专利名称：回肠炎诊断测定的制作方法
背景技术：
发明领域本发明主要涉及用来检测抗细胞内劳森氏菌(Lawsonia intracellularis)抗体的改进的免疫测定法，以及含有细胞内劳森氏菌(L.intracellularis)脂多糖的抗原性提取物并且优选基本上由其组成的有效抗原。优选的测定法是具有极好特异性和灵敏度的间接型ELISA测定，采用这种测定法能够在疾病的临床征兆出现之前在感染的最初阶段检测动物衍生标本中低水平的抗体。
现有技术描述猪增生性肠炎(PPE)，也称为回肠炎、肠腺瘤病、出血性肠病或坏死性肠炎，是一种自然产生的疾病，它能够影响幼年(waning)到青壮年的猪。以前认为PPE是由camplyobacter样生物或回肠共生胞内菌(ileal symbiont intracellularis)造成的。最近确定其病原体是细胞内劳森氏菌，这是一种专性胞内革兰阴性菌。这种疾病会造成受感染动物的死亡损失、医疗费用增加、增重情况差以及食物转化率降低，因此具有经济重要性。
合理治疗和有效控制PPE的一个关键因素是快速准确地鉴定病原体。可通过观察肉眼损伤(gross lesion)来诊断PPE并可通过观察到特定组织病理学(hystopathological)损伤加以证实，其中可通过包括使用抗劳森氏菌(anti-Lawsonia)单克隆抗体的专门染色方法来证实胞内弯曲杆菌。理想的是，通过分离病原体作出最终的判定。然而，分离和培养细胞内劳森氏菌要求专门的细胞培养技术。
过去已经尝试过开发检测抗劳森氏菌抗体的快速测定法。目前的基于血清学的测定法如间接荧光抗体测试(IFAT)和免疫过氧化物酶测定(IPMA)证实，检测死前猪血清中的抗劳森氏菌抗体有良好的灵敏度和特异性。Knittel JP，Jordan DM，Schwartz KJ等，《对用于死前检测接触细胞内劳森氏菌的猪的聚合酶链反应和血清学方法的评价》(Evaluation of Antemorten Polymerase Chain Reaction and Serological Methods forDetection of Lawsonia intracellularis-exposed Pigs).American Journal of VeterinianResearch.59722-726(1998)。Guedes RMC，Gebhart CJ，Deen J等，《证实免疫过氧化物酶单层测定可作为猪增生性肠病的血清学测试》(Validation of anImmunopreoxidase Monolayer Assay as a Serological Test for Porcine ProliferativeEnteropathy).Journal of Veterinarian Diagnostic Investigation.14528-530(2002)，这些参考资料的教义和内容通过引用纳入本文。然而，这些测定法对于检测通常在最初接触和感染开始期间在猪血清中发现的较低浓度的抗劳森氏菌抗体都不够灵敏。此外，这些现有测定法依靠非常熟练的技术人员以准确进行测试和解释结果，例如，结果是花数小时观察显微镜、分析用UV或自然光照亮的孔、搜索被代表“阳性”样品的绿色荧光或红色荧光染色的细胞内劳森氏菌或细胞内劳森氏菌感染的细胞而主观获得的。
也已经开发了用于检测抗劳森氏菌抗体的酶联免疫测定法(ELISA)。这些之前的努力由于各种限制而无法进行足够灵敏和特异的测定，所述限制包括抗原质量差和数量少、抗体效价的可变性、感染和非感染猪之间抗体效价的重叠、缺乏有效的阳性/阴性“截止(cut-off)”值以及猪抗体和非特异性抗原组分之间的交叉反应。HolyoakePK，Cutler RS，Caple IW，Monckton RP.《用于检测猪血清中回肠共生胞内菌特异性免疫球蛋白G应答的酶联免疫吸附测定法》(Enzyme-linked Immunosorbent Assay forMeasuring Ileal Symboint intracellularis-specific Immunoglobulin G Response in Sera inPigs).Journal of Clinical Microbiology.311980-1985(1994)，其教义和内容通过引用纳入本文。
