植物木质素含量的调控的制作方法

专利名称：：植物木质素含量的调控的制作方法
技术领域：
：本发明涉及通过操控木质素生物合成途径来进行基因修饰的植物(尤其是树木)，且更具体而言，本发明涉及通过下调4CL、C3H、CCR、C4H、Cald5H、SAD或CCoAOMT来进行基因修饰的植物以实现改变木质素含量。
背景技术：
：木质素(一种复杂的酚类聚合物)是次生木质部细胞壁中的主要组份。一般而言，木质素占木头(wood)干重的25%，此使其成为地球上继纤维素之后第二丰富的有机化合物。尽管木质素有利于维持茎的强度和刚度并可保护微原纤维免受物理、化学和生物攻击，但其会妨碍将木头转化成纸的过程。为了释放用于造纸用的木纤维，必须自经过加工的木屑中去除大部分木质素。自木纤维中提取木质素是一个艰难且昂贵的过程，涉及有害的化学品并产生毒性废物。因此，从业人员已经在寻找更成本有效且对环境更友好的减少木制品中木质素含量的方法。一个替代方案涉及对木质素生物合成途径进行基因修饰。例如，Chiang等人己经试图通过对植物的木质素单体生物合成途径进行基因修饰来减少植物中的木质素含量。参见W002/20717。所述方法涉及用来自苯基丙烷途径的多个基因转化植物、在木质素单体生物合成途径中纳入关键木质素控制位点，例如酶4-香豆酸酯-CoA连接酶(4CL)、松柏醛5-羟化酶(Cald5H)、S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)依赖型5-羟基松柏醛、O-甲基转移酶(AldOMT)、松柏醇脱氢酶(CAD)和关键醇脱氢酶(sinewyalcoholdehydrogenase,SAD)。同时，人们已经试图通过将这些基因的拷贝单独地导入植物基因组中来减少木质素含量。参见(例如)WO00/58489(Scald);WO99/24561(4CL)。从业人员还在反义策略中运用这些基因来调节木质素生物合成。参见(例如)WO99/24561。尽管这些方法中的某些方法已成功地下调了木质素合成，但木质素的下调可能会对植物表现型不利。Anterola等人，P/i;ytoc/iem!'^7,61:221-294(2002)。因此，需要用于调节木质素表达的改进方法。一种在mRNA水平使基因表达沉默的最新方法已经作为先前技术的有效替代方案出现。RNA干扰现象(RNAi)是一个通过导入可导致基因以序列特异性方式沉默的双链RNA(dsRNA)来引发的转录后过程。继首先在线虫(C.e/egaw)中发现RNA干扰现象(Fire等人，脂騰'391:806-811(1998)和美国专利第6,506,559号)之后，人们发现了许多其中导入dsRNA可诱导序列特异性沉默效应的生物体实例。例如，据报导，RNAi天然存在于各种生物体(如线虫、锥体虫、植物、真菌和动物)中。实际上，RNAi最有可能用于保护生物体免受病毒侵袭，调节转座子活性和消除异常转录产物。对果蝇黑腹果蝇(Drw叩MameZ朋ogay敏)的研究表明RNAi为两步作用机制(Elbashir等人，Ge廳Z)ev.，15(2):188-200(2001))。首先，借助称作切酶(Dicer)的酶将长的dsRNA切成21-23个核糖核苷酸(nt)片段，称为小干扰RNA(siRNAs)。然后，siRNA与核糖核酸酶复合体(对于RNA诱导的沉默复合体称为RISC)结合，此使这个复合体耙向互补mRNA。RISC随后切割与互补siRNA相对的靶向mRNA，此使得所述mRNA对其它RNA降解途径敏感。RNAi可为控制木质素合成的先前方法提供替代方案。然而，在实现该可能性之前，必须研发可在木质素合成过程中引发RNAi过程的DNA构建体。
发明内容在一个实施例中，提供用于调节木质素相关基因的表达的DNA构建体。在另一实施例中，提供调节植物中木质素表达的方法。另外，还产生包含用于调节木质素相关基因的表达的DNA构建体的重组植物。在一个实施例中，DNA构建体包含以可操作方式连接到第一段DNA片段的启动子，所述第一段DNA片段对应于木质素单体生物合成途径中的基因的至少一部分；间隔区DNA片段；和与所述第一段DNA片段互补的第二段DNA片段，其中所述第一段和第二段DNA片段在所述DNA构建体中分别沿5'至3'方向排列。在某些实施例中，木质素单体生物合成途径中的基因选自由4CL、C3H、CCR、C4H、Cald5H、SAD或CCoAOMT组成的群组。在另一实施例中，DNA构建体包含以可操作方式连接到第一段DNA片段的启动子，所述第一段DNA片段对应于4-香豆酸酯辅酶A连接酶(4CL)基因的至少一部分；间隔区DNA片段；和与所述第一段DNA片段互补的第二段DNA片段，其中所述第一段和第二段DNA片段在所述DNA构建体中分别沿5'至3'方向排列。本发明还提供包括使用这些构建体来调节、抑制和/或减少植物中木质素的表达的方法。在又一实施例中，一种抑制植物细胞中木质素表达的方法包括将沿5'至3'方向包括下列各部分的构建体整合于所述植物细胞的基因组中启动子、对应于4CL基因的至少一部分的第一段DNA片段、间隔区DNA片段和与所述第一段DNA片段互补的第二段DNA片段；及使所述植物细胞生长。本发明还提供通过这些方法产生的植物和植物细胞，以及源自所述植物和植物细胞的纸和木制品。本发明还提供源自这些转基因植物的纸浆和纸浆制品。另一方面，本发明提供源自这些转基因植物的实木制品。木制品包括(例如)木料、木材和复合材料。在再一实施例中，产生沿5'至3'方向包含下列各部分的植物细胞启动子、对应于4CL基因的至少一部分的第一段DNA片段、间隔区DNA片段和与所述第一段DNA片段互补的第二段DNA片段。以可操作方式连接到第一段DNA片段的启动子对于植物细胞基因组而言可以是内源的或外源的。在其它实施例中，产生其中所述第一段DNA片段对应于C3H、C4H、CCR或CCoAOMT基因的至少一部分的植物细胞。在植物中，LIM蛋白质己显示可控制木质素生物合成途径中的许多对于研发木头十分重要的基因(KawaokaA，EbinumaH2001TranscriptionalcontrolofligninbiosynthesisbytobaccoLIMprotein.P/jytoc/iem^^y57:1149-1157,Kawaoka等人，fVa/^/22:289-301(2000))。因此，在再一实施例中，产生沿5'至3'方向包含下列各部分的植物细胞启动子、对应于LIM基因的至少一部分的第一段DNA片段、间隔区DNA片段及与所述第一段DNA片段互补的第二段DNA片段。在另一实施例中，一种制造木头的方法包括将沿5'至3'方向包含下列各部分的DNA构建体整合于植物细胞的基因组中启动子、对应于木质素单体生物合成途径中的基因的至少一部分的第一段DNA片段、间隔区DNA片段和与所述第一段DNA片段互补的第二段DNA片段；使所述植物细胞生长及获得所述木头。另一方面，一种制造木浆的方法包括将沿5'至3'方向包含下列各部分的DNA构建体整合于植物细胞的基因组中启动子、对应于木质素单体生物合成途径中的基因的至少一部分的第一段DNA片段、间隔区DNA片段和与所述第一段DNA片段互补的第二段DNA片段；使所述植物细胞生长及获得所述木浆。在另一实施例中，一种造纸方法包括将沿5'至3'方向包含下列各部分的DNA构建体整合于植物细胞的基因组中启动子、对应于木质素单体生物合成途径中的基因的至少一部分的第一段DNA片段、间隔区DNA片段和与所述第一段DNA片段互补的第二段DNA片段；使所述植物细胞生长及获得所述纸。另一方面，一种DNA构建体包含以可操作方式连接到第一段DNA片段的启动子，所述第一段DNA片段对应于木质素单体生物合成途径中的基因的至少一部分；间隔区DNA片段；和与所述第一段DNA片段互补的第二段DNA片段，其中所述第一段和第二段DNA片段在所述DNA构建体中分别沿5'至3'方向排列且木质素单体生物合成途径中的所述基因是4CL基因且其中所述DNA构建体选自由pARB1202、pARB675和pARB599组成的群组。在另一实施例中，一种DNA构建体包含以可操作方式连接到对应于4CL基因的至少一部分的DNA片段上的启动子以便沿在反义方向生成所述DNA片段的转录本，其中所述DNA构建体为pARB1201、pARB598、pARB411和pARB412。在另一实施例中，一种DNA构建体包含以可操作方式连接到对应于4CL基因的至少一部分的DNA片段上的启动子以便沿正义方向生成所述DNA片段的转录本，其中所述DNA构建体为pARB368。在其它方面，一种DNA构建体包含以可操作方式连接到对应于CAld5H基因的至少一部分的DNA片段上的启动子，其中所述DNA构建体选自由pARB1203、pARB1205、pARB675、pARB661、pARB662和pARB374组成的群组。在再一实施例中，一种DNA构建体包含以可操作方式连接到对应于SAD基因的至少一部分的DNA片段上的启动子，其中所述DNA构建体选自由pARB486、pARB487和pARB488组成的群组。一方面，本发明提供抑制植物中木质素表达的方法，其包括将包含如下启动子的DNA构建体整合于所述植物的基因组中所述启动子以可操作方式连接到对应于4CL基因的至少一部分的DNA片段上以便沿反义方向生成所述DNA片段的转录本。另一方面，抑制植物中木质素表达的方法包括将包含如下启动子的DNA构建体整合于所述植物的基因组中所述启动子以可操作方式连接到对应于4CL基因的至少一部分的DNA片段上以便沿反义方向生成所述DNA片段的转录本。另外，或另一选择为，所述方法可采用包含如下启动子的DNA构建体所述启动子以可操作方式连接到对应于CAW5H基因的至少一部分的DNA片段上。在其它方面，抑制植物中木质素表达的方法涉及包含如下启动子的DNA构建体:所述启动子以可操作方式连接到对应于SAD基因的至少一部分的DNA片段上。本发明还提供通过这些方法产生的植物和植物细胞，以及源自所述植物和植物细胞的纸和木制品。本发明还提供源自这些转基因植物的纸浆和纸浆制品。另一方面，本发明提供源自这些转基因植物的实木制品。所述木制品包括(例如)木料、木材和复合材料。参照下列详细说明可易知本发明的其它目的、特征和优点。详细说明和具体实例表示较佳实施例，但其仅出于说明目的，因此所属领域的技术人员自此详细说明可易知属于本发明精神和范围内的各种变化形式和修改形式。而且，所述实例阐明本发明的原理而不能够期望这些实例具体阐明对于那些熟悉先前技术的人而言明显有用的可应用本发明的所有实例。图1(A)(SEQIDNO:5、6、7、8、15、9和64，分别按照出现顺序给出)及图l(B)(SEQIDNO:16、17、10、11、12和13)提供用于制造某些本文所述DNA构建体的引物和组份。图2(A)(SEQIDNO:65、25和26分别按照出现顺序给出)及图2(B)(SEQIDNO:34和33)提供用于本文所述DNA构建体的组份。图3提供显示所得转基因桉树高度的条形图。图4A提供显示所得转基因桉树高度的条形图，而图4B图示所述转基因树木的平均木质素含量。图5提供松树4CL基因(SEQIDNO:66)的核酸序列。.图6(A)(SEQIDNO:18、19、20和21，分别按照出现顺序给出)及图6(B)(SEQIDNO:22、23、24和48，分别按照出现顺序给出)可鉴别若干松树4CL片段的核酸序列。图7提供本发明DNA构建体的总体设计。图8提供用于调节松树中木质素的若干4CLDNA构建体的示意图。图9提供用于调节松树中木质素的若干4CLDNA构建体的示意图。图10以图形方式说明通过4CLRNAi构建体调节木质素水平。木质素数值是通过NMR测量的细胞壁材料中的木质素百分比。图11是桉树4CL构建体pARB345的质粒图。图12是桉树4CL构建体pARB339的质粒图。图13是桉树4CL构建体pARB341的质粒图。图14提供火炬松试样的质谱。20000=对照；1268b=包含DNA构建体pARB585的转基因树。图15A是使用质量范围为m/z50-200的转基因火炬松试样所收集质谱的PC1分值对PC2分值的散点图。图15B是突出显示构建体pWVC41和对照的聚集状况的散点图。图16A是突出显示构建体pWVK154、pWVC40和对照的聚集状况的散点图。图16B是突出显示构建体pWVK158、pWVC46和对照的聚集状况的散点图。图17是来自图16A中所选构建体的火炬松试样的质谱。被赋予木质素峰值的热解片段在对照谱图的上方示出。图18是经pWVK154转化的转基因火炬松种系和未经转化对照种系的13CCP/MAS谱图。所述谱图表明转基因种系与对照种系相比，芳族碳和甲氧基碳相对于碳水化合物区域减少(60-110ppm)。图19是使用2种主要组份通过PLS模型完全交叉验证测定的PLS预计木质素数值和NMR测定木质素数值的散点图。图20提供木质素构建体pARB1201和pARB1203的质粒图。图21提供木质素构建体pARB675和pARB598的质粒图。图22提供木质素构建体pARB661和pARB662的质粒图。图23提供木质素构建体pARB599的质粒图。图24提供木质素构建体pARB1205和pARB1202的质粒图。图25提供木质素构建体pARB368和pARB486的质粒图。图26提供木质素构建体pARB487和pARB488的质粒图。图27提供木质素构建体pARB411和pARB412的质粒图。图28提供木质素构建体pARB374的质粒图。具体实施例方式在一个实施例中，DNA构建体可用于抑制靶向基因的表达。本文所述构建体和方法可用于各活体外或活体内细胞中。一般而言，所述构建体通过编码双链RNA(dsRNA)和引发RNA干扰(RNAi)来选择性地抑制耙基因。在一较佳实施例中，所述DNA构建体可用于减少植物中的木质素含量。一方面，本发明提供一种用于调节植物的木质素含量的DNA构建体。在一个实施例中，一种DNA构建体包括以可操作方式连接到第一段DNA片段的启动子，所述第一段DNA片段对应于4-香豆酸酯辅酶A连接酶(4CL)基因的至少一部分；间隔区DNA片段；和与所述第一段DNA片段互补的第二段DNA片段，其中所述第一段和第二段DNA片段在所述DNA构建体中分别沿5'至3'方向排列。因此，当转录时，所述DNA构建体产生包含下列各部分的RNA分子:对应于4CL基因的至少一部分的第一段RNA片段、间隔区RNA片段和与所述第一段RNA片段互补的第二段RNA片段。包含C3H、C4H、CCoAOMT、松柏醛5-羟化酶(也称作阿魏酸酯-5-羟化酶(F5H))和CCR的DNA片段的构建体可以类似的方式作业。尽管不完全了解本发明的运作机制且发明者并不希望将其发明限制于任何特定理论，但人们认为所得RNA分子的第一段和第二段RNA片段可形成茎环。所述茎环的dsRNA可能会降解为长度约为21-23个核苷酸的小干扰RNA(siRNA)。随后，siRNA与核糖核酸酶复合体(对于RNA诱导的沉默复合体称为RISC)结合，此使这个复合体耙向互补mRNA。