用于减少肌醇六磷酸的蛋白质分离方法

专利名称：用于减少肌醇六磷酸的蛋白质分离方法
技术领域：
本申请涉及从含油种子粉(oil seed meal)中制备蛋白质分离物，尤其是低芥酸菜子(canola)蛋白质分离物，其中该制备使得蛋白质分离物中的肌醇六磷酸含量下降。
背景技术：
低芥酸菜子蛋白质分离物可以由低芥酸菜子含油种子粉中制备。在2002年5月3日提交的共同未决美国专利申请No.10/137391(WO02/089597)中，描述了由低芥酸菜子含油种子粉制备低芥酸菜子蛋白质分离物的方法，所述分离物的蛋白质含量(N×6.25)为至少100重量％，该专利申请已经转让给了本受让人，其公开在此引入作为参考。该方法涉及多个工艺步骤，包括采用盐溶液优选氯化钠水溶液浸提低芥酸菜子含油种子粉，将所得的蛋白质水溶液和残余含油种子粉分离，采用选择性膜技术将水溶液的蛋白质浓度提高到至少大约200g/L并同时保持离子强度基本为常数，将所得的浓缩蛋白质溶液在冷却水中稀释以形成蛋白质胶束，蛋白质胶束沉降以形成无定形的、粘性的、胶状的、麸质状蛋白质胶束质(protein micellar mass，PMM)，从上清液中回收蛋白质胶束质，所述PMM的蛋白质含量通过Kjeldahl定氮法(N)×6.25确定为至少大约100重量％。本申请所用的蛋白质含量基于干重量确定。回收的PMM可以进行干燥。
在上述并且在申请No.10/137391中具体描述的方法的一个实施方案中，来自PMM沉降步骤的上清液经过进一步处理，以从湿PMM和上清液中回收含有干燥蛋白质的蛋白质分离物。这种方法通过以下步骤得以实现首先采用超滤膜浓缩上清液，将浓缩的上清液和湿PMM混合，以及干燥所述混合物。所得的低芥酸菜子蛋白质分离物的纯度高，具有至少大约90重量％的蛋白质(N×6.25)，优选至少大约100重量％蛋白质(N×6.25)。
在上述并且在申请No.10/137391中具体描述的方法的另一个实施方案中，来自PMM沉降步骤的上清液经过处理以从所述上清液中回收蛋白质分离物。这个方法可以通过首先采用超滤膜浓缩上清液和干燥所述浓缩物得以实现。所得的低芥酸菜子蛋白质分离物的纯度高，具有至少大约90重量％的蛋白质(N×6.25)，优选至少大约100重量％蛋白质(N×6.25)。
上述美国专利申请所述的方法基本上是分批方法。在2002年11月19日提交的共同未决美国专利申请No.10/298678(WO03/043439)中，描述了制备低芥酸菜子蛋白质分离物的连续方法，该专利申请已经转让给了本受让人，其公开在此引入作为参考。根据该申请，将低芥酸菜子含油种子粉和盐溶液优选氯化钠水溶液连续混合，将混合物通过管道传输并同时从低芥酸菜子含油种子粉中浸提蛋白质以形成蛋白质水溶液，连续地从残余的低芥酸菜子含油种子粉中分离该蛋白质水溶液，将蛋白质水溶液连续传输通过选择性膜操作从而将蛋白质水溶液的蛋白质含量提高到至少大约200g/L并同时保持离子强度基本为常数，所得的浓缩的蛋白质溶液和冷却水连续混合以形成蛋白质胶束，使蛋白质胶束连续沉降并同时使上清液连续溢流，直到在沉降容器中累积所需量的PMM为止。从沉降容器中去除PMM，并可以进行干燥。PMM的蛋白质含量用Kjeldahl定氮法(N)×6.25确定至少大约90重量％，优选至少大约100重量％(N×6.25)。
如前述美国专利申请No.10/137391所述，可以对溢流的上清液进行处理，以从中回收低芥酸菜子蛋白质分离物。
如同在2003年4月15日提交的美国专利申请No.10/413371和相应的PCT公开No.WO03/088760所述，源自PMM的低芥酸菜子蛋白质分离物主要由7S蛋白质和一些12S蛋白质组成，而源自上清液的低芥酸菜子蛋白质分离物主要由2S蛋白质组成，所述专利申请和PCT公开已经转让给了本受让人，并且其公开在此引入作为参考。
含油种子粉(包括低芥酸菜子含油种子粉)含有抗营养因子，包括肌醇六磷酸，通常以盐形式比如肌醇六磷酸盐的形式存在。本文所用术语“肌醇六磷酸”包括这些盐形式。含油种子粉中的肌醇六磷酸含量可以是大约0.3-大约10重量％，具体取决于含油种子。通常，低芥酸菜子含油种子粉包含大约2-大约6重量％的肌醇六磷酸。
用氯化钠水溶液对低芥酸菜子含油种子粉进行浸提以形成蛋白质水溶液，使得包括肌醇六磷酸的抗营养因子从含油种子粉中溶出，这导致在从蛋白质水溶液中回收的蛋白质分离物中存在着肌醇六磷酸。随着蛋白质分离物中肌醇六磷酸量的增加，蛋白质分离物的可消化性受到负面影响。在某些应用包括水产养殖中，蛋白质分离物的可消化性很重要。所以，需要针对这些应用降低蛋白质分离物中的肌醇六磷酸含量。
低芥酸菜子也称作菜籽或者油菜籽。

发明内容
本发明涉及使从含油种子粉回收的蛋白质分离物中的肌醇六磷酸含量降低的方法。申请人发现，如果在一定条件下实施对含油种子粉优选低芥酸菜子含油种子粉的初始浸提，那么就能够制备出肌醇六磷酸含量降低而且营养值提高的蛋白质分离物。
在本发明的一个实施方案中，已经发现如果用氯化钠水溶液对含油种子粉优选低芥酸菜子含油种子粉进行浸提是在高温下进行，那么获得的蛋白质水溶液在和残余的含油种子粉分离后，具有比在常温下进行浸提所制备的低芥酸菜子蛋白质水溶液低的肌醇六磷酸含量。
