用于增强蛋白生产的基因盒的制作方法

专利名称：用于增强蛋白生产的基因盒的制作方法
本申请要求于2004年5月18日提交的美国临时序列号60/571,943的优先权，所述临时申请整体引入本文作为参考。
背景技术：
1.发明领域本发明涉及基因表达和蛋白生产和/或累积的增强。更具体而言，本发明涉及赋予蛋白抗生素抗性及增加的生产的基因盒。本发明提供了用于增强靶基因表达和编码的蛋白或肽等的生产和/或累积的基因盒以及将其导入宿主细胞的方法，以及它们在生物系统中的用途。
2.发明背景开发用于生产重组蛋白的表达系统对于开发用于研究或治疗需要的给定蛋白的来源是重要的。关于原核细胞例如大肠杆菌(E.coli)以及关于真核细胞的基因表达系统已被开发，所述真核细胞包括酵母(例如，糖酵母属物种(Saccharomyces spp.)、毕赤氏酵母属物种(Pichia spp.)以及克鲁维氏酵母属物种(Kluyveromyces spp.))和哺乳动物细胞。哺乳动物细胞中的基因表达通常优选用于生产治疗蛋白，因为在此类表达系统中的翻译后修饰可能比发生在微生物(原核)表达系统中的翻译后修饰类型更类似于那些在哺乳动物中发现的。
细菌大肠杆菌(Escherichia coli)是通过提取前细胞内蛋白的表达和/或累积来生产异源重组蛋白的最常用原核宿主之一。为了增加效率并降低重组蛋白生产的成本，已付出相当大的努力以增加每单位体积每单位时间的蛋白生产量。因此，本领域需要开发能极大增加重组蛋白容积得率的工具。
几种美国专利和研究论文总体上描述异源重组蛋白基因表达和重组蛋白生产的方面(参见例如，美国专利号6,596,514、6,271,207、6,096,505、5,658,763和5,089,397；Menzella等，Biotechnol Bioeng.2003，82(7)809-17；Chao等，Biotechnol Prog.2002，18(2)394-400；以及Bhandari等，J Bacteriol.1997，179(13)4403-6)。
美国专利号6,596,514公开了当存在于表达载体中时在稳定的细胞库中能将真核细胞中重组蛋白的表达从2倍提高到8倍的核苷酸序列。美国专利号6,271,207描述了提高转基因表达最高达3倍的基因转移方法。美国专利号6,096,505公开了通过将三个单独元件共转染到哺乳动物宿主细胞内来生产重组蛋白的方法，在所述宿主细胞中所述元件可操作地连接，从而使得选择标记基因的表达必然要求目的基因的共表达。美国专利号5,658,763公开了通过将DNA序列转染整合到基因组中来达到增强蛋白生产的方法，所述蛋白由非天然基因构建体表达。美国专利号5,089,397描述了利用由DNA序列转化的CHO细胞重组产生所需蛋白的表达系统，所述DNA序列含有可操作地连接的增强子，所述增强子能够提升生产和/或赋予毒性抗性的基因的水平，这能影响整个系统的扩增。
Menzella等(Biotechnol Bioeng.2003，82(7)809-17)通过使用基因工程改造的BL21品系以允许在补料分批培养中有效利用乳糖作为诱导物来获得重组蛋白生产(最高达16mg/L)。Chao等(Biotechnol Prog.2002，18(2)394-400)公开了当被构建以携带与araBAD启动子融合的T7基因1.0的染色体拷贝时，异源基因在大肠杆菌品系BL21中的高水平表达。Bhandari等(J Bacteriol.1997，179(13)4403-6)报道了在大肠杆菌品系BL21中用NaCl作为T7基因1.0的诱导物，构建质粒以获得盐诱导的基因超表达和单个靶基因产物的超量产生。
然而，上述公开内容无一能提供以相当大的量增强蛋白包括重组蛋白生产的系统或方法。此外，此类系统可以在实体上(physically)或结构上与用于增强目的基因表达的靶基因或重组分子(例如，天然或重组分子)分开。
因此，本领域需要开发利用标准的工业上使用的宿主细胞以及其他非常规宿主极大地增加靶基因表达并增强蛋白包括重组蛋白生产的系统或方法。该需要首次通过本发明得到了满足。
发明概述本发明涉及基因表达/激活以及蛋白生产和/或累积的增强。本发明提供了用于增强靶基因表达和编码的蛋白或肽等的生产和/或累积的基因盒以及将其导入宿主细胞的方法，以及它们在生物系统中的用途。
在一个方面，本发明提供了增强蛋白表达的方法，所述方法包括(a)将基因盒转移到宿主细胞内，其中所述基因盒包含SEQ IDNO1和/或SEQ ID NO2的多核苷酸；以及(b)在适当的生长条件下培养细胞，从而允许蛋白生产和/或累积。
在另一方面，本发明提供了重建用于生产重组蛋白的宿主细胞的方法，所述方法包括(a)将基因盒转移到宿主细胞内，其中所述基因盒包含SEQ ID NO1和/或SEQ ID NO2的多核苷酸；(b)导入包含用于表达重组蛋白的重组基因的载体；以及(c)在适当的生长条件下培养细胞，从而允许重组蛋白生产和/或累积。
在另一方面，本发明提供了增强重组蛋白生产的方法，所述方法包括(a)将基因盒转移到宿主细胞内，其中所述基因盒包含SEQID NO1和/或SEQ ID NO2的多核苷酸；(b)将包含用于表达重组蛋白的重组基因的载体导入宿主细胞；以及(c)在适当的生长条件下培养细胞，从而允许重组蛋白生产和/或累积。
在另一方面，本发明提供了用于增强蛋白生产的基因盒，其中所述基因盒包含SEQ ID NO1和/或SEQ ID NO2的多核苷酸。
还在另一方面，本发明提供了基因盒，其中所述基因盒包含与SEQ ID NO1和/或SEQ ID NO2具有至少90-95％的序列同一性的多核苷酸。
再在另一方面，本发明提供了基因盒，其中所述基因盒包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽与SEQ ID NO3具有至少90-95％的序列同一性。
在本发明的再一方面，基因盒被插入到宿主细胞的基因组中。例如，在大肠杆菌细胞的情况下，所述盒被插入到yjaG基因或galR基因中。
在另一方面，该基因盒在实体上或结构上不与携带重组蛋白基因的载体连接，例如，该基因盒在实体上或结构上不与质粒、粘粒、噬茵体或病毒连接。
除非另有说明，本文所使用的以其各种语法形式存在的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文所述的那些相类似的方法和材料可以用于本发明的实践或测试中，但下文还是阐述了优选的方法和材料。在冲突的情况下，以本说明书包括定义为准。此外，材料、方法和实施例仅是举例说明的且不是限制性的。
本发明的进一步的特征、目的和优点在随后的权利要求和详述中是显而易见的。然而，应当理解，该详述和具体实施例，尽管显示本发明的优选方面，但仅为了举例说明而给出，因为对于本领域技术人员而言，本发明精神和范围内的各种改变和修改根据本详述将是显而易见的。
附图简述

