专利名称：茶氨酸的制造方法
技术领域：
本发明涉及茶氨酸的新制造方法。
背景技术：
茶氨酸作为绿茶风味的主要成分被已知，作为以茶为代表的食品香味成分是重要的物质。含有茶氨酸的γ-谷氨酰衍生物，被指出作为动物和植物体中的生理活性物质发挥作用。例如，在Chem.Parm.Bull.，19(7)1301-1307(1971)中，报导了茶氨酸或者L-谷氨酰胺拮抗于由咖啡因诱发的痉挛。由此认为这些化合物对中枢神经系统产生作用，期待着作为生理活性物质的有用性。
以往，作为茶氨酸的制造方法，一般是从在含有茶氨酸的玉露的生产用茶园中得到的茶叶干燥物中提取的方法。但是，使用该方法时，有以下2个缺点。即，(1)茶氨酸在茶叶干燥物中、只蓄积1.5％左右的程度，和(2)在一般的煎茶用茶园中、光合成活跃，所以，合成的茶氨酸被迅速分解、蓄积量少。因此，指出在从茶叶干燥物的提取法中，工业化生产充分量的茶氨酸比较困难，不实用。
从这样的情况出发，期待着工业生产方法的开发，作为其一，报导了化学有机合成茶氨酸的方法(上述Chem.Parm.Bull.，19(7)1301-1307(1971))。但是，指出该有机合成反应收率低，在合成物的分离精制等中，存在必须进行复杂操作的问题。
另外，作为其他工业生产方法，报导了利用来自假单胞菌(Pseudomonas)属的谷氨酰胺酶的γ-谷氨酰基转移反应，由L-谷氨酰胺和乙胺合成茶氨酸的酶法(特开平11-225789)。此外，开发了将该酶固定在载体上的酶法(特开平5-328986)。但是，在使用来自假单胞菌(Pseudomonas)属的谷氨酰胺酶时，在合成茶氨酸反应的同时，通过水解反应，L-谷氨酸作为副反应物被合成。因此，存在作为副产物的L-谷氨酸使精制茶氨酸变得复杂的问题。
专利文献1特开平11-225789号公报专利文献2特开平5-328986号公报非专利文献1Chem.Parm.Bull.，19(7)1301-1307(1971)发明内容本发明是鉴于上述问题而完成的发明，其目的在于提供茶氨酸的有效制造方法。
发明人等为了解决上述课题而反复深入研究的结果，发现使用来自芽孢杆菌(Bacillus)属、霉菌或酵母中的1种或2种以上的微生物的谷氨酰胺酶时，可以以高收率合成茶氨酸，并且副产物极其少量，以致基本上完成本发明。即，本发明的要点涉及一种茶氨酸的制造方法，其特征在于，使来自芽孢杆菌(Bacillus)属、霉菌、或酵母中的1种或2种以上微生物的谷氨酰胺酶作用于谷氨酰胺和乙胺衍生物的混合物。
根据本发明，提供茶氨酸的有效新制造方法，可以进行简易而工业性有利的生产。即，通过使用来自芽孢杆菌(Bacillus)属、霉菌、或酵母中的1种或2种以上的微生物的谷氨酰胺酶，确认高于以往的茶氨酸转化率，可以工业性生产。
图1是表示使用来自芽孢杆菌(Bacillus)属的谷氨酰胺酶和来自假单胞菌(Pseudomonas)属的谷氨酰胺酶，由L-谷氨酰胺和乙胺，酶合成茶氨酸时的合成茶氨酸量、谷氨酸量的表。
图2是表示使用来自霉菌的谷氨酰胺酶和来自假单胞菌(Pseudomonas)属的谷氨酰胺酶，由L-谷氨酰胺和乙胺，酶合成茶氨酸时的合成茶氨酸量、谷氨酸量的表。
图3是表示使用来自酵母的谷氨酰胺酶和来自假单胞菌(Pseudomonas)属的谷氨酰胺酶，由L-谷氨酰胺和乙胺，酶合成茶氨酸时的合成茶氨酸量、谷氨酸量的表。
图4是表示茶氨酸标准品和分离物质的IR光谱的图表。
具体实施例方式
接着，对本发明的实施方式详细地说明，但本发明的技术范围限定于下述的实施方式，不变更其要点，可以进行各种改变而实施。另外，本发明的技术范围，涉及到等效的范围。
所谓在本发明中可以使用的茶氨酸，是茶叶中所含的谷氨酸衍生物，并是茶风味的主要成分，作为以呈味为用途的食品添加剂使用。具体地，是称为γ-谷氨酰基乙酰胺、L-谷氨酸-γ-乙酰胺等的化合物。