尽管不想受到任何理论的束缚，但是相信在高温下从含油种子粉中浸提出的肌醇六磷酸将从所得蛋白质水溶液中沉淀出来，然后在用以将蛋白质水溶液和残余含油种子粉分离的过滤过程中去除。另外，由于随着温度升高肌醇六磷酸在氯化钠水溶液中的溶解度下降，所以肌醇六磷酸可能不被浸提到蛋白质水溶液中。
根据本发明的另一实施方案，现在也已经发现，如果在上述专利申请所述方法的浸提步骤中优选采用的氯化钠被氯化钙替代，那么在和用过的低芥酸菜子含油种子粉分离的蛋白质水溶液中，肌醇六磷酸量下降。
尽管不想受到任何理论的束缚，相信钙离子通过这些方法和肌醇六磷酸络合以形成不溶性的沉淀物，这些沉淀物和用过的粉末停留在一起，或者在蛋白质水溶液的澄清化过程中去除。
相应的，在本发明的一个方面，提供了制备蛋白质分离物的方法，其包括(a)对含油种子粉进行浸提，以使所述含油种子粉中的蛋白质溶出从而形成蛋白质水溶液，同时抑制将肌醇六磷酸从含油种子粉中浸提到蛋白质溶液中，(b)将蛋白质水溶液和残余的含油种子粉分离，(c)将蛋白质水溶液的蛋白质浓度提高到至少大约50g/L的浓度，同时保持离子强度基本不变，从而提供浓缩的蛋白质溶液，(d)将所述浓缩的蛋白质溶液稀释到温度低于大约15℃的冷却水中，以形成蛋白质胶束，(e)使蛋白质胶束沉降，以形成无定形的、粘性的、胶状的、麸质状胶束质，和(f)将所述蛋白质胶束质和上清液分离，所述蛋白质胶束质的蛋白质含量基于干重为至少大约90重量％(N×6.25)。
通过上述两个实施方案的组合，即，在高温下采用氯化钙实施浸提，可以使浸提含油种子粉所得的蛋白质水溶液中的肌醇六磷酸含量进一步下降。
根据本文所述方法制备的低芥酸菜子蛋白质分离物，可用于蛋白质分离物的常规应用中，比如加工过的食品的蛋白质营养强化、油的乳化、烘烤食品的成型剂、以及在含有气体的制品中作为发泡剂。另外，低芥酸菜子蛋白质分离物可以形成蛋白质纤维(可用于仿肉制品(meat analog)中)，可在其中蛋白用作粘合剂的食品中用作蛋白替代物或者蛋白补充剂。低芥酸菜子蛋白质分离物可以用作营养补充剂。低芥酸菜子蛋白质分离物的其它用途在于宠物食品、动物饲料、水产养殖、工业和美容应用、以及个人护理制品。


图1是根据本发明的一个实施方案制备具有不同蛋白质分布的低芥酸菜子蛋白质分离物的方法的流程图；和图2是根据本发明的另一个实施方案制备具有不同蛋白质分布的低芥酸菜子蛋白质分离物的连续方法的流程图。
具体实施例方式
如同上述美国专利申请所概述的那样，源自PMM的低芥酸菜子蛋白质分离物和源自上清液的低芥酸菜子蛋白质分离物各自可以通过分批方法或者连续方法或者半连续方法和低芥酸菜子含油种子粉分离开。虽然下面将主要就低芥酸菜子对本发明进行描述，但是本发明也可适用于其中肌醇六磷酸在浸提步骤中溶出的其它含油种子粉，包括亚麻、大麻和大豆的粉。
提供低芥酸菜子蛋白质分离物的方法的第一步骤涉及从低芥酸菜子含油种子粉中溶出蛋白质材料。从低芥酸菜子粉中回收的蛋白质材料可以是低芥酸菜子中的天然蛋白质，或者可以是通过基因操纵改性但具有天然蛋白质的特征性疏水和极性性质的蛋白质。低芥酸菜子粉可以是通过从具有不同非变性蛋白质含量的低芥酸菜子含油种子中移出低芥酸菜子油而获得的任何低芥酸菜子粉，例如，通过热己烷浸提或者冷油挤压方法。从低芥酸菜子含油种子中移出低芥酸菜子油，可以作为和本文所述蛋白质分离物回收方法相独立的操作来进行。
蛋白质溶出的实施导致在低芥酸菜子蛋白质水溶液中存在的肌醇六磷酸量，和上述美国专利申请所述的方法相比降低。采用含水盐溶液来进行蛋白质溶出，所述溶液可以是氯化钠水溶液，或者在优选实施方案中是氯化钙水溶液。
为了使浸提低芥酸菜子含油种子粉所得的低芥酸菜子蛋白质水溶液中的肌醇六磷酸浓度下降，可以在温度范围内采用氯化钙水溶液进行浸提，或者在不使用氯化钙水溶液的情况下在高温而非室温下进行浸提。
所述高温浸提可以在大约45℃-大约70℃进行。优选的，所述浸提在大约55℃-大约65℃用氯化钠水溶液进行。
蛋白质浸提中所用的盐水溶液，当不是氯化钙和优选的氯化钠时，其离子强度、pH、和粉浓度可以是下面针对氯化钙浸提所讨论的值。
根据本发明的一个实施方案，蛋白质的溶出优选采用氯化钙溶液进行。为了能够溶出大量的蛋白质，盐溶液的离子强度至少大约是0.05，优选至少大约0.1。随着氯化钙溶液的离子强度的增加，含油种子粉中的蛋白质的溶出程度先增加，直到达到最大值为止。离子强度的任何后续增加都不会增加溶出的总蛋白。使蛋白质最大程度溶出的氯化钙溶液离子强度随着所选含油种子粉而变。
随着离子强度增加，蛋白质沉淀物所需的稀释程度增加；就此而言，通常优选采用小于大约0.8，更优选大约0.1-大约0.15的离子强度。
在分批方法中，在至少大约5℃，优选高至大约35℃的温度进行蛋白质的盐溶出，优选伴有搅拌以缩短溶出时间，所述溶出时间通常大约10-大约60分钟。优选所述溶出的实施使得从含油种子粉中浸提出基本上尽可能多的蛋白质，从而提供高的总体产率。
温度下限选择为大约5℃，这是因为在此温度之下溶出慢得没有实际意义；而优选温度上限选择为大约35℃，这是因为分批模式下在更高温度水平时该方法变得不经济。但是，对氯化钙浸提而言，如上所述，为了进一步降低蛋白质水溶液的肌醇六磷酸含量，可能希望温度更高。