图1描述了野生型品系MG1655(图1A)及其衍生(重组)品系SK100(图1B)的总细胞蛋白的二维蛋白凝胶，所述衍生品系SK100包含2.4kb的Tn21盒。
图2的凝胶照片显示Ni-NTA柱纯化后，在表达质粒pExp66中携带6His-MalE-HupA克隆的野生型BL21和SK101中重组蛋白6His-MalE-HupA的表达概况。
图3描述了以毫克/升相等细胞内容物的培养物体积形式表示的从BL21和SK101品系分离出的重组6His-MalE-HupA蛋白总量的图示。
图4的凝胶照片显示Ni-NTA柱纯化后，在载体pET15b中包含脱水酶基因的野生型BL21和SK101中6-His-碳酸酐酶的表达。
图5的凝胶照片显示在BL21和SK101品系的粗细胞裂解物中人抗-TAC VH蛋白表达。
图6显示了由pGFPuv质粒产生的GFPuv的比荧光强度的时程，所述pGFPuv质粒被导入到BL21和SK101品系中。
图7的凝胶照片描述了野生型品系(MG1655)、在染色体的yjaG基因中包含2.4kb的Tn21盒的抗生素抗性重组品系(SK100)、在染色体的yjaG基因中只包含aadA1基因的抗生素抗性重组品系(SK102)以及在染色体的galR基因中包含aadA1基因的抗生素抗性重组品系(SK103)的总细胞蛋白概况。
图8是如图7中所述以μg/100ml包含约等量细胞的培养物体积表示的野生型和抗生素抗性重组品系的总细胞蛋白含量的图示。
发明详述定义表达载体术语“表达载体”是指已经过插入或整合蛋白或多肽基因序列处理的本领域已知的质粒、病毒或其他载体。使得载体适合增殖的这种DNA元件可以是在原核或真核细胞中起作用的复制起点。在原核细胞起作用的复制起点的实例有colE1 ori。重组载体还需要用于控制这些生物生长的选择标记。适当的选择标记包括当在细胞中作为蛋白表达时保护生物不受抗生素例如氨苄青霉素、链霉素、氯霉素的影响(抗生素抗性)，或在缺少化合物的环境条件(营养缺陷型生长条件)下提供生长的基因。
如本文所使用的，术语“表达”是指基因产物的生物合成。例如，在结构基因的情况下，表达涉及将结构基因转录成mRNA以及将mRNA翻译成一个或多个多肽。
术语“克隆载体”是指在宿主细胞中具有自主复制能力的核酸分子，例如，质粒、粘粒或噬菌体。克隆载体一般包含(i)一个或少数限制性内切核酸酶识别位点，在所述位点上可以以可测定的方式插入外来DNA序列而不丧失载体的基本生物学功能，以及(ii)适合用于鉴定并选择用克隆载体转化或转染的细胞的标记基因。标记基因包括提供例如四环素抗性或氨苄青霉素抗性的基因。
重组蛋白的表达重组表达载体包括编码蛋白的合成的或cDNA-衍生的DNA片段，所述DNA片段与适当的衍生自哺乳动物、病毒或昆虫基因的转录或翻译调节元件可操作地连接。如本领域所述，此类调节元件包括转录启动子、编码适当的mRNA核糖体结合位点的序列以及控制转录和翻译终止的序列。哺乳动物表达载体还可包括非转录元件，例如复制起点、与要表达的基因连接的适当的启动子和增强子、其他5′或3′侧翼非转录序列、5′或3′非翻译序列例如必需的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点以及转录终止序列。还可整合赋予在宿主中复制的能力的复制起点以及促进转化体识别的选择基因。
当它们在功能上相互关联时，DNA区为可操作地连接的。例如，如果它表达为参与多肽分泌的前体，则关于信号肽(分泌前导序列)的DNA与关于多肽的DNA可操作地连接；如果它控制序列的转录，则启动子与编码序列可操作地连接；或者如果它被这样定位以便允许翻译，则核糖体结合位点与编码序列可操作地连接。一般地，可操作地连接是指邻接的，且在分泌前导序列的情况下，邻接且在读框中。然而，在本发明的情况下，通过增强基因表达或通过增强蛋白生产，该基因盒与基因或携带目的基因的载体可以在实体上或结构上分开而仍然在功能上相关或可操作地连接。
通过病毒来源可以提供用于转化脊椎动物细胞的表达载体中的转录和翻译控制序列。例如，通常使用的启动子和增强子来源于多瘤病毒(Polyoma)、腺病毒2、猿猴病毒40(SV40)以及人巨细胞病毒。病毒基因组启动子、控制和/或信号序列可以用于驱动表达，前提是此类控制序列与所选择的宿主细胞是相容的。可以如由Okayama和Berg(Mol.Cell.Biol.3280，1983)所公开的构建示例性的载体。非病毒的细胞启动子也可以被利用(即，β-珠蛋白和EF-1α启动子)，这取决于将在其中表达重组蛋白的细胞类型。
衍生自SV40病毒基因组的DNA序列，例如SV40起点、早期和晚期启动子、增强子、剪接位点以及聚腺苷酸化位点，可以用于提供异源DNA序列表达所需的其他遗传因子。早期和晚期启动子是特别有用的，因为作为也包含SV40病毒复制起点的片段二者都易于从病毒获得(Fiers等，Nature 273113，1978)。较小或较大的SV40片段也可以被利用，前提是包括从Hind III位点向位于病毒复制起点的BglI位点方向延伸的大约250bp的序列。
术语“可操作地连接”用于描述调节元件和基因或其编码区之间的联系。即，基因表达一般置于某些调节元件的控制下，所述调节元件包括组成型或诱导型启动子、组织特异性调节元件和增强子。此类基因或编码区被称为与调节元件“可操作地连接”或“有效地连接”或“可操作地关联”，意思是该基因或编码区受该调节元件的控制或影响。然而，当它们在功能上相互关联或增强多肽生产时，DNA片段或基因可以被认为与另一基因或携带编码多肽的基因的载体反式可操作地连接。
宿主细胞转化的宿主细胞是已转化或转染了表达载体的细胞，所述表达载体利用重组DNA技术构建并且含有编码重组蛋白的序列。取决于所选择的DNA，被表达的蛋白优选分泌到培养物上清液中，但也可沉积在细胞膜中。
宿主细胞可以是培养的细胞、外植体、体内细胞等。宿主细胞可以是原核细胞，例如大肠杆菌，例如品系BL21，或真核细胞，例如酵母、昆虫、两栖动物或哺乳动物细胞，例如Vero、CHO、HeLa及其他。
各种哺乳动物细胞培养系统也可用于表达重组蛋白。适当的哺乳动物宿主细胞系的实例包括由Gluzman(Cell 23175，1981)所述的猴肾细胞COS-7系，以及其他能够表达合适载体的细胞系，包括，例如CV-1/EBNA(ATCC CRL 10478)、L细胞、C 127、3T3、中国仓鼠卵巢(CHO)、HeLa和BHK细胞系。
“细胞系”是指无限增殖的且可以经历传代的培养的细胞。传代是指将培养的细胞从一个培养室移至另一个培养室，从而使得培养的细胞可以繁殖到下一代。
“重组宿主”可以是包含克隆载体或表达载体的任何原核或真核细胞。这个术语还包括经过基因工程改造以在宿主细胞染色体或基因组中包含克隆的基因的那些原核或真核细胞。