RISC然后切割与互补siRNA相对的靶向mRNA，此使得所述mRNA对其它RNA降解途径敏感。在另一实施例中，DNA构建体包含以可操作方式连接到对应于4CL基因的至少一部分的DNA片段上的启动子以便沿反义方向生成所述DNA片段的转录本。在再一实施例中，DNA构建体包含以可操作方式连接到对应于4CL基因的至少一部分的DNA片段上的启动子以便沿正义方向生成所述DNA片段的转录本。在其它实施例中，DNA构建体包含以可操作方式连接到对应于CAW5H基因或SAD基因的至少一部分的DNA片段上的启动子。定义短语"靶基因"和"相关基因"在本文中可互换使用。如本文中所理解，靶基因用于指专用于调节或抑制的基因。耙向基因可包含或可不含调控元件，例如，转录因子结合位点或增强子。可选择用于抑制的基因包括那些编码结构蛋白(例如，细胞壁蛋白)或调控蛋白(例如，转录因子和受体)的基因以及其它功能基因。而且，该术语不仅欲包括多肽的编码区而且欲包括DNA中存在的内含子、调控元件、启动子和转录终止子。因此，"靶基因的至少一部分"意欲包括转录序列的至少一部分和/或启动子的至少一部分和/或相关基因终止子的至少一部分。本文所述DNA构建体最基本地包括一个启动子、一或多个DNA片段和一个转录终止子。本文所用"DNA片段"意欲指包含至少若干个相邻碱基的脱氧核糖核酸分子。对应于耙基因的DNA片段的长度可为30个碱基对(bp)或更多，较佳为至少50bp且少于2000bp，且更佳为至少100bp且少于750bp。DNA片段可为单链或双链。本发明上下文中的DNA片段可包括基因或cDNA或其一部分，或者其可包括启动子或调控元件或其一部分。术语"RNA片段"是指包含至少若干个相邻碱基的核糖核酸分子。RNA片段可为编码完整多肽的转录本(即，mRNA分子)或者其可为所述转录本的一部分。而且，RNA片段不需要编码多肽或其任何部分，只要所述片段符合本文所定义RNA片段的品质。例如，RNA片段可包括不编码肽的内含子、5'-UTR或3'-UTR。当包含启动子、调控元件或非基因序列的DNA片段受到转录时，也可产生RNA片段。术语"间隔区"是指隔离2个DNA或RNA片段的一系列相邻核苷酸。在一个实例中，"间隔区DNA片段"编码隔离2个RNA片段的"间隔区RNA片段"。间隔区长度可在宽范围内变化，自10个碱基对(bp)至2000bp或更多。当非常长的DNA互补片段被短间隔区隔离时，构建体可能会不稳定。因此，间隔区较佳应为其所隔离片段长度的1/4至2倍。例如，如果存在长度为160bp的互补DNA片段，则二者之间的间隔区片段较佳可介于40至320bp之间。间隔区可编码自转录本切除的内含子，以使所得间隔区RNA远远短于转录本的互补DNA片段。"互补"RNA或DNA片段是彼此可以特异性方式结合的片段。较佳地，2个互补片段的序列彼此之间应至少80%互补。更佳地，互补性应为至少85%、卯％、95%、96%、97%、98%、99%或甚至是100%。彼此互补的DNA片段的长度可为30个碱基对(bp)或更长，较佳为至少50bp且少于2000bp且更佳为至少100bp且少于750bp。例如，95%互补性意指互补RNA或DNA片段的核苷酸将以精确的碱基对碱基的方式彼此结合，只是一个RNA或DNA片段对于另一互补RNA或DNA片段链的100个碱基可能含有至多5个点突变。点突变可为删除碱基或取代碱基形式。而且，参考序列的这些突变可发生在一个互补核苷酸序列的5'或3'末端位置或两个末端位置之间分别散布于参考序列中各核苷酸中或参考序列中一或多个相邻基团中的任何地方。事实上，可通过(例如)使用GAP计算机程序(6.0版，可自UniversityofWisconsinDeneticsComputerGro叩(UWGCG)获得)对比序列信息来确定互补性百分比以及一致性。所述GAP程序利用Needleman和Wunsch比对方法(1970)。简单来说，GAP程序将相似性定义为相似的被比对符号(即，核苷酸或氨基酸)数量除以两个序列中较短一个序列中的总符号数量。GAP程序的较佳缺省参数包括(1)核苷酸的单元比较矩阵(含有表示一致性的数值1和表示不一致的数值0)，及Gribskov和Burgess加权比较矩阵(1986)，(2)对于每个空隙罚分为3.0且对于每个空隙中的每个符号额外罚分为0.10;和(3)对于末端空隙无罚分。或者，可使用Bestfit程序(WisconsinSequenceAnalysisPackage,Version8forUnix,DeneticsComputerGroup,UniversityResearchPark,575ScienceDrive,Madison,Wis.53711)评定互补性百分比。Bestfit使用Smith和Waterman局部同源算法(AdvancesinAppliedMathematics2:482-489(1981))来搜寻两个序列间最佳同源片段。当使用Bestfit或任何其它序列比对程序来测定一具体序列是否有(例如)95%等同于本发明的参考序列时，当然应将参数设定为能计算全长参考核苷酸序列的一致性百分比并允许在参考序列中含有占核苷酸总数量至多5%的同源空隙。在对置DNA链上具有相似或相同序列的两个DNA片段被称作"反向重复序列"。通过具有反向DNA重复序列的区域转录可产生彼此"互补"的RNA片段。包含两个互补的RNA片段的转录本可形成具有双链区的单一RNA分子。所述双链区有时被称为"茎环"或"发夹结构"。"转录终止子"意指编码可造成RNA聚合酶停止或延迟转录的RNA转录本3'-末端的DNA片段。由于大多数真核mRNA在其3'-末端添加有poly(A)片段，因此大多数转录终止子可确定添加有腺苷残基的一个或多个碱基。因此，转录终止子可包含编码mRNA的3'-UTR的至少一部分的DNA，所述mRNA紧邻且包括其中添加有poIy(A)尾的核苷酸。转录终止子还可包括紧随聚腺苷酸化作用位点之后的DNA序列的至少一部分以便为转录停止位点提供更完整的DNA背景。转录终止子还包括可终止转录的片段，但不包括用于聚腺苷酸化作用的终止子，例如，组蛋白基因或核糖体RNA基因的转录终止子。本文所用DNA构建体还包括载体。术语"载体"是指能够在宿主细胞内自动复制的DNA分子。如那些所属领域的人员所知，载体包括但不限于质粒、粘粒、噬菌粒、病毒载体、噬菌体载体、酵母载体、哺乳动物载体和诸如此类。通常，载体会包含编码抗药性标记的基因，即胸苷激酶基因或补充营养缺陷体的基因。为了有助于选择含有这些载体的宿主细胞纯系，人们已将各种抗生素抗性基因并入载体中。例如，并入欲导入细菌宿主细胞的载体中的抗生素抗性基因包括但不限于对选自由下列组成群组的抗生素产生抗性的基因氨苄西林(ampicillin)、卡那霉素(kanamycin)、四环素、新霉素(neomycin)、G418、杀稻瘟菌素(blastocidin)S和氯霉素。用于补充营养缺陷体的基因是编码可促进宿主利用营养或功能组份(例如，嘌呤、嘧啶、氨基酸(例如，赖氨酸、色氨酸、组氨酸、白氨酸、半胱氨酸)或鞘脂)的酶或蛋白质的基因。另外，载体还将包括用于特定宿主细胞的复制起点(复制子)。例如，各种原核复制子己为那些所属领域的人员所熟知且其可用于引导原核宿主细胞中重组分子的自动复制和维持。术语"以可操作方式连接"是指DNA的化学融合、连接或合成以便在对于拟转录成RNA片段的DNA序列适当的方向上形成启动子-DNA序列组合。可通过启动子(可联合其它调控元件)调控启动子-DNA序列的转录。或者，可不通过启动子调控启动子-DNA片段的转录。在启动子-DNA序列组合的构造中，通常较佳的情形是使启动子位于距DNA片段的初始密码子上游一段距离处，所述距离和启动子与其在其自然背景中控制的片段之间的距离大致相同。然而，如此项技术所知，在不损失启动子功能的情况下，可允许所述距离有显著变化。术语"启动子"指能够结合RNA聚合酶以引发转录的天然或合成核苷酸序列。这些启动子为那些所属领域的人员所熟知且其可包括细菌、病毒、真菌、植物、哺乳动物或其它真核生物启动子，这些启动子的选择取决于被转化的宿主细胞或生物体。人们预计，当所抑制构建体在与靶基因相同的组织中转录时，靶基因沉默将是最有效的。尽管有证据表明可将沉默信号移位至植物的远端部分(例如，PalauquiandVaucheret,1998，PNAS95:9675-9680.)，但是某些细胞可能不能够接受此信号。例如，病毒抑制构建体并不能使生长芽尖端的GFP表达沉默(Dalmay等人，2000,PlantCell12:369-379)。为了使在许多类别细胞中表达的基因沉默，较佳采用具有至少中等强度的组成型启动子。可在植物中起作用的组成型启动子的实例是病毒启动子，例如CaMV或FiMV(Sanger等人，1990.PlantMol.Biol.14:433-443);细菌启动子，例如胭月旨氨酸合成酶(mw)或甘露氨酸合成酶(mw);或植物启动子，例如那些来自芥菜属肌动蛋白2或遏^"歪^W基因者(An等人，1996，PlantJ.10:107-121;Norris等人，1993,PlantMol.Biol.21:895-906)。使用组成型启动子来驱动抑制构建体还可使具有限制表达方式的靶基因沉默。然而，可能需要避免抑制构建体的表达超出沉默表现型所需要的程度。可使用与靶基因具有类似表达方式的抑制构建体启动子。例如，如果计划使表达木质部的靶基因沉默，则可使用荷兰芹4CL基因的启动子(Hauffe等人，1993,PlantJ.4:235-253)，或如果耙向分生组织特异性基因，则可使用阿拉伯芥/^OL/F^M启动子(Springer等人，1995，Science268:877-880)。在一个实施例中，启动子源自不同于被转化物种的物种以避免相同启动子序列之间的相互作用。用于在真核细胞中表达的各种其它启动子己为此项技术所熟知，包括但不限于病毒或病毒样基本启动子，如SV40晚期启动子和RSV启动子；及真菌或哺乳动物细胞启动子(参见，例如Larsen等人，1995,NucleicAcidsRes.23:1223-1230;Donis等人，1993，BioTechniques15:786-787;Donda等人，1993，Mol.Cell.Endocrinol.90:R23-26;和Huper等人，1992,InVitroCellDev.Biol.28A:730-734)。可在真核细胞中用于引导重组分子在真核宿主细胞中复制和维持的各种复制子(其为重组分子的一部分)已为那些所属领域的人员所熟知。术语"调控元件"是指可影响DNA转录或mRNA转译的特异性或效率的核酸序列，包括但不限于转录因子的结合位点、增强子、和转录或转译引发和终止信号。增强子序列是指与附近DNA片段相比，以相对独立于其位置和方向的方式呈现增加转录效率的DNA元件。因此，视DNA构建体而定，增强子可位于特定DNA片段的上游或下游以增加转录效率。可使用此项技术中已知的重组DNA方法将这些调控元件插入构建体DNA序列中。其它调控元件包括但不限于RNA片段上的5'未转译区(5'UTR)以及RNA片段上的3'UTR(即，包括poly(A)尾)，其对于达成稳定性及有效转译RNA片段或转录本而言是必需的。本文所用"盒"是一类包含启动子、转录终止子和插入这二者之间的DNA片段的DNA构建体。盒可用于在其中启动子处于激活状态的宿主细胞或生物体中驱动DNA或RNA片段的表达。术语"实质序列一致性"描述两个或更多个核苷酸序列的相关性。较佳地，所述序列彼此之间至少80%是相同的，如上文所计算。更佳地，所述一致性应为至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或甚至100%。"约"将为所属领域的普通技术人员所了解且在使用此词语的上下文中具有一定程度的不同。如果使用此词语的上下文中所使用的此词语不为所属领域的普通技术人员所了解，则"约"将意指特定词语的至多±10%。讨论本发明一方面提供用于调节植物中木质素含量的DNA构建体。在一个实施例中，一种DNA构建体包含以可操作方式连接到第一段DNA片段的启动子，所述第一段DNA片段对应于4-香豆酸酯辅酶A连接酶(4CL)基因的至少一部分；间隔区DNA片段；和与所述第一段DNA片段互补的第二段DNA片段，其中所述第一段和第二段DNA片段在所述DNA构建体中分别沿5'至3'方向排列。组成型启动子，例如来自辐射松(P.radiata)的超级泛素(s叩erubiquitin)(美国专利第6,380,459号，其以引用的方式并入本文中)，可用于驱动靶基因4CL或其它木质素生物合成基因的表达。在另一实施例中，本发明的DNA构建体包含特异性地引导木质部表达的启动子。自火炬松(Ptoe&)的4CL基因上游区分离的启动子片段(美国专利第6,252,135号，其以引用的方式并入本文中)是一个显示强木质部优选型表达的启动子的实例。本文所述实验证据表明在本发明DNA构建体中使用4CL启动子可有效地减少木质素含量而不会对植物高度造成不利影响。本发明构建体的第一段和第二段DNA片段可源自任何4CL基因。在一较佳实施例中，当改变松树或桉树中的木质素含量时，所述第一段和第二段DNA片段源自辐射松(松树)的4CL基因(美国专利申请公开案第20030131373号)或巨桉(五.的4CL基因(美国专利第6,410,718号)。同样地，本发明构建体的第一段和第二段DNA片段可源自4CL基因的任何部分。例如，可使用约50bp、100bp、200bp、400bp、600bp或1000bp的片段。本文所示其它示范性长度包括189bp、327bp、334bp、373bp、389bp和668bp。在较佳实施例中，第一段DNA片段包括选自图示于图SEQIDNO18、19、20、21、22、23、24、33和48中的序列的片段。第一段DNA片段可源自4CL基因的正义链或反义链。由于第二段DNA片段与第一段DNA片段互补且因此源自反向链，因此第一段DNA片段的链选择必然会影响第二段DNA片段的来源。如上文所述，间隔区DNA片段编码用于隔离其它RNA片段的间隔区RNA片段。间隔区RNA片段在本发明中可充当由本发明构建体的DNA盒转录形成的茎环中的环。间隔区DNA片段可以是完全合成的或源自天然DNA序列。在一个实施例中，间隔区DNA片段是源自内含子。示范性间隔区DNA片段如图1所示。可使用此项技术中熟知的设计用于操控核酸分子的方法和技术来分离先前鉴别的相关基因或其部分或启动子。例如，用于分离、纯化和克隆核酸分子的方法以及阐述使用真核和原核宿主细胞及在其中表达核酸和蛋白质的方法和技术由Sambrook等人阐述于MolecularCloning:ALaboratoryManual(第2版，ColdSpringHarbor,N.Y.，1989)禾卩CurrentProtocolsinMolecularBiology(FrederickM.Ausubel等人编写，JohnWiley&Sons,Inc.,1987)中，其揭示内容以引用的方式并入本文中。