因此，本领域需要一种高度灵敏和特异的改进的抗劳森氏菌抗体测定法，该方法能够在感染早期阶段准确检测动物衍生标本中低浓度的抗体。
脂多糖(LPS)是革兰阴性菌如细胞内劳森氏菌的主要超结构(suprastructure)，它极大促成了细菌的结构完整性和保护细菌不受宿主免疫防御攻击。LPS形成了革兰阴性菌细胞壁的一部分并包含三个部分多糖侧链、核心多糖和脂质A。脂质A可能含有罕见的脂肪酸(例如，羟基肉豆蔻酸(hydroxy-mysteric acid))，而核心多糖通常含有罕见的糖(例如，KDO、酮脱氧辛酮酸(keto-deoxy octulonate)和庚酮糖)。多糖侧链被称为细菌的O-抗原。LPS起内毒素的作用，这是由于它们能结合巨噬细胞的CD 14受体、引发巨噬细胞/内皮细胞分泌促炎细胞因子的完整级联反应。
发明概述本发明克服了上述问题并提供了一种改进的检测抗细胞内劳森氏菌抗体的存在的免疫测定法，该方法具有高特异性和灵敏度，能够用于PPE的早期检测。一般来说，本发明的测定法是一种免疫测定法，其中，使动物衍生的标本接触有效量的含有至少一部分细胞内劳森氏菌脂多糖的抗原以使所述抗原和所述抗体之间形成复合物，然后检测这种抗原-抗体复合物的存在。在优选形式中，所述测定法是间接ELISA测试。
所述动物衍生的标本最优选是血清，但也可以包括初乳、关节液、唾液、组织匀浆和粪便。这些标本可按照用于测定目的的常规技术来制备。尽管本发明特别涉及检测猪的PPE，但也可在诸如猪、仓鼠、蓝狐、鸸鹋(emus)、鹿、犬、豚鼠、马、猕猴、鸵鸟、兔和大鼠等动物中检测由劳森氏菌(Lawsonia)引起的类似疾病。用本发明的方法检测的抗体通常选自IgG、IgA或IgM抗体。
用于本发明的免疫测定法的优选抗原是细胞内劳森氏菌脂多糖的一部分或提取物。这种提取物的分子量优选约为15-25kDa，更优选约为18-20kDa。其提取物或部分应具有足够的大小和抗原性，以便在给予有效量抗原之后在动物中诱导免疫应答。此外，其提取物或部分必须有足够大小以与LPS抗体形成抗体-抗原复合物。在特别优选的形式中，采用细菌内毒素测试，所述LPS抗原显示出约3-75EU/ml(更优选约10-60EU/ml，再优选约20-50EU/ml，再优选约25-40EU/ml)的内毒性(endotoxicity)。所述抗原优选主要由LPS提取物组成，用ATCC登录号PTA-4927的细胞内劳森氏菌提取物获得了良好结果。
本申请发现可使用各种类型的免疫测定法，其中包括但不限于ELISA，如竞争性或抑制性测定法，并包括直接和间接测定法，以及夹心或捕获抗体测定法。最优选的免疫测定法是间接型ELISA，它包括首先用LPS包被微量滴定板孔，然后室温孵育过夜。然后加入封闭剂并再在4℃孵育过夜。然后加入选择的稀释检测抗体，在37℃孵育1小时，然后加入稀释的偶联物(conjugate)再孵育1小时(37℃)。然后加入TMB发色剂并室温孵育5分钟。此时加入2M硫酸终止反应并在450nm阅读平板。
在ATCC登录号PTA-4927的起始LPS提取物样品的内毒素水平约为34.75EU/ml的情况下，优选的ELISA测试最好。在该例子中，抗原的稀释度应为约1∶250至1∶8000，更优选约1∶400至1∶6000，再优选约1∶500至1∶4000，再优选约1∶600至1∶3000，再优选约1∶750至1∶2000，再优选约1∶900至1∶1500，最佳为1∶1,000。检测抗体的稀释水平应约为1∶20-1∶320、1∶25-1∶240、1∶30-1∶128、1∶35-1∶60，最佳为1∶40。ELISA偶联物的应用水平约为1∶250-1∶2000、1∶300-1∶1500、1∶350-1∶1000、1∶400-1∶600，优选1∶500。当然，如果起始抗原具有不同于本发明优选产品的内毒素水平，可方便地计算合适的稀释水平。
本发明还可将重组LPS抗原用作抗原来源。此时，所述LPS抗原或其部分将采用常规的重组技术产生。例如，可将编码该LPS抗原或其所需部分的DNA插入表达载体并操作性连接于表达控制序列，然后该表达控制序列可使表达载体表达所需LPS抗原或其部分。然后回收表达的抗原并按照本发明使用。当然，精通本领域的技术人员熟悉产生和回收本发明的重组抗原的各种方法。在所有情况中，本发明的重组抗原将优选结合细胞内劳森氏菌抗体或与其杂交。