宿主细胞的制备和转化几种转化方案是本领域已知的，并在Kaufman，R.J.，Meth.Enzymology 185537(1988)中被综述。所选择的转化方案取决于宿主细胞类型和目的基因特性，并且可以基于常规实验法进行选择。任何此类方案的基本要求是首先将编码目的蛋白的DNA导入到适当的宿主细胞中，并随后鉴定且分离已以稳定的可表达的方式整合了异源DNA的宿主细胞。
一个导入异源DNA的常用方法是磷酸钙沉淀，例如，如由Wigler等所述(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 773567，1980)。通过这种方法导入到宿主细胞中的DNA经常经历重排，从而使得这个方法可用于共转染独立的基因。
聚乙烯诱导的细菌原生质体与哺乳动物细胞的融合(Schaffner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 772163，1980)是另一种导入异源DNA的有用方法。原生质体融合方案经常产生多个整合到哺乳动物宿主细胞基因组中的质粒DNA拷贝；然而，这个技术要求选择和扩增标记与目的基因处于相同质粒上。
按照如Yu等(Yu等，Proc Natl Acad Sci U S A.2000，97(11)5978-83)描述的方法，可以以线性DNA的形式将基因盒或基因片段导入染色体中。
例如，如Potter等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.817161，1988)或Shigekawa和Dower(BioTechniques 6742，1988)所述，还可以利用电穿孔将DNA直接导入到宿主细胞的细胞质中。与原生质体融合不同，电穿孔不要求选择标记和目的基因处于相同质粒上。
最近，用于将异源DNA导入到哺乳动物细胞中的几种试剂已得到描述。这些试剂包括LipofectinRTM试剂和LipofectamineTM试剂(Gibco BRL，Gaithersburg，Md.)。这两种试剂都是商业上可获得的用于形成脂质-核酸复合物(或脂质体)的试剂，当应用于培养的细胞时所述试剂促进细胞摄入核酸。
扩增目的基因的方法同样是重组蛋白表达所需要的，并且一般包括使用选择标记(综述于Kaufinan，R.J.，见上)。对细胞毒性药物的抗性是最经常用作选择标记的特性，并且可以是显性性状(例如，能够不依赖于宿主细胞类型而使用)或隐性性状(例如，用于对任何被选择的活性都缺陷的特殊宿主细胞类型)的结果。几种可扩增的标记均适用于本发明的表达载体(例如，如Maniatis，MolecularBiologyA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，NY，1989；pages 16.9-16.14所述)。
本领域已知的有用的调节元件也可包括在用于转化哺乳动物细胞的质粒中。本文所选取的转化方案以及所选择使用的元件将取决于所使用的宿主细胞类型。本领域技术人员知道许多不同的方案和宿主细胞，并可以基于其细胞培养系统的需要来选择合适的用于表达所需蛋白的系统。
术语“转化的细胞”是指已通过例如重组DNA技术或病毒向其中(或向其前代或祖先)导入编码本发明多肽的核酸分子的细胞。
转座子Tn21转座子Tn21是在质粒NR1(R100)中发现并从弗氏志贺氏菌品系(Shigella flexneri strain)(Nakaya等，Biochem.Biophys.Res.Commun.3654-659，1960)中分离出的约20kb的核酸分子(GenBank位置AF071413)(Nisen等，J.Mol.Biol.117975-998，1977)。Tn21是包含紧密相关元件的Tn3家族的亚组，所述元件主要负责革兰氏阴性细菌中的多重抗生素抗性。Tn3家族的转座因子可能是细菌中最成功的可移动DNA元件组存在许多不同但相关的成员并广泛分布在革兰氏阴性和革兰氏阳性菌中。在肠杆菌科(Enterobacteriaceae)家族成员中许多编码多重抗生素抗性的转座子属于Tn21亚组。已知转座子Tn21赋予对链霉素、壮观霉素、Sulfadimine、汞(Mercury)和卡那霉素的抗性(de la Cruz，F.，和J.Grinsted.J Bacteriol.151222-228，1982)。在转座子Tn21及其许多最接近的相关物中携带被称为整合子的潜在地独立移动的DNA元件。该整合子编码RecA-非依赖性的、位点特异的整合系统，所述整合系统负责获得编码抗生素抗性基因的被称为基因盒的多个小移动元件。
基因盒术语“基因盒”是指包含下列物质的盒核酸分子(参见例如，SEQ ID NO.1)、氨基糖苷腺苷酰转移酶(aadA1)基因(参见例如，SEQ ID NO.2，GenBank登录号NC_003292，区36072-36863)、转座子Tn21基因的衍生物、同源分子或其片段，所述盒可以被导入(例如，通过转化或电穿孔)宿主细胞(原核的或真核的)以用于增强靶基因(例如，天然或重组分子)表达并增强编码的蛋白或多肽的生产和/或累积。术语“基因盒”也指编码包含氨基糖苷腺苷酰转移酶活性的蛋白(参见例如SEQ ID NO.3，GenBank蛋白ID.NP 511224.1(aadA1))的核酸分子、其同源分子或片段。“基因盒”也可以赋予宿主细胞对氨基糖苷类抗生素例如壮观霉素或链霉素的抗性。
如本文所使用的，“靶基因”是指被表达的基因，在其中基因表达水平或基因产物活性的调节增强其编码的蛋白或多肽的生产和/或累积。靶基因可以是宿主细胞的天然基因或被导入细胞的重组分子。
一般而言，术语“基因”是指基因组上能够被转录为RNA的区域，所述RNA具有调节功能、催化功能和/或编码蛋白。真核基因一般具有内含子和外显子，它们可以组织为产生不同的RNA剪接变体，所述变体编码可变形式的成熟蛋白。熟练的技术人员将理解本发明包含了可以被发现的所有靶基因编码的转录物，包括剪接变体、等位基因变体和由于可变启动子位点或可变聚腺苷酸化位点而发生的转录物。因此“全长”基因或RNA包含任何自然发生的剪接变体、等位基因变体、其他可变转录物、通过重组技术产生的具有与自然发生的变体相同功能的剪接变体，以及由此产生的RNA分子。基因包括aadA1的“片段”，可以来自基因的任何部分，所述片段可代表或不代表功能结构域，例如催化结构域、DNA结合结构域等。片段可优选包括编码至少25个邻接氨基酸，且优选至少约30、40、50、60、65、70、75或更多邻接氨基酸或在那附近或那之间的任何整数的核苷酸序列。
如下文所述，本发明的核酸分子，例如aadA1基因或其子序列，可以被插入到载体中，这将促进靶基因的表达。因此，包含本发明核酸的载体、用这些载体转染的细胞、所表达的多肽以及所产生的针对整个多肽或其抗原性片段的抗体，是在本发明方面中的。
“被分离的DNA分子”是指已经从生物的染色体或基因组DNA中分离出的DNA片段。分离也定义为暗示与最初来源或环境分离的程度。例如，编码aadA1基因的克隆的DNA分子是被分离的DNA分子。被分离的DNA分子的另一实例是没有整合到生物基因组DNA中的化学合成的DNA分子或酶促生成的cDNA。可以对被分离的DNA分子实施本领域已知的方法以去除污染物，从而使得该DNA分子被认为是纯化的，即，接近更均一的状态。
