高山被孢霉C_16/18脂肪酸延伸酶的制作方法

专利名称：：高山被孢霉C_16/18脂肪酸延伸酶的制作方法高山被孢霉(^16/18脂肪酸延伸酶发明领域本发明属于生物
技术领域：
。更具体地，本发明涉及编码对于提高产油微生物中硬脂酸产量有用的C16/18脂肪酸延伸酶的核酸片段的分离和表征。
背景技术：
：细胞中的油生物合成一般是指甘油三酯(TAG)的合成，其中TAG被定义为由酯化到甘油分子的三个脂肪酰基残基构成的中性脂质。这样的油可以含有光谱的脂肪酸，包括饱和的和不饱和的脂肪酸以及短链和长链脂肪酸。并且，不意外地，大量的因素影响了特定微生物中这样产生的油的数量和它最终的脂肪酸成分。虽然传统方法(即，育种)和遗传工程方法已经成功地应用于产生具有改善的油含量的含油种子植物[通过例如高月桂酸油菜、高硬脂酸油菜、高油酸大豆和高油酸玉米的商业可获得性展现],在产油微生物中油含量的类似操纵在过去没有显著地进行。然而，将具有在它们的油成分内商业上产生长链co-3和/或co-6多不饱和脂肪酸("PUFA，，，例如，183、184、203、204、205、226脂肪酸)能力的微生物工程化的新近努力已经产生了对提高流入脂质代谢的碳的方法的需求。在大多数有机体中的脂质代谢由多酶脂肪酸合成酶复合物("FAX")催化，首先通过八个双碳片段(来自乙酰CoA的乙酰基)的缩合来形成棕榈酸，一种16碳饱和脂肪酸(Smith,S</,8(15)1248-59(1994))。一旦游离棕榈酸(160)从FAS上释放，该分子经历延伸(即，经由。16/18脂肪酸延伸酶来产生硬脂酸(180)或不饱和现象(即，经由A9脱饱和酶来产生棕榈油酸(161))。从这两种代谢前体合成所有其他脂肪酸分子。由于棕榈酸的主要结局是延伸，然而(去饱和仅是大多数有机体中的很小的反应)，断定的是，C16/18脂肪酸延伸酶在确定进入脂肪酸生物合成途径的碳通量方面起到重要作用，从而在这样产生的油的数量和组成方面起到决定性作用。近年来已经分离和表征了多种脂肪酸延伸酶。例如，讨论酵母、哺乳动物、植物和低等真核生物中的长链脂肪酸的延伸的有用的综述是Leonard,AE，等人(ProgLipidRes4336-54(2004))。Leonard等人的表1提供了脂肪酸延伸酶基因的概述、GenBankAccessionNo.和每种酶催化的反应(即，来自酿酒酵母(S.cewvWae)[ELOl、EL02、EL03],人类，小鼠[Elovl、Elov2、Elov3、Elov4、Lee]，大鼠[rELOl、rEL02],秀丽小杆线虫(C"e"or/z^^'他e/ega朋)[CEELOl],高山被孢霉(MW/，〃a咖—[GEELO，MAELO],球等鞭金藻(/薦—&ga/6""a)[IgASEl]和小立碗藓(尸/z"com"re〃a/a&朋)[PSE1])。已经描述和功能上表征的其他脂肪酸延伸酶包括来自(9w^occcc附^wn'[OtELOl、OtEL02]、7Tz(2/"肌'cw'ra戸ew(iom"冊[TpELOl、TpEL02]、光滑爪蟾(Xe"o/船/aev/力[XIELO]和虫工鳟((9"co咖"c/zwsw-m)[OmELO](Meyer,A,等人，J.Z^W/^45(10)1899-1909(2004))金黄色破囊壶菌(7^rawWoc一n'謂薦re纖)(US6,677,145)、尸.[pavELO](Pereira，S等人,^oc/emJ384357-366(2004))和秀丽小#干线虫(Cae"or/^6(i//^e/eg"7is)CeEL02(Kniazeva,M等人,Ge"e"'cs163159-169(2003))的那些。然而，仅大鼠rEL02和秀丽小杆线虫(C.e/ega朋)CeEL02延伸酶纟皮分类为具有适合的底物特异性以允许棕榈酸向硬脂酸的转化的(316/18脂肪酸延伸酶。因而，在此希望的是利用遗传工程的技术鉴定和表征新的d6m脂肪酸延伸酶，作为允许产油微生物中流入脂质代谢的碳的增量调节的手段。申请人通过从高山被孢霉(7kfoW^^/""///"")分离编码Cl6/18脂肪酸延伸酶的基因、展现在产油酵母解脂耶罗维亚酵母(]^TOVW"/00"ca)中过量表达该基因时提高了160向180的转化解决了声明的难题。这允许提高微生物油中PUFA含量和提高油生物合成。发明概述本发明涉及分离自被孢霉(MoWew〃a)的编码C16/18脂肪酸延伸酶的基因，对于操作引起微生物油的产生、特别是在产油酵母中微生物油的产生的生物化学途径是有用。