在连续方法中，通过以从低芥酸菜子含油种子粉中连续浸提蛋白质相一致的任何方式，从低芥酸菜子含油种子粉中浸提蛋白质。在一个实施方案中，低芥酸菜子含油种子粉和氯化钙溶液连续混合，所述混合物通过管道或导管传输，所述管道或导管的长度及流速使得停留时间足以实现根据本申请所述的参数进行所需的浸提。在所述连续方法中，盐溶出步骤快速进行，优选在最高约10分钟的时间内，从而使得从低芥酸菜子含油种子粉中浸提出基本上尽可能多的蛋白质。连续方法中的溶出优选在高温下进行，优选高于大约35℃，一般高达大约65℃。如前所述，高温使得蛋白质水溶液中的肌醇六磷酸含量更低。
氯化钙水溶液和低芥酸菜子含油种子粉的天然pH为大约5-大约6.8，从而可以通过胶束路线形成蛋白质分离物，参见下面的详述。
在pH范围的极限处和附近，蛋白质分离物仅仅部分通过胶束路线形成，产率比pH范围内的其它值所能达到的低。出于这些原因，优选pH值为大约5.3-大约6.2。
需要时，采用任何常规酸，通常为盐酸，或者碱，通常为氢氧化钠，可以将盐溶液的pH调至大约5-大约6.8范围内的任何所需值，从而在浸提步骤中使用。
在溶出步骤中，含油种子粉在氯化钙溶液中的浓度可以变化得非常大。通常浓度值为大约5-大约15重量/体积％。
至少在部分浸提步骤中，在盐溶液中可以存在抗氧化剂。抗氧化剂可以是任何常规抗氧化剂，比如亚硫酸钠或者抗坏血酸。在浸提步骤中采用的抗氧化剂量取决于所用的材料，可以在大约0.01-大约1重量％之间变化，优选大约0.05重量％。抗氧化剂用于抑制蛋白质水溶液中酚类(phenolics)的氧化，所述氧化可能对最终制品的颜色有负面影响。
用氯化钙水溶液浸提蛋白质的步骤具有使低芥酸菜子粉中可能存在的脂肪溶出的附加效果，这进而导致脂肪出现在含水相中。
来自浸提步骤的蛋白质溶液通常的蛋白质浓度为大约5-大约40g/L，优选大约10-大约30g/L。采用氯化钙水溶液从低芥酸菜子含油种子粉中浸提蛋白质，导致在蛋白质溶液中出现肌醇六磷酸，但是和在相同浸提条件下采用氯化钠水溶液从低芥酸菜子含油种子粉中浸提相比，含量显著降低。
来自浸提步骤的含水相随后可以以任何常规方式和残余的低芥酸菜子粉分离，比如通过采用沉降式离心随后进行盘式离心和/或过滤来去除残余的粉。分开的残余粉可以进行干燥后处置。
通过将粉末活性炭或者其它色素吸附剂和分离后的蛋白质水溶液混合，然后通常通过过滤去除吸附剂来提供蛋白质溶液，可以对最终低芥酸菜子蛋白质分离物的颜色向着浅色和弱黄色方向进行改善。也可以采用透滤法来去除色素。
通过采用任何合适的色素吸附剂，可以在任何常规条件下，一般而言在分离后的蛋白质水溶液的环境温度，实施所述色素去除步骤。就粉末活性炭而言，采用的量是大约0.025重量/体积％-大约5重量/体积％，优选大约0.05重量/体积％-大约2重量/体积％。
如同美国专利No.5844086和6005076所述，当低芥酸菜子粉含有大量脂肪时，可以对分离后的蛋白质水溶液以及下面讨论的蛋白质浓缩水溶液实施本文中所述的脱脂步骤，所述专利已经转让给本受让人，且其公开内容在此引入作为参考。当实施颜色改进步骤时，所述步骤可以在首次脱脂步骤后实施。
一种备选方法是用pH值较高，高于大约6.8，一般而言高达大约9.9的氯化钙溶液浸提含油种子粉。通过采用任何常规食品级碱，比如氢氧化钠水溶液，可以将氯化钙溶液的pH调到所述的碱性值。可替换地，可以用pH较低，低于大约pH5，一般而言低至大约pH3的氯化钙溶液浸提所述含油种子粉。如果采用了所述备选方法，那么采用任何常规方式将得自所述含油种子粉浸提步骤的含水相和残余低芥酸菜子粉分离，比如采用沉降式离心然后进行盘式离心和/或过滤来去除残余的粉。分开的残余粉可以进行干燥后处置。
然后，如上所述，将得自所述高pH或者低pH浸提步骤的蛋白质水溶液的pH调至大约5-大约6.8的范围，优选大约5.3-大约6.2，然后如下所述进行进一步处理。所述pH调节可以采用任何常规酸，比如盐酸，或者碱，比如氢氧化钠，来按照需要实施。
随后，浓缩蛋白质水溶液以提高其蛋白质浓度，同时保持其离子强度基本为常数。一般而言，进行所述浓缩以提供蛋白质浓度为至少大约50g/L，优选至少大约200g/L，更优选至少大约250g/L的浓缩蛋白质溶液。
浓缩步骤可以以和分批操作或者连续操作相一致的任何常规方式进行，比如通过采用任何常规选择性膜技术，比如采用膜进行超滤或透滤；所述膜比如中空-纤维膜或者螺旋卷绕膜，具有合适的截止分子量，比如大约3000-大约100000道尔顿，优选大约5000-大约10000道尔顿，具体取决于不同的膜材料和构造，并且对于连续操作而言，其尺寸允许当蛋白质水溶液通过所述膜时获得所需的浓缩度。
随后，使所述浓缩蛋白质溶液经历透滤步骤，所述透滤采用含水盐溶液，其可以是摩尔浓度和pH和浸提溶液相同的氯化钠水溶液或者氯化钙水溶液。可以采用大约2-大约20体积的透滤溶液，优选大约5-大约10体积的透滤溶液实施所述透滤。在透滤操作中，通过使透出物通过所述膜，从蛋白质水溶液中去除了另外量的污染物，包括酚醛树脂和可见的颜色。透滤操作可以进行到透出物中没有明显的另外量的酚醛树脂和可见颜色为止。所述透滤可以采用截止分子量为大约3000-大约100000道尔顿，优选大约5000-大约10000道尔顿的膜来进行，具体取决于不同的膜材料和构造。
至少在部分透滤步骤中，在透滤介质中可以存在抗氧化剂。抗氧化剂可以是任何常规抗氧化剂，比如亚硫酸钠或者抗坏血酸。在透滤介质中采用的抗氧化剂量取决于所用的材料，可以在大约0.01-大约1重量％之间变化，优选大约0.05重量％。抗氧化剂用于抑制浓缩的低芥酸菜子蛋白质分离物溶液中酚醛树脂的氧化，所述氧化可能对最终制品的颜色有负面影响。