可将包含相关基因或启动子的至少一部分的DNA构建体导入宿主细胞中，如上文所述，所述宿主细胞可为个体细胞、培养中细胞、作为宿主生物体一部分的细胞、受精卵母细胞或配子体或胚细胞。术语"导入"是指此项技术中己知的用于将重组载体DNA传递到靶宿主细胞中的标准程序。这些程序包括(但不限于)转染、感染、转化、自然吸收、电穿孔、基因枪法和土壤杆菌法。土壤杆菌法已经被成功地用于各种物种，包括杨树(Leple，J.C等人，1992.PlantCellRep.11:137-141.)、桉树(Tournier，V.等人，2003.TransgenicRes.12:403-411)和松树(美国专利第6,518,485号(基因枪)和美国公开专利申请案第20020100083号)。土壤杆菌法是用于成功地获得转基因火炬松、挪威云杉(Wenck，A.R.等人，1999.PlantMol.Biol.39:407-416.)、7乂稻(Hiei,Y.等人，1997.PlantMol.Biol.35:205-218,;Cheng,X.等人，1998.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.95:2767-2772.)、小麦(Cheng，M.等人，1997.PlantPhysiol.115:971-980.)和玉米(Ishida，Y.等人，1996.NatBiotechnol.14:745-750.)的再生植物的唯一公开方法。转化法己经被用于诸如大麦(Tingay，S.等人，1997.PlantJ.11:1369-1376.)、甘蔗(Arencibia,A.D.等人，1998.TransgenicResearch7:1陽10;Enriquez-Obregon,G.A.等人，1998.Plant206:20-27.)、香蕉(May,G.D.等人，1995.Bio/Technology13:486-492.)、石刁柏(A^^ragwc#'dnafc)(Ddbreil，B.等人，1993.PlantCellRep.12:129-132.)和早花百子莲(Agapa"f/uwpraeco;c)(Suzuki,S.等人，2001.PlantSci.161:89-97.)等种系。可以各种方式测量DNA构建体在调节木质素含量方面的效能。例如，可按照USDairyForageResearchCenter(Madison,Wisconsin)所用程序对不含提取物的磨碎试样进行乙酰溴木质素测定(Fukushima,R.S.和Hatfield,R.D.,丄Ag.FoodCAem.,49(7):3133(2001))。还可使用热解分子束质谱。所述方法包括在惰性氦气氛中于50(TC下迅速加热试样(O.lg)。通过扩展经过一取样孔继而形成分子束直接对所生成的热解产物实时取样，此可提供快速试样骤冷并可抑制试样冷凝。所述质谱仪提供所有取样产物的通用检测且分子束取样可确保对来自初始分子的代表性产物进行检测(Magrini等人，5m^ranme加aZPo^riwz,116:255-268(2002))。在另一实例中，可使用核磁共振法(NMR)来分析木质素结构。NMR是一种通过测量核在磁场影响下所吸收的射频电磁辐射来检测分子的亚原子和结构信息的分析方法。通常，IH和13C是采用Li，S.和K.Lundquist方法(A^&c/^Z/Paperie化arc/z■/.,3.191-195)来定性未衍生化木质素的两种主要核。木质素水平的降低和可能伴随的树木CHO水平的增加对于纸浆工业可为经济的且环保的优势。减少枝条中的木质素可减少制浆所需化学品且甚至可能减少漂白纸浆所需化学品的量。下列实例用于阐明本发明的各个实施例且不应以任何方式将其诠释为限制本发明的范围。实例实例1.cDNA文库的构造为了鉴别辐射松和巨桉数据库中的木质素单体合成、木质素单体运输和木质素聚合候选基因，可对cDNA序列与公共结构域序列进行比较(通过SWISS-PROT/TrEMBLID)以针对松树和桉树数据库进行搜寻(通过重叠群(contig)确定无冗余，预计值<1.0e-2)。随后获得用于这些匹配物的重叠群一致DNA和蛋白质序列并鉴别重复序列。然后使用蛋白质序列进行多序列比对。使用其余松树和桉树序列以及阿拉伯芥成员可产生蛋白质比对。自该蛋白质比对产生树状图。通过引物步移法分析这些序列以提供一全长序列(最佳HT取自全长序列经分析的重叠群)。还提取来自玉米、棉花、水稻和杨树的公共结构域木质素单体合成、木质素单体运输和木质素聚合基因序列并与松树和桉树数据库对比。完整引物步移的松树和桉树序列也与自身序列对比并取前500个匹配物。实施此举以便可使用所述序列进一步搜寻并通过使用阿拉伯芥超家族确保未遗漏松树和桉树数据库中的任何数据。此搜寻找到在先前搜寻中未发现的另外4个序列。然后也将这些序列发送到经引物步移的全长序列。在引物步移后去除少量的额外重复体之后，鉴别松树和桉树的引物步移木质素单体合成、木质素单体运输和木质素聚合超家族成员。通过与ClustalX、对应树状图和MEME/MAST分析比对来确定这些序列的分类。为了鉴别cDNA文库中部分cDNA序列5'或3'的额外序列，使用SMARTRACEcDNA扩增套组(ClontechLaboratories,PaloAlto，Calif)对cDNA末端(RACE)进行5'和3'快速扩增。一般来说，所述方法具体包括如下步骤首先分离poly(A)mRNA，进行第一链和第二链cDNA合成以生成双链cDNA、钝化cDNA末端且随后将SMARTRACE衔接子连接至cDNA以形成经衔接子连接的dscDNA文库。基因特异性引物被设计为与衔接子特异性引物一起用于5'和3'RACE反应。使用5'和3'RACE反应，可获得、排序和克隆5'和3'RACE片段。可重复此过程直至鉴别出全长基因的5'和3'末端。通过PCR使用对基因的5'和3'末端具有特异性的引物(通过末端对末端PCR)可产生全长cDNA。例如，为了扩增第一链cDNA的基因的缺失5'区，自模板序列的反向链将引物从5'设计为3'且其来自模板序列的介于100-200bp之间的区域。成功的扩增应在模板的5'末端与PCR产物之间得到100bp的DNA序列重叠区。使用ConcertReagentProtocol(Invitrogen，Carlsbad,CA)及标准分离和提取程序自4种松树组织(即，籽苗、木质部、韧皮部和结构根部)提取RNA。然后用Dnase、使用10U/微升DNaseI(RocheDiagnostics,Basel,Switzerland)处理所得RNA。对于100叱RNA，使用9pi10xDNase缓冲液(Invitrogen，Carlsbad,CA)、10piRocheDNaseI和90^不含Rnase的水。然后在室温下将RNA培育15分钟并加入1/10体积的25mMEDTA。使用RNeasy微型套组(Qiagen，Venlo，TheNetherlands)按照制造商的方案进行RNA纯化。为了合成cDNA，使用自木质部、韧皮部、籽苗和根部提取的RNA且随后按照制造商的方案使用SMARTRACEcDNA扩增套组(ClontechLaboratoriesInc，PaloAlto,CA)。对于RACEPCR，组合来自4种组织的cDNA。通过混合等体积的来自木质部、韧皮部、根部和籽苗组织的cDNA来形成用于PCR的主混合物。在96孔PCR平板中进行PCR反应，并将1ml引物从引物稀释平板(10mM)移至对应的孔位置。将49ml主混合物等份加至具有引物的PCR平板中。使用DeneAmp9700(AppliedBiosystems，FosterCity,CA)以下列参数开始热循环94。C(5sec),72'C(3min)，5个循环；94°C(5sec)，70。C(10sec)，72。C(3min)，5个循环;94。C(5sec)，68。C(10sec)，72°C(3min)，25个循环。按照标准程序使用琼脂糖凝胶分离cDNA。通过按照制造商说明书使用Qiagen96-孔凝胶稀释套组切除凝胶片段并自所述凝胶洗提凝胶片段。按照下列说明将PCR产物连接到96孔板中的pGEMTeasy(Promega,Madison,WI)过夜用水将60-80ngDNA、5pi2X快速连接缓冲液、0.5pipGEMTeasy载体、0.1^DNA连接酶补足至10^并培育过夜。按照标准程序将每个纯系转化到大肠杆菌(￡.中并从按照标准方案选取的12个纯系提取DNA。使用l呢琼脂糖凝胶来验证DNA提取和DNA品质。通过限制酶消化、使用限制性内切酶EcoRI和凝胶电泳并按照标准实验室程序测定各个纯系中适当尺寸插入体的存在。实例2.松树4CL表达载体的构造制备一系列包含来自火炬松4CL基因的至少一部分的重组构建体并评定其减少植物中木质素含量的能力。一般而言，每一DNA构建体均包含以可操作方式连接到第一段DNA片段的启动子，所述第一段DNA片段对应于4CL基因的至少一部分；间隔区DNA片段；和与所述第一段DNA片段互补的第二段DNA片段，其中所述第一段和第二段DNA片段在所述DNA构建体中分别沿5'至3'方向排列。设计11种构建体并使用辐射松4CL基因的不同片段(图5)和不同启动子制备这些构建体。构建体的一般设计图示于图7至9中。使用超级泛素启动子(美国专利第6,380,459号，RanjanJPerera等人，Plant&AnimalGenomeVIIIConference(2000))作为组成型启动子，而使用来自火炬松的4CL启动子(美国专利第6,252,135号)作为维管优选型启动子。使用源自拟南芥YABBY基因(SEQIDNO:64)的内含子(FosterTM等人，HamCWZ,14(7):1497-1508(2002))作为间隔区DNA片段。构建体利用图示于图5中的来自辐射松的4CL基因部分。图6A-6B提供所述构建体中所用的4CLRNAi片段的核酸序列(A至H)(SEQIDNO:18-24和48)。通过向质粒pBluescript(BRLGibcoLifeTechnologies,GaithersburgMD)的多克隆位点添加额外的限制性内切酶位点来制备骨架载体。通过消化具有A^/和^f/的质粒及使用Klenow禾BT4聚合酶(Invitrogen公司，CarlsbadCA)填充末端来破坏初始pBluescript载体中的7VW/和位点。通过平端连接来环化质粒并随后用限制性内切酶和照M///消化以促进连接子克隆。将含有额外限制酶切位点的连接子(在5'末端受到磷酸化)(在SEQIDNO:1和2中给出)一起退火并连接到经EcoRI/Hindlll消化的pBluescript载体中。将来自辐射松超级泛素基因(美国专利第6,380,459号)的3'UTR克隆到质粒pBI-121中(Jefferson等人，服卵/6:3901-3907，1987)。首先，使用标准PCR技术及SEQIDNO:3和4中给出的引物来扩增所述基因的3'UTR片段。这些引物含有额外的核苷酸以提供SW/限制酶切位点以供用于克隆到经SW/消化的质粒pBI-121中。然后，将含有nos终止子的3'UTR片段转移至pBluescript质粒中。借助PCR使用SEQIDNO:5和6中给出的引物扩增pBI-121的3'UTR和nos终止子片段，用K;m/和Cto/切除并克隆到经《;w///7Cto/消化的经修饰pBluescript中。向此构造物中添加具有内含子的輻射松超级泛素启动子序列。首先，使用标准PCR技术及SEQIDNO:7和8的引物自美国专利第6,380,459号中鉴别的辐射松超级泛素序列扩增启动子/内含子序列。然后使用X^/和i^/限制酶消化将经扩增片段连接到基础载体中。使用标准PCR技术及SEQIDNO:10和11的引物扩增来自辐射松cDNA的辐射松4CL内含子序列(SEQIDNO:9)，然后使用T-尾连接克隆到经Xcm/消化的载体骨架中。为了自巨尾桉和辐射松分离和定性木质素单体合成、木质素单体运输和木质素聚合样基因，自植物组织提取总RNA(使用Chang等人的方案，PlantMol.Biol.Rep.11:113-116(1993))。自韧皮部(P)、形成层(C)、扩展木质部(XI)、及分化和木质化木质部(X2)获得植物组织试样。使用Poly(A)QuikmRNA分离套组(Stratagene，LaJolla,CA)或DynalBeadsOligo(dT)25(Dynal，Skogen，Norway)自总RNA制备物分离mRNA。通过逆转录酶合成、然后按照制造商的方案使用ZAPExpresscDNA合成套组(Stratagene)将所得cDNA纯系插入LambdaZAP中来从经纯化mRNA构造cDNA表达文库。使用GigapackIIPackagingExtract(Stratagene)用来自5mL连接反应物的等份试样(1-5(A，取决于所述文库)封装所得cDNA。使用具有ExAssist辅助噬菌体(Stratagene)的XLOLR细胞(Stratagene)和XL1-BlueMRP'细胞来实施所述文库的大块切除。切除的噬菌粒用NZY肉汤(GibcoBRL,Ga池ersburg,MD)稀释并铺在含有X-gal和异丙基硫基-P-半乳糖苷(IPTG)的LB-卡那霉素琼脂平板上。在平铺及选择用于DNA微量制备物的菌落中，99%含有适用于测序的插入体。在具有卡那霉素的NZY肉汤中培养阳性菌落并借助碱裂解方法和聚乙二醇(PEG)沉淀方法纯化cDNA。使用1%琼脂糖凝胶来筛选用于染色体污染的测序模板。使用TurboCatalyst800机器(PerkinElmer/AppliedBiosystemsDivision,FosterCity,CA)按照制造商的方案来制备染色引物序列。使用PerkinElmer/AppliedBiosystemsDivisionPrism377序列分析仪获得阳性纯系DNA序列。首先自5'末端且在某些情况下也可自3'末端对cDNA纯系测序。对于某些纯系，使用外切核酸酶III删除分析(在pBK-CMV中产生一不同尺寸的亚纯系文库)或通过使用设计为相关基因鉴别区的基因特异性引物直接测序可获得内部序列。使用实例1中所述方法，自木质部构造辐射松cDNA表达文库并进行筛选。在PerkinElmer/AppliedBiosystemsDivisionPrism377序列分析仪上使用正向和反向引物获得阳性纯系DNA序列并将所测定序列与上述EMBL数据库中的已知序列对比。根据与其它植物物种已知序列的相似性，将所分离DNA序列鉴别为编码4CL(SEQIDNO:18-24和48)和咖啡酰基CoA甲基转移酶(SEQIDNO:44)。使用标准PCR技术和引物SEQIDNO:12和13扩增来自辐射松4CLcDNA纯系的片段。对所述引物进行设计以向扩增片段的两个末端添加和CtoZ限制酶切位点。