTCTTGTTGCTAGTCCAGACCTTCAAGGTCTF G Y T V G T V Q E N N D Q V W K F Q R -GGTACTTCTTGGTGCAGGAGTACTGCAACCGCCTGAACATCCCCTTCCCCTTTGTGGTCT3061 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3120CCATGAAGAACCACGTCCTCATGACGTTGGCGGACTTGTAGGGGAAGGGGAAACACCAGAY F L V Q E Y C N R L N I P F P F V V F -TCGCCTACTTCTACATGGTGGTCAAGAAGTGCTTCGGATGCTGCTGCAGGGAGAAACACG3121 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3180AGCGGATGAAGATGTACCACCAGTTCTTCACGAAGCCTACGACGACGTCCCTCTTTGTGCA Y F Y M V V K K C F G C C C R E K H A -CCGAGCCTTCTGCCTGCTGTTTCAGAAATGAAGACAATGAGACTCTGGCATGGGAGGGTG3181 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3240GGCTCGGAAGACGGACGACAAAGTCTTTACTTCTGTTACTCTGAGACCGTACCCTCCCACE P S A C C F R N E D N E T L A W E G V -TCATGAAAGAAAATTACCTTGTCAAGATCAACACGGAGGCCAATGACACCTCACAGGAAA3241 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3300AGTACTTTCTTTTAATGGAACAGTTCTAGTTGTGCCTCCGGTTACTGTGGAGTGTCCTTTM K E N Y L V K I N T E A N D T S Q E M -TGAGGCATCGGTTTAGACAGCTGGATACAA GATTAATGATCTCAAGGGCCTTCTGAAAG3301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3360ACTCCGTAGCCAAATCTGTCGACCTATGTTTCTAATTACTAGAGTTCCCGGAAGACTTTCR H R F R Q L D T K I N D L K G L L K E -AGATCGCTAATAAAATCAAATAGAACTTCATGGACTGTACTGGAGAAAAACCTAATTATA3361 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3420TCTAGCGATTATTTTAGTTTATCTTGAAGTACCTGACATGACCTCTTTTTGGATTAATATI A N K I K *GCAAGGTGACACCAGAAATCGAAGTGGGAACCAGTCAAGAAAAGCTGATGAACAGTTTTG3421 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3480CGTTCCACTGTGGTCTTTAGCTTCACCCTTGGTCAGTTCTTTTCGACTACTTGTCAAAACTTACTGACTGCTCAGTAAGAACTGTTCAGGCCGTGGGTATTTAGCAGATGGCTTTCATCA3481 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3540AATGACTGACGAGTCATTCTTGACAAGTCCGGCACCCATAAATCGTCTACCGAAAGTAGTCCCCAGTGTGCTCAAATCTGGGAAACAGACGTGTGATTGGTTTCCCCCGAGAAGATAGAC3541 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+3600GGGGTCACACGAGTTTAGACCCTTTGTCTGCACACTAACCAAAGGGGGCTCTTCTATCTGACCCAGGAAGAGCTTCCCCTGAAGGCCACCCTGTTACTTCCTGAGTCTCCACCACTCATA3601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3660TGGGTCCTTCTCGAAGGGGACTTCCGGTGGGACAATGAAGGACTCAGAGGTGGTGAGTATCCCACTGCGGGTCATCTTAGAGTGTGTTCCTGCACTCTTCTTCTTTCTTCACTTTTCCTA3661 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3720GGGTGACGCCCAGTAGAATCTCACACAAGGACGTGAGAAGAAGAAAGAAGTGAAAAGGAT