浓缩步骤和透滤步骤可以在任何常规温度，一般而言大约20-大约60℃，优选大约20-大约30℃，下进行获得所需浓缩度的时间。采用的温度和其它条件在一定程度上取决于用来实现所述溶液浓缩和所需蛋白质浓度的膜装置。
在这一步骤中蛋白质溶液浓缩至高于大约200g/L的优选浓度，不仅仅将过程产率提高到高于大约40％优选高于大约80％的水平(基于浸提出的蛋白质的比例，所述蛋白质以干燥的蛋白质分离物的形式回收)，而且也降低了最终蛋白质分离物在干燥后的盐浓度。在其中盐浓度的变化会影响具体食品应用的功能性质和感官性质的分离物应用中，控制分离物盐浓度的能力很重要。
如同所公知的那样，超滤和类似的选择性膜技术允许低分子量物质通过，但防止高分子量物质通过。低分子量物质不仅仅包括盐的离子物种，而且包括从原料中浸提的低分子量材料，比如碳水化合物、色素和抗营养因子，以及蛋白质的任何低分子量形式。膜的截止分子量通常经过选择以确保在溶液中保留了大量比例的蛋白质但同时允许杂质通过，具体取决于不同的膜材料和构造。
如同美国专利No.5844086和6005076所述，需要时，浓缩的并且任选透滤后的蛋白质溶液可以进行进一步的脱脂操作。
浓缩的并且任选透滤的蛋白质溶液可以进行脱色操作，以作为上述脱色操作的替换方案。在该操作中可以采用粉末活性炭以及颗粒活性炭(GAC)。可用作该步骤的颜色吸附剂的另一种材料是聚乙烯基吡咯烷酮。
颜色吸附剂处理步骤可以在任何常规条件下，通常在低芥酸菜子蛋白质溶液的环境温度下进行。对于粉末活性炭或者颗粒活性炭而言，可以采用大约0.025重量/体积％-大约5重量/体积％，优选大约0.05重量/体积％-大约2重量/体积％的量。如果聚乙烯基吡咯烷酮用作颜色吸附剂，可以采用大约0.5重量/体积％-大约5重量/体积％，优选大约2重量/体积％-大约3重量/体积％的量。颜色吸附剂可以通过任何常规方法比如过滤来从低芥酸菜子蛋白质溶液中去除。
源自任选的脱色步骤的经过浓缩和任选透滤的蛋白质溶液可以进行巴氏灭菌，以杀死由于储存或者其它原因存在于初始粉中并在浸提步骤中从所述粉浸提到低芥酸菜子蛋白质分离物溶液中的任何细菌。所述巴氏灭菌可以在任何所需的巴氏灭菌条件下实现。一般而言，浓缩的和任选透滤的蛋白质溶液被加热到大约55-大约70℃，优选大约60-大约65℃，大约10-大约15分钟，优选大约10分钟。随后，巴氏灭菌后的浓缩蛋白质溶液可以冷却以如下进行进一步处理，优选冷却至大约25-大约40℃。
取决于浓缩步骤和任选的透滤步骤中采用的温度以及是否进行了巴氏灭菌步骤，所述浓缩的蛋白质溶液可以加热到至少约20℃，直到大约60℃，优选大约25-大约40℃，以降低浓缩的蛋白质溶液的粘度，从而便于执行后续的稀释步骤和胶束成型。浓缩的蛋白质溶液不应加热到超过用冷却水稀释时不发生胶束成型的温度。
随后，将来自浓缩步骤、和任选的透滤步骤、任选的脱色步骤、任选的巴氏灭菌步骤和任选的脱脂步骤的浓缩蛋白质溶液，通过和体积满足所需稀释度的冷却水进行混合，来进行稀释以实现胶束成型。取决于希望通过胶束路线获得的低芥酸菜子蛋白质的比例和来自上清液的比例，浓缩的蛋白质溶液的稀释度可以变化。一般而言，稀释度越高，在水相中保留的低芥酸菜子蛋白质比例越大。
当希望通过胶束路线提供最大比例的蛋白质时，将浓缩的蛋白质溶液稀释大约15倍或以下，优选大约10倍或以下。
与浓缩的蛋白质溶液混合的冷却水的温度低于大约15℃，通常大约3-大约15℃，优选低于大约10℃，这是因为在所用的稀释系数时，在这些更低温度下蛋白质胶束质形式的蛋白质分离物的产量提高。
在分批操作中，如上所述，在具有所需体积的静态冷却水中加入浓缩蛋白质溶液的批料。浓缩的蛋白质溶液的稀释和由此导致的离子强度的下降，导致形成了离散蛋白质液滴(胶束形式)形式的高度连接性蛋白质分子的云雾状物质。在分批方法中，允许蛋白质胶束在冷却水体中沉降，以形成聚集的、共聚的、致密的、无定形粘性的麸质状蛋白质胶束质(PMM)。所述沉降可以比如通过离心来辅助。所述诱发性沉降(induced settling)降低了蛋白质胶束质的液体含量，从而将水分含量一般而言从大约70重量％-大约95重量％降至一般而言大约50重量％-大约80重量％的值，所述值基于胶束质的总量。以此方式降低胶束质的含水量，也降低了胶束质封闭的盐含量，因此降低了干燥分离物的盐含量。
备选地，可以通过将浓缩的蛋白质溶液连续通过T型管的一个进料口，同时将稀释水送入T型管的另一进料口，以在所述管中预混，来连续进行稀释操作。稀释水以足以实现浓缩蛋白质溶液的所需稀释度的速率送入T型管。
浓缩的蛋白质溶液和稀释水在管中的混合，引发了蛋白质胶束的形成，所述混合物连续从T型管的出口进入沉降容器，当充满所述容器时允许上清液溢流。混合物进入沉降容器中液体本体的方式优选是使液体本体中紊流最小的方式。
在连续方法中，蛋白质胶束在沉降容器中沉降以形成聚集的、聚结的、致密的、无定形的、粘性的、麸质状的蛋白质胶束质(PMM)，所述方法连续进行直到在沉降容器的底部累积所需量的PMM为止，自此所述累积的PMM从沉降容器中去除。作为通过沉淀进行沉降的替代方式，可以通过离心连续分离PMM。