因而，本发明提供了编码d6A8脂肪酸延伸酶的分离的核酸分子，所述分离的核酸分子选自(a)编码SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的分离的核酸分子，(b)在以下杂交条件下与(a)杂交的分离的核酸分子0.1xSSC，0.1%SDS,65°C，以及用2xSSC、0.1%SDS随后用0.1xSSC、0.1%SDS洗涤，与(a)或(b)完全互补的分离的核酸分子。此外，本发明提供了由本发明的分离的核酸分子编码的多肽、遗传嵌合体和表达所述多肽的宿主细胞。在类似的实施方式中，本发明提供了分离的核酸分子，其包含编码至少275个氨基酸的。16/18脂肪酸延伸酶的第一核苷酸序列，当根据BLAST比对方法与具有SEQIDNO:2中所示序列的多肽相比较时，所述(:16/18脂肪酸延伸酶具有至少90%的同一性，或包含所述第一核苷酸序列的互补物的第二核苷酸序列。此外提供的是产生硬脂酸的方法，包括a)提供产油酵母，所述产油酵母包含处在适合的调节序列的控制下的、编码如SEQIDNO:2中所示具有(316/18脂肪酸延伸酶活性的多肽的分离的核酸片段，b)提供包含棕榈酸的延伸酶底物源，c)在一定条件下与(b)的延伸酶底物一起生长步骤(a)的产油酵母，在所述条件中步骤(a)(i)或步骤(a)(ii)的核酸分子被表达并且产生硬脂酸，和d)任选地回收步骤(c)的硬脂酸。类似地，本发明提供了生产多不饱和脂肪酸的方法，包括a)提供产油酵母，其包含(i)编码如SEQIDNO:2中所示具有(316/18脂肪酸延伸酶活性的多肽的分离的核酸片段，(ii)编码功能性多不饱和脂肪酸生物合成途径的基因，b)提供包含棕榈酸的延伸酶底物源，c)在一定条件下与(b)的延伸酶底物一起生长步骤(a)的产油酵母，在所述条件下产生多不饱和脂肪酸，和d)任选地回收步骤(c)的多不饱和脂肪酸。在另一个实施方式中，本发明提供了通过本发明的方法产生的微生物油。附图的简要描述和序列描述附图1图形地表示了SEQIDNO:1、2、7、14、17、18、19和29之间的关系，它们每一个都涉及高山被孢霉(MoWere〃aa/尸/朋)中的(:16/18脂肪酸延伸酶酶(EL03)。附图2提供了以下质粒的质粒图(A)pZF5T-PPC、(B)pZUF6S和(C)pZUF6S-E3WT。附图3说明了PUFA生物合成途径和前体。根据以下的详细说明和构成本申请的一部分的附随的序列描述可以更完整地理解本发明。以下序列符合37C.F.R.§1.821-1.825("含有核苷酸序列和/或氨基酸序列公开内容的专利申请的要求-序列规则")，并且符合世界知识产权组织(WIPO)标准ST25(1998)以及EPO和PCT(Rules52和495(a-bis),以及实施细则的小节208和附录C)的序列表要求。核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式复合37C.F.R.§1.822的规则。SEQIDNO:1、2、7、14、17-22和25-28是ORF编码基因或蛋白质(或其部分)或质粒，如表l中所标识的。表l基因和蛋白质SEOID编号的概述<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>SEQIDNO.3、4和5相应于BD-ClontechCreatorSmartcDNA库试剂盒引物SMARTIV寡核苷酸、CDSIII/3'PCR引物和5'-PCR引物SEQIDNO:6相应于用于cDNA库测序的M13正向引物SEQIDNO:8和9相应于来自ClonTech的UniversalGenomeWalkerTM试剂盒的GenomeWalker接头，用于基因组步移来分离高山被孢霉(M.EL03的3'末端区域。SEQIDNO:10-13分别相应于引物MAElong3'1、AP1、MAElong3'2和AP2,用于基因组步移来分离高山被孢霉(M"/;z"")EL03的3'末端区域。SEQIDNO:15和16分别相应于引物MAElong5'1和MAelong5'2,用于基因组步移来分离高山被孢霉(M:a/p'朋)EL03的5'末端区域。SEQIDNO:23和24相应于引物MAELONG5'Ncol3和MAELONG3'Notl1,用于从高山被孢霉(Af."/p&a)cDNA扩增完整的EIX>3。发明详述在此引用的所有专利、专利申请和出版物通过以它们的整体引用而合并在此。这特别地包括，但不限于，以下的申请人的受让人的共同待决申请美国专利申请No.10/840478(2004年5月6日提交)、美国专利申请No.10/840579U004年5月6日提交，美国专利申请No.