CTTCTAACTCTGTGCATATTACATCTCTCCTGCAAGGGGGTCATGCCTTCCCTCCCATAA3721---------+---------+---------+---------+---------+---------+3780GAAGATTGAGACACGTATAATGTAGAGAGGACGTTCCCCCAGTACGGAAGGGAGGGTATTAAAAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA3781---------+---------+---------+ 3815TTTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT表2C MSFEGARLSM RNRRNGTLDS TRTLYSSTSR STDVSYSESD LVNFIQANFK KRECVFFTKD 60|||**||||| |||||*|||| |||||||*|| |||*|||||| |||||||||| |||||||*||H MSFRAARLSM RNRRNDTLDS TRTLYSSASR STDLSYSESD LVNFIQANFK KRECVFFIKD|||||||||| |*|||||**| |||||||*|| |||||||*|| |||||||||| ||||||||*|M MSFEGARLSM RSRRNGTMGS TRTLYSSVSR STDVSYSDSD LVNFIQANFK KRECVFFTRD|||||||||| |*||||||*| |||||||*|| |||||||||| |||||||||| ||||||||*|R MSFEGARLSM RSRRNGTLGS TRTLYSSVSR STDVSYSESD LVNFIQANFK KRECVFFTRDC SKATENVCKC GYAQSQHIEG TQINSNEKWN YKKHTKEFPT DAFGDIQFET LGKKGKYIRL 120|||||||||| |||||||*|| ||||**|||| |||||||||| |||||||||| ||||||||||H SKATENVCKC GYAQSQHMEG TQINQSEKWN YKKHTKEFPT DAFGDIQFET LGKKGKYIRL|||*||*||| |||||||||| ||||*||||| |||||||||| |||||||||| |||||||*||M SKAMENICKC GYAQSQHIEG TQINQNEKWN YKKHTKEFPT DAFGDIQFET LGKKGKYLRL|||*|**||| |||||||||| |||||||||| |||||||||| |||||||||| |||||||*||R SKAMESICKC GYAQSQHIEG TQINQNEKWN YKKHTKEFPT DAFGDIQFET LGKKGKYLRLC SCDTDAETLY ELLTQHWHLK TPNLVISVTG GAKNFALKPR MRKIFSRLIY IAQSKGAWIL 180|||||||*|| |||||||||| |||||||||| |||||||||| |||||||||| ||||||||||H SCDTDAEILY ELLTQHWHLK TPNLVISVTG GAKNFALKPR MRKIFSRLIY IAQSKGAWIL|||||*|||| |||||||||| |||||||||| |||||||||| |||||||||| ||||||||||M SCDTDSETLY ELLTQHWHLK TPNLVISVTG GAKNFALKPR MRKIFSRLIY IAQSKGAWIL|||||*|||| |||||||||| |||||||||| |||||||||| |||||||||| ||||||||||R SCDTDSETLY ELLTQHWHLK TPNLVISVTG GAKNFALKPR MRKIFSRLIY IAQSKGAWILC TGGTHYGLMK YIGEVVRDNT ISRNSEENIV AIGIAAWGMV SNRDTLLRNC DAEGYFSAQY 240|||||||||| |||||||||| |||*|||||| |||||||||| ||||||*||| ||||||*|||H TGGTHYGLMK YIGEVVRDNT ISRSSEENIV AIGIAAWGMV SNRDTLIRNC DAEGYFLAQY|||||||||| |||||||||| |||||||||| |||||||||| ||||||*|*| |*||*|||||M TGGTHYGLMK YIGEVVRDNT ISRNSEENIV AIGIAAWGMV SNRDTLIRSC DDEGHFSAQY|||||||||| |||||||||| |||||||||| |||||||||| ||||||*||| |*||*|||||R TGGTHYGLMK YIGEVVRDNT ISRNSEENIV AIGIAAWGMV SNRDTLIRNC DDEGHFSAQYC IMDDFKRDPL YILDNNHTHL LLVDNGCHGH PTVEAKLRNQ LEKYISERTI QDSNYGGKIP 300*||||*|||| |||||||||| |||||||||| |||||||||| |||||||||| ||||||||||H LMDDFTRDPL YILDNNHTHL LLVDNGCHGH