将蛋白质溶液浓缩到至少大约200g/L的优选蛋白质含量以及采用小于大约15的稀释系数这两个工艺参数组合起来，使得和采用任何所述的现有技术蛋白质分离物成型方法(例如，美国专利No.5844086、6055076和4208323)相比，在从原始粉浸提物中回收蛋白质胶束质形式的蛋白质方面获得了更高的产量，通常高得多的产量，以及在蛋白质含量方面获得了纯度大很多的分离物。
和分批方法相比，通过采用连续方法回收低芥酸菜子蛋白质分离物，初始蛋白质浸提步骤可以显著缩短时间来达到相同水平的蛋白质浸提，而且在浸提步骤中可以采用高得多的温度。另外，在连续操作中，和分批方法相比污染的机会降低，导致产品质量更高，而且该方法可以在更加紧凑的装备中进行。
比如通过将残余含水相从沉降物质中滗析出来或者通过离心，将沉降的分离物和残余水相或者上清液分离。PMM可以以湿形式使用，或者可以通过任何常规技术比如喷雾干燥、凝固干燥或者真空转筒干燥成干形式。干PMM的蛋白质含量高，超过大约90重量％蛋白质，优选至少大约100重量％蛋白质(采用Kjeldahl定氮法计算，N×6.25)，并且基本上是非变性的(通过差示扫描量热法确定)。
如同在上述美国专利申请No.10/413371中所述，源自PMM的低芥酸菜子蛋白质分离物主要由7S蛋白质组成，具有下如蛋白质分布大约60-大约90重量％的7S蛋白质，
大约1-大约15重量％的12S蛋白质，和0-大约15重量％的2S蛋白质，优选地，大约88-95重量％的7S蛋白质，大约1-大约12重量％的12S蛋白质，和0-大约1重量％的2S蛋白质。
从脂肪含油种子粉中分离的干PMM也具有低的残余脂肪含量，当如需采用USP5844086和6005076的方法时，可以低于大约1重量％。和在相同反应条件下或者在环境温度下用氯化钠水溶液浸提粉相比，低芥酸菜子蛋白质分离物含有减少量的肌醇六磷酸，优选可以低于大约1重量％。
来自PMM成型和沉降步骤的上清液含有大量的没有在稀释步骤中沉淀的低芥酸菜子蛋白质，该上清液经过处理以从中回收低芥酸菜子蛋白质分离物。在去除PMM之后，从稀释步骤中获得的上清液经过浓缩以提高其蛋白质浓度。所述浓缩采用任何常规选择性膜技术进行，比如超滤，采用具有合适截止分子量的膜，该膜允许低分子量物种通过但将低芥酸菜子蛋白质保留在溶液中，所述低分子量物种包括盐和从蛋白质原料中浸提的其它非蛋白质性低分子量材料。可以采用截止分子量为大约3000-100000道尔顿，优选大约5000-大约10000道尔顿的超滤膜，具体取决于不同的膜材料和构造。上清液以此方式浓缩也减少了为回收蛋白质而需要进行干燥的液体的体积。一般而言，上清液在干燥前浓缩成蛋白质浓度至少为大约50g/L，优选大约100-大约400g/L，更优选大约200-大约300g/L。如同上面描述蛋白质溶液浓缩步骤时一样，所述浓缩操作可以以分批模式或者连续操作来进行。
然后，浓缩的上清液可以通过水实施透滤步骤。所述透滤可以采用大约2-大约20体积的透滤溶液，优选大约5-大约10体积的透滤溶液来进行。在透滤操作中，通过使透出物通过膜，从含水的上清液中去除了另外量的污染物。透滤操作可以进行到在透出物中没有明显的另外量的酚醛树脂和可见颜色时为止。所述透滤可以采用和浓缩步骤相同的膜来进行。但是，如果需要，透滤可以采用单独的膜来进行，所述膜比如截止分子量为大约3000-大约100000道尔顿，优选大约5000-大约10000道尔顿，具体取决于不同的膜材料和构造。
至少在部分透滤步骤中，在透滤介质中可以存在抗氧化剂。抗氧化剂可以是任何常规抗氧化剂，比如亚硫酸钠或者抗坏血酸。在透滤介质中采用的抗氧化剂量取决于所用的材料，可以在大约0.01-大约1重量％之间变化，优选大约0.05重量％。抗氧化剂用于抑制浓缩的低芥酸菜子蛋白质分离物水溶液中酚醛树脂的氧化。
浓缩的并且任选透滤过的上清液可以通过任何常规技术，比如喷雾干燥、凝固干燥或者真空转筒干燥来干燥成干形式，以提供另外的低芥酸菜子蛋白质分离物。所述另外的低芥酸菜子蛋白质分离物的蛋白质含量高，超过大约90重量％蛋白质，优选至少大约100重量％蛋白质(采用Kjeldahl定氮法计算，N×6.25)，并且基本上是非变性的(通过差示扫描量热法确定)。
如同在上述美国专利申请No.10/413371中所述，源自上清液的低芥酸菜子蛋白质分离物主要由2S蛋白质组成，具有下如蛋白质分布大约60-大约95重量％的2S蛋白质，大约5-大约40重量％的7S蛋白质，和0-大约5重量％的12S蛋白质，优选的，大约70-75重量％的2S蛋白质，大约5-大约30重量％的7S蛋白质，和0-大约2重量％的12S蛋白质。
和在相同浸提条件下或者在环境温度下用氯化钠水溶液浸提蛋白质粉相比，低芥酸菜子蛋白质分离物的肌醇六磷酸含量下降，优选可以低于大约1重量％。
如果需要，至少部分湿PMM可以和至少部分浓缩的上清液进行合并，然后再通过任何常规技术对该合并的蛋白质料流进行干燥，以提供组合的低芥酸菜子蛋白质分离物组合物。混合在一起的蛋白质状材料的相对比例可以经过选择，以提供具有所需2S/7S/12S蛋白质分布的所得低芥酸菜子蛋白质分离物组合物。可替换地，所述干燥的蛋白质分离物可以以任何所需比例组合，以在混合物中提供任何所需的具体2S/7S/12S蛋白质分布。组合的低芥酸菜子蛋白质分离物组合物的蛋白质含量高，超过大约90重量％优选至少大约100重量％蛋白质(采用Kjeldahl定氮法计算，N×6.25)，并且基本上是非变性的(通过差示扫描量热法确定)。