所谓本发明中使用的乙胺衍生物，可以列举乙胺、乙胺盐酸盐、乙胺氯化金酸盐、乙胺脂肪酸盐、乙胺苦味酸盐、乙胺的N-苯磺酰基化合物、乙胺的N-对甲苯磺酰基化合物等，但不限于这些。另外，其中特别优选使用乙胺、乙胺盐酸盐。
所谓本发明中的谷氨酰胺酶，是具有水解L-谷氨酰胺、生成L-谷氨酸的谷氨酰胺酶活性，在提高豆酱·酱油等发酵食品的香味、提高呈味性中使用的谷氨酰胺酶。已知谷氨酰胺酶在碱性条件下，γ-谷氨酰基转移活性变得比水解活性高，在以茶氨酸为代表的烷基酰胺的合成中也可以利用。
本发明中的谷氨酰胺酶活性，通过以L-谷氨酰胺为底物、使酶作用，定量所生成的L-谷氨酸而测定。可以使用市售的试剂盒例如F试剂盒L-谷氨酸(Roche Diagnostics公司)测定所生成的L-谷氨酸量。作为该酶的单位，将每1分钟生成1μmol谷氨酸的酶量定义为“mU”。另外，使用该定义，将溶液中的每1mg蛋白质的酶量定义为谷氨酰胺酶比活性“mU/mg”。
所谓本发明中的芽孢杆菌(Bacillus)属，在细胞形态学中，是具有革兰氏阳性的好气性菌、杆菌、芽胞形成能力、运动性等各项性质的微生物。
来自本发明中的芽孢杆菌(Bacillus)属的谷氨酰胺酶的起源没有特别的限定，优选是来自枯草杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、缓慢芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、多粘芽孢杆菌(Bacillus polymixa)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、Bacillus thermoproteolyticus的酶。从优选谷氨酰胺酶比活性特别高的菌的观点出发，最优选的是来自枯草杆菌(Bacillussubtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的谷氨酰胺酶。
另外，来自芽孢杆菌(Bacillus)属的谷氨酰胺酶也可以使用应用生物工程学、通过基因重组等的修饰菌而制造的谷氨酰胺酶。
所谓本发明中的霉菌，是在真菌类中，成为菌丝相互缠绕的无定形集合体的菌类的总称，在藻菌类、多数子囊菌类和一部分担子菌类中可见。
来自本发明中的霉菌的谷氨酰胺酶的起源，没有特别的限定，但优选是来自米曲菌(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)、青霉菌(Penicillium notatum)、Rizopus stolonifer、Mucor sponosus的霉。从优选谷氨酰胺酶比活性特别高的菌的观点出发，最优选的是来自米曲菌(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)的谷氨酰胺酶。
另外，来自霉菌的谷氨酰胺酶，也可以使用应用生物工程学、通过基因重组等的修饰菌而制造的谷氨酰胺酶。
所谓本发明中的酵母，是属于子囊菌类的菌类。不含叶绿素，出芽繁殖，但也有分裂繁殖。应用于酒类、酱油、面包等的制造。
来自本发明中的酵母的谷氨酰胺酶的起源，没有特别的限定，优选是来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、鲁氏酵母(Saccharomyces rouxii)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、南极假丝酵母(Candida antarctica)、Hansenulla anomala、八孢裂殖酵母(Schizosaccaromyces octosporus)的酶。从优选谷氨酰胺酶比活性特别高的菌的观点出发，最优选的是来自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、鲁氏酵母(Saccharomyces rouxii)、产朊假丝酵母(Candidautilis)、南极假丝酵母(Candida antarctica)的谷氨酰胺酶。