取决于情况，“被分离的核酸分子”可以指从基因或基因片段的5′和3′编码序列中分离出的核酸分子，所述序列在生物自然发生的基因组中是邻接的。术语“被分离的核酸分子”还包括非自然发生的核酸分子，例如，通过重组DNA技术生成的核酸分子。
术语“互补DNA”(cDNA)，通常被称为“拷贝DNA(copyDNA)”，是通过逆转录酶从mRNA模板形成的单链DNA分子。一般地，利用与mRNA部分互补的引物启动逆转录。本领域的技术人员也用术语“cDNA”指包含此类单链DNA分子及其互补DNA链的双链DNA分子。
“核酸”是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其单链或双链形式的聚合物。这个术语包括含有已知的核苷酸类似物或被修饰的主链残基或键的核酸，所述核酸是合成的、自然发生的以及非自然发生的，所述核酸具有与参考核酸相似的结合特性，并且所述核酸以与参考核苷酸相似的方式进行代谢。此类类似物的实例包括，但不限于，硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-O-甲基化核糖核苷酸和肽-核酸(PNAs)。
除非另有说明，具体的核酸序列也含蓄地包括其保守修饰的变体(例如，简并密码子置换)和互补序列，以及明确说明的序列。具体地，通过产生这样的序列可以实现简并密码子置换，在所述序列中一个和多个被选择的(或所有的)密码子的第三个位置被适当的混合碱基和/或脱氧肌苷残基置换(Batzer等，Nucleic Acid Res，19081，1991；Ohtsuka等，J Biol.Chem.，2602600-2608，1985；Rossolini等，Mol.Cell Probes，891-98，1994)。术语核酸可以与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸互换使用。
在两个核酸或多肽序列上下文中的术语“序列同一性”包括提及当在具体的比较窗口以最大一致性比对时在两个序列中相同的残基，并可以考虑添加、缺失和置换。当序列同一性的百分比用于提及蛋白时，应当认识到不同一的残基位置通常差别在于保守氨基酸的置换，其中用氨基酸残基置换其他具有相似化学特性(例如，电荷或疏水性)的氨基酸残基并因此不会不利地改变分子的功能特性。
如本文所述，序列同一性的百分比是指通过在比较窗口比较两个最佳比对的序列而测定的值，其中对于两个序列的最佳比对，与参考序列(它不包含添加、置换或缺失)相比，比较窗口中的多核苷酸序列部分可以包含添加、置换或缺失(即缺口)。通过如下方法来计算百分比，测定这样的位置数目，在所述位置上相同的核酸碱基或氨基酸残基出现在两个序列中以产生匹配的位置数目，用比较窗口中的位置总数目去除匹配的位置数目，并将结果乘以100以得出序列同一性的百分比。
在多核苷酸上下文中以其各种语法形式存在的术语“同源的”是指利用所述比对程序之一使用标准参数与参考序列相比较，多核苷酸包含具有所需同一性的序列，所述同一性例如至少60％的同一性，优选至少70％的序列同一性，更优选至少80％，再更优选至少90％并且甚至更优选至少95％。技术人员将认识到，通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、读框定位等，可以适当调整这些值以测定由两个核苷酸序列所编码的蛋白的相应同一性。用于这些目的的氨基酸序列的相当大同一性通常指序列同一性为至少60％、更优选至少70％、80％、90％，并甚至更优选至少95％。
如果两个分子在严格的杂交条件下互相杂交，则核苷酸序列也可以是基本上同一的。然而，如果它们编码的多肽是基本上同一的，则在严格的杂交条件下不互相杂交的核酸仍然是基本上同一的。例如，当利用遗传密码所允许的最大的密码子简并性产生核酸拷贝时，这种情况就会发生。两个核酸序列是基本上同一的一个指示是第一个核酸编码的多肽与第二个核酸编码的多肽有免疫学交叉反应，尽管此类交叉反应性不是认为两个多肽基本上同一所必需的。
在Tiissen，Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes，“Overview of principles ofhybridization and the strategy of nucleic acid assays”(1993)中可以找到关于核酸杂交的详尽指导。示例性的严格杂交条件可以如下所述，例如50％甲酰胺，5x SSC和1％SDS，于42℃温育，或5x SSC和1％SDS，于65℃温育，伴随于65℃在0.2x SSC和0.1％SDS中洗涤。可替代的条件包括，例如，至少与于68℃杂交20小时，随后在2x SSC、0.1％SDS中洗涤，于55℃两次30分钟和于60℃三次15分钟一样严格的条件。另一可替代的条件设定为于约45℃在6x SSC中杂交，随后于50-65℃在0.2x SSC、0.1％SDS中洗涤一次或多次。关于PCR，约36℃的温度对于低严格性扩增是代表性的，尽管依赖于引物的长度，退火温度可以在约32℃和48℃之间变动。对于高严格性PCR扩增，约62℃的温度是代表性的，尽管取决于引物的长度和特异性，高严格性的退火温度可以为约50℃到约65℃。关于高和低严格性扩增的一般循环条件包括90℃-95℃30秒-2分钟的变性阶段、持续30秒-2分钟的退火阶段以及约72℃1-2分钟的延伸阶段。
在数值和范围上下文中的术语“约”或“大约”是指近似或接近于所列举的值或范围的值或范围，从而使得本发明可以如技术人员从本文所含教导可以看出的那样预期执行，例如在反应混合物中具有所需的核酸或多肽量。这至少部分是由于核酸组合物的变化特性、年龄、种族、性别、解剖学和生理学变量以及生物系统的不精密性。因此，这些术语包含由系统误差产生的那些值以外的值。
本发明提供了基因盒，当转移至宿主细胞，例如细菌细胞例如大肠杆菌时，所述基因盒诱导蛋白的生产和累积的增强。更具体地，该基因盒(转座子Tn21的衍生物)赋予对氨基糖苷类抗生素例如壮观霉素和链霉素的抗性。此外，该基因盒在受体(recepient)细胞内引起蛋白(细胞的、天然的和/或重组的)的增加。
当转移至宿主细胞，例如原核细胞例如大肠杆菌品系BL21时，该基因盒以约5-约200倍或更多倍增加蛋白的生产。
依照本领域已知方法(例如，Yu等(Yu等，Proc Natl Acad SciU S A.2000，97(11)5978-83)，可以以线性DNA的形式将该基因盒或基因片段导入到宿主细胞的染色体中。依照类似方法还可以完成染色体中的所有后续插入。
根据本发明，通过导入该基因盒而增加的蛋白生产不受宿主细胞特性、载体、诱导系统、蛋白特性、用于将基因盒导入染色体中的方法或基因盒在染色体中的位置的限制。