扩增片段的核苷酸序列作为SEQIDNO:24提供。沿正义方向克隆辐射松4CL片段时，需使用限制酶/^/切割扩增片段、使用Klenow平端化并将其克隆到位于平端化Cto/位点的骨架载体中。沿反义方向克隆辐射松4CL片段时，需使用Pw/消化扩增片段并将其克隆到经i^r/消化的骨架载体中。使用设计类似于上文那些用于Pr4CL和PDK内含子序列者的引物扩增yabby内含子序列(Foster等人，2002,PlantCell.14(7):1497-1508)并将其克隆到上文所述的载体骨架中。使用设计类似于那些用于SEQIDNO:24者的引物扩增6个额外的片段(SEQIDNO:18-23)，不同之处为将SEQIDNO:18的引物设计为向扩增片段的两个末端添加Sma/限制酶切位点；将SEQIDNO:19的引物设计为在扩增片段的两个末端添加fo^/和限制酶切位点；将SEQIDNO:22的引物设计为在扩增片段的两个末端添加Pw/限制酶切位点。将SEQIDNO:23的引物设计为向扩增片段的一个末端添加SmoT限制酶切位点而向该扩增片段的另一个末端添加5coi/和限制酶切位点。按照上文所述或通过使用所列举限制酶沿正义和反义方向将所有7个片段克隆到骨架载体中。将含有启动子::正义片段::内含子::反义片段::3'UTR::nos终止子构建体的完整RNAi盒自如上文所述pBluescript质粒移除并使用标准克隆技术将其克隆到双元载体pART27或pART29(经7VW/消化)中。.双元载体pART29是经修饰pART27载体(Gleave,/^a"fMo/.历C塗1203-1207,1992)，其含有阿拉伯芥遍在蛋白3(UBQ3)启动子而非nos5'启动子且无lacZ序列。通过iVw/限制酶消化将含有启动子::正义片段::内含子::反义片段::3'UTR::nos终止子构建体的完整RNAi盒(SEQIDNO:14)自pBluescript质粒移除并使用标准克隆技术将其克隆到双元载体pART29(经WW/消化)中以产生最终载体pARB513。通过下列来重新改造构建体以供用于松树移除Notl片段并将这些片段插入具有NotI位点以及组成型启动子表达GUS(以验证不使用PCR时的转化)和可选标记盒(其包含受阿拉伯芥UbqlO启动子驱动的叩tII)的基础载体中。使用限制酶NotI自表l"被改造者"列中所列各载体移除启动子::4CLRNAi盒。使用限制酶NotI来线性化载体pWVR31并用SAP处理以防止其重退火到其原本状态。将每一片段连接到Notl位点处的pWVR31以生成表1中所列载体。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>构建体pWVK154、pWVK143、pWVC46和pWVC40由美国典型培养物保藏中心(P.O.Box1549，Manassas,Virginia,USA,20108)在2004年9月21日保存且分别给予ATCC登录号PTA-6229、PTA-6228、PTA-6227和PTA-6226。通过分别将来自火炬松的4CL启动子(美国专利第6,252,135号)和来自辐射松的超级泛素基因(美国专利第6,380,459号)以及GUS(内含子)基因(参考)克隆到载体pWVR31中来生成对照载体pWVC41和pWVK159。骨架载体pWVR5是其中35S启动子GUS序列被移除且NOS启动子被来自阿拉伯芥的UBQ10启动子(Sun，C.W&Callis,J(1997)PlantJ.,11:101-111)代替的pBI121载体(Clontechlaboratories,PaloAltoCA)。为了制备载体pWVR8，需扩增肌动蛋白II启动子(MEAGHER,/欣CytoZ，125:139-163(1991))并将其与GUS+内含子基因一起克隆到pWVR5载体中(Ohta等人，PZa^CeW尸/zyWC,31:805-813(1990))。自载体pWVR8(阿拉伯芥肌动蛋白II::GUSINT，UBQIO::NPTII)改造骨架载体pWVR31。通过PCR使用引物扩增来自阿拉伯芥的UBQll启动子(NorrisSR等人，(1993)P^mrMW说'"21(5):895-906)且用此代替来自pWVR8的肌动蛋白II启动子以制备载体pWVR31。另外，还可按照上文所述构造表2中所列举载体，但下列序列的至少一个会受到修饰启动子和/或双元载体。为了将表2中所列举的不同启动子克隆到最终载体中，需用Snial和Sstl限制酶和使用标准技术消化辐射松超级泛素启动子内含子载体，使用标准技术将此片段克隆至含有下列各部分的Bluescript载体中来自火炬松的4CL启动子、来自巨桉的COMT启动子或来自辐射松的LIM启动子。火炬松4CL启动子(美国专利第6,252,135号)、巨桉COMT启动子(美国专利第10/703,091号)和辐射松LIM启动子(美国专利申请案第10/717,897号)全部使用设计类似于那些用于扩增具有上述内含子的輻射松超级泛素启动子序列者的引物来扩增且随后将其连接到上述Bluescript基础载体中。通过A^/限制酶消化自pBluescript质粒移除含有启动子::正义片段::内含子::反义片段::3'UTR::nos终止子构建体的完整RNAi盒并使用标准克隆技术将其克隆至双元载体pART29或pWVK147(经A^/消化)中。pWVK147载体是其中35S启动子GUS序列被移除且NOS启动子被来自阿拉伯芥的UBQ10启动子代替(Sim，C.W&Callis，J(1997)尸to"〃.'11:101-111)以驱动nptll基因的pBI121载体(Clontechlaboratories,PaloAltoCA)。通过添加连接于Apal和Kpnl位点的衔接子可向载体添加独特的HpaI限制酶切位点。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>使用与那些上文所述者相同的方法构造表3中所列举载体，不同之处为使用标准PCR技术并使用引物SEQIDNO:16和17来扩增PDK内含子序歹ij(Wesley等人，/^w27:581-590,2001)(SEQIDNO:15)。对于每个构建体，表达盒中的表达基因均是4CL片段G(SEQIDNO:24)。表3.<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>实例3.桉树4CL表达载体的构造按照上文所述制备一系列含有4CL基因的至少一部分的重组构建体并评定其减少植物中木质素含量的能力。一般而言，每一DNA构建体包含以可操作方式连接到第一段DNA片段的启动子，所述第一段DNA片段对应于来自巨桉的4CL基因的至少一部分(美国专利第6,410,718号)；间隔区DNA片段；和与所述第一段DNA片段互补的第二段DNA片段，其中所述第一段和第二段DNA片段在所述DNA构建体中分别沿5'至3'方向排列。首先使用不同片段长度的4CL基因和不同的启动子制备3种构建体。参见表16。所述构建体的一般设计图示于图7中。超级泛素启动子(美国专利第6,380,459号；RanjanJPerera等人，Plant&AnimalGenomeVIIIConference(2000))用作组成型启动子，而来自火炬松SEQIDNO:77中4CL基因的启动子用作维管优选型启动子。来自阿拉伯芥(FosterTM等人，P/"加Ce,14(7):1497-1508(PlantCell))YABBY基因的内含子用作间隔区DNA片段。图2A和2B提供4CLRNAi200bp片段(SEQIDNO:33)和4CLRNAi600bp片段(SEQIDNO:34)的核酸序列。骨架载体的构造如实例2中所述。使用标准PCR技术和SEQIDNO:25和26中给出的引物扩增来自巨桉4CLcDNA纟屯系(美国专利第6，410，718号)的片段。对引物进行设计以向扩增片段的两个末端添加P^/及C/"/限制酶切位点。扩增片段的核苷酸序列在SEQIDNO:27中给出。为了沿正义方向克隆4CL片段，需用限制酶Pw/切割扩增片段并将其克隆到骨架载体中。为了沿反义方向克隆4CL片段，需用Ck/消化扩增片段并将其克隆到骨架载体中。通过Ww/限制酶消化自pBluescript质粒移除含有启动子::正义片段::内含子::反义片段::3TJTR::nos终止子构建体的完整RNAi盒(SEQIDNO:32)并将其克隆至如实例2所述的双元载体pART29(经A^/消化)中以产生最终载体pAB583。通过使用设计类似于那些以上实例的片段中所用者的引物扩增另外4个片段(SeqIDNO:28-31)来构造表4中所列举的最终载体。将所有5个片段沿正义和反义方向克隆到如上所述的骨架载体中，然后将完整RNAi盒克隆到如上所述的pART29中。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>使用与那些上文所述者相同的方法构造表5中所列举的载体，不同之处为使用标准PCR技术用引物SEQIDNO:16和17来扩增PDK内含子序列(Wesley等人，Ptow27:581-590,2001)(SEQIDNO:15)。表5最终载体启动子沿正向和反向克隆的RNAi片段用作间隔区的内含子pARB578超级泛素(SEQIDNO:76)Euc.4CL200bp(SEQEDNO:27)SEQIDNO:15pARB579超级泛素(SEQIDNO:76)Euc.4CX223bp(SEQIDNO:28)SEQIDNO:15pARB580超级泛素(SEQIDNO:76)Euc.4CL300bp(SEQIDNO:29)SEQIDNO:15pARB581超级泛素(SEQEDNO:76)Euc.4CL336bp(SEQEDNO:30)SEQIDNO:15pARB582超级泛素(SEQIDNO:76)Euc.4CL500bp(SEQIDNO:31)SEQEDNO:15按照实例2中所述构造表6中所列举载体，其中有下列变化。使用设计类似于那些用于Pr4CL和PDK内含子序列者的引物来扩增yabby内含子序列(Foster等人,2002,PlantCell.14(7):1497-1508)并将其克隆到如实例2所述的载体骨架中。使用设计类似于那些以上实例中片段SEQIDNO:27-31所用者的引物来扩增片段插入体SEQEDNO:33和34。在下表6中指定处按照实例2中所述用火炬松4CL启动子替代来自辐射松超级泛素启动子+内含子的启动子。将所列举片段插入体和启动子克隆到如以上实例2中所述的最终载体中，然后将完整RNAi盒克隆到pART27中。yabby内含子(SEQIDNO:64)在每一构建体中均用作间隔区。表6最终载体驱动RNAi盒的启动子在yabby内含子间隔区周围沿正向和反向克隆的RNAi片段pARB339辐射松超级泛素+内含子(SEQIDNO:76)Euc.4CL200(SEQIDNO:33)pARB341辐射松超级泛素+内含子(SEQIDNO:76)Euc.4CL600(SEQIDNO:34)pARB345火炬松4CL(SEQIDNO:77)Euc.4CL200(SEQIDNO:33)pARB347火炬松4CL(SEQIDNO:77)Euc.4CL600(SEQIDNO:34)通过iV^/限制酶消化自上文所列举pARB345(SEQIDNO:89)最终载体移除包含启动子::正义片段::内含子::反义片段::3'UTR::nos终止子构建体的完整RNAi盒及使用标准克隆技术将其克隆至双元载体pARB1002或pARB1005(经NotI消化)中来构造表7中所列举的最终载体。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>类似地，通过自pARB599删除开花基因来产生载体pARB1202。这样，pARB1202就包括含有下列各部分的RNAi盒火炬松4CL启动子(SEQIDNO:77)、正义Euc.4CL200bp片段(SEQIDNO:33)、yabby内含子(SEQIDNO:64)和反义Euc.4CL200bp片段(SEQIDNO:33)。pARB1202的示意图提供于图24中。为了调节桉树植物中木质素含量，可使用包含启动子、第一段DNA片段和内含子的各种组合的构建体。利用从备选构建体中选择的构建体，从业人员可获得具有期望数量的木质素含量和生长的植物。在此方面，美国专利公开案第20040146904号和第20040163146号揭示多种维管优选型启动子且这些案件的全文均以引用的方式并入本文中。表8提供了可用于此方面的各种构建体。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>构建体pARB339、pARB345和pARB599由美国典型培养物保藏中心(P.O.Box1549,Manassas,Virginia,USA,20108)在2004年9月21日保存且分别给予其ATCC登录号PTA-6222、PTA-6223和PTA-6225。实例4:分离下列巨桉cDNA:CCoAOMT、C3H、C4H和CCR构造两个巨桉cDNA表达文库(一个来自单一树木各种组织的混合物且一个来自单一树木的树叶)并按照下列筛选。使用Chang等人的方案(i^aWMo/ecwZarAWogy尺eiwrter11:113-116，1993)自植物组织提取mRNA，其中有少许变动。具体而言，将试样溶于CPC-RNAXB(100mMTris-Cl,pH8,0;25mMEDTA;2.0MNaCl;2%CTAB;2%PVP和0.05%Spermidine*3HC1)中并用氯仿异戊醇(24:1)提取。用乙醇沉淀mRNA并使用Poly(A)QuikmRNA分离套组(Stratagene，LaJolla，CA)纯化全部RNA制备物。通过反向转录酶合成并随后按照制造商的方案使用ZAPExpresscDNA合成套组(Stratagene)将所得cDNA纯系插入LambdaZAP中来从经纯化m認A构造cDNA表达文库。使用GigapackIIPackagingExtract(Stratagene)并用1^试样DNA(来自5fil连接混合物)封装所得cDNA。使用XL1-BlueMRF细胞和XLOLR细胞(Stratagene)用ExAssist辅助噬菌体(Stratagene)对所述文库进行大块切除。切除的噬菌粒用NZY肉汤(GibcoBRL，Gaithersburg，MD)稀释并铺在含有X-gal和异丙基硫基-P-半乳糖苷(IPTG)的LB-卡那霉素琼脂平板上。在平铺和选择用于DNAminiprep的菌落中，99%含有适用于测序的插入体。在具有卡那霉素的NZY肉汤中培养阳性菌落并借助碱裂解方法和聚乙二醇(PEG)沉淀方法纯化cDNA。使用1%琼脂糖凝胶来筛选用于染色体污染的测序模板。