另外，来自酵母的谷氨酰胺酶，也可以使用应用生物工程学、通过基因重组等的修饰菌而制造的谷氨酰胺酶。
作为来自上述芽孢杆菌(Bacillus)属、霉菌、酵母等微生物的谷氨酰胺酶，可以使用(1)微生物本身、或(2)从微生物提取的粗酶。但是，从茶氨酸转化率的观点看，优选从微生物中精制谷氨酰胺酶而使用。谷氨酰胺酶的精制方法，可以使用公知的任一种酶精制方法。可以例示，例如柱色谱，使用溶剂的分配，透析，超滤，电泳，由中性盐的分级盐析，使用乙醇、丙酮的分级沉淀法，HPLC等。其中，优选组合溶剂分配和各种色谱、HPLC来精制谷氨酰胺酶。还可以组合CM-纤维素柱色谱、葡聚糖凝胶G150柱色谱、羟磷灰石柱色谱、Butyl-Toyopearl柱色谱。
这样，在本发明的茶氨酸的制造方法中，优选使来自芽孢杆菌(Bacillus)属、青霉菌(Penicillium)属、Rizopus属、毛霉菌(Mucor)属、曲霉菌(Aspergillus)属、Hansenulla属、裂殖酵母(Schizosaccaromyces)属、假丝酵母(Candida)属中的1种或2种以上的微生物的谷氨酰胺酶作用于谷氨酰胺和乙胺衍生物。此时，(1)优选是在这些微生物的培养上清的谷氨酰胺酶比活性成为10mU/mg以上的条件下培养的情况，另外，(2)对谷氨酰胺酶，从减少副产物出发，优选使用使本发明中的主产物茶氨酸与副产物谷氨酸的比(茶氨酸/谷氨酸)大于5的谷氨酰胺酶。
本发明中的茶氨酸酶合成时的液体性质没有特别的限定，但pH优选约9～12、更优选约10～11。另外，反应温度没有特别的限定，优选约0℃～45℃、更优选约4℃～30℃。作为底物使用的L-谷氨酰胺、乙胺衍生物浓度没有特别的限定，但优选L-谷氨酰胺约0.1摩尔以上、乙胺衍生物约1摩尔以上。所谓本发明中的L-谷氨酰胺，除含有纯的L-谷氨酰胺外，含有L-谷氨酰胺钠盐等适当的无机盐或有机盐。
从反应液分离精制由本发明的方法合成的茶氨酸时，可以使用公知的任一种氨基酸精制方法，可以例示例如柱色谱，使用溶剂的分配，透析，晶析，超滤，电泳，由中性盐的分级盐析，使用乙醇、丙酮的分级沉淀法、HPLC等。其中，优选组合溶剂分配和各种色谱、HPLC来精制谷氨酰胺酶。还可以组合CM-纤维素柱色谱、葡聚糖凝胶G150柱色谱、羟磷灰石柱色谱、Butyl-Toyopearl柱色谱。
所谓本发明中的载体，是将谷氨酰胺酶固定的物体，例如，可以列举Celite、硅藻土、高岭土(kaolinite)、硅胶、分子筛、多孔玻璃、活性炭、碳酸钙、陶瓷等的无机载体，陶瓷粉、聚乙烯醇、聚丙烯、壳聚糖、离子交换树脂、疏水吸附树脂、螯合树脂、合成吸附树脂等的有机高分子等，但不限于这些。
实施例以下，由实施例和试验例更详细地说明本发明。这些是本发明的实施例的一部分，本发明不限于该实施例和试验例。
实施例1在含有0.3％葡萄糖、3.0％聚蛋白胨、1.0％酵母提取物、0.5％氯化钠、pH为7.0的培养基中，在30℃的温度下培养枯草杆菌(Bacillussubtilis)。离心分离所得到的培养液，得到培养上清液。在该培养上清液中添加冷乙醇，离心分离所得到的沉淀、进行回收。在磷酸缓冲溶液(pH7.0)中溶解得到的沉淀物，进行透析。透析液在使用DEAE-Sepharose Fast Flow吸附后，通过盐溶液的洗提而提高蛋白质的纯度。使用UF膜(UFP-5-C-3MA)(Amersham Bioscience(株))，将得到的谷氨酰胺酶溶液进行浓缩和脱盐，得到精制谷氨酰胺酶。培养上清液的谷氨酰胺酶比活性为67mU/mg。