PTVEAKLRNQ LEKYISERTI QDSNYGGKIP|||||*|||| |||||||||| |||||||||| |||||||||| |||||||||* ||||||||||M IMDDFTRDPL YILDNNHTHL LLVDNGCHGH PTVEAKLRNQ LEKYISERTS QDSNYGGKIP|||||*|||| |||||||||| |||||||||| |||||||||| |||||||||* ||||||||||R IMDDFMRDPL YILDNNHTHL LLVDNGCHGH PTVEAKLRNQ LEKYISERTS QDSNYGGKIPC IVCFAQGGGR ETLKAINTSI KSKIPCVVVE GSGQIADVIA SLVEVEDVLT SSVVKEKLVR 360|||||||||* |||||||||| |*|||||||| |||||||||| |||||||*|| ||*|||||||H IVCFAQGGGK ETLKAINTSI KNKIPCVVVE GSGQIADVIA SLVEVEDALT SSAVKEKLVR|||||||||| |||||||||* |||||||||| |||||||||| |||||||||| ||*|||||||M IVCFAQGGGR ETLKAINTSV KSKIPCVVVE GSGQIADVIA SLVEVEDVLT SSMVKEKLVR|||||||||| |||||||||* |||||||||| |||||||||| |||||||||| ||*|||||||R IVCFAQGGGR ETLKAINTSV KSKIPCVVVE GSGQIADVIA SLVEVEDVLT SSMVKEKLVRC FLPRTVSRLP EEETESWIKW LKEILESSHL LTVIKMEEAG DEIVSNAISY ALYKAFSTNE 420|||||||||| |||||||||| ||||||*||| |||||||||| |||||||||| ||||||||*|H FLPRTVSRLP EEETESWIKW LKEILECSHL LTVIKMEEAG DEIVSNAISY ALYKAFSTSE|||||||||| |||*|||||| |||||||||| |||||||||| |||||||||| ||||||||||M FLPRTVSRLP EEEIESWIKW LKEILESSHL LTVIKMEEAG DEIVSNAISY ALYKAFSTNE|||||||||| |||*|||||| |||||||*|| |||||||||| ||*||*|||| ||||||||||R FLPRTVSRLP EEEIESWIKW LKEILESPHL LTVIKMEEAG DEVVSSAISY ALYKAFSTNEC QDKDNWNGQL KLLLEWNOLD LANEEIFTND RRWGSADLQE VMFTALIKDR PKFVRLFLEN 480|||||||||| |||||||||| |||*|||||| |||*|||||| |||||||||| ||||||||||H QDKDNWNGQL KLLLEWNQLD LANDEIFTND RRWESADLQE VMFTALIKDR PKFVRLFLEN|||||||||| |||||||||| ||**|||||| |||*|||||| |||||||||| ||||||||||M QDKDNWNGQL KLLLEWNQLD LASDEIFTND RRWESADLQE VMFTALIKDR PKFVRLFLEN|||||||||| |||||||||| ||**||||*| |||*|||||| |||||||||| ||||||||||R QDKDNWNGQL KLLLEWNQLD LASDEIFTHD RRWESADLQE VMFTALIKDR PKFVRLFLENC GLNLRKFLTN DVLTELFSNH FSTLVYRNLQ IAKNSYNDAL LTFVWKLVAN FRRGFRKEDR 540|||||||||* |||||||||| |||||||||| |||||||||| |||||||||| ||||||||||
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H RFRQLDTKLN DLKGLLKEIA NKIK||||||*|*| |||*|||||| |*||M RFRQLDSKLN DLKSLLKEIA NNIK||||||||*| |||||||||| |*||R RFRQLDTKLN DLKGLLKEIA NKIK表3
表4
实施例1由狗DRG神经元克隆CMR1A.poly(A+)RNA的分离作为cCMR1克隆中的第一步，使用OligotexTM离心柱(Qiagen Inc.，CA)由100μg犬DRG的总RNA[(由Analytical Biological Service Inc.DE定做)]分离poly(A+)RNA。简而言之，将150μl无RNA酶的水、250μl缓冲液OBB[20mM Tris，pH7.5，1M NaCl，2mM EDTA和0.2％SDS]和15μl Oligotex珠的悬浮液力加入到100μl总RNA溶液(1μg/μl)中。然后在70℃加热RNA/Oligotex珠混合物3分钟，以破坏RNA的任何二级结构，接着于室温温育10分钟。离心poly(A+)RNA/Oligotex颗粒复合物，并用400μl缓冲液OW2[10mM Tris，pH7.5，150mM NaCl和1mM EDTA]漂洗2次，然后转移至用于洗脱步骤的离心柱。使用200μl预温热(70℃)的缓冲液OEB[5mM Tris，pH7.5]由Oligotex珠洗脱poly(A+)RNA。最后，在20μg糖原和150mM乙酸钠存在下以乙醇沉淀犬DRG poly(A+)RNA，并重悬浮在10μl无RNA酶的水中。