使用TurboCatalyst800机器(PerkinElmer/AppliedBiosystems，FosterCity,CA)按照制造商的方案制备染色引物序列。使用PerkinElmer/AppliedBiosystemsPrism377序列分析仪获得阳性纯系的DNA序列。首先自5'末端且在某些情况下也可自3'末端对cDNA纯系测序。对于某些纯系而言，使用亚克隆片段获得内部序列。通过使用限制酶图谱的标准程序并亚克隆到pBluescriptIISK+载体来实施亚克隆。使用2.0.4版FASTA算法(1996年2月)(可在因特网上于ftp站点ftp:〃ftp.virginia.edu/pub/fasta/获得)或BLASTN算法(2.0.4版[1998年2月24日]或2.0.6版[1998年9月16日])比较所测定cDNA序列与EMBL数据库(1996年3月46版)中的已知序列。使用冗余序列的多次比对来构建可靠的一致序列。根据与其它植物种系已知序列的相似性，将本发明的分离聚核苷酸鉴别为编码特定酶。使用上文所述程序分离编码下列多肽的源自巨桉文库的cDNA序列咖啡酰基CoA甲基转移酶(美国专利第6,410,718号)、肉桂酸酯-4-羟化酶(C4H)(美国专利第6,410,718号)、p-香豆酸酯-3-羟化酶(C3H)(美国专利第5，981，837号)禾卩CCR(美国专利第6,410,718号)。实例5.辐射松LIM表达载体的构造按照实例2中所述构造表9中所列举的最终载体，其中有下列变动使用不同的片段、启动子和/或内含子。使用标准PCR技术和设计类似于那些实例2中所用者的引物扩增来自辐射松LIMcDNA纯系(专利申请案第WO00/53724号)的两个片段(SEQIDNO:38和39)。按照实例2中所述沿正义和反义方向将辐射松LIM片段克隆到骨架载体中。通过以类似于实例2中所述的方式改变启动子来构造表9中最终载体，其含有不同于骨架载体中所含启动子的启动子。使用实例2中所述方法将yabby内含子(SEQIDNO:64)插入最终载体中。将完整RNAi盒克隆到pART27或pART29中，如实例1和2中所述。表9.<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>为了在松树中使用基于pART27的载体，必须重新改造构建体以移除所选盒nos::叩tll。如实例2中所述，可移除Notl片段并将其插入具有Notl位点以及组成型启动子表达GUS(以检验不使用PCR时的转化)和可选标记盒(其包含受阿拉伯芥UbqlO启动子驱动的叩tll)的基础载体中。载体pWVR31可用作新基础载体。实例6.巨桉LIM表达载体的构造按照实例2中所述构造骨架质粒。使用标准PCR技术和被设计为可向扩增片段的两个末端添加和Wa/限制酶切位点的引物扩增来自巨桉LIMcDNA纯系(专利申请案第WO00/53724号)的两个片段(SEQIDNO:40和41)。沿正义方向克隆LIM片段时，使用限制酶Ecoi/和XkJ切割扩增片段、使用Klenow进行平端化并将其克隆至在平端化CZa/位点含有yabby内含子和辐射松超级泛素启动子序列(实例2中所述)的骨架载体中。沿反义方向克隆LIM片段时，使用限制酶Ea^/和处a/切割扩增片段、使用Klenow进行平端化并使用标准克隆技术将其克隆到位于平端化Pstl位点的相同骨架载体中。通过iV^/限制酶消化自骨架载体移除含有启动子::正义片段::内含子::反义片段::3'UTR::nos终止子构建体的完整RNAi盒并使用标准克隆技术将其克隆到双元载体pART29(经NotI消化)中。为了获得表10所列的含有不同启动子的最终载体，需使用实例2中所述方法取代所述启动子序列。使用此方法构造表10中所列举载体。<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>实例7.松树CCoAOMT表达载体的构造按照实例2中所述克隆下列载体，其中变动之处是使用设计类似于那些实例2中所用者并用于实例2中所述方法中的引物来扩增来自松树CCo-OMT(咖啡酰基-辅酶O-甲基转移酶)(SEQIDNO:42)的片段。还可使用实例2中所述方法通过添加yabby内含子和使用pART27双元载体来修饰最终载体。<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>为了在松树中使用所述载体，必须重新改造构建体以移除所选盒nos::nptll。如实例2中所述，可移除Notl片段并将其插入具有Notl位点以及组成型启动子表达GUS(以检验不使用PCR时的转化)和可选标记盒(其包含受阿拉伯芥Ubql0启动子驱动的nptll)的基础载体中。载体pWVRH可用作新基础载体。实例8.其它松树CCoAOMT表达载体的构造按照实例3中所述克隆下列载体，其中变动之处是使用设计类似于那些实例4中所用者并用于实例4中所述方法中的引物扩增来自松树CCo-AOMT(咖啡酰基-辅酶AO-甲基转移酶)(SEQIDNO:43)的片段。还可借助上文所述方法通过添加PDK内含子、使用具有内含子的辐射松超级泛素启动子或火炬松4CL启动子和使用pWVK147双元载体来修饰最终载体。<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>实例9.巨桉CCoAOMT表达载体的构造按照实例3中所述克隆下列载体，其中变动之处为使用设计类似于那些实例3中所用者并用于实例3中所述方法中的引物扩增来自巨桉(￡.gramfc)CCoAOMT(咖啡酰基辅酶AO-甲基转移酶)(SEQIDNO:44)纯系的片段(在实例4中分离，其在W098/11205中作为部分序列提出)。还可借助实例3中所述方法通过添加PDK内含子或桉树木质部内含子、巨桉COMT485bp启动子(SEQIDNO:78))及使用pART29双元载体来修饰最终载体。表13<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>按照实例3中所述克隆下列载体，其中变动之处为使用设计类似于那些实例3中所用者并用于实例3中所述方法中的引物扩增来自巨桉CCR(肉桂酰基CoA还原酶)纯系(SEQIDNO:45)(在实例4中分离)的片段。还可借助实例3中所述方法通过添加PDK内含子或桉树木质部内含子、巨桉COMT485bp启动子(SEQIDNO:78))、及使用pART29双元载体来修饰最终载体。表14<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>按照实例3中所述克隆下列载体，其中变动之处为使用设计类似于那些实例2中所用者并用于实例3中所述方法中的引物扩增来自巨桉C3H纯系(SEQIDNO:46)(在实例4中分离)或巨桉C4H纯系(SEQIDNO:47)(在实例4中分离，其在WO00/22099中作为部分序列提出)的片段。来自巨桉的阿拉伯半乳聚糖启动子(SEQIDNO:35)或来自火炬松的4CL启动子(美国专利第6,252,135号)用于这些载体。用^m///限制酶消化辐射松超级泛素启动子内含子载体并使用标准技术将其克隆至含有火炬松4CL启动子(经SamiZ/消化)或巨桉阿拉伯半乳聚糖启动子(经0。/消化)的Bluescript载体中。使用设计类似于那些扩增具有内含子的辐射松超级泛素启动子序列所用者的引物来扩增火炬松4CL启动子和巨桉阿拉伯半乳聚糖启动子且随后将其连接到实例3中所述的Bluescript基础载体中。还可借助实例3中所述方法通过添加Pr4CL内含子和使用pARB1002双元载体来修饰最终载体。表15.<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>使用下列程序将3个含有两个不同长度的RNAi片段的不同构建体pARB339、pARB341禾卩pARB345(见表16)转化到巨桉中。表16.<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>使用在伸长培养基(具有l(iMBAP、20g/L蔗糖和7g/L琼脂的MS)中微体繁殖培养的克隆巨桉叶片外植体进行转化。按照Burrel等人的国际公开案第WO00/12715号中所述进行转化，所述案件以引用的方式并入本文中。按照WO00/12715中所述选择转基因外植体，只是省略NAA且培养基含有50mg/L卡那霉素和250mg/L特美汀(timentin)。将外植体在此培养基上保留2周且随后在2周后将其转移至含有100mg/L卡那霉素和250mg/L特美汀的培养基且再过2周将其转移至含有150mg/L卡那霉素和250mg/L特美汀的培养基。随后按月将培养物转移至含有150mg/L卡那霉素和250mg/L特美汀的新鲜培养基中直至可收集到健康的单芽。将单芽置于伸长培养基上以增殖推定的转基因组织。当可自增殖组织收集约200mg组织时，自初始外植体移除此增殖组织以用于PCR分析。使用PuRe化《Ready-To-GoPCR珠粒(AmershamBiosciences)按照制造商的说明书进行PCR分析以确定启动子和所选基因的存在。随后进一步用含有150mg/L卡那霉素和250mg/L特美汀的伸长培养基进一步增殖具有阳性PCR结果的组织并将其保留为储存培养物。为了产生用于进一步测试的转基因植物，将一些芽置于伸长培养基上。将芽保留在此培养基上直至其高约2-3cm。如果此需要l个月以上，则每隔一个月将芽置于新鲜的培养基上。当芽高为2-3cm时，移除单芽并置于生根培养基中。在生根培养基中10天以后，将植物转移至温室中。那些熟悉植物转化和植物组织培养的人员应了解许多不同的培养基和间隔期可适于再生本发明植物。使植物在温室中于盆栽混合物中生长6个月，使用适当的湿度方案和杀真菌剂以控制真菌生长。使植物在环境温度及毛管水灌溉下生长于网格小室中。将植物栽培在5L塑料袋中补充有缓慢释放肥料的以土壤-少量泥煤为主的堆肥中。以破坏性方式对约6个月期的植物取样以进行木质素总量分析。髙度测量表17列举使用卡那霉素选择并在6个月后于土壤中存活的微体繁殖植物的百分比、在植入土壤中后第20周观测的矮小植物百分比及在将经pARB339、pARB341或pARB345转化的桉树植物植入土壤中后第22周观测的植物平均高度。经pARB341转化的植物的存活数据远远低于经pARB339或pARB345转化的植物的存活数据。在经pARB341转化并存活的全部植物中，有82%是矮小的，此表明DNA载体pARB341与其它两种载体(pARB339和pARB345)相比可在更大程度上影响植物的高度和存活率。表17.<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>图3和图4A中所示数据表明每一构建体对植物高度造成的明显影响。尽管经pARB345和pARB339转化的每组植物中最高的植物个体是接近的(分别为159cm和168cm)，但最矮的pARB339植物(53cm，64cm)较最矮的pARB345植物(91cm，96cm)矮很多。此图并不包含收集用于分析的矮小pARB341试样的平均高度。矮小pARB341植物的平均高度为13cm。木质素分析在约6个月时对按照以上实例中所述产生的转基因桉树取样以用于木质素分析。自所有待分析试样收集底部20cm茎。通过剥离自所述茎移除树皮、韧皮部和初生皮层且随后在液氮中迅速冷冻所述茎试样。按照制造商说明书在Flexi-Dry微处理器控制-耐腐蚀冻干机(StoneRidge,NewYork,USA)中对冷冻试样实施冷冻干燥。在Wiley磨机(ArthurH.Thomas公司；Philadelphia,U.S.A)中研磨试样且随后在环式磨机中再次研磨。随后将所研磨试样在55。C下干燥最少1天并在此温度下储存直至使用。通过将所研磨材料悬浮于溶剂或溶液中、用超声波净化器提取、离心且随后倾倒出上清液等一系列阶段自试样分离细胞壁材料。使用下列提取顺序两种浓度的NaCl、乙醇水溶液；CHCl3:MeOH;和丙酮。为了移除淀粉，洗涤所提取细胞壁材料，在叁-乙酸盐缓冲液中加热以使淀粉胶凝化且随后用a-淀粉酶处理。在酶处理之后，离心所述悬浮液并用乙醇和丙酮洗涤所得沉淀，使其静置过夜且随后在55'C下干燥。所分离细胞材料用于使用Fukushima,R.S.和Hatfield,R.D.(2001)/Ag,FoodC/^m.49(7):3133-9中所述方案进行的小规模木质素测定。结果示于图4A和图4B中。pARB341中的RNAi盒使所有转化植物中的矮小植物达82%。所收集的这些植物试样显示其将木质素水平减少至约正常水平的80%。当与另两种被测试载体相比时，此载体对植物高度具有最大的影响且其对减少木质素水平也有很大的影响。尽管木质素减少等级的极端的特征是矮小表现型，但在此研究中受到鉴别的所有植物中的最低木质素转基因种系(transline)(pARB345转基因种系)具有合理的正常高度。因此，在许多pARB341转化体中见到的矮小现象可能是由基因(不包括在木质化次生木质部中表达的4CL基因，例如，在植物其它部分表达的4CL基因或与4CL具有部分同源性的基因)受到抑制而造成的单独现象。pARB345中的RNAi盒与pARB339中的RNAi盒相比能更有效地产生木质素明显减少的表现型。pARB345中的200bpRNAi盒能够使木质素减少多达-25%也不会引发在许多转化体中由600bpRNAi盒(其受pARB341中的相同启动子驱动)产生的矮化效应。自以上木质素分析选择经pARB345转化的9株植物并使用热解分子束质谱及通过用于方法对比的固态^CNMR对从第一试样以上部位收获的第二个20cm茎试样进行木质素含量测定。所有3种方法给出近似相同的木质素减少数值。实施热解分子束质谱时，在石英舟中称重每一试样并在由石英管(内径为2.5cm)构成的反应器中热解所述试样，其中氦以5L/min(在STP下)流过。以使分子束质谱仪的采样口位于所述石英反应器末端内部的方式放置反应管。使用采用ExtrelTMTQMSC50型质谱仪的分子束质谱仪进行热解蒸气分析，如Evans&Milne(1987)(Energy&Fuels,1:123-37)中所述。对所述反应器进行电加热且将其温度保持在550°C。尽管热解反应在不超过50秒内完成，但总的热解时间为90秒。据估计，热解蒸气在反应器热解区中的滞留时间为75ms且其足够短以使得石英反应器中的二次裂化反应降至最低。用TekniventVector2tm数据采集系統使用22eV电子碰撞电离电压获得介于20-450Da之间的质谱数据。使用此系统，可同时并实时对轻气体和重焦油取样。热解蒸气的质谱可提供分子片段的快速、半定量图示。使用质量范围介于m/z50与200间的pyMBMS图谱进行的主要组份分析突出显示来自木质素和碳水化合物的热解产物同时能最大程度地减少小热解片段和电子撞击片段(低于m/z50)和提取物(高于m/z200)。