优选实施方案的描述以下实施例列出了构建劳森氏菌LPS和将其用作免疫测定抗原来源的目前优选的技术。这种实施例包括针对劳森氏菌抗体的间接型ELISA免疫测定。然而还应理解，这种实施例仅以说明方式提供，不能理解为是要限制本发明的总范围。
实施例I基于LPS的间接ELISA测定的开发和证实细菌抗原的制备细菌分离物被鉴定为多次传代的(从来自感染内脏的最初分离物传代20次以上)细胞内劳森氏菌分离物#15540(ATTC登录号PTA-4927)。这种分离物获自被急性出血性增生性肠病(HPE)感染的丹麦母猪(Danish soW)，感染可通过常规的组织学和免疫组织化学(IHC)染色技术证实，并用之前描述过的方法共培养以获得细胞内劳森氏菌的纯培养物。Lawson GHK，McOrist S，Jasni等，《猪增生性肠病的胞内菌体外培养和维持》(Intracellular Bacteria of Porcine Proliferative EnteropathyCultivation andMaintenance in Vitro).Journal ofClinical Microbiology.311136-1142(1993)，其教义和内容通过引用纳入本文。在生物反应器(Applicon，Inc.，Foster City，CA)中用新鲜的McCoy细胞(ATCC #1696)悬液繁殖多批每批30升的细胞内劳森氏菌#15540。使活性培养物达到80-100％细胞侵染性，然后用装有JA-10转头的Avanti Beckman J-20I离心机(Beckman Instruments，Inc.，Fullerton，CA)在4℃以17,000xg离心15分钟收获。弃去各批次的上清液，将含有细胞外的细胞内劳森氏菌和被细胞内劳森氏菌感染的McCoy细胞的细胞团重悬于30ml无菌1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)，并储存于-80℃。
为从McCoy细胞纯化细胞内劳森氏菌，按照之前描述过但略经修改的方法制备不连续的percoll梯度。Holyoake PK，Cutler RS，Caple IW，Monckton RP.《用于检测猪血清中回肠共生胞内菌特异性免疫球蛋白G应答的酶联免疫吸附测定法》Journal of Clinical Microbiology.311980-1985(1994)，其教义和内容通过引用纳入本文。简言之，将225ml percoll(Amersham Biosciences，Pharmacia Biotech，乌普萨拉，瑞典)与260ml试剂级(RG)水和15ml 5M氯化钠(NaCl，Fisher牌)混合。使上面提到的收获的培养物通过25号针20次以上，并将5ml细菌/McCoy细胞匀浆转移到置于30ml聚碳酸酯离心管内的25ml percoll梯度中。将管翻转以混合并在4℃以37,000xg离心1小时。离心管的上半部分为含有分散的细胞碎片的悬浮液，而在浮力密度为1.075g/ml的地方出现了明显的细胞条带。除去梯度的上半部分，用5ml聚丙烯移液管小心收集条带并将条带转移到新的含有20ml无菌PBS的30ml离心管中。将离心管在4℃以37,000xg离心(Avanti Beckman J-20I，JA-17转头)15分钟，该过程最多重复3次以洗净各样品中的percoll。最后一次离心步骤之后，将团块重悬于1-2ml无菌PBS，汇合，等分到1.8ml的冻存管(Nalgene，Nalgene Nunc Int’l.，Rochester，NY)并储存于-80℃。在暗视野显微镜下观察含有高度浓缩的、percoll纯化的细胞内劳森氏菌#15540的重悬样品以证实存在微小的弯曲杆菌而不存在完整McCoy细胞。采用之前描述过但略经修改的方法用热的酚水溶液(aqueous phenol)提取percoll纯化的细胞内劳森氏菌#15540抗原的LPS抗原性组分。Westphal，O.和Luderitz，O.Chemische Erforschung von Lipopolysacchariden Gramnegativer Bacterien.Angew.Chemical 66407-17(1954)，其内容和教义通过引用纳入本文。简言之，将18ml percoll纯化的细胞内劳森氏菌和3.75ml酚氯仿(Ameresco，Solon，OH)，pH 8.0在65℃的水浴中分别孵育10分钟。