B.双链cDNA的合成混合4μl(1μg)犬DRG poly(A+)RNA和1μl cDNA合成引物(一种具有序列5’-TTCTAGAATTCAGCGGCGC(T)30N-1N-3′(N-1＝G、A或C；N＝G、A、C或T)(Clontech，CA SEQ ID NO10)的52聚寡核苷酸)，并于70℃温育2分钟，然后在冰上冷却2分钟。在10μl的1mMdNTP混合物和第一链合成缓冲液(50mM Tris，pH8.5，8mM MgCl2，30mM KCl和1mM DTT)存在下，使用20单位AMV逆转录酶，于42℃进行1小时的第一链cDNA合成(逆转录)。通过加入80μl的酶混合物(由24单位大肠杆菌DNA聚合酶I、5单位大肠杆菌DNA连接酶I、单位大肠杆菌RNA酶H组成)、0.25mM dNTP混合物(dATP、dCTP、dGTP和dTTP各0.25mM)和第二链缓冲液(100mM KCl、10mM硫酸铵、5mM MgCl2、0.15mM β-NAD、20mM Tris pH7.5和50μM/ml牛血清白蛋白)进行cDNA第二链的合成。反应首先于16℃进行90分钟，接着加入20单位T4 DNA聚合酶，以相同的温度继续温育45分钟。通过加入10mM EDTA和8μg糖原终止反应。进行苯酚和氯仿提取，接着乙醇沉淀。然后将双链cDNA悬浮在200μlTE缓冲液中，并储存于-20℃。
C.狗CMR1近羧基端的PCR扩增使用两种称为cmr1-23(5′-ttcatctgggccattcttcag-3′(SEQ ID NO3)，其与SEQ ID NO 1的核苷酸1761-1781杂交)和cmr1-26(5′-cacagtggcttggactcatt-3′(SEQ ID NO4)，其与SEQ ID NO1的核苷酸2868-2886杂交)的引物，通过PCR成功扩增部分cCMR1序列。在含5μl犬DRG双链cDNA、提供Advantage2 DNA聚合酶的5μl 10X反应缓冲液、200μM dNTP、200nM正向引物cmr1-23、200nM反向引物cmr1-26和1μl 50X AdvantageTM-HF2 DNA聚合酶混合物(Clontech，CA)的50μl终体积中进行PCR反应。通过94℃、1分钟的初始变性步骤，接着30个循环(a)于94℃变性30秒，(b)于55℃退火30秒，和(c)于72℃延伸60秒，进行PCR。
进行琼脂糖凝胶电泳，其揭示PCR产物约为1.1kb。在PCR后，纯化1.1kb PCR片段，并按照供应商的方法将其亚克隆入pPCRscript(Stratagene)中。拣出2个独立的克隆，进行DNA测序分析。
序列结果揭示，PCR扩增的片段与小鼠、大鼠和人CMR1近羧基端的同一性分别为83％、84％和87％。
D.cCMR1序列5′和3′末端的RACE-PCR为获得cCMR1基因的完整5′和3′cDNA序列，进行RACE-PCR技术。首先，用SMARTTMRACE DNA扩增试剂盒(BD Clontech，CA)，按照生产商的说明，分别合成5′-和3′-RACE-Ready cDNA。为制备用于5′RACE的cDNA，在一个0.5ml管中，将A中获得的3μl狗DRG poly(A+)RNA与1μl 5′-CDS引物和1ml SMART II A寡核苷酸混合。为制备用于3′RACE的cDNA，在另一个0.5ml管中将3μl狗DRG poly(A+)RNA与1μl 3’-CDS引物和1μl无RNA酶的水混合，然后于70℃温育2分钟，接着在冰上冷却2分钟。接着，将2μl 5X第一链缓冲液、1μl 20mM DTT、1μl 10mM dNTP混合物和1μlPowerScript逆转录酶加入到各个管中，并于42℃进行90分钟的合成。通过加入200μl TE缓冲液并于72℃加热样品7分钟终止反应。将反应产物储存于-20℃。
对于RACE-PCR，基于接近cCMR1 cDNA 5′部分的1.1kb cDNA序列合成两个引物。3′RACE-PCR的正向引物称为dcmr1-3，具有以下序列5′-GCCCATCGACAAGCACAAGAAGATC-3′(SEQ ID NO5)，其与SEQ ID NO1(互补链)的核苷酸2213-2237杂交；用于5′RACE-PCR的反向引物称为dcmr1-1，具有以下序列5′-GATCTTCTTGTGCTTGTCGATGGGC-3′(SEQ ID NO6)，其与SEQID NO1的核苷酸2213-2237杂交。在含5μl cDNA模板(如上所述的5′-或3′-RACE-Ready cDNA中的任一种)、5μl 10X反应缓冲液、200μM dNTP、200nM通用引物混合物(UPM)(Clontech)、SEQ ID NO7(5′-CCA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC-3′)、200nMcCMR1特异性引物(用于5′-RACE PCR的dcmr1-1或用于3′-RACEPCR的dcmr1-3)和1μl 50X AdvantageTM-HF2 DNA聚合酶混合物(Clontech)的50μl终体积中进行5′和3′-RACE PCR两者。用于RACE-PCR的热循环仪参数是a)于94℃初始变性2分钟；b)5个循环94℃、30秒，72℃、3分钟；c)5个循环94℃、30秒，70℃、30秒，72℃、3分钟；和d)25个循环94℃、5秒，68℃、30秒，72℃、3分钟。在反应后，纯化、精修RACE-PCR产物，并直接亚克隆入pPCRscript中。由5′-RACE或3′-RACE拣出4个独立克隆，并进行DNA测序分析。