实施例2在含有0.3％葡萄糖、3.0％聚蛋白胨、1.0％酵母提取物、0.5％氯化钠、pH为7.0的培养基中，在30℃的温度下培养解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。离心分离所得到的培养液、得到培养上清液。在该培养上清液中添加冷乙醇，离心分离所得到的沉淀、进行回收。在磷酸缓冲溶液(pH7.0)中溶解得到的沉淀物，进行透析。透析液在使用DEAE-Sepharose Fast Flow吸附后，通过盐溶液的洗提而提高蛋白质的纯度。使用UF膜(UFP-5-C-3MA)(AmershamBioscience(株))，将得到的谷氨酰胺酶溶液进行浓缩和脱盐，得到精制谷氨酰胺酶。培养上清液的谷氨酰胺酶比活性为53mU/mg。
实施例3在含有0.3％葡萄糖、3.0％聚蛋白胨、1.0％酵母提取物、0.5％氯化钠、pH为7.0的培养基中，在30℃的温度下培养凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)。离心分离所得到的培养液，得到培养上清液。在该培养上清液中添加冷乙醇，离心分离所得到的沉淀、进行回收。在磷酸缓冲溶液(pH7.0)中溶解得到的沉淀物，进行透析。透析液在使用DEAE-Sepharose Fast Flow吸附后，通过盐溶液的洗提而提高蛋白质的纯度。使用UF膜(UFP-5-C-3MA)(Amersham Bioscience(株))、将得到的谷氨酰胺酶溶液进行浓缩和脱盐，得到精制谷氨酰胺酶。培养上清液的谷氨酰胺酶比活性为43mU/mg。
实施例4在含有0.3％葡萄糖、3.0％聚蛋白胨、1.0％酵母提取物、0.5％氯化钠、pH为7.0的培养基中，在30℃的温度下培养地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。离心分离所得到的培养液，得到培养上清液。在该培养上清液中添加冷乙醇，离心分离所得到的沉淀、进行回收。在磷酸缓冲溶液(pH7.0)中溶解得到的沉淀物，进行透析。透析液在使用DEAE-Sepharose Fast Flow吸附后，通过盐溶液的洗提而提高蛋白质的纯度。使用UF膜(UFP-5-C-3MA)(Amersham Bioscience(株))，将得到的谷氨酰胺酶溶液进行浓缩和脱盐，得到精制谷氨酰胺酶。培养上清液的谷氨酰胺酶比活性为40mU/mg。
实施例5在含有0.3％葡萄糖、3.0％聚蛋白胨、1.0％酵母提取物、0.5％氯化钠、pH为7.0的培养基中，在30℃的温度下培养蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)。离心分离所得到的培养液，得到培养上清液。在该培养上清液中添加冷乙醇，离心分离所得到的沉淀、进行回收。在磷酸缓冲溶液(pH7.0)中溶解得到的沉淀物，进行透析。透析液在使用DEAE-Sepharose Fast Flow吸附后，通过盐溶液的洗提而提高蛋白质的纯度。使用UF膜(UFP-5-C-3MA)(Amersham Bioscience(株))，将得到的谷氨酰胺酶溶液进行浓缩和脱盐，得到精制谷氨酰胺酶。培养上清液的谷氨酰胺酶比活性为5mU/mg。
比较例1来自硝基还原假单胞菌(Pseudomonas nitroreducens)的精制谷氨酰胺酶的配制使用含有0.6％谷氨酸钠、0.1％酵母提取物、1.0％葡萄糖、0.05％KH2PO4、0.05％K2HPO4、0.07％MgSO4·7H2O、0.01％EDTA-Fe的培养液(pH7)，在30L容积的发酵缸(jar fermenter)(30L、通气1vvm＝25L/分钟、旋转数2000rpm)中培养硝基还原假单胞菌(Pseudomonas nitroreducens)约20小时。洗净所得到的培养液175L份的菌体后，在7.5L的30mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中悬浊，在5～20℃下超声波破碎，得到菌体破碎物。