最初的孵育期之后将4.5ml percoll纯化的细胞内劳森氏菌转移到含有4.5ml 90％(v/v)热的酚氯仿水悬液(aqueous phenol suspension chloroform)的各个试管中并通过翻转轻轻混合。将试管在65℃的水浴中再孵育25分钟，在孵育期间每5分钟翻转混合一次，然后在4℃冷却过夜。冷藏储存期间在各管中水相和固相发生轻微分层。各管在4℃以7,700xg离心(Avanti Beckman J-20I，JA-17转子)25分钟，收集来自所有4个试管的含有LPS的上清液并保留，弃去细胞团。将上清液转移到预先灭菌的透析管(Spectrum Laboratories，Inc.，Rancho Domingo，CA)中，将透析管放在4L的塑料烧杯中并用冷的试剂级(反渗透)水透析24-48小时以除去样品中的酚氯仿。每2-4小时用新鲜水更换新的试剂级水直到洗涤步骤完成。小心收集所得纯化的细胞内劳森氏菌LPS提取物并储存于-80℃待用。
在MOPS电泳缓冲液(NuPAGE，Invitrogen)中通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)用4-12％的Bis-Tris预制凝胶(NuPAGE，Invitrogen，Carlsbad，CA)分离以通过目测确认LPS提取物。将LPS提取物与percoll纯化的全细胞细胞内劳森氏菌和未感染的全细胞McCoy细胞进行比较。按1∶2稀释入4X十二烷基硫酸锂(LDS)变性缓冲液(NuPAGE，Invitrogen)并在85℃的水浴中孵育10分钟以制备SDS-PAGE样品。按照Bio-Rad Silver Stain的说明书(略经修改)用高碘酸银染色凝胶。简言之，首先用40％甲醇(MeOH，Fisher牌，Hanover Park，IL)/10％乙酸(Fisher牌)(v/v)第一次固定凝胶20-30分钟，然后在含有0.7％高碘酸的40％MeOH/10％乙酸(v/v)中室温再孵育5分钟。第二次固定时将凝胶转移到10％乙醇(EtOH)/5％乙酸(v/v)中5分钟，然后用氧化剂(Bio-Rad，Hercules，CA)氧化5分钟，之后用去离子水洗涤直到凝胶的黄色消失。在0.16mM的二硫苏糖醇(DTT)水溶液中孵育凝胶5分钟然后用银试剂(Bio-Rad)室温染色20分钟。凝胶用去离子水洗涤一次(20-40秒)并放在显影剂(Bio-Rad)中直到出现所需强度的条带。在5％(v/v)乙酸中室温放置20分钟以终止反应，并用去离子水洗涤一次。用10-220kDa的蛋白质标准(BenchMark，Invitrogen)以分子量鉴定蛋白质。
基于LPS的间接ELISA用基于细胞内劳森氏菌LPS的间接酶联免疫吸附测定(LPS-ELISA)检测测试样品中的抗劳森氏菌免疫球蛋白G(IgG)抗体。用以1∶1000稀释入0.05M碳酸钠包被缓冲液(pH 9.6)的细胞内劳森氏菌LPS以100μl/孔包被Immulon 2HB板(Dynex，Chantilly，VA)，用聚酯薄膜平板密封器(Thermo Labsystems，Franklin，MA)密封并于室温孵育24小时。各板用Ultrawash PLUS(Dynex)洗涤，350ml/孔，无需浸泡，用含有0.05％Tween 20(Fisher牌)、0.137M NaCl(Fisher牌)、0.005M氯化钾(KCl，Sigma，St.Louis，MO)、0.009M磷酸氢二钠(Na2HPO4，Sigma)、0.001M磷酸钾(KH2PO4，Sigma)，pH7.2-7.4的洗涤缓冲液的RG水溶液洗涤1轮。用在SeaBlockTM(Pierce Biotech，Rockford，IL，含有虹鳟鲑鱼(steelhead salmon)血清和0.1％氧化钠的PBS溶液)中含有5％(v/v)脱脂奶粉(Bio-Rad)的封闭缓冲液以300ml/孔在4℃封闭抗原包被的平板24小时以防止测试血清非特异性结合于平板。然后如上所述洗涤各板3次。用封闭缓冲液以1∶40预先稀释测试血清和对照。