E.全长cCMR1 cDNA的序列基于通过RACE-PCR获得的5′和3′末端的序列，通过合成PCR引物，证实全长犬CMR1 cDNA的序列。用正向引物dcmr1-7(其具有以下序列5′-AAGCTTCAT ATG TCC TTC GAG GGG GCC AGGCTC AGC ATG AGG AA-3′(SEQ ID NO8))和反向引物dcmr1-8(其具有以下序列5′-CTCGAG CTA TTT GAT TTT ATT AGC GAT CTCTTT CAG AAG GCCC-3′(SEQ ID NO9))，通过高保真度DNA聚合酶，由在B中制备的犬DRG双链cDNA扩增全长cCMR1 cDNA。在含5μl上述狗DRG双链cDNA、5μl 10x反应缓冲液、200μMdNTP、200nM正向引物dcmr1-7、200nM反向引物dcmr1-8和1μl 50x AdvantageTM-HF2 DNA聚合酶混合物(Clontech，CA)的50μl终体积中进行PCR。PCR反应参数为1个循环于94℃初始变性2分钟；35个循环a)于94℃变性30秒，b)于70℃退火和延伸5分钟。在PCR后，纯化3.4kb PCR片段，并按照与C相同的克隆方法亚克隆入pPCRscript中。拣出4个独立的克隆，并进行DNA测序分析。克隆NQC562用于进一步亚克隆和研究。测序结果揭示，cCMR1 cDNA核酸序列(SEQ ID NO1的核苷酸69-3380)与小鼠(登录号AY095352)、大鼠(登录号AY072788)和人(登录号NM_024080)CMR1 cDNA序列的同一性分别为86.2％、86.6％和90.9％。
F.序列分析5′-和3′-RACE-PCR允许测定5′非翻译区的68个核苷酸的序列；3′-RACE-PCR允许测定3′非翻译区含37聚poly(A+)尾的431bp。未鉴别出符合读框的终止密码子。
预测的cCMR1可读框由3315bp的序列组成，预测其编码1104个氨基酸(SEQ ID NO2)的多肽，该多肽具有127.6kDa的理论分子量(参见表1)。初级序列的Kyte-Doolitle亲水性分析(未显示)推测存在8个聚簇在羧基端附近的推定疏水结构域。鉴别出卷曲螺旋结构域位于由残基1070至末端的非常羧基端的几率很高，这可能暗示通道寡聚化。此外，用GCG SeqWeb进行初级序列分析揭示，cCMR1含多个N-糖基化位点，分别位于残基15、256、317、812、934、1050和1072。cCMR1还在残基92含一个推定PKA(蛋白激酶A)磷酸化位点，在残基30、228和288含3个酪氨酸磷酸化位点，并含17个PKC(蛋白激酶C)磷酸化位点。
使用Accelrys的Seqweb第2版的Gap程序比对cCMR1氨基酸序列和人(GenBank登录号NP_076985)、大鼠(GenBank登录号NP_599198)和小鼠(GenBank登录号AAM23261)序列，结果揭示分别具有95.1％、94.1％和93.9％同一性。Gap程序使用Needleman和Wunsch(J Mol.Biol.，48443(1970))的算法，以研究两个完整序列的比对。其使匹配数最大，使空位数最小。
实施例2CMR1的重组表达A.将cCMR1克隆入哺乳动物表达载体中为在哺乳动物细胞系中表达cCMR1，通过进行三向连接，将cCMR1的全长cDNA亚克隆入pcDNA3.1中。首先，用HindIII和NcoI消化全长cCMR1克隆NQC562，产生0.8kb的5′片段。接着，在独立的限制性反应中，用NcoI和SalI消化NQC562，产生2.5kb的3′片段。纯化0.8kb的5′cCMR1片段和2.5kb的3′cCMR1片段，并与用HindIII和SalI预消化的pcDNA3.1连接，产生载体pcDNA3.1-cCMR1。
对于体外翻译分析，将全长cCMR1 cDNA亚克隆入pAGA4载体(由Promega的pGEM3改进，Sanford 1991和Qin等，1997)中。简单地说，通过用NdeI和NcoI消化NQC562获得0.8kb的N端片段，并通过用NcoI和XhoI消化NQC562获得2.5kb的C端片段。将两个纯化片段与用NdeI和SalI预消化的载体pAGA4连接在一起，产生构建物cCMR1/pAGA4。通过DNA测序检验全部最终构建物。
B.cCMR1的体外翻译用TnTTM T7快速偶合转录/翻译系统(Promega)，按照供应商推荐的方法，进行犬CMR1的体外翻译。简单来说，将1μl 0.1μg/μlcCMR1/pAGA4和0.2μl[35S]-甲硫氨酸(1000Ci/mmol，10mCi/ml)加入到9μl TNT Quick Master Mix中。将反应混合物于30℃温育90分钟。通过加入等体积的2X SDS/PAGE荷载缓冲液终止反应，然后，对样品进行4-20％梯度SDS-PAGE分析。在电泳后，用考马斯蓝R250染色凝胶，干燥并对X光胶片曝光。如同由对应核酸序列如实翻译的氨基酸序列的预测，体外翻译的cCMR1迁移至约135kDa的分子量。