本发明还提供了重建用于增加蛋白得率的宿主细胞例如细菌细胞(例如，大肠杆菌)的方法。
通过将基因盒(例如Tn21基因盒)导入到疫苗品系基因组中增加重组保护性抗原/蛋白的生产，本发明可以用于增强活的或减毒疫苗载体/品系的功效、潜能和免疫原性。
本文所公开的基因盒、方法和/或系统提供了超过本领域当前使用的标准或常规品系的明显优点。优点包括增强产物得率、减少培养体积、更快的处理以及更低的生产成本。结果证明与在等基因的亲本品系中观察到的表达水平成对比，在本发明携带基因盒的品系中蛋白表达水平显著增加(参见图1-8)。因此，根据本发明的基因盒、方法和/或系统显然为在制药学和生物技术应用中的成功实施提供了增加的生产率和更少的处理时间的优点。
本发明提供了基因盒，当转移至大肠杆菌品系时，所述基因盒诱导天然和/或重组蛋白生产和/或累积的激活/增强。将从转座子Tn21(GenBank登录号NC_003292)获得的2.4Kb DNA盒插入大肠杆菌K12品系(MG1655和W3110)和大肠杆菌B品系(BL21)的yjaG基因中，所述基因盒赋予对氨基糖苷类抗生素例如壮观霉素和链霉素的抗性。导入这个基因盒后，细胞中的总细胞蛋白含量有急剧的增加。图1显示了来自亲本品系(MG1655)及其包含抗生素抗性盒的衍生品系(SK100)的二维蛋白凝胶概况。对来自等量细菌细胞的提取物分析它们的总蛋白含量。通过Bradford方法偶联二维凝胶分析的总蛋白评价显示SK100中总细胞蛋白含量相对于MG1655有5-10倍的增加。
研究了这个基因盒对细胞中重组蛋白表达的作用。为了这个目的利用了工业上通常用于生产外来蛋白的宿主大肠杆菌B，品系BL21，及其包含抗生素抗性盒的衍生品系(SK101)。选择编码6His-MalE-HupA融合蛋白的基于噬茵体T7的表达质粒作为模型重组蛋白，以证实来自两种品系的表达水平的差异。图2举例说明了SK101的澄清裂解液以及纯化级分中重组蛋白的累积和得率的相对于BL21中的显著增加。图3描述了来自SK101和BL21这两种品系的重组蛋白总容积得率的定量评估。最终纯化后，来自SK101品系的得率是来自BL21品系的得率的约140倍。在最高水平的表达系统中，重组蛋白的最大得率占总细胞蛋白的20-30％。在SK101中，重组蛋白得率超过总细胞蛋白的60％。另一显著特征是，尽管重组蛋白的最终得率极大增加，但该蛋白还是保持其可溶性和功能活性，并且没有聚集成无活性的内含体。
为了证实增加的蛋白得率不是对任何特别的启动子或重组基因特异的，还测试了包含不同启动子和不同重组基因的其他表达质粒。图4和图5中显示了两个此类实例。图4显示了来自SK101和BL21宿主细胞的大肠杆菌碳酸酐酶的总得率。图5显示了同样来自SK101和BL21这两种品系的人抗-TAC VH蛋白的得率。在每种情况下，SK101中的蛋白得率显然更高，从而证实该基因盒或系统在增强重组蛋白生产中的潜在普遍性。在人抗-TAC VH蛋白的情况下，BL21中有少量至没有蛋白表达，表明在目前使用的系统中非细菌蛋白表达的先天困难。因此，该盒的导入不仅巨大地增加了所表达蛋白的得率，还减轻了某些难控制的外来蛋白合成中的表达阻断。
除了最终得率之外，重组蛋白的合成速率对于提高生产率并降低生产成本也是关键的。研究了基因盒系统对重组蛋白生产动力学的作用。图6显示BL21和SK101背景中的绿色荧光蛋白(GFPuv)合成的比速率。这个研究证实整合了该基因盒的系统中外来重组蛋白的合成速率也比常规品系中的速率更快。
尽管大多数实验在BL21的衍生品系中进行，但通过本领域已知的简单的基因技术也可以将该基因盒转移至任何宿主细胞，包括大肠杆菌品系。因此，该基因盒系统的应用不受宿主、表达载体或诱导方法选择的限制。
该基因盒的进一步研究揭示792bp的aadA1基因主要负责增加蛋白的生产。图7显示了包含完整的2.4kb基因盒的品系(SK100)(左起第3个泳道)、在染色体的相同位置处(在yjaG基因上)包含792bp的aadA1基因的品系(SK102)(左起第4个泳道)以及在染色体的不同位置处(在galR基因上)包含aadA1基因的品系(SK103)(左起第5个泳道)的总细胞蛋白概况。与野生型品系(MG1655)(左起第2个泳道)相比，包含完整的2.4kb盒的品系(SK100)和只包含792bp的aadA1基因的品系(SK102和SK103)中的总细胞蛋白含量都更高。包含完整基因盒的品系(SK100)产生的蛋白含量略高于只包含792bp的aadA1基因的品系(SK102和SK103)(参见图8)。结果同样显示aadA1基因在染色体上的位置不是关键的，因为当被插入yjaG基因中或galR基因中时它对细胞蛋白含量有着几乎相同的作用(参见图8)。
通过下列实施例进一步描述本发明，所述实施例不以任何方式限制本发明。
实施例实施例I基因盒诱导的总细胞蛋白含量的增加。
将从转座子Tn21(参见SEQ ID NO.1)获得的2.4Kb DNA盒插入大肠杆菌K12品系(MG1655)和大肠杆菌B品系(BL21)的yjaG基因中。大肠杆菌细胞生长直到对数期中期(OD600nm-0.5)并从细胞中提取总蛋白。将来自相等OD的培养物的蛋白加载在凝胶上。分析来自等量细菌细胞的提取物的总蛋白含量。通过Bradford方法偶联二维凝胶分析评价总蛋白。在包含2.4kb Tn21盒的品系中，对于多数蛋白，单个蛋白斑点的强度极大地增加。结果显示SK100中总细胞蛋白含量相对于MG1655有5-10倍的增加(参见图1)。由于加载在凝胶上的蛋白取自相等数目的野生型和重组细胞，所以这个实验显示在重组品系SK100中大部分细胞蛋白表达水平升高。图1显示了来自亲本品系(MG1655)及其包含抗生素抗性盒的衍生品系(SK100)的二维蛋白凝胶概况。
实施例II基因盒对重组蛋白表达的作用。
大肠杆菌B，品系BL21，与其包含基因盒的衍生品系(SK101)一起使用。选择编码6His-MalE-HupA融合蛋白的基于噬菌体T7的表达质粒作为模型重组蛋白，以证实来自两种品系的表达水平的差异。用重组克隆转化BL21和SK101细胞后，将细胞用1mM IPTG在37℃诱导3小时。在诱导(I)后以及同样在Ni-NTA柱纯化(P)后的总细胞裂解液中检查重组蛋白的表达。结果显示在包含Tn21盒的SK101品系中重组蛋白的表达水平急剧增加(参见图2)。来自这两种品系(BL21和SK101)的重组蛋白的总容积得率的定量评价显示来自SK101的得率为来自BL21的得率的约140倍(参见图3)。
实施例III基因盒诱导的6-His-碳酸酐酶增强的表达。
测定了SK101和BL21中大肠杆茵碳酸酐酶的生产。通过1mMIPTG在37℃诱导重组蛋白生产3小时。在加载用于凝胶电泳之前利用Ni-NTA柱纯化重组蛋白。这个实验显示在包含Tn21盒的SK101品系中6-His-碳酸酐酶的表达水平增加(参见图4)。这个实验还证实了该基因盒在包含Tn21盒的SK101品系中诱导增强的重组蛋白表达的普遍性，所述重组蛋白包括6-His-碳酸酐酶和6His-MalE-HupA(参见图3和图4)。