腦69630(2004年6月16日提交)、美国专利申请No.10/987548(2004年12月12日提交)，美国专利申请No.11/225354(2005年9月12日提交)、美国专利申请No.60/624812(2004年11月4日提交)、美国专利申请No.11/183664(2005年7月18日提交)和美国专利申请No.11/185301(2005年7月20日提交)。申请人已经分离了编码Cl6/lS脂肪酸延伸酶的高山被孢霉(A/oWe^〃aa/;^力a)基因，其对棕榈酸向硬脂酸的转化负责。这个基因(在此标识为"EL03")对于改变在产油酵母例如解脂耶罗维亚酵母(7"mn^'a/^o一,ca)中产生的长链多不饱和脂肪酸(PUFA)的数量是有用的。PUFA的重要性是毫无疑义的。例如，某些PUFA是健康细胞的重要生物成分，并被认为是"必需"脂肪酸，其在哺乳动物中不能从头合成而必需在膳食中获得或通过亚油酸(LA)或a-亚麻酸(ALA)的脱饱和延伸来衍生。此外，长链oo-3PUFA的高摄入产生心血管保护效果(Dyerberg,J等人，j匿JC//"淑r28958-966(1975)、Dyerberg,J等人,丄a"c"2(8081)117-119(July15,1978)、Shimok證a，H,^^/c/WevAAw&Z)/",88100-108(2001)、vonSchacky，C,andDyerberg,J.,WorW尺evM^Z)/eG8890-99(2001))。大量其他研究记载了通过施用co-3和/或co-6脂肪酸所赋予的针对多种症状和疾病(例如，哮喘、银屑病、湿渗、糖尿病、癌症)的广泛健康效益。因而，本发明存在许多应用。通过在此公开的方法积累的PUFA或其衍生物可以用作饮食代替物或增补剂，特别是婴儿配制食品，用于经历静脉给养的患者或用于预防或治疗营养不良。做为选择，纯化的PUFA(或其衍生物)可以被掺入烹调油、脂肪或人造黄油配方，从而在正常的使用中接受者将接受期望数量的饮食补充。PUFA也可以掺入婴儿配制食品、营养增补剂或其他食物产品，可以用作抗炎试剂或胆固醇降低试剂。任选地，组合物可以用于药物用途(人类或兽医学)。在这种情况下，PUFA—般口服地施用，但可以通过可以成功地吸收它们的任何途径来施用，例如，胃肠外地(例如，皮下地、肌内注射地或静脉内地)、直肠地、阴道地或体表地(例如，作为皮肤软膏剂或洗液)。具有通过重组方法产生的PUFA对人类或动物的增补可以产生提高水平的所添加PUFA,以及它们的代谢产物。例如，用ARA处理可以不^(又引起提高水平的ARA，还产生ARA的下游产品例如前列腺素。复杂的调节机制使得希望组合各种PUFA或添加不同的PUFA的轭合物，以防止、控制或克服这些机制来实现个体中期望水平的特定PUFA。定义在本公开中，使用了许多术语和缩写。提供了以下定义。"开放阅读框"缩写为ORF。"聚合酶链式反应"缩写为PCR。"美国典型培养物保藏所"缩写为ATCC。"多不饱和脂肪酸"缩写为PUFA。"微生物油，，或"单细胞油，，是由微生物(例如，藻类、产油酵母和丝状真菌)在它们生命期期间天然产生的那些油。这些油一般作为"中性脂质，，保持在细胞中。术语"甘油三酯"、"油，，和"TAG"是指由酯化到甘油分子的三个脂肪酰基残基构成的中性脂质(这些术语将在此处的当前公开中可互换地使用)。这些油可以含有短链和长链饱和的和不饱和的脂肪酸。因而，"油生物合成"一般是指TAG在细胞中的合成。术语"脂肪酸"是指各种链长度的长链脂肪族酸(链烷酸)，从约C12到C22(虽然更长和更短链长度的酸是已知的)。主要链长度是在C16和C22之间。脂肪酸的结构由简单的符号系统"XY"表示，其中X是特定脂肪酸中碳(C)原子的总数，Y是双键的数目。涉及"饱和脂肪酸"对比"不饱和脂肪酸"、"单不饱和脂肪酸"对比"多不饱和脂肪酸"(或PUFA)、以及"oo-6脂肪酸，，(co-6或n-6)对比"oo-3脂肪酸，，(co-3或n-3)的其他细节在WO2004/101757中提供了。在本公开中用于描述PUFA的命名以下在表2中示出。在标为"简化符号"的列中，co-参考系统被用于标明碳的数目、双键的数目和最靠近Q碳的双键的位置，从Ct碳(为此被编号为l)从开始数起。表格的其余部分概述了w-3和co-6脂肪酸及其前体的常见名称，将在整个说明书中和每个化合物的化学名称上使用缩写。表2某些脂肪酸的命名<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>"延伸酶系统，，是指四种酶的套系，其对脂肪酸碳链的延伸负责，来产生比延伸酶系统作用的脂肪酸底物更长2个碳的酸。更具体地，延伸的过程与脂肪酸合成酶相关地发生，其中CoA是酰基载体(Lassner等人，T7ze尸/朋fCe〃8281-292(1996))。在第一步中，已经发现这一步是底物特异性和速度限制性的，丙二酰基CoA与长链酰基CoA缩合来产生C02和P-酮酰基-CoA(其中酰基部分被延长两个碳原子)。