一边用7％氨水将pH调整为7，一边对菌体破碎物进行硫酸铵分馏，得到45～90％饱和馏份。将其溶解在0.01M磷酸钾缓冲液中，相对于同缓冲液透析。使之吸附在DEAE-纤维素柱(15×60cm)上，用含有0.1M食盐的缓冲液洗提谷氨酰胺酶，得到谷氨酰胺酶液。使用UF膜(UFP-5-C-3MA)(Amersham Bioscience(株))，将得到的谷氨酰胺酶溶液进行浓缩和脱盐，得到精制谷氨酰胺酶。培养上清液的谷氨酰胺酶比活性为15mU/mg。
实施例6由精制谷氨酰胺酶的茶氨酸的酶合成使用精制谷氨酰胺酶(0.1mL)，在pH10.0、温度30℃的条件下，将10mL底物溶液(0.5M的L-谷氨酰胺和各种浓度的乙胺)进行茶氨酸的酶合成。
实施例7由HPLC的茶氨酸量和谷氨酸量的定量进行了茶氨酸的酶合成的酶反应液中的茶氨酸量和谷氨酸量，在适当稀释反应液后、通过HPLC进行定量。使用得到的茶氨酸量(mol/L)和谷氨酸量(mol/L)，计算从底物的谷氨酸量(mol/L)的摩尔转化率(％)。
HPLC的定量条件如下表所示。
表1
试验例1来自芽孢杆菌(Bacillus)属的谷氨酰胺酶和来自假单胞菌(Pseudomonas)属的谷氨酰胺酶的茶氨酸酶合成使用在实施例1～实施例5和比较例1中调制的来自各微生物的谷氨酰胺酶，以实施例6的条件进行茶氨酸酶合成试验。试验后的茶氨酸量和谷氨酸量，以实施例7的条件进行测定。在图1中表示试验的结果。
在使用实施例1～实施例5和比较例1的任一种谷氨酰胺酶时，从L-谷氨酰胺向茶氨酸的摩尔转化率都是50％以上。特别是，实施例1～实施例4的谷氨酰胺酶的摩尔转化率分别是78％、76％、72％和70％的高值。另一方面，从L-谷氨酰胺向L-谷氨酸的摩尔转化率(副产物的生成)，实施例1～实施例4的谷氨酰胺酶是6％以下的低值，但在实施例5和比较例1的谷氨酰胺酶中显示15％以上的高值。在使用谷氨酰胺酶合成茶氨酸时，除向茶氨酸的摩尔转化率高以外，优选向作为副产物的L-谷氨酸的摩尔转化率低。如此，可以使茶氨酸的精制工序简易化。在本试验例中，为了满足这样的条件，优选使用来自芽孢杆菌(Bacillus)属的谷氨酰胺酶、其培养上清液的谷氨酰胺酶比活性为10mU/mg以上。
实施例8在含有2.0％麦芽提取物(Malt extract)、2.0％葡萄糖、0.1％蛋白胨、0.1％酵母提取物(Yeast extract)、pH为5.0的培养基中，在30℃的温度下培养Aspergilus oryzae。离心分离所得到的培养液、得到培养上清液。在该培养上清液中添加冷乙醇，离心分离所得到的沉淀、进行回收。在磷酸缓冲溶液(pH7.0)中溶解得到的沉淀物，进行透析。透析液在使用DEAE-Sepharose Fast Flow吸附后，通过盐溶液的洗提而提高蛋白质的纯度。使用UF膜(UFP-5-C-3MA)(AmershamBioscience(株))，将得到的谷氨酰胺酶溶液进行浓缩和脱盐，得到精制谷氨酰胺酶。培养上清液的谷氨酰胺酶比活性为42mU/mg。
实施例9在含有2.0％麦芽提取物、2.0％葡萄糖、0.1％蛋白胨、0.1％酵母提取物、pH为5.0的培养基中，在30℃的温度下培养黑曲霉(Aspergillusniger)。离心分离所得到的培养液、得到培养上清液。在该培养上清液中添加冷乙醇，离心分离所得到的沉淀、进行回收。在磷酸缓冲溶液(pH7.0)中溶解得到的沉淀物，进行透析。透析液在使用DEAE-Sepharose Fast Flow吸附后，通过盐溶液的洗提而提高蛋白质的纯度。使用UF膜(UFP-5-C-3MA)(Amersham Bioscience(株))，将得到的谷氨酰胺酶溶液进行浓缩和脱盐，得到精制谷氨酰胺酶。培养上清液的谷氨酰胺酶比活性为39mU/mg。