将稀释的血清以每孔50微升一式两份转移到各平板，密封并在37℃孵育1小时。将洗涤步骤重复3轮，然后以50μl/孔加入用封闭缓冲液1∶500稀释的羊抗猪IgG辣根过氧化物酶(HRP)偶联物(Kirkegaard and Perry Laboratories，Inc.，Gaithersburg，MD)。密封平板并在37℃孵育1小时。洗涤步骤重复3轮以上，然后在各板加入50μl/孔由双组分(2-component)3，3’，5，5’四甲基联苯胺(TMB，KPL)构成的过氧化物酶底物并于室温孵育5分钟。这样做是为了观察各测试样品内抗原-抗体复合物的存在。每孔加入50μl 2M硫酸(H2SO4，Fisher牌)溶液终止生色反应。在V-max 96孔微板阅读器(Medtechs，Inc.，Chapel Hill，NC)上以450nm波长阅读平板以获得各测试样品的光密度(OD)值。各平板包括含有针对细胞内劳森氏菌LPS提取物的高阳性到低阳性抗体(用封闭缓冲液连续2倍稀释高阳性样品得到)以及阴性抗体的标准对照。如果在对标准OD值的线性回归分析中决定系数(r2-值)为30.9，则认为该测试平板有效。不含测试样品或对照样品的空孔被作为所有测试的空白对照。
LPS-ELISA的验证从以下研究获得猪血清以便用于验证用来检测猪中抗劳森氏菌IgG抗体的LPS-ELISA。(i)通过肌肉内注射用1∶2的细胞内劳森氏菌LPS提取物和弗氏不完全佐剂(Sigma)配制的2ml制剂，使两只约3周龄的猪超免。对一只约3周龄的猪肌内注射用1∶2的Dulbecco极限必需培养基(DMEM)和5％(v/v)牛血清(JRH Biosciences，Lenexa，KS)组成的安慰剂与弗氏不完全佐剂配制的2ml制剂。初免后，在第3周和第6周用各接种物加强免疫以产生阳性(有细胞内劳森氏菌LPS的抗体)和阴性(无细胞内劳森氏菌抗体)对照测试血清。在接种前、接种后的第3周和第6周收集各猪的4-6毫升血清，通过间接荧光抗体血清学测试(IFAT)检测细胞内劳森氏菌全细胞抗原的反应，以证实血清样品中存在或不存在抗劳森氏菌抗体，可参见Knittel JP，JordanDM，Schwartz JK等，《对用于死前检测接触细胞内劳森氏菌的猪的聚合酶链反应和血清学方法的评价》American Journal of Veterinarian Research.59722-726(1998)，其教义和内容通过引用纳入本文。初次接种8周后，对动物实施安乐死并收集最终的血清。收集各猪的阳性对照血清，通过IFAT检测以证实对细胞内劳森氏菌的阳性反应，抗劳森氏菌LPS的阳性和阴性对照血清都以1ml等分储存于-80℃。
对来自之前进行的2次疫苗功效研究的猪血清进行测试以研究抗劳森氏菌LPS抗体阳性/阴性光密度截止限，参见Kroll，J.等，(2004).《口服细胞内劳森氏菌无毒活疫苗之后评价猪的保护性免疫》(Evaluation of protective immunity in pigs followingoral administration of an avirulent live vaccine of L.intracellularis).AJVR 65(5)559-565，其教义和内容通过应用纳入本文。用毒性异源性细胞内劳森氏菌分离物N101494(Boehringer Ingelheim Vetmedica，Inc.，St.Joseph，MO)实验性感染之后，产生了之前被证实为抗劳森氏菌抗体IFAT-阳性的80只6-9周龄的猪的测试血清。从80只3-9周龄在各临床研究期间的任何时刻都未接受疫苗接种或刺激的旧标准(oldstrict)对照猪收集到之前被证实为IFAT-阴性的测试血清。
接种细胞内劳森氏菌减毒活疫苗EnterisolIleitis(Boehringer IngelheimVetmedica，Inc.)之后、用毒性异源性细胞内劳森氏菌分离物N101494刺激之后、或者进行这两者之后收集25只猪的175份血清样品。从在整个研究中未接受疫苗接种或刺激且保持抗劳森氏菌抗体的IFAT阴性的10只标准对照猪收集另外70份血清样品。研究设计包括35只3-4周龄的猪，将它们随机分成3个治疗组。在研究的第0天，组1的15只接受2ml口服剂量的疫苗，而组2和3(10只猪/组)接受等剂量的安慰剂，安慰剂由悬浮在生长培养基中的未感染McCoy细胞组成。在第21天，胃内给予组1和2的猪细胞内劳森氏菌N101494的毒性异源性纯培养物进行刺激。在第42天，对猪进行尸体解剖并评价损伤发展以鉴定接种疫苗的猪相比未接种疫苗的猪在刺激后的表现。从第0-42天每周收集粪便样品和血清供常规诊断测试，以便检测由于施用疫苗或刺激而造成的细胞内劳森氏菌的接触率(rate of exposure)和主动排泄率(active shedding)。在第42天只通过下述肉眼检查、组织学和IHC法评价损伤以证实存在PE。