在另一备选方法中，仅仅部分浓缩的上清液和仅仅部分PMM混合，并且所得混合物进行干燥，所述浓缩上清液的剩余部分可以干燥，PMM的任何剩余部分同样也可以干燥。而且，如上所述，干燥的PMM和干燥的上清液也可以以任何所需的相对比例进行干混。
通过以这种方式操作，可以回收大量的低芥酸菜子蛋白质分离物，所述蛋白质分离物的形式是干燥的PMM、干燥的上清液、以及源自PMM的低芥酸菜子蛋白质分离物和源自上清液的低芥酸菜子蛋白质分离物成各种比例的干燥混合物，所述比例通常是大约5∶95-大约95∶5重量比，这对于基于组合物中的不同2S/7S/12S蛋白质比例来获得不同功能性质和营养性质而言可能是理想的。
作为如上所述将浓缩的蛋白质溶液稀释到冷却水中并且对所得沉淀物和上清液进行处理的替换方案，可以通过透析所述浓缩的蛋白质溶液以降低其盐含量来从浓缩的蛋白质溶液中回收蛋白质。浓缩的蛋白质溶液中盐含量的下降导致在透析管中形成蛋白质胶束。在透析后，如上所述，可以使蛋白质胶束沉降、收集和干燥。来自蛋白质胶束沉降步骤的上清液可以如上所述进行处理，以进一步从中回收蛋白质。可替换地，透析管的内含物可以直接干燥。当需要小的、试验室级别的蛋白质品质时，可以使用后一种备选方案。
已经发现，当稀释来自氯化钙浸提的浓缩步骤的保留物时，PMM沉降得很差，导致和在相同浸提条件下用氯化钠浸提相比，在上清液中保留有更多的7S蛋白质。
可以在浸提步骤中采用氯化钙，然后在稀释之前，用氯化钠代替氯化钙，以便用氯化钠溶液透滤所述保留物。
参见图1，示意性示出了用于制备具有降低的肌醇六磷酸含量的低芥酸菜子蛋白质分离物的分批方法的流程图。低芥酸菜子含油种子粉和含水氯化钙浸提介质通过管道10送入浸提容器12中，在所述容器中浸提所述含油种子粉和形成蛋白质水溶液。备选地，低芥酸菜子含油种子粉和氯化钠水溶液通过管道10送入浸提容器中，以便在高温下浸提。
蛋白质水溶液和残余含油种子粉的浆料经由管道14通过沉降式离心机16，以便分离残余的含油种子粉，所述含油种子粉通过管道18回收。蛋白质水溶液随后经由管道20进入澄清操作22，在该操作中蛋白质水溶液经过离心和过滤以去除碎屑，所述碎屑通过管道24回收。
澄清的蛋白质水溶液通过管道26泵送通过超滤膜28，以制备浓缩的蛋白质溶液作为管道30中的保留物，而渗出物通过管道32回收。浓缩的蛋白质溶液被送到沉淀容器34中，所述容器含有通过管道36供给的冷水。在沉淀容器34中形成的蛋白质胶束质通过除泥装置35，然后经由管道38到达喷雾干燥器40，以提供干燥的低芥酸菜子蛋白质分离物42。
来自除泥装置35的上清液通过管道44去除，并泵送通过超滤膜46以制备浓缩的蛋白质溶液，所述蛋白质溶液作为在管道48中的保留物，而渗出物通过管道50去除。浓缩的蛋白质溶液通过喷雾干燥器52，以进一步提供干燥的低芥酸菜子蛋白质分离物54。
作为备选方案，管道48中的浓缩蛋白质溶液可以经由管道56传递，以和蛋白质胶束质混合，该混合物然后在喷雾干燥器40中干燥。
参见图2，示意性示出了用于制备具有降低的肌醇六磷酸含量的低芥酸菜子蛋白质分离物的连续方法的流程图。低芥酸菜子含油种子粉和含水氯化钙浸提介质分别经由管道110和112送入混合器114，在此混合含油种子粉和含水浸提介质，所述混合物经由管道116送达混合管118。在混合管118中，浸提含油种子粉并形成蛋白质水溶液。备选地，低芥酸菜子含油种子粉和氯化钠水溶液分别经由管道110和112送入混合器114，用以在高温下在混合管118中浸提。蛋白质水溶液和残余含油种子粉的浆料经由管道120送达沉降式离心机122，以便分离残余的含油种子粉，所述含油种子粉通过管道124回收。蛋白质水溶液随后经由管道126进入澄清操作128，在该操作中蛋白质水溶液经过离心和过滤以去除碎屑，所述碎屑通过管道130回收。
澄清的蛋白质水溶液通过管道132泵送通过定制的超滤膜134，以提供对蛋白质水溶液的所需程度的浓度，从而制备浓缩的蛋白质溶液作为管道136中的保留物，而渗出物通过管道138回收。浓缩的蛋白质溶液被送达混合T型体140，同时通过管道142向其供给量足以获得所需稀释度的冷水。所得溶液经由管道144送达调压箱146，然后送达除泥装置147。蛋白质胶束质经由管道148从除泥装置中去除，穿过喷雾干燥器150，以提供干燥的低芥酸菜子蛋白质分离物152。
来自除泥装置147的上清液通过管道154去除，并泵送通过超滤膜152以制备浓缩的蛋白质溶液，所述蛋白质溶液作为在管道158中的保留物，而渗出物通过管道160去除。浓缩的蛋白质溶液通过喷雾干燥器162，以进一步提供干燥的低芥酸菜子蛋白质分离物164。
作为备选方案，管道158中的浓缩蛋白质溶液可以经由管道166传递，以和蛋白质胶束质混合，该混合物然后在喷雾干燥器150中干燥。
实施例实施例1本实施例描述低芥酸菜子蛋白质分离物的制备。
在“b”L的浸提溶液中加入“a”kg的市售低芥酸菜子含油种子粉，所述溶液是0.1M的NaCl或者0.075M的CaCl2，含有0.05重量％的抗坏血酸，处于环境温度下，搅拌30分钟，以提供蛋白质含量为“c”重量％的蛋白质水溶液。所有蛋白质含量采用Leco FP528 NitrogenDeterminator确定。去除残余的低芥酸菜子粉，通过离心和过滤来澄清所得的蛋白质溶液，以制备蛋白质含量为“e”重量％的“d”L过滤的蛋白质溶液。