实施木质素含量的NMR测定时，在4.7T及交叉极化(CP)和变角度旋转(MAS)下于一BrukerAvance200MHz光谱仪中收集高分辨率、固态13CNMR质谱。使用可变振幅交叉极化(整个交叉极化期间的线性斜坡为1db)来最小化在较高MAS转速下对Hartma皿-Hahn错配序列敏感的未质子化芳族碳原子的变化(S.0Smith,LKustanovich,X.Wu，O.B.Peersen,JournalofMageneticResonance(1994)104:334-339)。在53.6kHz下匹配iH和"C域并在匹配期间将ldB斜坡施加于质子r.f.。采集时间为0.033秒且扫频宽度为31.3kHz。在7000Hz速率下，进行变角度旋转。使用2ms接触时间和1.0秒脉冲重复率来平均2000-4000次扫描。在相对峰值强度方面观测到的差异及积分面积可用于确定类似试样间的差异。使用Haw等人1984(J.F.Haw.,G.E.Maciel.，H.A.Schroder,AnalyticalChemistry56:1323)的方法自芳香族(IIOppm-160ppm)区和碳水化合物(40ppm-100ppm)区的积分面积计算重量免木质素数值。.使用Unscrambler7.8版软件程序(CAMOA/S，Trondheim，Norway)进行数据分析。使用隐结构投影(PLS-1)算法(其一次仅处理1个Y-变量)来构造用于预测松树试样木质素含量的模型。使用pyMBMS谱作为X-矩阵(310个变量(m/z值介于50与360之间))并使用通过固态NMR测量的木质素数值作为Y-矩阵来形成可预知木质素含量的模型。在进行分析之前，将质谱归一化为总离子电流。使用完全交叉验证进行模型验证，其中自所述数据中系统地移除一个试样，利用其余试样建立模型且随后使用此模型来预测自数据组移除的试样的Y-变量数值。持续所述过程直至已经移除并自Y-矩阵预测全部试样。配合度(g卩，高相关系数)和最小剩余误差是用于选择最佳模型的标准。自NMR木质素数值和pyMBMS谱来构造可预测木质素含量的PLS1模型。当选取来自相同种系的1株以上树木作为试样来进行NMR分析时，取各树木对应质谱的平均值并使用其构建模型。使用介于50至360间的m/z数值构造PLS模型。此范围是根据经验确定的，以便基于完全交叉验证模型的相关系数提供最佳模型。表18显示9个所选试样的NMR结果的对比。NMRwt免木质素数值与所选试样的PCI分值的对比显示PCI分值可精确地反映火炬松试样中的木质素含量且PCI分值可用于评定不同构造物的木质素含量。在NMR测定的木质素含量与如上文所述由乙酰溴测定的含量之间也有极佳的相关性。表18.<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>将使用均苯三酚/HCl测定松柏醛单元的木质素组织化学测试应用于取自含有本发明DNA构建体的转基因植物侧枝的手切切片。均苯三酚(也称作Weisner试剂)是一种木质素染剂(Pomar等人，/VotopZa纖a，220(1-2):17-28(2002))且Maule染剂用于特定地检测紫丁香基木质素亚单位(Lewis等人，PZaWP/o^'o/AfW41:455-496(1990)。经pARB339和pARB345转化的转基因植物未显示与对照未转化植物的可观测差异。正常高度的pARB341植物也不具有与对照植物的可观测差异而矮小的pARB341植物具有降低的均苯三酚染色量，表明这些试样中的木质素水平大大地降低了。检查矮小pARB341转基因种系的染色切片，显示在转基因种系与转基因种系之间存在不同。具有特别极端的解剖学表现型的一个矮小转基因种系的两个无性系分株在其外观方面是高度一致的，表明所观测到的木质素沉积和解剖学的微扰具有(转)基因基础。也使用Maule染剂对矮小和正常高度的pARB341植物的手切切片染色。此染剂是紫丁香基木质素亚单元的特异性染剂(StrivastavaLM1966.Histochemicalstudiesonlignin.TappiJournal49:173-183)。如同经均苯三酚染色的切片一样，在矮小植物中观测到的木质素明显少于"正常的"植物且矮小植物茎干中明显缺乏维管分化。矮小pARB341植物由于具有粉色的木质而在表现型上也不同于其高大对应植物。这可在剥离茎干时观测到。与高大植物相比，这些植物的茎干也较软且有弹性。令人感兴趣的是，当剥去树皮、韧皮和初生皮层时,具有高大/"正常"表现型的少数pARB345植物也具有粉色木质。通过聚焦显微镜检查来检査两个野生型试样和10个转基因试样。所检査的10个转基因试样包括5株pARB339植物，一株具有粉色木质；2株矮小pARB341植物，均具有粉色木质；和3株pARB345植物，其中2株具有粉色木质。将2-3cm长的茎干片段固定在福尔马林醋酸-酒精(FAA)中。在水中洗涤试样并使用滑动式切片机以30-60mm厚度切片。使用番红和均苯三酚/HCl对切片进行染色以供用于借助聚焦显微镜检查进行解剖学分析。一些试样使用甲苯胺蓝色染剂检査。所有试样均含有大量及不同数量的受拉木质，其通常以缀块形式仅存在于茎干的一侧。其特征为具有或多或少未木质化次生壁的极厚壁纤维。在所有试样的受拉木质中，木质化程度的减少通过均苯三酚/HCl所染红色的减少和经番红染色后绿色荧光的增加及通过使用甲苯胺蓝色所染粉色来证实。为了自受拉木质效应辨别转基因表现型，使用聚焦显微镜检査法及番红染色(且亦使用均苯三酚/HCl染色)对所有试样中未显示典型受拉木质染色图案的正常木质茎干区进行检查。大多数试样中的正常纤维或导管细胞壁组成没有明显改变的迹象。来自pARB341转基因树木的2个试样显示表明细胞壁组成发生变化的解剖学表现型导管直径明显减少且导管细胞壁呈现波浪形外观。这些试样中的至少一个还显示了木质部(木髓中的木质化组织)外侧的变化。然而，应注意的是来自上文所鉴别的非矮小低木质素试样的试样未显示可通过聚焦显微镜检査法测定的解剖学异常。结果表明本发明构建体可导致出现生长高度、木质素含量减少和解剖学表现型改变的各种组合。因此，所揭示方法能够产生和选择呈现最佳表现型组合的转基因树木以用于生产纸浆或其它木制品。实例13.对火炬松中4CL构建体的评估使用PyMBMS评估木质素火炬松(巧mwto^a)和杂交松树(火炬松；c刚松)胚细胞系是使用美国专利第5,856,191号中所述方案自单独不成熟雌配子的合子胚产生并使用美国专利第5,506,136号中阐述的方案保持。在维持培养基上培养l-3个月之后，冻存组织培养物，储存长达数年时间并随后使用美国专利第6,682,931号的方法复苏。熟悉植物组织培养技术的人员应了解，其它冻存和恢复方案均可应用于本方法且不应将此实例的详细阐述诠释为限制所述方法的应用。通过按照美国专利第5,491,090号的方法用1g每种组织接种250mlNephdo带侧壁的烧瓶(KontesChemistryandLifeSciencesProducts)来建立来自每一种基因不同组织培养细胞系的均匀悬浮培养物。将含有存于液体培养基中的细胞的烧瓶置于处于23°C+2匸温度的黑暗培养室中且以100rpm转动的旋转振荡器上。一周后，通过向培养烧瓶中注入15ml新鲜培养基使每个烧瓶中液体达35ml并旋动以使细胞分布均匀。通过将细胞和培养基倾倒入烧瓶的侧壁部分、使细胞沉降30分钟并随后测量沉降细胞体积(SCV)来测量细胞生长。当SCV大于或等于最大SCV的一半(烧瓶体积的50%被植物细胞占据)时，将各培养物转移至总共含有80ml细胞和培养基的500ml带侧壁的烧瓶中并将转移培养物保持在相同的条件下。准备进行基因转移时，通过高压蒸汽灭菌对聚酯膜载体进行灭菌并将其置于单独的无菌布氏漏斗中，且对于每种细胞系的6个复制板中的每一个，将l-3毫升松树胚性悬浮液移至各载体以便胚组织均匀地分布。自所述组织抽吸液体培养基并按照美国专利公开案第20020100083号中所述的方法将具有胚形成组织的各载体置于用于土壤杆菌培育的凝胶化准备培养基上。具体而言，通过所属领域的技术人员所熟知的技术将双元构建体pWVC60、pWVC62、pWVK158、pWVK154、pWVK157、pWVK155、pWVK143、pWVC46、pWVC40、pWVC43和pWVC44各自导入不同的根癌土壤杆菌(Agra^acfen'wm似me/adew)分离物中，且在通过常用技术施与乙酰丁香酮时引发毒性，此时将每种经诱导土壤杆菌分离物与植物材料的各复制品混合。将这些细胞在黑暗中于22'C+2'C下共同培养约72小时。在共同培养后，按照美国专利公开案第20020100083号中所述的方法自所述培养物去除土壤杆菌。然后以2周间隔将聚酯膜载体上载有的细胞转移至新鲜的选择培养基中。在许多培养皿上众多隔离区中的选择培养基上均发生了积极生长。在选择试剂存在下此积极生长通常表示生长组织已经将选择基因整合入其染色体中并受到稳定转化。这些积极生长的区域被视为独立转化事件且因此被称作推定的转基因亚系。通过将生长转基因扇区转移至补充有相应选择试剂的新鲜半固体维持培养基中可增加推定的转基因胚形成组织。在达到约2g之后选择推定的转化亚系使用标准技术实施聚合酶链反应(PCR)扩增以验证转基因的存在。表19.用于PCR的引物对(SEQIDN068-75，分别按照出现顺序给出)<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>也可使用来自每一亚系的材料进行GUS染色和显微镜检查。对于GUS染色，通过按照植物转化技术中熟知的技术对来自各转基因细胞系的细胞在暴露于生色葡糖醛酸酶酶底物"X-gluc"(可自Inalco购得)后进行深蓝染色来检测被插入wVM基因(其编码在组织培养细胞中表达的酶P-葡糖醛酸酶)。显微镜检查表明细胞分化已经恢复且转基因的瞬时表达对这些轰击展现正常的频率。可发芽的胚按照下列制备。当己经在选择培养基上培养的细胞团增殖到至少1克后，将每一细胞团再次分别重新悬浮于液体培养基中。当使细胞悬浮液成为均匀的(最大值的一半)SCV时，将等量的悬浮培养细胞转移到无菌膜载体上并将其置于如美国专利第5,506,136号所述的发育/成熟培养基上以形成可收获的高品质第3阶段(子叶)胚。在黑暗生长室中于23+2'C下培育培养皿。每3周将膜载体转移到含有新鲜培养基的新陪替氏培养皿(petridish)中。在第9周时，以目测方式分析第3阶段(子叶)胚的发芽品质并收获到美国专利第5,506,136号所述培养基上的纤维载体上并在黑暗中于4'C土2'C的温度下培育约4周。接下来，在黑暗中于25'C土2'C温度下将其纤维载体上的胚在密封容器中的水上培育约3周。在进行以上两次处理之后，将其纤维载体上的胚转移至发芽培养基并在黑暗中于25'C士2'C的温度下将其培育约3天。然后自其纤维载体移除胚并将其置于新鲜发芽培养基的表面上。在光中于25。C土2。C的温度下进行发芽。每周检查一次发芽平板，持续约4周，并将发芽胚转移到含有100ml发芽培养基的MAGENTA⑧箱中以转化成幼苗。将含有正在发育幼苗的MAGENTA⑧箱在光中于25。C士2。C下培育约8-12周。当幼苗形成上胚轴(约2-4cm的新生芽)时，将其转移至填充有盆栽用混合物[2:1:2的泥炭:珍珠岩:蛭石，含有602g/m3OSMOCOTE月巴料(18-6-12)、340g/m3白云石石灰和78g/m3MICRO-MAX微量营养混合物(SierraChemical公司)]的容器中。使所述幼苗生长在阴暗的温室中并偶尔喷洒水雾，达约2周时间。使其脱离水雾以在温室环境中适应约4周。然后将幼苗转移至室外阴凉处达约6周以适应最终环境，然后移到完全日晒条件下。然后使这些幼苗在容器中生长直至条件允许田间种植。测量经上述RNAi载体转化的5个月期火炬松树的高度并记录结果(表20)。对高度数据进行邓肯多重范围(DuncanMultipleRange)检验且发现经含有pWVKl57、pWVK155、pWVC40、pWVC43和pWVC44的RNAi盒的载体转化的植物与GUS对照植物(pWVC41)相比不具有任何明显的高度差别，而所有其它经转化系与对照相比均显示明显的高度差异。还测得单一未转化对照的高度为21.1cm但没有对此试样进行统计学分析，因为所述高度为单一结果而非多个试样的平均值。在5个月时测量所有经转化树木和对照树木的根部干重但没有观测到对照试样与转基因试样之间存在明显的差异。通过自每一茎干切割约20mg组织自以上经转化树木或对照未转化树木收集约200个7个月期的试样。在石英舟中对每一试样称重并在由石英管(内径为2.5cm)构成的反应器中热解所述试样，其中氦以5L/min(在STP下)流过。以使分子束质谱计的采样口位于石英反应器末端内部的方式放置反应管。使用采用ExtrelTMModelTQMSC50质谱仪的分子束质谱仪进行热解蒸气分析，如Evans&Milne(1987)(Energy&Fuels,1:123-37)中所述。对所述反应器进行电加热且将其温度保持在550°C。尽管热解反应在不超过50秒内完成，但总的热解时间为90秒。据估计，热解蒸气在反应器热解区中的滞留时间为75ms且其足够短以最大程度地减少石英反应器中的二次裂化反应。用TekniventVector2，数据采集系统使用22eV电子碰撞电离电压获得介于20-450Da之间的质谱数据。使用此系统可同时并实时对轻气体和重焦油取样。热解蒸气的质谱可提供分子片段的快速、半定量图示。连续两天以成段方式收集火炬松试样组和标准试样的复制物质谱以减少可能由于光谱仪每天偏移引起的与数据分析相关的问题。对两天所收集质谱的组合分析表明仅存在最小的光谱仪偏移。检查所述光谱可确定转基因试样的质谱不同于对照的质谱。来自转基因和对照火炬松试样的热解产物的pyMBMS谱的实例示于图14中。使用介于m/z50与200之间质量范围的火炬松pyMBMS谱的主要组份分析突出显示来自木质素和碳水化合物的热解产物同时最大程度地减少小热解片段和电子撞击片段(低于m/z50)和提取物(高于m/z200)。通过选择含有较多关于木质素的信息和较少关于提取物的信息的质量范围，构建体之间的明显差异会变得明了。图15A显示对于所有所分析转基因试样使用m/z50-200质量范围所收集的质谱的PCI分值对PC2分值的散点图。自此散点图，我们可得出如下结论经某些载体转化的植物与对照未转化植物相比显示明显的不同，这是因为自质谱分析和PC装载所测定的木质素数量不同，而其它则没有明显不同。图15B、16A和16B提供额外的鉴别信息。经pWVC41转化的树木是GUS对照转基因树木且其未显示不同于对照未转化树木。经pWVC40和pWVK154转化的树木均含有编码松树4CL片段D的序列(SEQIDNO:21)且经pWVC46和pWVK158转化的树木均含有编码松树4CL片段C的序列(SEQIDNO:20)。