为此，催化这个第一缩合反应的酶将在下文中称为"延伸酶"或"脂肪酸延伸酶"。随后的反应包括还原成P-羟基酰基-CoA、脱水成烯酰基-CoA，并二次还原来产生延长的酰基CoA。本领域公知的是，脂肪酸延伸酶可以具有不同的底物特异性和选择性，其中"底物特异性"是指当面对单个底物时酶的活性，"底物选择性，，描述了从底物混合物中特定底物的选择。例如，C!6/!8脂肪酸延伸酶优先C16底物，C18/20脂肪酸延伸酶优先C18底物，C20/22脂肪酸延伸酶优先C20底物。同样地，A9脂肪酸延伸酶能够分别催化LA和ALA向EDA和ETrA的转化。重要的是注意到，某些脂肪酸延伸酶具有广泛的特异性，因而单个酶可能能够催化几种脂肪酸延伸酶反应(例如，从而作为d6m脂肪酸延伸酶和C18/20脂肪酸延伸酶)。在优选的实施方式中，最希望的是能够通过用脂肪酸延伸酶的基因转化适合的宿主并确定它对宿主的脂肪酸分布的影响来经验性地确定脂肪酸延伸酶的特异性。在本公开的上下文中，术语"EL03"是指高山被孢霉OfoW/we〃a咖"a)(^16/18脂肪酸延伸酶酶(在此作为SEQIDNO:2提供)，由elo3基因(SEQIDNO:1)编码。根据在此报告的数据，EL03优先地催化棕榈酸(160)向硬脂酸(180)的转化。术语"脱饱和酶"是指一种多肽，其可以在一种或多种脂肪酸中脱饱和，即，引入双键来产生单或多不饱和脂肪酸。尽管在整个说明书中对于特定脂肪酸使用w参考系统，更方便的是使用△系统从底物的羧基末端开始计数来表明脱饱和酶的活性。在此特别感兴趣的是A9脱饱和酶，其催化棕榈酸向棕榈油酸(161)和/或硬脂酸向油酸(181)的转化。与本公开相关的其他脱饱和酶包括A12脱饱和酶，其在分子从羧基末端数起第12和13个碳原子之间脱饱和脂肪酸并催化油酸向LA的转化；A15脱饱和酶，其催化LA向ALA的转化；△17脱饱和酶，其催化DGLA向ETA和/或ARA向EPA的转化；△6脱饱和酶，其催化LA向GLA和/或ALA向STA的转化；△5脱饱和酶，其催化DGLA向ARA和/或ETA向EPA的转化，A4脱饱和酶，其催化DPA向DHA的转化；以及，A脱饱和酶，其催化EDA向DGLA和/或ETrA向ETA的转化。术语"转化效率"和"底物转化百分比"是指特定的酶(例如脱饱和酶或延伸酶)将底物转化成产物的效力。转化效率根据以下公式测量([产物]/[底物+产物]*100,其中"产物"包括即时产物和来自它的途径中的所有产物。术语"PUFA生物合成途径酶"是指与PUFA的生物合成相关的任何以下的酶(和编码所述酶的基因)，包括A4脱饱和酶、A5脱饱和酶、A6脱饱和酶、A12脱饱和酶、A15脱饱和酶、A17脱々包和酶、A9脱饱和酶、A8脱饱和酶、A9脂肪酸延伸酶、014/16脂肪酸延伸酶、C^m脂肪酸延伸酶、。18/2()脂肪酸延伸酶和/或C20/22脂肪酸延伸酶。类似地，术语"co-3/oo-6脂肪酸生物合成途径'，是指一组基因，当在适合的条件下表达时它们编码酶，所述酶催化w-3或co-6脂肪酸的直接或间接产生。在附图3中说明了代表性的途径，提供了肉豆蔻酸通过各种中间物向DHA的转化，这展现了oo-3和w-6脂肪酸如何从共同的来源产生。该途径天然地分成两个部分，其中一个部分将产生w-3脂肪酸，另一个部分仅产生w-6脂肪酸。仅产生co-3脂肪酸的部分在此将称为w-3脂肪酸生物合成途径，而仅产生oo-6脂肪酸的部分在此将称为oo-6脂肪酸生物合成途径。在此关于PUFA生物合成途径的上下文中使用的术语"功能性"是指在途径中的某些(或所有)基因表达活性的酶。要理解的是，"PUFA生物合成途径"或"功能性PUFA生物合成途径"不意味着需要上文段落中列出的所有基因，因为许多脂肪酸产物将仅需要这个途径的基因的子集的表达。术语"产油的"是指倾向于以脂质形式保存它们的能源的那些有机体(Weete,InFungalLipidBiochemistry,2nded,Plenum,1980)。术语"产油酵母"是指可以产生油的、分类为酵母的那些微生物。一般地，产油微生物的细胞油或TAG含量跟随S形曲线，其中脂质的浓度提高直到它在晚对数生长期或早期稳定生长期达到最大值，然后在晚期稳定期和死亡期期间逐渐地降低(YongmanitchaiandWard,jp"/.五聰腦.Mc油W57419-25(1991))。对于产油微生物罕有的是将超过它们细胞干重的约25%积累成油产油酵母的实例包括但不限制于以下的属耶罗维亚酵母属(7^row/a)、假丝酵母属(Om^c/a)、红酵母属(A/zocfotorw/")、红冬孢酵母属(i^otfo^onWwm)、隐5求菌属(Oy/^ococcws)、丝孑包酵母属(7Wc/zos^ora")和油月旨酵母属(Z/^7omyces)。