实施例10在含有2.0％麦芽提取物、2.0％葡萄糖、0.1％蛋白胨、0.1％酵母提取物、pH为5.0的培养基中，在30℃的温度下培养Rizopus stolonifer。离心分离所得到的培养液、得到培养上清液。在该培养上清液中添加冷乙醇，离心分离所得到的沉淀、进行回收。在磷酸缓冲溶液(pH7.0)中溶解得到的沉淀物，进行透析。透析液在使用DEAE-Sepharose FastFlow吸附后，通过盐溶液的洗提而提高蛋白质的纯度。使用UF膜(UFP-5-C-3MA)(Amersham Bioscience(株))，将得到的谷氨酰胺酶溶液进行浓缩和脱盐，得到精制谷氨酰胺酶。培养上清液的谷氨酰胺酶比活性为15mU/mg。
实施例11在含有2.0％麦芽提取物、2.0％葡萄糖、0.1％蛋白胨、0.1％酵母提取物、pH为5.0的培养基中，在30℃的温度下培养Mucor sponosus。离心分离所得到的培养液、得到培养上清液。在该培养上清液中添加冷乙醇，离心分离所得到的沉淀、进行回收。在磷酸缓冲溶液(pH7.0)中溶解得到的沉淀物，进行透析。透析液在使用DEAE-Sepharose FastFlow吸附后，通过盐溶液的洗提而提高蛋白质的纯度。使用UF膜(UFP-5-C-3MA)(Amersham Bioscience(株))，将得到的谷氨酰胺酶溶液进行浓缩和脱盐，得到精制谷氨酰胺酶。培养上清液的谷氨酰胺酶比活性为5mU/mg。
试验例2来自霉菌的谷氨酰胺酶和来自假单胞菌(Pseudomonas)属的谷氨酰胺酶的茶氨酸酶合成使用在实施例8～实施例11和比较例1调制的来自各微生物的谷氨酰胺酶，以实施例6的条件进行茶氨酸酶合成试验。试验后的茶氨酸量和谷氨酸量，以实施例7的条件测定。在图2中表示试验结果。
在使用实施例8～实施例11和比较例1的任一种谷氨酰胺酶时，从L-谷氨酰胺向茶氨酸的摩尔转化率都是50％以上。特别是、实施例8和实施例9的谷氨酰胺酶的摩尔转化率分别是72％和73％的高值。另一方面，从L-谷氨酰胺向L-谷氨酸的摩尔转化率(副产物的生成)，实施例8和实施例9的谷氨酰胺酶是5％以下的低值，但在比较例1的谷氨酰胺酶中为10％以上的高值。在使用谷氨酰胺酶合成茶氨酸时，除向茶氨酸的摩尔转化率高以外，优选向作为副产物的L-谷氨酸的摩尔转化率低。如此，可以使茶氨酸的精制工序简易化。在本试验例中，为了满足这样的条件，优选使用来自霉菌(特别是曲霉菌(Aspergillus)属、Rizopus属、毛霉菌(Mucor)属)的谷氨酰胺酶，(1)其培养上清液的谷氨酰胺酶比活性为10mU/mg以上，或者(2)在从L-谷氨酰胺的摩尔转化率中，本实施例中的作为主产物的茶氨酸与作为副产物的谷氨酸的比(茶氨酸/谷氨酸的比＝X)，X＞5。
实施例12在含有0.3％麦芽提取物、0.3％酵母提取物、0.5％蛋白胨、1.0％葡萄糖、pH为5.0的培养基中，在30℃的温度下培养酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。离心分离所得到的培养液、得到培养上清液。在该培养上清液中添加冷乙醇，离心分离所得到的沉淀、进行回收。在磷酸缓冲溶液(pH7.0)中溶解得到的沉淀物，进行透析。透析液在使用DEAE-Sepharose Fast Flow吸附后，通过盐溶液的洗提而提高蛋白质的纯度。使用UF膜(UFP-5-C-3MA)(AmershamBioscience(株))，将得到的谷氨酰胺酶溶液进行浓缩和脱盐，得到精制谷氨酰胺酶。培养上清液的谷氨酰胺酶比活性为45mU/mg。