还通过蛋白质印迹分析体外翻译的cCMR1蛋白。对5μl体外翻译的cCMR1蛋白进行4-20％梯度SDS-PAGE。然后将凝胶上的蛋白转移至硝酸纤维素。接着用5％奶粉的TTBS(0.5％Tween20，100mMTris-HCl和0.9％NaCl，pH＝7.5)溶液于室温封闭印迹1小时，然后与抗-cCMR1多克隆抗体(1∶500)于4℃温育过夜。第二天，用100ml TTBS漂洗印迹3次，并与缀合辣根过氧化物酶(Pierce)的山羊抗兔IgG抗体于室温温育1小时。用100ml TTBS漂洗印迹3次，按照生产商的说明用ECL-Plus发光试剂(Amersham-Pharamacial Biotech)显像。
使用GeneJammerTM试剂盒(Stratagene，CA)，按照生产商的方法，将pcDNA3.1-cCMR1构建物转染入HEK293(人胚胎肾细胞(ATCCCRL-1573))中。通过在G418存在下生长选择稳定的细胞克隆。分离并纯化单个G418抗性克隆。使用钙内流实验分析含cCMR1 cDNA的克隆。
实施例3cCMR1的钙内流功能实验进行FLIPR实验，以研究cCMR1通道在细胞群中的特性。
为证实在重组细胞中表达的cCMR1的功能性，将CMR1/HEK293稳定转染细胞以6.7×105细胞/孔的浓度接种在384孔板中，于37℃温育过夜。第二天，用缓冲液和钙染料(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)加载细胞至40μl终体积，并于室温温育30分钟。在加入薄荷醇或Icilin之前和之后，通过FLIPR检测荧光强度，其中薄荷醇或Icilin分别各以100μM或10μM的浓度加入细胞中。结果示于图1。
实施例4采用降低的Ca++荷载浓度的CMR1功能实验CMR1在激动剂(例如薄荷醇或Icilin)以及轻度低温(15-25℃)作用下开放。因此，在室温(22-24℃)下CMR1可为活化的，并诱导Ca2+内流。但是，Ca2+内流又诱导Ca2+依赖性失活，导致负反馈调节CMR1。在此情况下，CMR1由室温活化后将失活，并一直到温度提高至约25℃以上才被再活化。因此，在正常测试条件(室温并有含2mM Ca2+的缓冲液)下，某些物种的CMR1，例如大鼠CMR1，对任何激动剂都无反应。为制备其中应使用CMR1于室温筛选拮抗剂的系统，通过去除染料荷载缓冲液的Ca2+，然后用4mM Ca2+刺激含CMR1的系统，开发Ca2+内流实验。在此条件下，尽管CMR1有活性(于室温)，但没有钙通过通道进入细胞，未发生失活。在这些实验条件下，CMR1具有组成型活性，Ca2+一加入到胞外溶液中，CMR1就被激发而允许Ca2+内流。
将用大鼠CMR1转染的人胚胎肾细胞(HEK293)接种在384孔板中(6.7×105细胞/孔)。第二天，去除培养基，用完全Hank缓冲液漂洗细胞。然后用缓冲液和钙染料(Mol.Dev.)加载细胞至40μl终体积，并于室温温育30分钟。然后，将板转移至FLIPR装置，其中，在0时将要测试其拮抗剂活性的化合物加至4.2μM终浓度。在约10秒的时间将钙加至4mM终浓度，通过FLIPR检测荧光强度。代表性的结果示于图2，其中在0时未加测试化合物。
实施例5用于CMR1通道脱敏剂或失活剂的筛选实验一般来说，当离子通道长时间接触活化刺激(例如激动剂)时或在直接脱敏或失活刺激作用下，通道可采取改变的构象，该构象在活化刺激作用下几乎不能被活化。这些几乎不能活化或失活的构象在功能上可称为脱敏或失活的，产生这些状态的化合物分别称为脱敏剂或失活剂。此构象可通过这些所谓的脱敏剂或失活剂或在其存在下诱导或稳定，并可通过脱敏剂或失活剂对开放或关闭的通道的优先作用而产生。另外，这种构象在可变的时程和条件内可以是可逆的，或者在重新合成新生通道的过程中是不可逆的。鉴别为可逆或不可逆的脱敏剂或失活剂的化合物可用于治疗其中降低CMR1活性有治疗作用的某些疾病，例如疼痛病症。
因此，在另一个实施方案中，本发明提供CMR1活性的可逆和不可逆脱敏剂或失活剂的鉴别方法。第一种方法设计用于鉴别将通道由关闭状态诱导和/或稳定在脱敏或失活状态的化合物，其包括以下步骤(a)提供含cCMR1蛋白编码核酸的重组细胞，(b)使重组细胞于活化阈值以上的温度(通常约28℃以上)和测试化合物接触不同的时间长度，(c)彻底洗除测试化合物，和(d)于变化的时间点测定测试化合物在随后接触CMR1活化刺激的作用下降低CMR1活性的程度。第二种方法设计用于鉴别将通道由开启状态诱导和/或稳定在脱敏或失活状态的化合物，其或者包括以下步骤(a)提供含cCMR1蛋白编码核酸的重组细胞，(b)使重组细胞于活化阈值以上的温度(通常约28℃以上)和CMR1激动剂接触，(c)使重组细胞与测试化合物接触不同的时间长度，(d)彻底洗除测试化合物和激动剂，和(e)于变化的时间点测定测试化合物在随后接触CMR1活化刺激的作用下降低CMR1活性的程度，或者该方法包括以下步骤(a)提供含cCMR1蛋白编码核酸的重组细胞，(b)于活化阈值以下的温度(通常约28℃以下)温育重组细胞，(c)使重组细胞与测试化合物接触不同的时间长度，(d)彻底洗除测试化合物，和(e)于变化的时间点测定测试化合物在随后接触CMR1活化刺激的作用下降低CMR1活性的程度。