证实猪的PE按照粘膜厚度标准(1＝正常，2＝轻微增厚，3＝中度增厚/炎症，4＝严重增厚/炎症/可能存在粘膜出血或坏死)对上述临床研究中的猪回肠和结肠中发现的肉眼损伤进行评分。Kroll，J.等，(2004).《口服细胞内劳森氏菌无毒活疫苗之后评价猪的保护性免疫》(Evaluation of protective immunity in pigs following oral administration of anavirulent live vaccine of Lawsonia intracellularis).AJVR 65(5)559-565。死后(postmortem)收集长度为2-4cm的回肠和结肠样品，浸入福尔马林缓冲液固定并对其进行加工以便检测显微损伤。其中包括苏木精和曙红(H&E)以及细胞内劳森氏菌特异性单克隆抗体的IHC染色。Kroll，J等，AJVR，(2004)。后者被认为是猪实际感染细胞内劳森氏菌的状态的目前评价标准。Kroll，J.等，(2004)。按照细胞内劳森氏菌特异性细胞增殖的严重性(0＝正常，1＝轻微/病灶，2＝中度/扩散，3＝严重/扩散)对IHC染色组织中发现的显微损伤分别评分。计算肉眼和显微损伤的平均评分以及受影响组织中检测到的损伤发生频率，以进行组间比较。在之前的研究中，肉眼和显微损伤的平均评分被认为是判断疫苗对抗毒性异源性刺激的功效的主要参数。Kroll，J.等，(2004)。
实施例II优选的LPS-ELISA材料和方法下面列出了根据本发明目前优选的LPS-ELISA测定法。
A.方案1.材料a.LPS结合平板·Immunlon 2 HB 96孔板，Dynex目录号3455或等价物。
b.稀释平板·Falcon Pro-Bind试验平板(Fisher Scientific，Pittsburg，PA)，96孔，U形底，无盖(聚苯乙烯，非无菌)，Becton Dickinson(San Diego，CA)目录号353910或等价物。
c.平板密封器·Mylar平板密封器，Thermo Labsystems(Franklin，MA)目录号5701或等价物。
d.包被缓冲液·0.05M碳酸钠缓冲液·10.6g Na2CO3Sigma目录号S6139或等价物。
·用试剂级(RG)H2O(或等价物)补足至1.0L。
·pH＝9.6±0.1。
·储存于2-7℃待用。
·失效7天。
e.洗涤液·0.05％Tween 20、0.137M NaCl、0.005M KCl、0.009M Na2HPO4、0.001MKH2PO4
·32.0g NaCl。
·0.8g KCl。
·2.44g Na2HPO4。
·0.8g KH2PO4。
·用RG H2O或等价物补足至4.0L。
·用NaOH或HCl将pH调至7.2-7.4。
·2.0ml Tween，Fisher目录号BP337-100或等价物。
·储存于室温(25±5℃)待用。
·失效1周。
f.封闭液·含有5％脱脂奶粉的SeablockTM。
·25.0g脱脂奶粉。Bio-Rad目录号170-6404或等价物。
·用SeablockTM(Pierce Biotech目录号37527或等价物)补足至500mL。
·储存于2-7℃待用。
·失效1个月。
g.抗原·细胞内劳森氏菌脂多糖完整分子的1∶1000稀释液。
·在40ml包被缓冲液中加入40μl细胞内劳森氏菌LPS。
·立即使用。
h.检测抗体·康复期猪的细胞内劳森氏菌血清抗体的1∶40稀释液。
·在120μl封闭液中加入3μl猪血清或等价物。
·储存于2-7℃待用。
·失效24小时。
i.偶联抗体·山羊抗小鼠IgG(H+L)-辣根过氧化物酶(HRP)的1∶500稀释液。Kierkegaardand Perry Laboratories，Inc.目录号14-14-06或其等价物。
·在20ml封闭液中加入40μl偶联物。
·储存于2-7℃待用。
·失效24小时。
j.底物·双组分微孔过氧化物酶底物(Gaithersburg，MD)，KPL目录号50-76-00或等价物。
·临用前将TMB过氧化物酶底物(试剂A)与过氧化物酶溶液B(试剂B)等体积混合。