如在此使用的，术语"分离的核酸片段"或"分离的核酸分子"将可互换地使用，是指单链或双链的、任选地含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基的RNA或DNA的聚合物。DNA聚合物形式的分离的核酸片l爻可以由cDNA、基因组DNA或合成DNA的一种或多种片段组成。当核酸分子的单链形式可以在适合的温度和溶液离子强度条件下与另一个核酸分子退火时，核酸分子是与另一个核酸分子，例如cDNA、基因组DNA或RNA分子"可杂交的"。杂交和洗涤条件是公知的，在Sambrook,J,Fntsch,EFandManiatis,TMolecularCloningALaboratoryManual,2nded,ColdSpringHarborLaboratoryColdSpringHarbor,NY(1989)、特别是其中的第11章和其中的表111中(通过引用完全合并在此)举例说明了。温度和离子强度条件决定了杂交的"严格度"。可以调节严格条件来筛选中度相似的片段(例如，来自远缘相关有机体的同源序列)、到高度相似的片段(例如，来自近相关有机体的同功能酶)。杂交后洗涤决定了严格条件一组优选的条件利用一系列的洗涤，从用6xSSC、0.5%SDS在室温下15分钟开始，然后用2xSSC、0.5%SDS在45。C30分钟重复，然后用0.2xSSC、0.5%SDS在50°C30分钟重复两次。一组更优选的严格条件利用更高的温度，其中洗涤与上述的相同，只是在0.2xSSC、0.5%SDS中最后两次30分钟洗涤的温度提高到6(TC。另一组优选的高严格条件利用在65。C下在0.1xSSC、0.1%SDS中的两次最后的洗涤。其他的严格条件组包括例如在O.lxSSC、0.1%SDS、65。C杂交，和用2xSSC、0.1%SDS最后通过0.1xSSC、0.1%SDS洗涤。杂交需要两个核酸含有互补序列，然而取决于杂交的严格度，碱基之间的错配是可能性。杂交核酸的合适的严格度取决于本领域公知的核酸的长度和互补的程度、变量。两个核苷酸序列之间的相似度或同源性越高，具有这些序列的核酸的杂交的Tm的值越大。核酸杂交的相对稳定性(与更高的Tm相应)4姿照以下顺序降4氐RNARNA、DNARNA、DNADNA。对于长度超过100个核苷酸的杂交，已经得出了计算Tm的方程式(参见Sambrook等人，w/ra,950-951)。对于更短的核酸即寡核苷酸的杂交，错配的位置变得更为重要，寡核苷酸的长度决定了它的特异性(参见Sambrook等人，w/ra,117-118)。在一个实施方式中，可杂交核酸的长度是至少约10个核苷酸。优选的，可杂交核酸的最小长度是至少约15个核苷酸，更优选的至少约20个核苷酸；最优选的，该长度是至少约30个核苦酸。此外，熟练的技术人员将认识到，温度和洗涤溶液盐浓度可以按需要根据一些因素如探针的长度来调节。氨基酸或核苷酸序列的"基本部分"是包含足够的多肽氨基酸序列或基因核苦酸序列以推定性地鉴定该多肽或基因的部分，所述鉴定通过由本领域技术人员人工评估序列，或通过使用例如BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool;Altschul,SF,等人，JM/.肠/215403-410(1993))的算法计算机自动化的序列比较和鉴定。一般地，为了推定性地鉴定多肽或核酸序列同源于已知蛋白或基因，十个或更多连续氨基酸或者三十个或更多核苷酸的序列是必需的。此外，对于核普酸序列，包含20-30个连续核苷酸的基因特异性寡核苷酸探针可以用于序列依赖性的基因鉴定方法(例如，Southern杂交)和分离(例如,细节菌落或噬菌斑的原位杂交)。此外，12-15个碱基的短寡核苷酸可以用作PCR中的扩增引物以获得包含该引物的特定核酸片段。因而，核苷酸序列的"基本部分，，包含足够的序列以特异性地鉴别和/或分离包含该序列的核酸片段。本说明书教导了编码一种或多种特定真菌蛋白质的部分或完整氨基酸和核苷酸序列。熟练的技术人员得益于在此报道的序列，现在可以使用所公开序列的所有或基本部分，用于本领域技术人员已知的目的。因而，本发明包含如在附随的序列表中报道的完整序列，以及以上定义的那些序列的基本部分。术语"互补"被用于描述能够相互杂交的核苦酸碱基之间的关系。例如，对于DNA,腺苷酸互补于胸腺嘧啶，胞嘧咬互补于鸟嘌呤。因而，本发明还包括与附随的序列表中报道的完整序列互补的分离的核酸片段，以及那些基本上相似的核酸序列。术语"同一性百分比"，如本领域已知的，是通过比较序列确定的、两种或多种多肽序列或两种或多种多核苦酸序列之间的相互关系。