这些转化体中的每一个在散点图上与对照试样分开，此表明转基因试样与对照试样之间的木质素数量是不同的。图17显示图16A中所选试样(即对照、转基因试样pWVC40和pWVK154)的扩展质谱区。很明显，由木质素热解产生的峰值相对于可赋予碳水化合物和提取物(参见表21)的其它峰值有所降低。对其它构建体进行类似的质谱分析表明PC1可反映每一试样中的木质素浓度。图15-16中右侧试样具有最高的木质素含量且左侧试样具有远低于其的木质素含量。经pWVK158、pWVK154、pWVC46和pWVC40转化的7个月期火炬松树显示当与未转化对照和GUS转化对照相比时，木质素含量减少最大。经pWVK158、pWVK154和pWVC42转化的树木较未转化和GUS转化树木明显更矮，而经pWVC40转化的树木具有明显木质素减少但无明显高度减少。使用核磁共振谱评估木质素在4.7T及交叉极化(CP)和变角度旋转(MAS)下于BrukerAvance200MHz光谱仪中收集高分辨率、固态"CNMR谱。使用可变振幅交叉极化(整个极化期间的线性斜坡为1db)来最小化在较高MAS转速下对Hartmann-Hahn错配序列敏感的未质子化芳族石发原子的变化(S.OSmith,I.Kustanovich，X.Wu,0.B.Peersen,JournalofMageneticResonance(1994)104:334-339)。在53.6kHz下匹配&和13C域并在匹配期间将ldB斜坡施加于质子r.f.。采集时间为0.033秒且扫频宽度为31.3kHz。在7000Hz速率下，进行变角度旋转。使用2ms接触时间和1.0秒脉冲重复速率来平均2000-4000次扫描。在相对峰值强度方面观测到的差异及积分面积可用于鉴别类似试样间的差异。使用Haw等人1984(J.RHaw.，GE.Maciel.,H.A.Schroder,AnalyticalChemistry56:1323)的方法自芳香族(IIOppm-160ppm)区和碳水化合物(40ppm-100ppm)区的积分面积计算重量％木质素数值。.根据其pci分值选择12个试样并使用固态13CNMR测定木质素含量。在某些情况下，将来自相同种系的若干试样组合以获得一足够大的试样以供NMR分析。图18显示对照种系(两个试样组合)与转化种系pWVK154(四个试样组合)的NMR谱的对比。NMR谱证实了pyMBMS分析的结果，即pWVK154转基因种系较对照种系具有低得多的木质素含量。通过结合对木质素和碳水化合物结构的某些假定对芳香族区和碳水化合物区进行积分来确定重量％木质素(参见Haw等人，(1984)Amz/yft'ca/C&mZ^7，56:1323)。12个所选试样的结果在表22中给出。利用所选试样的PCI分值进行的NMRwt呢木质素数值对比显示，PCI分值可精确地反映火炬松试样中的木质素数量且PC1记分可用于评定不同构建体的木质素含量。使用多变量数据分析评估木质素使用Unscrambler7.8版软件程序(CAMOA/S,Trondheim，Norway)进行数据分析。使用隐结构投影(PLS-1)算法(其一次仅处理1个Y-变量)来构造用于预测松树试样木质素含量的模型。使用pyMBMS谱作为X-矩阵(310个变量(m/z值介于50与360之间))并使用通过固态NMR测量的木质素数值作为Y-矩阵来形成可预知木质素含量的模型。在进行分析之前，将质谱归一化为总离子电流。使用完全交叉验证进行模型验证，其自所述数据中系统地移除一个试样，利用其余试样建立模型且随后使用此模型来预测自数据组移除的试样的Y-变量数值。持续所述过程直至移除并自Y-矩阵预测全部试样。配合度(即，高相关系数)和最小剩余误差是用于选择最佳模型的标准。自NMR木质素数值和pyMBMS谱构造可预测木质素含量的PLS1模型。当选取来自相同种系的1株以上的树木作为试样来进行NMR分析时，取所述树木的对应质谱的平均值并使用其构建模型。使用介于50至360之间的m/z值构造PLS模型。此范围是以经验方式确定的，以便基于完全交叉验证模型的相关系数提供最佳模型。示于图19中的最终完全交叉验证模型具有0.9的RMSEP和0.94的rM直。使用由NationalRenewableEnergyLaboratory(Golden,Colorado)石开发的基于NMR的模型测定每一转化种系的木质素水平。表20显示每一RNAi构建体与未转化对照相比的木质素百分比。所有转化体显示木质素相对于对照植物有所减少，但不同的种系具有不同数量的木质素。包含具有片段C或D的构建体的转化体显示最大的木质素减少。表20.RNAi构建体对木质素水平的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>图10提供显示自每一转化体所获得的木质素数值的图形。所述构建体是按照沿X-轴的平均高度顺序列出。因此，所述结果显示在松树中，片段C和D与生长以及木质素的平均减少相关。片段E既不减少生长，也不在很大程度上减少木质素。自片段A(受任何启动子驱动)或片段F(受4CL启动子驱动)可见，最佳木质素减少并不伴随平均生长减少。这些构建体构成森林学应用的适当表现型。表21提供与火炬松木头试样的热解分子束质谱相关的质谱峰值分配(Evans等人，&1:123-137(1987))。表21.<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>1片段离子。表22:通过NMR测得的木质素重量9fc数值用以转化种系的构建体NMR测定的木质素重量％<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>实例14.松树转化体的田间测试从122行中的每一行中选出4-8个基因等同的繁殖体(无性系分株)用于田间种植，对于16个构建体的每一个均包含约相等数量的行，共以随机划块设计方式种植约1000株树苗。将经4CL启动子驱动的构建体和超级泛素启动子驱动的构建体转化的细胞系种植于约500株树苗的单独区块(各自具有对应的对照)中。表23中用星号标记的构建体产生至少一些矮小转化体。自所述表中可见，具有受超级泛素启动子驱动的构建体的转化体更有可能显示矮小。同时，具有受4CL启动子驱动的构建体的转化体更有可能显示木质素减少而没有明显的矮化现象，如可自下表23中所见，其中运用邓肯多重范围检验来测量高度。在表23中可观测到，较大高度类别中主要呈现含有受维管优选型启动子驱动的构建体的转化体。因此，具有组织优选型启动子的构建体较佳。表23.在田间测试中种植的4CLRNAi转化树木和对照树木。按照转基因树木的平均高度(在第8个月时测量)和根部质量(在第12个月时测得，即在植入田间时)进行评定<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>对高度和根部质量统计进行邓肯多重范围检验。实例15.碳水化合物水平的评估次生木质部(木材)主要由纤维素(一种线性葡萄糖聚合物)、半纤维素(一种被发现与纤维素相关的线性杂多糖；在裸子植物中，主要的组份糖是甘露糖)和木质素(一种不能够通过水解来解聚的酚类聚合物)组成。不同水平的碳水化合物(CHO)和木质素可影响树木在诸如制浆等过程中的使用。纤维素是纸浆产品的主要组份且产率还可受与纤维素相关的半纤维素的数量和类别的影响。另外，木材的纤维素含量与强度正相关，其对于纸浆和实木制品均非常重要。Harding等人(1999)(7Vaf历ofec/moU7(8):808-12)发现具有较低木质素水平的转基因白杨树显示升高的CHO水平。Harding等人认为CHO水平的升高归因于具有较低木质素水平的树木保存了植物结构完整性且这些树木会显示对制浆更有用。可测试总木质素数量被测试的转基因植物材料的碳水化合物(CHO)，其作为所存在纤维素和半纤维素数量的量度。对不含提取物的磨碎试样进行碳水化合物分析。这些试样用72%硫酸分2个阶段水解，首先通过在室温下培育1/2小时、然后在12CTC下培育1小时、倒出并通过离子层析来分析。自层析图确定阿拉伯聚糖、半乳聚糖、葡聚糖、木聚糖和甘露聚糖的百分比干木重量(DWW)。Hu等人(1999)(NatureBiotechnology17:808-812)阐明下调4CL基因的转基因白杨树呈现高达45%的木质素含量减少和15%的纤维素含量增加。估测实例15中被测试木质素的转基因树木的碳水化合物水平可确定这些构建体是否显示木质素含量减少与纤维素含量增加之间的相关性。转基因树木CHO的测定结果表明与经转化树木中纤维素或半纤维素含量的变化相关的那些构建体。这些结果表明这些构建体能够调节与纸浆产率及纸浆纤维和实木制品的强度相关的纤维素含量。所述构建体可改变经转化树木中的纤维素或半纤维素含量。经转化树木的木质素水平减少和CHO水平增加可为纸浆工业提供经济和环保优势。具体而言，木质素含量减少会减少制浆和漂白过程中所用的化学品。实例16.用于分析木质素含量的其它方法在此实例中，对先前在实例13中检查的树木基因纯系的较老试样进行解剖学分析以比较6个月期植物与约18个月期植物之间的转基因植物细胞结构和木质素含量。另外，通过聚焦显微镜检查法检査其木质素总量、CHO数量被测试且在实例11和13中分别被微浆化的转基因植物材料以观看所存在的细胞结构。将试样固定于福尔马林醋酸-酒精(FAA)中。在水中洗涤试样并使用滑动式切片机以30-60mm厚度切片。使用番红染色对切片进行染色并使用聚焦显微镜检查。还对所述试样施用木质素组织化学测试，其使用均苯三酚/HCl测定松柏醛单元。一些试样还使用作为木质素另一染剂的甲苯胺蓝色染剂进行检査。此解剖学分析可鉴别所存在反应木头的数量和转基因植物的木头(木质部)细胞是否相对于对照植物显示任何不同。这些结果表明在实例12和13中显示具有减少木质素水平但显示正常形态学的转基因树与具有"正常"/较高木质素水平的非转基因树在细胞结构方面不存在明显的不同。这些结果进一步证明所观测的6个月期树木的细胞结构与所观测到的18个月期树木试样的细胞结构是一致的。实例17.低木质素树木的加工为了测定木质素含量降低是否转化成了对制桨工艺的改进，可对所述实例的转基因树木进行微浆化。用于确定牛皮纸制浆木材资源适宜性的重要参数为纸浆产率、制浆速率、碱耗量、纤维品质和纸浆漂白性能。木头试样经空气干燥、制成碎片且然后在烘箱中于105'C下干燥至少2天直至达到恒定重量。在连接到Stalsvets多消化器制浆单元(Sdlsvets,Sweden)的旋转臂的150mL不锈钢反应器中进行牛皮纸制桨。所述反应器旋转通过聚乙烯浴，所述聚乙烯浴由具有12.5kW总容量的电加热器加热并由Omron控制器(Omron公司，Illinois,USA)来控制。典型的制浆条件为有效的碱量14%(以Na20计》液体硫化率30%液体木材比率6:1最高制浆温度170°C到达最高温度的时间90分钟H-因子通过改变170'C下的时间来测定那些熟悉纸浆制造技术的人员应理解微制浆条件的许多其它组合亦可用于测试本发明树木的木头可制浆性。所述反应器在冷水中骤冷并使用布氏漏斗过滤出经烹煮的碎片。保留滤液以用于残留碱分析。用自来水充分洗涤经烹煮碎片且随后在标准英式粉碎机中掺合15分钟。所得纸浆用布氏漏斗过滤并用水洗涤直至滤液为清澈的。将纸浆垫在60'C下干燥过夜并通过称重测定总产量。残留碱通过用0.5M盐酸滴定至第一个拐点来测定(Milanova，E.andDorris,G.M.,A/oni/cPw/p朋dPaperi"earc/z丑，9(1),4-9(1994))。碱耗量是碎片上的有效碱量与黑色液体中残留碱之差，表示为烘箱干燥碎片的百分比(以N^O计)。纸浆k数值通过半阶改变AppitaStandard201m-86(AS/NZS1301.201s:2002)来确定。制浆速率计算为达到给定烹煮时间的k数值。纸浆漂白性能通过在10%稠度下使用D-Eo-D序歹U(Kibblewhite等人，A/^"a,51(2)，1145-121(1998))按照下述对纸浆漂白来测定D阶段:0.25活性氯系数，100%工业二氧化氯，5CTC，60分钟。Eo阶段:2%NaOH，0.25mPaO2，70°C，60分钟。D阶段1%CIO"7(TC，180分钟。在漂白之后，于pH4-5.5下制备5g亮度垫并在23°C/50%RH下使用L&WElrepho(Lorentzen&Wettre,Kista,Sweden)平衡后测定亮度。使用KamanFiberglas系统(MetsAutomation,Kaman，Finland)分析诸如平均纤维长度、宽度和管腔尺寸等纤维性质和标准偏差。结果与转化中所用类型的构建体相关且表明所述构建体可有效地调节牛皮纸制浆所用木材资源的适宜性。实例18.反义构建体生成反义转录本的表达构建体可用于调控植物中的木质素含量。在此方面，本文所揭示任何启动子均可与来自本文所揭示任何基因的序列组合以产生可生成反义转录本的重组构建体。利用巨桉4CL基因的若干示范性表达盒提供于表24中。pARB1201、pARB598、pARB411和pARB412的载体图谱分别提供于图20、图21和图27中。构建体pARB598由美国典型培养物保藏中心(P.O.Box1549，Manassas,Virginia,USA,20108)在2004年9月21日保存且给予ATCC登录号PTA-6224。表24.<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>实例19.4CL的正义构建体用于调节植物中木质素的构建体还可通过组合本文所揭示任何启动子与所定向4CL基因的至少一部份来制备以生成正义转录本。这些构建体产生高水平的可抑制靶基因表达的4CL正义转录本。示范性构建体是pARB368，其图示于图25中。此构建体的表达盒包括辅射松4CL启动子(SEQIDNO:77)，其以可操作方式连接到按照美国专利第6,410,718号所述分离的来自巨桉的全长4CLcDNA(SEQIDNO:84)。实例20.包含Cald5H的构建体用于调节植物中木质素的构建体可通过组合本文所揭示任何启动子与Cald5H基因的至少一部分来制备。这些构建体可通过变更转化体中愈创木基紫丁香基木质素单体比率来改变转基因植物的木质素组成。若干示范性表达盒提供于表25中。所述载体的质粒图谱提供于图20-22、图24和图28中。将这些构建体的每一个设计为过度表达Cald5H并由此评定转化植物中的紫丁香基含量。这些构建体中所用Cald5H基因(SEQIDNO:83)自枫香树木质部cDNA文库分离，如美国专利第6，252，135号所述。表25.<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>实例21.包含SAD的构建体用于调节植物中木质素的构建体可通过组合本文所揭示任何启动子与SAD基因的至少一部分来制备。这些构建体可通过变更转化体中愈创木基紫丁香基木质素单体比率来改变转基因植物的木质素组成。