通过在截止分子量为100000道尔顿的聚醚砜(PES)膜上的浓缩将“f”L的等分蛋白质浸提溶液的体积降至“g”L，然后在60℃进行巴氏灭菌处理10分钟。所得的经过巴氏灭菌的浓缩溶液的蛋白质含量为“h”重量％。
温度为“i”℃的浓缩溶液在温度为“q”的冷RO水中稀释成“j”。形成了白色混浊，使其沉降。去除上面的稀释水，从容器底部回收沉淀的、粘性的、粘性质(PMM)，产率为过滤后蛋白质溶液的“k”重量％。干燥的源自PMM的蛋白质的蛋白质含量为“l”重量％(N×6.25)d.b。将产物记为“m(C300)”。
采用截止分子量为100000道尔顿的PES膜通过超滤使去除的稀释水的体积下降，然后将浓缩物在60℃进行巴氏灭菌处理10分钟。干燥含有“n”重量％蛋白质的巴氏灭菌后的浓缩物。由于从上清液回收了所述另外的蛋白质，所以过滤后的蛋白质溶液的整个蛋白质回收量是“o”。干燥的、源自上清液的蛋白质的蛋白质含量是“p”重量％(N×6.25)d.b。产物记为“m(C200)”。
参数“a”-“q”以及该方法的其它特征如下表I所示表I

实施例2本实施例比较了如实施例1所述制备的低芥酸菜子蛋白质分离物的肌醇六磷酸含量。
通过离子交换/比色法，分析了如实施例1所述制备的低芥酸菜子蛋白质分离物试样的肌醇六磷酸含量。结果如表II和III所示
表II

表III

从这些数据可以发现，在相同浸提条件下采用氯化钠浸提低芥酸菜子含油种子粉，和采用氯化钙浸提相比，肌醇六磷酸含量更高。当采用CaCl2时，C200和C300产物之间的肌醇六磷酸盐含量差值并不同样明显。
实施例3本实施例描述了试验室级别的试验，将用氯化钠和用氯化钙浸提低芥酸菜子含油种子粉进行了比较。
执行了一系列试验室级别的试验。在本试验中，将15g市售低芥酸菜子含油种子粉和150ml浸提溶剂组合在一起以提供10重量/体积％的浸提。采用轨道型振动器在室温下于220rpm搅拌混合物30分钟。浸提溶剂是0.05M CaCl2、0.1M NaCl、和按照如下比例(体积)组合而成的0.05M CaCl2与0.1M NaCl的共混物100％CaCl2/0％NaCl80％CaCl2/20％NaCl60％CaCl2/40％NaCl40％CaCl2/60％NaCl20％CaCl2/80％NaCl0％CaCl2/100％NaCl浸提物以10000g离心10分钟，从而将用过的粉从所述浸提物中分离。离心后的浸提物通过25微米滤纸过滤。滤出物以10000g进行离心20分钟。采用0.45微米的过滤器对80ml离心后的滤出物进行注射式过滤，用以分析和冷冻干燥。
采用LECO FP528 Nitrogen Determinator分析澄清后的浸提试样的蛋白质含量，采用离子交换HPLC(内部)和离子交换/比色法(外部)确定肌醇六磷酸含量。通过尺寸排出型HPLC分析试样的蛋白质分布。
来自内部试验室分析和外部独立分析的肌醇六磷酸和蛋白质含量如下表IV所示。
表IV

可以发现，浸提溶液中氯化钙的比例增加导致澄清后的浸提试样中肌醇六磷酸的含量降低，而且导致浸提试样中的蛋白质含量更高。
浸提试样中12S、7S和2S蛋白质的蛋白质分布如下表V所示表V

尽管各个浸提试样中蛋白质分布存在着差异，但是这些差异并不明显。
实施例4本实施例给出了浸提介质温度对肌醇六磷酸含量的影响。
采用氯化钠水溶液在环境温度和60℃下，浸提已经在低于70℃的温度进行过脱溶剂处理的低芥酸菜子含油种子粉试样。
在150ml的0.1M氯化钠水溶液中，加入15g蛋白质含量为35.91重量％和水分含量为8.95重量％(在100℃的烘箱中3小时后确定)的低芥酸菜子含油种子粉，置于220rpm的、处于环境温度下的Lab-Line型旋转振动器中30分钟。
采用Sorvall RC-5B离心机和GSA马达将浸提物于10000rpm进行离心，以将用过的粉和浸提物含水溶液分离。然后，将浸提物通过带槽的滤纸(25微米)进行过滤，以去除任何残余的颗粒物质。
将滤出物于10000rpm离心20分钟，然后进行注射式过滤(0.45微米)。滤出物经过冷冻干燥，将试样进行肌醇六磷酸分析。
然后，对相同低芥酸菜子含油种子粉的另一试样重复所述方法，除了将15g粉加入到150ml的0.1M NaCl中，预热到60℃并在Thermolyne热盘/搅拌器上于60℃搅拌5分钟以外。
对于在环境温度(47.34％)和60℃(46.51％)浸提的粉试样而言，表观蛋白质可浸提能力相似。
测量源自低芥酸菜子含油种子粉的试样的肌醇六磷酸含量，结果如表VI所示表VI

如表VI的结果所示，在60℃浸提导致浸提溶液的肌醇六磷酸含量低，这应该导致在回收的低芥酸菜子蛋白质分离物中的肌醇六磷酸更少。
发明综述总而言之，本发明通过采用含水氯化钙作为浸提介质和/或在浸提步骤中采用高温，提供了肌醇六磷酸含量下降的含油种子蛋白质分离物。在本发明的范围之内，可以进行修改。
权利要求
1.制备蛋白质分离物的方法，包括(a)对含油种子粉进行浸提，以使所述含油种子粉中的蛋白质溶出从而形成蛋白质水溶液，同时抑制将肌醇六磷酸从含油种子粉中浸提到蛋白质溶液中，(b)将蛋白质水溶液和残余的含油种子粉分离，(c)将蛋白质水溶液的蛋白质浓度提高到至少大约50g/L的浓度，同时保持离子强度基本不变，从而提供浓缩的蛋白质溶液，(d)将所述浓缩的蛋白质溶液稀释到温度低于大约15℃的冷却水中，以形成蛋白质胶束，(e)使蛋白质胶束沉降，以形成无定形的、粘性的、胶状的、麸质状胶束质，和(f)将所述蛋白质胶束质和上清液分离，所述蛋白质胶束质的蛋白质含量基于干重为至少大约90重量％(N×6.25)。