实施例IV基因盒诱导的真核蛋白增强的表达。
测定了BL21和SK101品系中人抗-TAC VH蛋白的表达。蛋白用1mM IPTG诱导3小时并将全部细胞裂解液加载到凝胶上以测定重组蛋白的表达。SK101中的蛋白得率显然较高，从而证实该基因盒在诱导增强的重组蛋白生产中的潜在普遍性。在人抗-TAC VH蛋白的情况下，BL21中有少量至没有蛋白表达(参见图5)，从而表明工业上当前使用的品系BL21中非细菌蛋白表达的先天困难。因此，该基因盒的导入不仅巨大地增加了所表达蛋白的得率，而且还减轻了某些难控制的外来蛋白合成中的表达阻断。这个实验还证实携带基因盒的细胞中重组蛋白增加的生产不限于细菌蛋白，真核蛋白也可以更高水平被表达。
实施例V体内蛋白生产的动力学。
在用pGFPuv质粒转化的BL21和SK101品系中研究了基因盒系统对重组蛋白生产动力学的作用。测定了BL21和SK101背景中的绿色荧光蛋白(GFPuv)合成的比速率。这个实验结果显示在包含Tn21盒的SK101品系中体内蛋白生产的动力学更高。来自BL21和SK101品系中的转化的pGFPuv质粒的比荧光强度的时程显示在重组品系SK101中以更快的速率生产蛋白(参见图6)。该实验证实含基因盒的系统中重组蛋白的合成速率也比常规品系中的速率更快。
实施例VI由792bp片段，aadA1基因诱导的增强的表达。
将从转座子Tn21(参见SEQ ID NO1)获得的2.4Kb基因盒，以及2.4Kb基因盒的792bp片段(aadA1基因，SEQ ID NO2)插入大肠杆菌K12品系(MG1655)和大肠杆菌B品系(BL21)的yjaG基因中。还将792bp片段插入大肠杆菌B品系(BL21)的galR基因中。大肠杆菌细胞生长直到对数期中期(OD600nm0.5)并从细胞中提取总蛋白。将来自相等OD的培养物的蛋白加载在凝胶上。分析来自等量细菌细胞的提取物的总蛋白含量。图7显示了包含被插入到大肠杆菌染色体yjaG基因中的完整的2.4kb基因盒的品系(SK100)(左起第3个泳道)、包含被插入到大肠杆菌染色体yjaG基因中的792bp的aadA1基因的品系(SK102)(左起第4个泳道)、包含被插入到大肠杆菌染色体galR基因中的792bp的aadA1基因的品系(SK103)(左起第5个泳道)、野生型品系(MG1655)(左起第2个泳道)的总细胞蛋白概况。包含2.4kb盒或792bp的aadA1基因的品系(品系SK100、SK102和SK103)中的总细胞蛋白含量高于野生型(WT)品系的含量(参见图8)。再次，包含完整的2.4kb盒的品系(SK100)产生的蛋白含量略高于只包含aadA1基因的品系(SK102和SK103)(参见图8)。结果显示基因盒(例如792bp的aadA1基因)在宿主细胞(例如，BL21衍生的SK102或SK103)染色体上的插入位置可以改变。例如，在宿主染色体的yjaG基因或galR基因中包含基因盒的品系SK102和SK103产生约相同量的细胞蛋白含量(参见图8)。
应当理解该说明书、具体实施例和数据尽管显示了示例的实施方案，但却是为了举例说明而给出的并且不预期限制本发明。根据本文所包含的讨论、公开内容和数据，本发明内的各种改变和修改对于技术人员将是显而易见的，并因此被认为是本发明的一部分。
序列表SEQ ID NO.1包括792bp aadA1基因(以粗体显示)的2,435bp基因盒。以粗体显示的部分是aadA1基因的编码序列(IncN质粒R46，完整序列登录号NC_003292，区域36072-36863)。
1 ACGCGATATC GAGCTGATAA AAGGGATCCA TCAGGCAACG41 ACGGGCTGCT GCCGGCCATC AGCGGACGCA GGGAGGACTT81 TCCGCAACCG GCCGTTCGAT GCGGCACCGA TGGCCTTCGC121 GCAGGGGTAG TGAATCCGCC AGGATTGACT TGCGCTGCCC161 TACCTCTCAC TAGTGAGGGG CGGCAGCGCA TCAAGCGGTG201 AGCGCACTCC GGCACCGCCA ACTTTCAGCA CATGCGTGTA241 AATCATCGTC GTAGAGACGT CGGAATGGCC GAGCAGATCC281 TGCACGGTTC GAATGTCGTA ACCGCTGCGG AGCAAGGCCG321 TCGCGAACGA GTGGCGGAGG GTGTGCGGTG TGGCGGGCTT361 CGTGATGCCT GCTTGTTCTA CGGCACGTTT GAAGGCGCGC401 TGAAAGGTCT GGTCATACAT GTGATGGCGA CGCACGACAC441 CGCTCCGTGG ATCGGTCGAA TGCGTGTGCT GCGCAAAAAC481 CCAGAACCAC GGCCAGGAAT GCCCGGCGCG CGGATACTTC521 CGCTCAAGGG CGTCGGGAAG CGCAACGCCG CTGCGGCCCT561 CGGCCTGGTC CTTCAGCCAC CATGCCCGTG CACGCGACAG601 CTGCTCGCGC AGGCTGGGTG CCAAGCTCTC GGGTAACATC641 AAGGCCCGAT CCTTGGAGCC CTTGCCCTCC CGCACGATGA681 TCGTGCCGTG ATCGAAATCC AGATCCTTGA CCCGCAGTTG721 CAAACCCTCA CTGATCCGCA TGCCCGTTCC ATACAGAAGC761 TGGGCGAACA AACGATGCTC GCCTTCCAGA AAACCGAGGA801 TGCGAACCAC TTCATCCGGG GTCAGCACCA CCGGCAAGCG841 CCGCGACGGC CGAGGTCTTC CGATCTCCTG AAGCCAGGGC881 AGATCCGTGC ACAGCACCTT GCCGTAGAAG AACAGCAAGG921 CCGCCAATGC CTGACGATGC GTGGAGACCG AAACCTTGCG961 CTCGTTCGCC AGCCAGGACA GCCCTGCCTC GACTTCGCTG1001 CTGCCCAAGG TTGCCGGGTG ACGCACACCG TGGAAACGGA1041 TGAAGGCACG AACCCAGTGG ACATAAGCCT GTTCGGTTCG1081 TAAGCTGTAA TGCAAGTAGC GTATGCGCTC ACGCAACTGG1121 TCCAGAACCT TGACCGAACG