在本领域中，"同一性"还意指多肽或多核苷酸序列之间的序列相关性的程度，视情况而定，如通过这些序列的串列之间的匹配所确定的。"同一性，，和"相似性，，可以通过已知的方法容易地计算，包括但不限于在1)ComputationalMolecularBiology(Lesk,AM,Ed)OxfordUniversityNY(1988),2)BiocomputinqInformaticsandGenomeProjects(Smith,DW,Ed)AcademicNY(1993),3)ComputerAnalysisofSequenceData,PartI(Griffin,AM,andGriffin,HG.，Eds)HumaniaNJ(1994),4)SequenceAnalysisinMolecularBiology(vonHeinie,G,Ed)Academic(1987),和5)SequenceAnalysisPrimer(Gribskov,MandDevereux，J，Eds)StocktonNY(1991)中描述的那些。确定同一性的优选的方法被设计以给出测试的序列之间的最佳匹配。确定同一性和相似性的方法被编写成公众可获得的计算机程序。序列比对和同一性百分比计算可以使用LASERGENE生物信息学计算套件(DNASTARInc,Madison,Wl)的Megalign程序来进行。使用Clustal比对方法(HigginsandSharp,cabios.5151-153(1989)))用默认参数(GAPMENALTY=10,GAPLENGTHPENALTY=10)进行多个序列比对。使用CLUSTAL方法的配对式比对的默认参数是KTUPLE1、GAPPENALTY=3、WINDOW=5和DIAGONALSSAVED=5。适合的核酸片段(本发明的分离的多核苷酸)编码多肽，所述多肽与在此报道的氨基酸序列至少约70%相同、优选的至少约75%相同、更优选的至少约80%相同。优选的核酸片,殳编码约85%相同于在此报道的氨基酸序列的氨基酸序列。更优选的核酸片段编码至少约90%相同于在此报道的氨基酸序列的氨基酸序列。最优选的是编码氨基酸序列的核酸片段，所述氨基酸序列至少约95%相同于在此报道的氨基酸序列。适合的核酸片段不仅具有上述同源性，而且一般地编码具有至少50个氨基酸、优选的至少100个氨基酸、更优选的至少150个氨基酸、再更优选的至少200个氨基酸、最优选的至少250个氨基酸的多肽。术语"序列分析软件"是指对于分析核苷酸或氨基酸序列有用的任何计算机算法或软件程序。"序列分析软件，，可以是商业上可获得的或独立地开发的。典型的序列分析软件包括但不限于1)GCG程序套件(WisconsinPackageVersion90，GeneticsComputerGroup(GCG),Madison,Wl),2)BLASTP,BLASTN,BLASTX(Altschul等人，JMo/AW.215.403-410(1990)),3)DNASTAR(DNASTAR,IncMadison,Wl),4)Sequencher(GeneCodesCorporation,AnnArbor,Ml)和5)包括Smith-Waterman算法的FASTA程序(WRPearson,C固，/她/7zocfeGe"謹e，[ProcIntSymp](1994),MeetingDate1992,111-20Suhai，Sandor,EdPlenumNewYork,NY)。在本申请的上下文中，要理解的是，当序列分析软件用于分析时，分析的结果将基于所涉及程序的"默认值"，除非另作说明。如在此使用的"默认值，，将意指当首次初始化时软件最初加载的任何数值或参数集合。"密码子简并性，，是指在遗传密码中允许核苷酸序列的变异而不影响编码的多肽的氨基酸序列的性质。熟练的技术人员熟知在指定给定氨基酸的核苷酸密码子的利用率方面特定宿主细胞所展现的"密码子偏差"。因而，当为了改善宿主细胞中的表达合成基因时，希望的是设计基因使得它的密码子利用的频率接近宿主细胞的优选的密码子利用频率。术语"优化的密码子"当涉及基因或核酸片段的编码区时，是指在基因或核酸分子的编码区中改变密码子以反映宿主有机体的典型密码子利用率而不改变DNA编码的多肽。"基因，，是指表达特定蛋白质的核酸片段，并且可以指单独的编码区，或可以包括在编码序列之前(5'非编码序列)和之后(3'非编码序列)的调节序列。"天然基因"是指在自然中存在具有其自身的调节序列的基因。"嵌合基因"是指任何基因，其不是天然基因，包含在自然中不在一起存在的调节和编码序列。因而，嵌合基因可以包含来自不同来源的调节序列和编码序列，或来自相同来源但以不同于自然中存在的方式排列的调节序列和编码序列。"