实施例13在含有0.3％麦芽提取物、0.3％酵母提取物、0.5％蛋白胨、1.0％葡萄糖、pH为5.0的培养基中，在30℃的温度下培养鲁氏酵母(Saccharomyces rouxii)。离心分离所得到的培养液、得到培养上清液。在该培养上清液中添加冷乙醇，离心分离所得到的沉淀、进行回收。在磷酸缓冲溶液(pH7.0)中溶解得到的沉淀物，进行透析。透析液在使用DEAE-Sepharose Fast Flow吸附后，通过盐溶液的洗提而提高蛋白质的纯度。使用UF膜(UFP-5-C-3MA)(Amersham Bioscience(株))，将得到的谷氨酰胺酶溶液进行浓缩和脱盐，得到精制谷氨酰胺酶。培养上清液的谷氨酰胺酶比活性为40mU/mg。
实施例14在含有0.3％麦芽提取物、0.3％酵母提取物、0.5％蛋白胨、1.0％葡萄糖、pH为5.0的培养基中，在30℃的温度下培养产朊假丝酵母(Candida utilis)。离心分离所得到的培养液、得到培养上清液。在该培养上清液中添加冷乙醇，离心分离所得到的沉淀、进行回收。在磷酸缓冲溶液(pH7.0)中溶解得到的沉淀物，进行透析。透析液在使用DEAE-Sepharose Fast Flow吸附后，通过盐溶液的洗提而提高蛋白质的纯度。使用UF膜(UFP-5-C-3MA)(Amersham Bioscience(株))，将得到的谷氨酰胺酶溶液进行浓缩和脱盐，得到精制谷氨酰胺酶。培养上清液的谷氨酰胺酶比活性为30mU/mg。
实施例15在含有0.3％麦芽提取物、0.3％酵母提取物、0.5％蛋白胨、1.0％葡萄糖、pH为5.0的培养基中，在30℃的温度下培养南极假丝酵母(Candida antarctica)。离心分离所得到的培养液、得到培养上清液。在该培养上清液中添加冷乙醇，离心分离所得到的沉淀、进行回收。在磷酸缓冲溶液(pH7.0)中溶解得到的沉淀物，进行透析。透析液在使用DEAE-Sepharose Fast Flow吸附后，通过盐溶液的洗提而提高蛋白质的纯度。使用UF膜(UFP-5-C-3MA)(Amersham Bioscience(株))，将得到的谷氨酰胺酶溶液进行浓缩和脱盐，得到精制谷氨酰胺酶。培养上清液的谷氨酰胺酶比活性为25mU/mg。
实施例16在含有0.3％麦芽提取物、0.3％酵母提取物、0.5％蛋白胨、1.0％葡萄糖、pH为5.0的培养基中，在30℃的温度下培养Hansenullaanomala。离心分离所得到的培养液、得到培养上清液。在该培养上清液中添加冷乙醇，离心分离所得到的沉淀、进行回收。在磷酸缓冲溶液(pH7.0)中溶解得到的沉淀物，进行透析。透析液在使用DEAE-Sepharose Fast Flow吸附后，通过盐溶液的洗提而提高蛋白质的纯度。使用UF膜(UFP-5-C-3MA)(Amersham Bioscience(株))，将得到的谷氨酰胺酶溶液进行浓缩和脱盐，得到精制谷氨酰胺酶。培养上清液的谷氨酰胺酶比活性为15mU/mg。
试验例3来自酵母的谷氨酰胺酶和来自假单胞菌(Pseudomonas)属的谷氨酰胺酶的茶氨酸酶合成使用在实施例12～实施例16和比较例1调制的来自各属的谷氨酰胺酶，以实施例6的条件进行茶氨酸酶合成试验。试验后的茶氨酸量和谷氨酸量，以实施例7的条件测定。在图3中表示试验的结果。
在使用实施例12～实施例16和比较例1的任一种谷氨酰胺酶时，从L-谷氨酰胺向茶氨酸的摩尔转化率都是50％以上。特别是、实施例12～实施例15的谷氨酰胺酶的摩尔转化率分别是70％以上的高值。另一方面，从L-谷氨酰胺向L-谷氨酸的摩尔转化率(副产物的生成)，实施例12～实施例15的谷氨酰胺酶都是低值，但在比较例1的谷氨酰胺酶中为10％的高值。在使用谷氨酰胺酶合成茶氨酸时，除向茶氨酸的摩尔转化率高以外，优选向作为副产物的L-谷氨酸的摩尔转化率低。如此，可以使茶氨酸的精制工序简易化。在本试验例中，为了满足这样的条件，优选使用来自酵母(特别是酵母菌(Saccharomyces)属、假丝酵母(Candida)属)的谷氨酰胺酶，其培养上清液的谷氨酰胺酶比活性为10mU/mg以上。