2.权利要求1的方法，其中所述抑制肌醇六磷酸的浸提是通过采用氯化钙水溶液浸提所述含油种子粉来实现的。
3.权利要求1的方法，其中所述抑制肌醇六磷酸的浸提是通过采用处于高温下的含水盐溶液浸提所述含油种子粉来实现的。
4.权利要求3的方法，其中所述高温是大约45-大约70℃，优选大约55-大约65℃。
5.权利要求3的方法，其中所述含水盐溶液是氯化钙的水溶液。
6.权利要求1的方法，其中所述含油种子粉是低芥酸菜子含油种子粉。
7.权利要求6的方法，其中所述低芥酸菜子蛋白质分离物的蛋白质含量是至少100重量％(N×6.25)。
8.权利要求6的方法，是以分批模式进行的，其中所述低芥酸菜子含油种子粉的浸提是采用含水盐溶液进行的，所述含水盐溶液的离子强度为至少大约0.05，pH为大约5-大约6.8，温度为至少大约5℃。
9.权利要求8的方法，其中所述溶液的离子强度为大约0.1-大约0.6。
10.权利要求8的方法，其中所述盐溶液的pH为大约5.3-大约6.2。
11.权利要求8的方法，其中所述浸提所述低芥酸菜子含油种子粉是通过搅拌所述含水盐溶液大约10-大约30分钟来实现的。
12.权利要求11的方法，其中在浸提步骤中所述低芥酸菜子含油种子粉在所述含水盐溶液中的浓度是大约5-大约15重量％。
13.权利要求8的方法，其中所述来自浸提步骤的蛋白质溶液的蛋白质浓度是大约10-大约30g/L。
14.权利要求8的方法，其中所述含水盐溶液含有抗氧化剂。
15.权利要求6的方法，是以连续模式进行的，其中所述浸提步骤是通过以下步骤实现的(i)将低芥酸菜子含油种子粉和含水盐溶液在温度为大约5-大约65℃连续混合，所述含水盐溶液的离子强度为至少大约0.5，pH为大约5-大约6.8，和(ii)将所述混合物连续通过管子输送，同时在长达大约10分钟的时间内从所述低芥酸菜子含油种子粉浸提蛋白质，以形成蛋白质含量为大约5-大约40g/L的蛋白质水溶液。
16.权利要求15的方法，其中所述盐溶液的离子强度为大约0.1-大约0.8。
17.权利要求15的方法，其中所述盐溶液的pH为大约5.3-大约6.2。
18.权利要求15的方法，其中在所述混合步骤中所述含油种子粉在所述含水盐溶液中的浓度是大约5-大约15重量/体积％。
19.权利要求15的方法，其中所述温度是至少大约35℃。
20.权利要求15的方法，其中所述蛋白质水溶液的蛋白质含量是大约10-大约30g/L。
21.权利要求15的方法，其中所述含水盐溶液含有抗氧化剂。
22.权利要求6的方法，其中在将所述蛋白质水溶液和残余低芥酸菜子种子粉分离之后，所述蛋白质水溶液经历去除色素的步骤。
23.权利要求22的方法，其中所述去除色素的步骤通过透滤所述蛋白质水溶液来进行。
24.权利要求22的方法，其中通过将色素吸附剂和蛋白质水溶液混合并随后从所述蛋白质水溶液中去除色素吸附剂来实施所述去除色素的步骤。
25.权利要求24的方法，其中所述色素吸附剂是粉末活性炭。
26.权利要求6的方法，其中所述浓缩步骤是通过超滤来进行的，以提供蛋白质含量为至少大约200g/L的浓缩蛋白质溶液。
27.权利要求6的方法，其中采用离子强度和浸提步骤所用相同的含水盐溶液透滤所述浓缩的蛋白质溶液。
28.权利要求27的方法，其中采用大约2-大约20体积的透滤溶液进行所述透滤。
29.权利要求28的方法，其中采用大约5-大约10体积的透滤溶液进行所述透滤。
30.权利要求27的方法，其中所述至少部分透滤步骤在抗氧化剂的存在下进行。
31.权利要求6的方法，其中所述浓缩的蛋白质溶液经历脱色步骤。
32.权利要求31的方法，其中所述脱色步骤采用颗粒活性炭或者聚乙烯基吡咯烷酮来进行。
33.权利要求6的方法，其中所述浓缩的蛋白质溶液经历巴氏灭菌步骤。
34.权利要求33的方法，其中通过将浓缩的蛋白质溶液加热到大约55-大约70℃大约10-大约15分钟来进行所述巴氏灭菌步骤。
35.权利要求6的方法，其中从上清液中回收另外的低芥酸菜子蛋白质分离物，所述分离物的蛋白质含量为至少大约90重量％。
36.权利要求35的方法，其中所述另外的低芥酸菜子蛋白质分离物的蛋白质含量是至少大约100重量％。
37.权利要求35的方法，其中通过将上清液浓缩至大约100-大约400g/L的蛋白质浓度并随后干燥所述浓缩的溶液来获得所述另外的蛋白质分离物。
38.权利要求37的方法，其中所述上清液被浓缩至大约200-大约300g/L的蛋白质浓度。
39.权利要求37的方法，其中所述浓缩的蛋白质溶液经历透滤。
40.权利要求39的方法，其中在所述透滤步骤中存在着抗氧化剂。
全文摘要
通过其中在从含油种子粉浸提蛋白质的过程中抑制从含油种子粉浸提肌醇六磷酸的方法，制备了肌醇六磷酸含量降低的含油种子蛋白质分离物，尤其是低芥酸菜子蛋白质分离物。
文档编号A23J3/14GK1988811SQ200580023023
公开日2007年6月27日 申请日期2005年5月6日 优先权日2004年5月7日
发明者M·施维策尔, K·I·塞加尔 申请人:伯康营养科学(Mb)公司