内源基因"是指在有机体的基因组中处在其自然位置的天然基因。"外源的"基因是指通过基因转移导入宿主有机体的基因。外源基因可以包含插入非天然有机体中的天然基因、导入天然宿主内的新位置的天然基因、或嵌合基因。"密码子优化的基因"是一种基因，它的密码子利用的频率被设计以模拟宿主细胞的优选的密码子利用的频率。"编码序列"是指编码特定氨基酸序列的DNA序列。"适合的调节序列"是指位于编码序列的上游(5'非编码序列)、之内、或下游(3'非编码序列)的核苷酸序列，其影响相连的编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译。调节序列可以包括启动子、翻译前导序列、内含子、多聚&泉苷酸识别序列、RNA加工位点、效应物结合位点和茎-环结构。"启动子"是指能够控制编码序列或功能性RNA的表达的DNA序列。一般地，编码序列位于启动子序列的3'。启动子可以整体地来自天然的基因，或由来自自然中发现的不同启动子的不同元件组成，或甚至包含合成的DNA片段。本领域技术人员理解的是，不同的启动子可以指导在不同组织或细胞类型中、或在不同的发育阶段、或响应于不同的环境或生理条件的基因表达。使得基因在大多数时间在大多数细胞类型中表达的启动子通常称为"组成型启动子"。进一步公认的是，大多数情况下，调节序列的确切边界没有被完全地划定，不同长度的DNA片段可能具有相同的启动子活性。术语"3'非编码序列"或"转录终止子"是指位于编码序列下游的DNA序列。这包括多聚腺苦酸识别序列和编码能够影响mRNA加工或基因表达的调节信号的其他序列。多腺苷酸化信号通常以影响多聚腺苷酸段向mRNA前体的3'末端的添加为特征。3'区域可以影响转录、RNA加工或稳定性，或相连的编码序列的翻译。"RNA转录产物"是指产自DNA序列的RNA聚合酶催化转录的产物。当RNA转录产物是DNA序列的理想互补拷贝时，它被称为原始转录产物，或者它可以是来自原始转录产物的翻译后加工的RNA序列，被称为成熟RNA。"信使RNA"或"mRNA"是指没有内含子并且可以;故细胞翻译成蛋白质的RNA。"cDNA，，是指互补于并来自mRNA的双链DNA。"正义，，RNA是指包括mRNA并因此可以被细胞翻译成蛋白质的RNA转录产物。"反义RNA"是指一种RNA转录产物，其与目标原始转录产物或mRNA的全部或部分互补并且阻断目标基因的表达(US5,107,065、WO99/28508)。反义RNA的互补性可以是对于特定基因转录产物的任何部分，即，在5'非编码序列、3'非编码序列、或编码序列中。"功能性RNA"是指反义RNA、核酶RNA、或不#:翻译j旦仍影响细胞过程的其他RNA。术语"可操纵地连接的"是指核酸序列在单个核酸片段上的相连，从而一个核酸序列的功能受到另一个的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达时(即，编码序列处在启动子的转录控制之下)，启动子是与编码序列可操纵地连接的。编码序列可以以正义或反义的取向与调节序列可操纵地连接。如在此使用的，术语"表达，，是指来自本发明的核酸片段的正义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积累。表达也可以指mRNA翻i奪成多肽。"转化"是指核酸分子进入宿主有机体的转移，引起遗传稳定的遗传。例如，核酸分子可以是自主复制的质粒；或，它可以整合到宿主有机体的基因组中。含有转化的核酸片段的宿主有机体被称为"转基因的"或"重组的"或"转化的"有机体。术语"质粒"、"载体，，和"盒"是指通常携带基因的染色体外元件，通常处于环形双链DNA片段的形式，所述基因不是细胞的中心新陈代谢的部分。这样的元件可以是自主复制的序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列、线性或环形的、单链或双链的DNA或RNA,来自任何来源，其中许多核苷酸序列已经连接或重组成独特的结构，所述结构能够将启动子片段和选定基因产物的DNA序列与合适的3'非翻译序列一起导入细胞。"表达盒"是指含有外源基因并具有除了外源基因之外的元件的特定载体，其容许该基因在外源宿主中增强的表达。术语"同源重组，，是指在两个DNA分子之间DNA片段的交换(在交叉期间)。交换的片段的侧翼是这两个DNA分子之间相同核苷酸序列的位点(即，"同源性区域")。术语"同源性区域，，是指在参与同源重组、具有相互的同源性的核酸片段上核苷酸序列的延伸。有效的同源重组一般将在这些同源性区域长度至少约10bp的地方发生，长度至少约50bp的地方是优选的。一般地，意图重组的片段含有至少两个同源性区域，在那里目标基因破坏或替换是期望的。