CAGCGGTGGT AACGGCGCAG1161 TGGCGGTTTT CATGGCTTGT TATGACTGTT TTTTTGGGGT1202 ACAGTCTATG CCTCGGGCAT CCAAGCAGCA AGCGCGTTAC1241 GCCGTGGGTC GATGTTTGAT GTTATGGAGC AGCAACGATG1281 TTACGCAGCA GGGCAGTCGC CCTAAAACAA AGTTAAACAT1321 CATGAGGGAA GCGGTGATCG CCGAAGTATC GACTCAACTA1361 TCAGAGGTAG TTGGCGTCAT CGAGCGCCAT CTCGAACCGA1401 CGTTGCTGGC CGTACATTTG TACGGCTCCG CAGTGGATGG1441 CGGCCTGAAG CCACACAGTG ATATTGATTT GCTGGTTACG1481 GTGACCGTAA GGCTTGATGA AACAACGCGG CGAGATTTGA1521 TCAACGACCT TTTGGAAACT TCGGCTTCCC CTGGAGAGAG1561 CGAGATTCTC CGCGCTGTAG AAGTCACCAT TGTTGTGCAC1601 GACGACATCA TTCCGTGGCG TTATCCAGCT AAGCGCGAAC1641 TGCAATTTGG AGAATGGCAG CGCAATGACA TTCTTGCAGG1681 TATCTTCGAG CCAGAAACGA TCGACATTGA TCTGGCTATC1721 TTGCTGACAA AAGCAAGAGA ACATAGCGTT GCCTTGGTAG1761 GTCCAGCGGC GGAGGAACTC TTTGATCCGG TTCCTGAACA
1801 GGATCTATTT GAGGCGCTAA ATGAAACCTT AACGCTATGG1841 AACTCGCCGC CCGACTGGGC TGGCGATGAG CGAAATGTAG1881 TGCTTACGTT GTCCCGCATT TGGTACAGCG CAGTAACCGG1921 CAAAATCGCG CCGAAGGATG TCGCTGCCGA CTGGGCAATG1961 GAGCGCCTGC CGGCCCAGTA TCAGCCCGTC ATACTTGAAG2001 CTAGACAGGC TTATCTTGGA CAAGAAGAAG ATCGCTTGGC2041 CTCGCGCGCA GATCAGTTGG AAGAATTTGT CCACTACGTG2081 AAAGGCGAGA TCACCAAGGT AGTCGGCAAA TAATGTCTAA2121 CAATTCGTTC AAGCCGACGC CGCTTCGCGG CGCGGCTTAA2161 CTCAAGCGTT AGATGCACTA AGCACATAAT TGCTCACAGC2201 CAAACTATCA GGTCAAGTCT GCTTTTATTA TTTTTAAGCG2241 TGCATAATAA GCCCTACACA AATTGGGAGA TATATCATGA2281 AAGGCTGGCT TTTTCTTGTT ATCGCAATAG TTGGCGAAGT2321 AATCGCAACA TCCGCATTAA AATCTAGCGA GGGCTTTACT2361 AAGCTTGCAT GCCCCTTAGG GCAGACCTGC GTGAGGCGGG2401 TGAGAGCAAT ATTGGTATAA TTTTTCAGCA ATAAG
SEQ ID NO.2aadA1核苷酸序列。
NC_003292.IncN plasmid R46，...[gi17530571]LOCUS NC_003292792bpDNADEFINITIONIncN plasmid R46，complete sequence.
ACCESSION NC_003292 REGION36072..36863VERSION NC_003292.1 GI17530571gene 1..792/gene＝″aadA1″/db_xref＝″GeneID1263126″CDS1..792/gene＝″aadA1″/protein_id＝″NP_511224.1″/db_xref＝″GI17530626″/db_xref＝″GeneID1263126″1ATGAGGGAAG CGGTGATCGC CGAAGTATCG ACTCAACTAT CAGAGGTAGT TGGCGTCATC61GAGCGCCATC TCGAACCGAC GTTGCTGGCC GTACATTTGT ACGGCTCCGC AGTGGATGGC121GGCCTGAAGC CACACAGTGA TATTGATTTG CTGGTTACGG TGACCGTAAG GCTTGATGAA181ACAACGCGGC GAGCTTTGAT CAACGACCTT TTGGAAACGT CGGCTTCCCC TGGAGAGAGC241GAGATTCTCC GCGCTGTAGA AGTCACCATT GTTGTGCACG ACGACATCAT TCCGTGGCGT301TATCCAGCTA AGCGCGAACT GCAGTTTGGA GAATGGCAGC GCAATGACAT TCTTGCAGGT361ATCTTCGAGC CAGCCACGAT TGACATTGAT CTGGCTATCT TGCTGACAAA AGCAAGAGAA421CATAGCGTTG CCTTGGTAGG TCCAGCGGCG GAGGAACTCT TTGATCCGGT TCCTGAACAG481GATCTATTTG AGGCGCTAAA TGAAACCTTA ACGCTATGGA ACTCGCCGCC CGACTGGGCT541GGCGATGAGC GAAATGTAGT GCTTACGTTG TCCCGCATTT GGTACAGCGC AGTAACCGGC601AGAATCGCGC CGAAGGATGT CGCTGCCGAC TGGGCAATGG AGCGCCTGCC GGCCAGTATC661AGCCCAGTCA TACTTGAAGC TAGACAGGCT TATCTTGGAC AAGAAGAAGA TCGCTTGGCC721TCGCGCGCAG ATCAGTTGGA AGAATTTGTT CACTACGTGA AAGGCGAGAT CACCAAGGTA781GTCGGCAAAT AASEQ ID NO.3aadA1蛋白序列。
NP_511224. aminoglycoside (3...[gi17530626]LOCUS NP_511224 263 aaDEFINITION aminoglycoside adenylyltransferase [IncN plasmid R46].