实施例17使用CHITOPEARL 4010的固定化谷氨酰胺酶的配制在50mM磷酸缓冲液(pH7.4)中，使作为壳聚糖珠(chitosan beads)的市售品CHITOPEARL 4010(富士纺绩(株))浸渍24小时。在25mL的实施例3中配制的谷氨酰胺酶(15mg/mL)中浸渍10mL的该平衡化后的CHITOPEARL 4010，振荡约2小时。此后，在2.5％戊二醛溶液中加入除去了附着液的CHITOPEARL 4010，再振荡2小时。在戊二醛处理后，使用30倍量的50mM磷酸钠缓冲液(pH7.4)，洗净到吸光度(280nm)为0.01，在柱中填充。
实施例18固定化谷氨酰胺酶的酶反应使用在实施例17中调制的固定化谷氨酰胺酶，以30℃、SV＝0.2的流速将底物溶液(4％谷氨酰胺、25％乙胺、pH10.0)通过柱时，可以以70％的收率得到茶氨酸。
实施例19使用阴离子交换树脂的固定化谷氨酰胺酶的配制相对于25mL在实施例3中得到的精制谷氨酰胺酶(15mg/mL)，添加10mL作为阴离子交换树脂的DIAION HPA25(三菱化学(株))后，振荡约2小时。此后，在2.5％戊二醛溶液中加入除去了附着液的HPA25，再振荡2小时。在戊二醛处理后，使用30倍量的50mM磷酸钠缓冲液(pH7.4)，洗净到吸光度(280nm)为0.01，在柱中填充。
实施例20固定化谷氨酰胺酶的酶反应使用在实施例19中调制的固定化谷氨酰胺酶，以30℃、SV＝0.2的流速将底物溶液(4％谷氨酰胺、25％乙胺、pH10.0)通过柱时，可以以75％的收率得到茶氨酸。
实施例21茶氨酸的精制从茶氨酸反应液的分离精制，在通过减压浓缩从反应液除去乙胺后，进行由RO膜的脱盐，此后，进行Dowex50×8、Dowex1×2柱色谱，由乙醇处理而进行。
当使该分离物质应用于氨基酸分析器、纸色谱分析法，显示与茶氨酸标准物质同样的性状。另外，用盐酸或谷氨酰胺酶进行水解处理分离物质，以1∶1的比例生成L-谷氨酸和乙胺。这样，因为由谷氨酰胺酶水解分离物质，所以显示乙胺结合在L-谷氨酸的γ位。另外，由L-谷氨酸脱氢酶(GluDH)确认水解生成的L-谷氨酸是L型。在图4中表示茶氨酸标准品和分离物质的IR光谱。两种物质都显示同样的光谱。从这些可以确认分离物质是茶氨酸。
权利要求
1.一种茶氨酸的制造方法，其特征在于使来自芽孢杆菌属、霉菌、或酵母中的1种或2种以上微生物的谷氨酰胺酶作用于谷氨酰胺和乙胺衍生物。
2.如权利要求1所述的茶氨酸的制造方法，其特征在于所述谷氨酰胺酶是在芽孢杆菌属、霉菌、或酵母中的1种或2种以上微生物的培养上清液的谷氨酰胺酶比活性为10mU/mg以上的条件下培养。
3.如权利要求1所述的茶氨酸的制造方法，其特征在于所述谷氨酰胺酶，使作为主产物的茶氨酸与作为副产物的谷氨酸的比(茶氨酸/谷氨酸)大于5。
4.如权利要求1～3中任一项所述的茶氨酸的制造方法，其特征在于所述谷氨酰胺酶被固定在载体上。
全文摘要
本发明提供一种茶氨酸的有效的新制造方法，其目的在于能够以副产物少、简单而且工业性有利地进行茶氨酸生产。通过在谷氨酰胺和乙胺衍生物的混合物中，使用来自芽孢杆菌(Bacillus)属、霉菌(特别是曲霉菌(Aspergillus)属、Rizopus属、毛霉菌(Mucor)属)、或酵母(特别是Hansenulla属、酵母菌(Saccharomyces)属、假丝酵母(Candida)属)中的1种或2种以上的来自微生物的谷氨酰胺酶，解决上述课题。
文档编号C12P13/02GK1977047SQ20058002183
公开日2007年6月6日 申请日期2005年6月22日 优先权日2004年6月28日
发明者冈田幸隆, 小关诚, 青井畅之 申请人:太阳化学株式会社