·所需体积＝5mL/板。因此，每块测试平板需要2.5mL试剂A+2.5mL试剂B。
·储存于2-7℃待用。
·失效预混合的试剂遵照制造商建议的有效期。立即使用混合的底物溶液。
k.终止液·2MH2SO4。
·在通风橱中小心混合444.4ml RG H2O。
·55.6ml 18M H2SO4Fisher目录号A300c-212，或等价物。
·储存于室温待用。
·失效6个月。
l.阳性对照·含抗-劳森氏菌LPS IgG抗体的超免猪血清的1∶2564稀释液。
·在10ml封闭液中加入3.9μl阳性对照(批号#090203)。
·储存于2-7℃待用。
·失效24小时。
m.阴性对照·不含抗细胞内劳森氏菌LPS分子抗体的超免猪血清的1∶2564稀释液。
·在10ml封闭液中加入3.9μl阳性对照(批号#090203)。
·储存于2-7℃待用。
·失效24小时。
2.方法a.样品一式两份进行实验。所需平板数＝样品总数/每板40个样品。向上取整到整数。第11和12列将含有1∶10连续稀释的阴性和阳性对照血清。
b.将细胞内劳森氏菌LPS抗原以1∶1000或适当工作稀释度稀释入包被缓冲液中。所需体积＝平板数×10ml/板。
c.在各板的每个孔中加入100ml稀释的抗原。
d.用平板密封器密封平板并在室温孵育过夜(14-24小时)。
e.用Dynex Ultrawash PLUS洗涤液洗涤平板，350ml/孔，无需浸泡，洗涤1轮。在纸巾上拍干平板。
f.在所有孔中加入300ml封闭液。密封平板并在2-7℃孵育过夜(14-24小时)。
g.用Dynex Ultrawash PLUS洗涤液洗涤平板，350μl/孔，无需浸泡，洗涤3轮。在纸巾上拍干平板。
h.在U形底稀释平板第1-10列的所有孔和第11和12列的孔B-H中加入120μl封闭液样品。
i.在第11和12列A排的孔中分别加入240μl阴性和阳性对照。
j.用50-300μl的多通道移液器将孔A-11和A-12中的120μl稀释对照转移到孔B-11和B-12中以产生各对照血清的10倍稀释液，注意不要将稀释的阴性对照转移到第11列最后一个孔中(孔H-11)，该孔中的样品将作为平板空白孔。
k.将3μl样品转移到稀释平板各孔内的120μl封闭液中以便将检测抗体(康复期猪血清)1∶10稀释入封闭液。每次在孔A-1、B-1、C-1等中加入不同样品进行稀释。
1.用50-300μl的多通道移液器上下吹打至少3次以混合第1列的内容物，并将50μl/孔转移到抗原包被的LPS结合测试平板的第1和2列。更换吸头并重复该步骤直到所有稀释的样品都已一式两份转移到该平板中。
m.将50μl/孔阴性对照(第11列的孔A-H)转移到测试平板相应的孔中。对阳性对照重复该步骤。各对照含有足以用于2块测试平板的稀释样品。
n.用平板密封器密封测试平板并在37℃±2.0℃孵育1.0小时±15分钟。
o.用Dynex Ultrawash PLUS洗涤液洗涤平板，350μl/孔，无需浸泡，洗涤3轮。在纸巾上拍干平板。
p.在测试平板的所有孔中加入50μl以1∶500或适当工作稀释度稀释的偶联抗体。所需体积＝平板数×5ml/板。
q.用平板密封器密封测试平板并在37℃±2.0℃孵育1.0小时±15分钟。
r.用Dynex Ultrawash PLUS洗涤液洗涤平板，350μl/孔，无需浸泡，洗涤3轮。在纸巾上拍干平板。
s.在测试平板的所有孔中加入50μl底物，并室温孵育5分钟±1分钟。
t.加入底物5分钟后在所有孔中加入50μl终止液以终止反应。
u.在装备有450nm波长滤镜的平板阅读器上读板。
3.结果解释a.在450nm处光密度＞0.200的测试样品被认为是抗-劳森氏菌LPS IgG抗体阳性。
b.在450nm处光密度＜0.200的测试样品被认为是抗-劳森氏菌LPS IgG抗体阴性。
权利要求
1.一种检测动物衍生标本中抗细胞内劳森氏菌(Lawsonia intracellularis)抗体的存在的免疫测定法，所述方法包括以下步骤使所述标本接触有效量的含有至少一部分细胞内劳森氏菌脂多糖的抗原，以使所述抗原和所述抗体之间形成复合物，以及检测所述复合物的存在。
2.如权利要求1所述的免疫测定法，其特征在于，所述标本选自动物衍生的血清、初乳、关节液、唾液、组织匀浆或粪便。
3.如权利要求1所述的免疫测定法，其特征在于，所述动物选自猪、仓鼠、蓝狐、鸸鹋、鹿、犬、豚鼠、马、猕猴、鸵鸟、兔或大鼠。