若干示范性表达盒提供于表26中。所述载体的质粒图谱提供于图25-26中。将这些构建体的每一种设计为过度表达SAD并由此评定转化植物中的紫丁香基含量。这些构建体中所用EGBASAD基因(SEQIDNO:85)自巨桉cDNA文库分离，所述文库自成熟的芽蕾产生这些构建体中所用EHUASAD基因(SEQIDNO:86)是自cDNA文库分离，所述cDNA文库自发育的桉树伞状花序(未开放伞状蕾)产生。这些cDNA文库可按照实例2中所述制备。表26.<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>表27提供本文所述许多聚核苷酸和DNA构建体的核酸序列。表27.<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>序列内含子序列PDK200580039277.4势s齿被46/803<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>序列号<table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table>权利要求1、一种DNA构建体，其包含以可操作方式连接到第一段DNA片段的启动子，所述第一段DNA片段对应于木质素单体生物合成途径中的基因的至少一部分，间隔区DNA片段，和与所述第一段DNA片段互补的第二段DNA片段，其中所述第一段和第二段DNA片段在所述DNA构建体中分别沿5’至3’方向排列。2、如权利要求1所述的DNA构建体，其中木质素单体生物合成途径中的所述基因选自由4CL、C3H、CCR、C4H和CCoAOMT组成的群组。3、如权利要求1所述的DNA构建体，其中所述启动子是组成型启动子。4、如权利要求1所述的DNA构建体，其中所述启动子是组织特异性启动子。5、如权利要求4所述的DNA构建体，其中所述启动子以维管优选方式引导表达以便在植物木质部中发生表达。6、如权利要求1所述的DNA构建体，其中所述启动子来自火炬松(P.toMa)的4CL启动子。7、如权利要求1所述的DNA构建体，其中所述基因的所述部分具有选自由约50bp、100bp、200bp、400bp、600bp和1000bp组成群组的片段长度。8、如权利要求1所述的DNA构建体，其中所述基因的所述部分具有约200bp的片段长度。9、如权利要求1所述的DNA构建体，其中所述基因的所述部分具有约334bp的片段长度。10、如权利要求1所述的DNA构建体，其中木质素单体生物合成途径中的所述基因是4CL基因。11、如权利要求10所述的DNA构建体，其中所述基因的所述部分选自由SEQIDNO18、19、20、21、22、23、24和178组成的群组。12、如权利要求IO所述的DNA构建体，其中所述基因的所述部分包括SEQIDNO:18的核苷酸序列。13、如权利要求10所述的DNA构建体，其中所述基因的所述部分包括SEQIDNO:23的核苷酸序列。14、如权利要求10所述的DNA构建体，其中所述基因的所述部分包括SEQIDNO:163的核苷酸序列。15、如权利要求1所述的DNA构建体，其中所述间隔区DNA片段为内含子的至少一部分。16、如权利要求1所述的DNA构建体，其中所述间隔区DNA片段包含选自由SEQIDNO:9、SEQIDNO:15和SEQIDNO:194组成的群组的核苷酸序列。17、如权利要求10所述的DNA构建体，其中所述启动子为维管优选型启动子且所述第一段DNA片段包括SEQIDNO:163的核苷酸序列。18、如权利要求10所述的DNA构建体，其中所述启动子为维管优选型启动子且所述第一段DNA片段包括SEQIDNO:18的核苷酸序列。19、如权利要求IO所述的DNA构建体，其中所述启动子为维管优选型启动子且所述第一段DNA片段包括SEQIDNO:23的核苷酸序列。20、如权利要求10所述的DNA构建体，其中所述DNA构建体选自由pARB345、pWVK158、pWVK154、pWVK143、pWVC46、pWVC40和pWVC44组成的群组。21、如权利要求1所述的DNA构建体，其进一步包括至少一个T-DNA边界。22、一种DNA构建体，其包含以可操作方式连接到第一段DNA片段的启动子，所述第一段DNA片段对应于LIM基因的至少一部分，间隔区DNA片段，和与所述第一段DNA片段互补的第二段DNA片段，其中所述第一段和第二段DNA片段在所述DNA构建体中分别沿5'至3'方向排列。23、一种调节植物中木质素表达的方法，其包括将如权利要求1所述的DNA构建体导入所述植物中并使所述植物生长。24、一种抑制植物中木质素表达的方法，其包括将如权利要求1所述的DNA构建体导入所述植物中并使所述植物生长。25、一种减少植物中木质素表达的方法，其包括将如权利要求1所述的DNA构建体导入所述植物中并使所述植物生长。26、一种抑制植物细胞中木质素表达的方法，所述方法包括将沿5'至3'方向包含下列各部分的DNA构建体整合于所述植物细胞的基因组中启动子、对应于木质素单体生物合成途径中的基因的至少一部分的第一段DNA片段、间隔区DNA片段和与所述第一段DNA片段互补的第二段DNA片段；及使所述植物细胞生长。27、如权利要求26所述的方法，其中木质素单体生物合成途径中的所述基因选自由4CL、C3H、CCR、C4H和CCoAOMT组成的群组。28、如权利要求26所述的方法，其中所述基因的所述部分具有约50bp、100bp、200bp、400bp、600bp和1000bp的片段长度。29、如权利要求26所述的方法，其中所述基因的所述部分具有约200bp的片段长度。30、如权利要求26所述的方法，其中所述基因的所述部分具有约334bp的片段长度。31、如权利要求26所述的方法，其中木质素单体生物合成途径中的所述基因是4CL。32、如权利要求31所述的方法，其中所述基因的所述部分选自由SEQEDNO18、19、20、21、22、23、24和178组成的群组。33、如权利要求31所述的方法，其中所述基因的所述部分包括SEQIDNO:18的核苷酸序列。34、如权利要求31所述的方法，其中所述基因的所述部分包括SEQIDNO:23的核苷酸序列。35、如权利要求31所述的方法，其中所述基因的所述部分包括SEQIDNO:163的核苷酸序列。36、如权利要求31所述的方法，其中所述DNA构建体选自由pARB345、pWVK158、pWVK154、pWVK143、pWVC46、pWVC40和pWVC44组成的群组。37、如权利要求26所述的方法，其中所述整合是使用一个以上的DNA构建体实现。38、如权利要求26所述的方法，其中所述植物是裸子植物。39、一种包含如权利要求1所述的DNA构建体的植物。40、一种包含如权利要求1所述的DNA构建体的植物细胞。41、一种植物细胞，其沿5'至3'方向包含启动子、对应于木质素单体生物合成途径中的基因的至少一部分的第一段DNA片段、间隔区DNA片段和与所述第一段DNA片段互补的第二段DNA片段。42、如权利要求41所述的植物细胞，其中木质素单体生物合成途径中的所述基因选自由4CL、C3H、CCR、C4H和CCoAOMT组成的群组。43、如权利要求41所述的植物细胞，其中所述启动子对于所述植物细胞而言是内源性的。44、一种包含如权利要求41所述的植物细胞的植物。45、一种源自如权利要求44所述的转基因植物的纸浆和纸浆制品。46、一种源自如权利要求44所述的转基因植物的实木制品。47、如权利要求46所述的木制品，其中所述制品选自由木料(timber)、木材(lumber)和复合材料组成的群组。48、一种具有减少的木质素含量的植物，其通过如权利要求26所述的方法产生。49、一种源自如权利要求48所述的转基因植物的纸桨和纸浆制品。50、一种源自如权利要求44所述的转基因植物的实木制品。51、如权利要求50所述的木制品，其中所述制品选自由木料、木材和复合材料组成的群组。52、一种制造木头(wood)的方法，其包括将沿5'至3'方向包含下列各部分的DNA构建体整合于植物细胞的基因组中启动子、对应于木质素单体生物合成途径中的基因的至少一部分的第一段DNA片段、间隔区DNA片段和与所述第一段DNA片段互补的第二段DNA片段；使所述植物细胞生长及获得所述木头。53、如权利要求52所述的方法，其中木质素单体生物合成途径中的所述基因选自由4CL、C3H、CCR、C4H和CCoAOMT组成的群组。54、一种通过如权利要求52所述的方法获得的木头。55、一种制造木浆的方法，其包括将沿5'至3'方向包含下列各部分的DNA构建体整合于植物细胞的基因组中启动子、对应于木质素单体生物合成途径中的基因的至少一部分的第一段DNA片段、间隔区DNA片段和与所述第一段DNA片段互补的第二段DNA片段；使所述植物细胞生长及获得所述木浆。56、如权利要求55所述的方法，其中木质素单体生物合成途径中的所述基因选自由4CL、C3H、CCR、C4H和CCoAOMT组成的群组。57、一种通过如权利要求55所述的方法获得的木浆。58、一种造纸方法，其包括将沿5'至3'方向包含下列各部分的DNA构建体整合于植物细胞的基因组中启动子、对应于木质素单体生物合成途径中的基因的至少一部分的第一段DNA片段、间隔区DNA片段和与所述第一段DNA片段互补的第二段DNA片段；使所述植物细胞生长及获得所述纸。59、如权利要求58所述的方法，其中木质素单体生物合成途径中的所述基因选自由4CL、C3H、CCR、C4H和CCoAOMT组成的群组。60、一种通过如权利要求58所述的方法获得的纸。61、一种DNA构建体，其包含以可操作方式连接到第一段DNA片段的启动子，所述第一段DNA片段对应于木质素单体生物合成途径中的基因的至少一部分，间隔区DNA片段，和与所述第一段DNA片段互补的第二段DNA片段，其中所述第一段和第二段DNA片段在所述DNA构建体中分别沿5'至3'方向排列且木质素单体生物合成途径中的所述基因是4CL基因且其中所述DNA构建体选自由pARB1202、pARB675和pARB599组成的群组。62、如权利要求61所述的DNA构建体，其中所述DNA构建体是pARB1202。63、如权利要求61所述的DNA构建体，其中所述DNA构建体是pARB675。64、如权利要求61所述的DNA构建体，其中所述DNA构建体是pARB599。65、一种DNA构建体，其包含以可操作方式连接到对应于4CL基因的至少一部分的DNA片段上的启动子以便沿反义方向生成所述DNA片段的转录本，其中所述DNA构建体为pARB1201、pARB598、pARB411和pARB412。66、如权利要求65所述的DNA构建体，其中所述DNA构建体是pARB1201。67、如权利要求65所述的DNA构建体，其中所述DNA构建体是pARB598。68、一种DNA构建体，其包含以可操作方式连接到对应于4CL基因的至少一部分的DNA片段上的启动子以便沿正义方向生成所述DNA片段的转录本，其中所述DNA构建体为pARB368。69、如权利要求68所述的DNA构建体，其中所述DNA构建体是pARB1203。70、如权利要求68所述的DNA构建体，其中所述DNA构建体是pARB1205。71、如权利要求68所述的DNA构建体，其中所述DNA构建体是pARB675。72、如权利要求68所述的DNA构建体，其中所述DNA构建体是pARB661。73、如权利要求68所述的DNA构建体，其中所述DNA构建体是pARB662。74、一种DNA构建体，其包含以可操作方式连接到对应于CAld5H基因的至少一部分的DNA片段上的启动子，其中所述DNA构建体选自由pARB1203、pARB1205、pARB675、pARB661、pARB662和pARB374组成的群组。75、一种DNA构建体，其包含以可操作方式连接到对应于SAD基因的至少一部分的DNA片段上的启动子，其中所述DNA构建体选自由pARB486、pARB487和pARB488组成的群组。76、一种包含如权利要求61所述的DNA构建体的植物细胞。77、一种包含如权利要求65所述的DNA构建体的植物细胞。78、一种包含如权利要求68所述的DNA构建体的植物细胞。79、一种包含如权利要求74至78中任一项所述的植物细胞的植物。80、一种源自如权利要求79所述的植物的纸浆和纸浆制品。81、一种源自如权利要求79所述的植物的实木制品。82、如权利要求81所述的木制品，其中所述制品选自由木料、木材和复合材料组成的群组。83、一种抑制植物中木质素表达的方法，其包括将如权利要求61至67中任一项所述的DNA构建体整合于所述植物的基因组中。84、一种改变植物中木质素组成的方法，其包括将如权利要求68至73中任一项所述的DNA构建体整合于所述植物的基因组中。85、如权利要求84所述的方法，其中所述木质素组成的改变包括调控转化植物中的愈创木基木质素单体:紫丁香基木质素单体比率。86、一种制造木头的方法，其包括将如权利要求61至68中任一项所述的DNA构建体整合于植物细胞的基因组中、使所述植物细胞生长及获得所述木头。87、一种制造木头的方法，其包括将如权利要求68至73中任一项所述的DNA构建体整合于植物细胞的基因组中、使所述植物细胞生长及获得所述木头。88、一种通过如权利要求86或87所述的方法获得的木头。89、一种制造木浆的方法，其包括将如权利要求61至68中任一项所述的DNA构建体整合于植物细胞的基因组中、使所述植物细胞生长及获得所述木头。90、一种制造木浆的方法，其包括将如权利要求68至73中任一项所述的DNA构建体整合于植物细胞的基因组中、使所述植物细胞生长及获得所述木头。91、一种通过如权利要求89或90所述的方法获得的木浆。92、一种造纸方法，其包括将如权利要求61至68中任一项所述的DNA.构建体整合于植物细胞的基因组中、使所述植物细胞生长及获得所述纸。93、一种造纸方法，其包括将如权利要求68至73中任一项所述的DNA构建体整合于植物细胞的基因组中、使所述植物细胞生长及获得所述纸。94、一种通过如权利要求92或93所述的方法获得的纸。全文摘要包含下列各部分的DNA构建体可用于减少或调节植物中的木质素含量对应于木质素单体生物合成途径中的基因的至少一部分的第一段DNA片段、间隔区DNA片段和与所述第一段DNA片段互补的第二段DNA片段。在某些实施例中，DNA构建体包括4CL、C3H、CCR、C4H、Cald5H、SAD或CCoAOMT基因的至少一部分。维管优选型和组成型启动子可用于驱动所述构建体的表达。文档编号C12N15/63GK101410521SQ200580039277公开日2009年4月15日申请日期2005年9月22日优先权日2004年9月22日发明者保罗·桑德斯,克莱尔·伊格尔顿,加里·张,威廉·H·罗特曼,桑德拉·乔安妮·菲茨杰拉德,玛丽·B·康内特,理查德·L·福斯特申请人:阿博根有限公司