实施例6芥子油活化cCMR1芥子油是一种在施加于皮肤时激发疼痛和炎症的天然产物。近来，已提议TRP家族的新成员TRPA1为芥子油刺激性作用的细胞和分子靶之一(Jordt等2004，Nature，427260-265)。我们证明，芥子油也活化cCMR1。
以6.7×105细u胞/孔的浓度将cCMR1稳定转染的HEK293细胞接种在384孔板中，并于37℃/5％CO2温育过夜。第二天，用钙染料荷载细胞，并于室温温育30分钟。在给予细胞化合物之前和之后，通过FLIPR检测钙介导的荧光强度。如图3所示，cCMR1不仅对冷感化合物(例如100nM Icilin(实线))敏感，而且被刺激性化合物1mM芥子油(虚线)活化。
实施例7全细胞膜片钳研究进行膜片钳实验，以研究在单个细胞中表达的cCMR1通道的特性。
将用犬cCMR1稳定转染的HEK293细胞在补加10％胎牛血清、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素和1mg/ml G418的DMEM中培养。细胞保持在37℃和5％CO2中。
除非另有说明，否则用于记录的标准胞外溶液含(单位为mM)NaCl，132；EGTA，1；KCl，5.4；MgCl2，0.8；HEPES，10；葡萄糖，10；pH＝7.4。在其中胞外溶液含Ca2+的实验中，根据使用的Ca2+浓度，使用的胞外溶液是以下的一种(单位为mM)(1)NaCl，132；CaCl2，0.1或1.8；KCl，5.4；MgCl2，0.8；HEPES，10；葡萄糖，10；pH＝7.4；(2)NaCl，116；CaCl2，10；KCl，5.4；MgCl2，0.8；HEPES，10；葡萄糖，10；pH＝7.4。用于填充记录电极的胞内溶液包含(单位为mM)CsCl，145；EGTA，5；HEPES，10；葡萄糖，5；pH＝7.4。
在以适于单细胞记录的密度将细胞接种在玻璃盖玻片上之后1-2天，使用常规全细胞膜片钳技术进行记录。通过膜片钳放大器放大电流，并以2kHz滤波(Axopatch 200B，Axon Instruments)。通过重力给予式灌注系统以0.5ml/分钟将薄荷醇(100μM)或Icilin(1μM)施加于细胞。于22℃进行与激动剂刺激相关的记录。
在其中温度变化的实验中，在通过双极温控器(型号CL-100，Warner Instruments)控制的双重线内加热器/冷却器(型号SC-20，Warner Instruments，Hamden，CT)中，通过加热/冷却灌注液，产生温度斜坡。用连接监测温度计(型号TH-8，Physitemp，Clifton，NJ)的定制小型热-微探针检测记录细胞附近的温度，并使用Digidata 1322A和pClamp 9.0(Axon Instruments，Union City，CA)采样，以全细胞膜片钳模式检测并发的电流。在这些研究中使用两个电压方案。第一个方案包括由-100mV至+60mV的600ms电压斜坡，采样速率10kHz。这种电压脉冲每5秒重复1次。在电压脉冲之间细胞保持在-100mV。在第二个方案中，细胞保持在-80mV，在此保持电位对电流持续采样(以100Hz)。
图4表明，cCMR1强外向整流，对阳离子是非选择性的。使用上述电压斜坡方案对cCMR1进行全细胞膜片钳记录。当应用冷却剂100μM薄荷醇时，超极化和去极化膜电位的全细胞电流幅度(实线)比对照(虚线)大幅增加。去极化电位的这种增加远比超极化电位显著。因此，通道强外向整流。另外薄荷醇活化电流具有接近0mV的逆转电位，表明通道的相对非选择性(至少对实验中使用的阳离子)特性。由另一种冷却剂Icilin也已获得性质上相似的结果。
cCMR1的温度敏感性示于图5。由于降低了cCMR1表达细胞灌注溶液的温度，所以在+60mV通过细胞的电流显著增加，活化阈值约为17℃。cCMR1通道在室温不开放，但在17℃以下的低温被活化。
图6表明，胞外Ca2+脱敏cCMR1通道。在没有胞外Ca2+(-80mV；灰色轨迹)时，100μM薄荷醇活化非脱敏电流。相反，在其它记录条件相同的情况下，在1.8mM胞外Ca2+存在下脱敏易于发生(黑色轨迹；对无Ca2+轨迹归一化以显示清晰性)。
当通道被薄荷醇(例如1mM)活化时，胞外Ca2+降低了cCMR1的电流幅度。胞外Ca2+的这种明显抑制是浓度依赖性的(图7)。胞外Ca2+浓度越高，电流幅度的抑制越强。图7中的虚线是代表对数据最佳拟合的逻辑函数。由最佳拟合分析获得1.6mM胞外Ca2+的IC50值。另外，胞外Ca2+的明显抑制是电压依赖性的(图8)。胞外Ca2+(10mM)在超极化电位强烈抑制电流幅度。此抑制在更去极化的电位降低。
权利要求
1.一种分离的核酸分子，所述核酸分子包含的核苷酸序列编码能够检测和转导冷刺激并与SEQ ID NO2具有至少96％序列同一性的多肽。
2.权利要求1的分离核酸分子，所述核酸分子编码与SEQ ID NO2具有至少98％序列同一性的多肽。
3.权利要求1的分离核酸分子，所述核酸分子编码SEQ ID NO2的多肽。
4.权利要求1的分离核酸分子，所述核酸分子包含SEQ ID NO1的核苷酸69至3380。
5.一种表达载体，所述载体包含权利要求1的分离核酸序列。
6.一种重组宿主细胞，所述细胞包含权利要求1的分离核酸序列。
7.一种基本纯化的多肽，所述多肽能够检测和转导冷刺激，并与SEQ ID NO2具有至少96％的序列同一性。