4.如权利要求1所述的免疫测定法，其特征在于，所述抗体选自IgG、IgA或IgM抗体。
5.如权利要求1所述的免疫测定法，其特征在于，所述免疫测定是ELISA测试。
6.如权利要求5所述的免疫测定法，其特征在于，所述抗原是重组产生的。
7.如权利要求5所述的免疫测定法，其特征在于，所述ELISA测试包括以下步骤将所述抗原固定在表面上，使所述标本接触所述固定的抗原，以使所述标本中的抗体和所述抗原之间形成复合物，以及检测所述复合物。
8.如权利要求1所述的免疫测定法，其特征在于，所述脂多糖的分子量约为15-25kDa。
9.如权利要求8所述的免疫测定法，其特征在于，所述分子量约为18-20kDa。
10.如权利要求1所述的免疫测定法，其特征在于，给予动物有效量的抗原之后所述抗原能够在所述动物内诱导免疫应答。
11.如权利要求1所述的免疫测定法，其特征在于，采用细菌内毒素测试时，所述抗原显示出约3-75EU/ml的内毒性。
12.如权利要求11所述的免疫测定法，其特征在于，所述内毒性约为25-40EU/ml。
13.如权利要求1所述的免疫测定法，其特征在于，所述抗原含有ATCC登录号PTA-4927的脂多糖提取物。
14.一种检测抗细胞内劳森氏菌(Lawsonia intracellularis)抗体的存在的抗原，所述抗原含有至少一部分分离的细胞内劳森氏菌脂多糖。
15.如权利要求14所述的抗原，其特征在于，所述脂多糖的分子量约为15-25kDa。
16.如权利要求15所述的抗原，其特征在于，所述分子量约为18-20kDa。
17.如权利要求15所述的抗原，其特征在于，给予动物有效量的抗原之后所述抗原能够在所述动物内诱导免疫应答。
18.如权利要求15所述的抗原，其特征在于，采用细菌内毒素测试时，所述抗原显示出约3-75EU/ml的内毒性。
19.如权利要求15所述的抗原，其特征在于，所述脂多糖是重组产生的。
20.如权利要求18所述的抗原，其特征在于，所述内毒性约为25-40EU/ml。
21.如权利要求14所述的抗原，其特征在于，所述抗原含有ATCC登录号PTA-4927的脂多糖提取物。
22.一种检测动物衍生标本中抗细胞内劳森氏菌(Lawsonia intracellularis)抗体的存在的酶联免疫测定法，其改进之处包括在所述免疫测定中使用细胞内劳森氏菌的脂多糖作为抗原。
23.如权利要求22所述的免疫测定法，其特征在于，所述标本选自动物衍生的血清、初乳、关节液、唾液、组织匀浆或粪便。
24.如权利要求22所述的免疫测定法，其特征在于，所述动物选自猪、仓鼠、蓝狐、鸸鹋、鹿、犬、豚鼠、马、猕猴、鸵鸟、兔或大鼠。
25.如权利要求22所述的免疫测定法，其特征在于，所述抗体选自IgG、IgA或IgM抗体。
26.如权利要求22所述的免疫测定法，其特征在于，所述ELISA测试是间接ELISA测试。
27.如权利要求26所述的免疫测定法，其特征在于，所述ELISA测试包括以下步骤将所述抗原固定在表面上，使所述标本接触所述固定的抗原，以使所述标本中的抗体和所述抗原之间形成复合物，以及检测所述复合物。
28.如权利要求22所述的免疫测定法，其特征在于，所述脂多糖的分子量约为15-25kDa。
29.如权利要求28所述的免疫测定法，其特征在于，所述分子量约为18-20kDa。
30.如权利要求22所述的免疫测定法，其特征在于，给予动物有效量的抗原之后所述抗原能够在所述动物内诱导免疫应答。
31.如权利要求22所述的免疫测定法，其特征在于，采用细菌内毒素测试时，所述抗原显示出约3-75EU/ml的内毒性。
32.如权利要求31所述的免疫测定法，所述内毒性约为25-40EU/ml。
33.如权利要求22所述的免疫测定法，其特征在于，所述抗原含有ATCC登录号PTA-4927的脂多糖提取物。
全文摘要
本发明提供了保护抗细胞内劳森氏菌抗体的改进的免疫测定法，该方法能够快速、方便地检测动物衍生标本中低浓度的抗劳森氏菌抗体。优选的测定法是采用细胞内劳森氏菌脂多糖的抗原性提取物的ELISA测定。
文档编号C12P19/00GK101065666SQ200580032313
公开日2007年10月31日 申请日期2005年8月10日 优先权日2004年8月13日
发明者J·J·克罗尔, M·B·鲁夫, M·A·艾希梅厄 申请人:勃林格殷格翰动物保健有限公司