ACCESSION NP_511224VERSIONNP_511224.1 GI17530626CDS 1..263/gene＝″aadA1″/coded_by＝″NC_003292.136072..36863″/db_xref＝″GeneID1263126″1MREAVIAEVS TQLSEVVGVI ERHLEPTLLA VHLYGSAVDG GLKPHSDIDL LVTVTVRLDE61TTRRALINDL LETSASPGES EILRAVEVTI VVHDDIIPWR YPAKRELQFG EWQRNDILAG121IFEPATIDID LAILLTKARE HSVALVGPAA EELFDPVPEQ DLFEALNETL TLWNSPPDWA181GDERNVVLTL SRIWYSAVTG RIAPKDVAAD WAMERLPASI SPVILEARQA YLGQEEDRLA241SRADQLEEFV HYVKGEITKV VGK
权利要求
1.一种增强蛋白表达的方法，其包括(a)将基因盒转移到宿主细胞中，其中所述基因盒包含SEQ IDNO.1和/或SEQ ID NO.2的多核苷酸；以及(b)在适当的生长条件下培养所述细胞，从而允许所述蛋白生产和/或累积。
2.一种重建用于生产重组蛋白的宿主细胞的方法，其包括(a)将基因盒转移到所述宿主细胞中，其中所述基因盒包含SEQID NO.1和/或SEQ ID NO.2的多核苷酸；(b)导入包含用于表达所述重组蛋白的重组基因的载体；以及(c)在适当的生长条件下培养所述宿主细胞，从而允许所述重组蛋白生产和/或累积。
3.一种增强重组蛋白生产的方法，其包括(a)将基因盒转移到宿主细胞中，其中所述基因盒包含SEQ IDNO.1和/或SEQ ID NO.2的多核苷酸；(b)将包含用于表达所述重组蛋白的重组基因的载体导入所述宿主细胞；以及(c)在适当的生长条件下培养所述细胞，从而允许所述重组蛋白生产和/或累积。
4.根据权利要求1、2或3的方法，其中所述宿主细胞是原核细胞。
5.根据权利要求1、2或3的方法，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。
6.根据权利要求1、2或3的方法，其中所述宿主细胞是BL21。
7.根据权利要求5或6的方法，其中所述基因盒被插入到所述宿主细胞的yjaG基因或galR基因中。
8.根据权利要求1、2或3的方法，其中所述宿主细胞是真核细胞。
9.根据权利要求1、2或3的方法，其中所述基因盒被插入到所述宿主细胞的基因组中。
10.根据权利要求1、2或3的方法，其中所述基因盒赋予氨基糖苷类抗生素抗性。
11.根据权利要求1、2或3的方法，其中所述基因盒赋予壮观霉素抗性。
12.根据权利要求1、2或3的方法，其中所述基因盒赋予链霉素抗性。
13.根据权利要求1、2或3的方法，其中所述基因盒以约5-约200倍增强所述蛋白的生产和/或累积。
14.根据权利要求2或3的方法，其中所述基因盒在实体上或结构上不与所述载体连接。
15.根据权利要求2或3的方法，其中所述载体为质粒、粘粒、噬菌体或病毒。
16.根据权利要求1、2或3的方法，其中所述基因盒包含与SEQID NO.1或SEQ ID NO.2具有至少95％的序列同一性的多核苷酸。
17.根据权利要求1、2或3的方法，其中所述基因盒包含与SEQID NO.1或SEQ ID NO.2具有至少90％的序列同一性的多核苷酸。
18.根据权利要求1、2或3的方法，其中所述基因盒包含编码SEQ ID NO.3的多肽的多核苷酸。
19.根据权利要求1、2或3的方法，其中所述基因盒包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽与SEQ ID NO.3具有至少90％的序列同一性。
20.一种用于增强蛋白生产的基因盒，其中所述基因盒包含SEQID NO.1和/或SEQ ID NO.2的多核苷酸。
21.根据权利要求20的方法，其中所述基因盒包含与SEQ IDNO.1或SEQ ID NO.2具有至少95％的序列同一性的多核苷酸。
22.根据权利要求20的方法，其中所述基因盒包含与SEQ IDNO.1或SEQ ID NO.2具有至少90％的序列同一性的多核苷酸。
23.根据权利要求20的方法，其中所述基因盒包含编码SEQ IDNO.3的多肽的多核苷酸。
24.根据权利要求20的方法，其中所述基因盒包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽与SEQ ID NO.3具有至少90％的序列同一性。
25.权利要求20的基因盒，其中所述盒赋予氨基糖苷类抗生素抗性。
26.权利要求20的基因盒，其中所述盒赋予壮观霉素抗性。
27.权利要求20的基因盒，其中所述盒赋予链霉素抗性。
28.权利要求20的基因盒，其中所述盒以约5-约200倍增强所述蛋白的生产和/或累积。
29.权利要求20的基因盒，其中所述盒被插入到所述宿主细胞的基因组中。
30.权利要求20的基因盒，其中所述宿主细胞是原核细胞。
31.权利要求20的基因盒，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。
32.权利要求20的基因盒，其中所述宿主细胞是BL21。
33.权利要求20的基因盒，其中所述宿主细胞是真核细胞。
34.权利要求20的基因盒，其中所述盒的执行不依赖于任何具体的载体类型、诱导系统或蛋白特性。
全文摘要
公开了用于基因表达和增强蛋白生产和/或累积的方法和组合物。本发明提供了用于增强靶基因表达和编码的蛋白或肽等的生产和/或累积的基因盒以及将其导入宿主细胞的方法。
文档编号C12N15/70GK1984995SQ200580023731
公开日2007年6月20日 申请日期2005年5月17日 优先权日2004年5月18日
发明者S·卡, S·L·阿迪亚 申请人:美国政府卫生与公众服务部