8.权利要求7的基本纯化的多肽，所述多肽与SEQ ID NO2具有至少98％的序列同一性。
9.权利要求7的基本纯化的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO2。
10.一种表达权利要求7的多肽的方法，所述方法包括以下步骤(a)将能够编码权利要求7的多肽的表达载体导入细胞中；和(b)在允许表达载体表达多肽的条件下培养细胞。
11.一种核酸探针，所述探针在严格杂交条件下与权利要求1的核酸分子选择性杂交。
12.一种抗体，所述抗体选择性结合权利要求7的多肽。
13.一种试剂盒，所述试剂盒包含权利要求11的核酸探针。
14.一种试剂盒，所述试剂盒包含权利要求12的抗体。
15.一种检测权利要求1的核酸分子的方法，所述方法包括使所述核酸分子与权利要求11的核酸探针接触的步骤。
16.一种检测权利要求7的多肽的方法，所述方法包括使所述多肽与权利要求12的抗体接触的步骤。
17.一种鉴别增加或降低cCMR1蛋白表达的化合物的方法，所述方法包括以下步骤(a)使测试化合物与含cCMR1基因表达调节机制的细胞接触；和(b)测定测试化合物是否增加或降低由细胞的所述机制控制的基因表达。
18.权利要求17的方法，其中其表达受所述机制控制的基因为报告基因。
19.权利要求17的方法，其中其表达受所述机制控制的基因为cCMR1基因。
20.一种鉴别增加或降低cCMR1离子通道电导率的化合物的方法，所述方法包括以下步骤(a)使测试化合物与cCMR1离子通道接触；和(b)测定测试化合物是否增加或降低所述离子通道的电导率。
21.权利要求20的方法，其中cCMR1离子通道包含具有SEQ IDNO2氨基酸序列的多肽。
22.权利要求20的方法，其中cCMR1离子通道与宿主细胞结合。
23.权利要求22的方法，其中宿主细胞为cCMR1离子通道的重组宿主细胞。
24.权利要求22的方法，其中宿主细胞为cCMR1离子通道的内源宿主细胞。
25.权利要求20的方法，其中cCMR1与分离的膜制备物结合。
26.权利要求20的方法，其中步骤(b)包括测定胞内钙水平的量。
27.权利要求20的方法，所述方法进一步包括在使测试化合物和离子通道接触的步骤之前增加离子通道电导率的步骤。
28.权利要求27的方法，其中增加离子通道电导率的步骤包括在含能够增加通道电导率的化合物的缓冲溶液中温育离子通道。
29.权利要求28的方法，其中能够增加通道电导率的化合物选自薄荷醇、Icilin和芥子油。
30.权利要求27的方法，其中增加离子通道电导率的步骤包括在cCMR1通道活化温度温育离子通道。
31.权利要求30的方法，其中cCMR1通道活化温度在4-17℃的范围内。
32.权利要求27的方法，其中增加离子通道电导率的步骤包括去极化离子通道。
33.权利要求20的方法，所述方法进一步包括在使测试化合物和离子通道接触的步骤之前降低离子通道电导率的步骤。
34.权利要求33的方法，其中降低离子通道电导率的步骤包括在含能够降低通道电导率的化合物的缓冲溶液中温育离子通道。
35.权利要求33的方法，其中降低离子通道电导率的步骤包括在cCMR1通道非活化温度温育离子通道。
36.权利要求35的方法，其中cCMR1通道非活化温度为室温。
37.权利要求33的方法，其中降低离子通道电导率的步骤包括在所含胞外Ca2+浓度足以降低通道电导率的缓冲溶液中温育离子通道。
38.权利要求33的方法，其中降低离子通道电导率的步骤包括超极化离子通道。
39.一种鉴别增加或降低哺乳动物CMR1离子通道电导率的化合物的方法，所述方法包括以下步骤(a)将离子通道在含亚失活量钙的缓冲溶液中温育；(b)活化离子通道；(c)使离子通道与测试化合物接触；(d)增加缓冲溶液中的钙量；和(e)测定测试化合物是否增加或降低离子通道的电导率。
40.权利要求39的方法，其中活化离子通道的步骤包括在含增加通道电导率的化合物的缓冲溶液中温育离子通道。
41.权利要求39的方法，其中活化离子通道的步骤包括在哺乳动物CMR1通道活化温度温育离子通道。
42.权利要求39的方法，其中活化离子通道的步骤包括去极化离子通道。
43.权利要求39的方法，其中哺乳动物CMR1蛋白为人、大鼠、小鼠或犬来源。
44.权利要求39的方法，其中测定测试化合物是否增加或降低离子通道电导率的步骤包括检测胞内钙的量。
45.权利要求44的方法，其中胞内钙的量使用FLIPR实验测定。
46.权利要求39的方法，其中测定测试化合物是否增加或降低离子通道电导率的步骤包括测定由离子通道传导的电流。
47.权利要求46的方法，其中使用膜片钳技术测定由离子通道传导的电流。
48.一种鉴别用于治疗疼痛的化合物的方法，所述方法包括以下步骤(a)使测试化合物与由cCMR1组成的离子通道接触；和(b)测定测试化合物是否增加或降低离子通道的电导率。
49.权利要求48的方法，所述方法进一步包括以下步骤(a)给予动物测试化合物；和(b)测定测试化合物改变动物的伤害感受/伤害防御反应的程度。
全文摘要
本发明提供核酸和多肽序列，其描述了本文称为犬CMR1 (cCMR1)的新型犬的冷和薄荷醇敏感受体。本发明的分离核酸或多肽分子可用于检测实验和筛选实验。
文档编号C12Q1/68GK1964988SQ200580018118
公开日2007年5月16日 申请日期2005年4月6日 优先权日2004年4月8日
发明者C·M·弗罗雷斯, Y·刘, M·L·鲁宾, N·秦 申请人:詹森药业有限公司