在此使用的标准重组DNA和分子扩增技术是本领域公知的，由Sambrook,J,Fntsch，EFandManiatis,T,MolecularCloningALaboratoryManual,2nded,ColdSpringHarborLaboratoryColdSpringHarbor,NY(1989)(hereinafter"Maniatis"),bySilhavy,TJ,Be腿n,MLandEnquist,LW，ExperimentswithGeneFusions,ColdSpringHarborLaboratoryColdSpringHarbor,NY(1984),以及由Ausubel,FM等人,CurrentProtocolsinMolecularBiology,publishedbyGreenePublishingAssocandWiley-lnterscience(1987)所描述。高山被孢霉(A/oWe"〃ao/^'wa)dwis脂肪酸延伸酶的序列鉴定在本发明中，编码(^16/18脂肪酸延伸酶(在此称为"EL03")的基因已经从高山被孢霉(A^r"ere〃aa/;/"a)的专有DuPontcDNA库分离。高山被孢霉(M"/内，)是在它的TAG级分中天然地积累具有等于或大于C20链长度的脂肪酸的有机体，因而表明(^16/18脂肪酸延伸酶可能以高效率起作用来确保硬脂酸进入PUFA生物合成途径的大的流量。使用BLAST算法(Altschul，SF,等人，7Vwc/"c爿"^253389-3402(1997))与公众数据库比较C16/18脂肪酸延伸酶核苷酸碱基和推断的氨基酸序列揭示了，大多数相似的已知序列在275个氨基酸的长度上约37%相同于在此报道的d6A8脂肪酸延伸酶的氨基酸序列。优选的氨基酸片段至少约70%-80%相同于此处的序列，其中85%-90%相同的那些序列是特别适合的，约95%相同的那些序列是最优选的。类似地，编码相应于当前ORF的优选的(:16/18脂肪酸延伸酶编码核酸序列是编码活性蛋白质的那些，其至少约70%-80%相同于编码在此报道的016/18脂肪酸延伸酶的核酸序列，其中85%-90%相同的那些序列是特别合适的，约95%相同的那些序列是最优选的。同源物的鉴定和分离本发明的C16/18脂肪酸延伸酶核酸片段可以用于从相同的或其他的细菌、藻类、真菌或植物物种鉴定和分离编码同源蛋白质的基因。鉴定技术。例如，在此描述的高山被孢霉(Mo^ere〃"a/p/"a)Ci6/18脂肪酸延伸酶氨基酸或核苷酸序列的基本部分可以用于推定地鉴定相关的多肽或基因，通过本领域技术人员的人工评估，或通过利用算法例如BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool,Altschul,SF,等人，Afo/i5/o/215403-410(1993))和ClustalW(DNASTAR软件的Megahgn程序)的计算机自动化序列比较和鉴定。做为选择，当前的脂肪酸延伸酶序列可以用作杂交试剂用于同源物的鉴定。核酸杂交测试的基本成分包括探针、怀疑含有感兴趣的基因或基因片段的样品和特定的杂交方法。本发明的探针一般是互补于要检测的核酸序列的单链核酸序列。探针是与要检测的核酸序列"可杂交的"。探针长度可以从5个碱基变化到数万碱基，将取决于所要进行的特定测试。一般地，约15个碱基到约30个碱基的探针长度是适合的。探针分子的仅一部分需要与要检测的核酸序列互补。此外，探针和目标序列之间的互补性不必是完美的。在不完全互补的分子之间确实发生杂交，结果是杂交区域中的碱基的某些部分不与适当的互补碱基配对。杂交方法是明确定义的。一般地，探针和样品必须在允许核酸杂有机盐的情况下接触探针和样品。探针和样品核酸必需接触足够长时间，从而可以发生在探针和样品核酸之间任何可能的杂交。混合物中探针或目标的浓度将决定发生杂交需要的时间。探针或目标浓度越高，所需的杂交孵育时间越短。任选的，可以添加离液剂。离液剂通过抑制核酸酶活性稳定了核酸。此外，离液剂容许短寡核苷酸探针在室温下的壽丈感和严才各的杂交(VanNessandChen,iVwc/.」c/&195143-5151(1991))。适合的离液剂包括盐酸胍、碌u氰酸胍、石危氰酸钠、四氯乙酸锂、高氯酸钠、四氯乙酸铷、碘化钾和三氟乙酸铯，等等。一般地，离液剂将以约3M的终浓度存在。如果希望，人们可以向杂交混合物添加甲酰胺，一般30-50%(v/v)。可以采用各种杂交溶液。一般地，这些包括约20到60%体积、优选的30%的极性有机溶剂。常见的杂交溶液采用约30-50%v/v曱酰胺、约0.15到1M氯化钠、约0.05到0.1M緩冲液(例如，柠檬酸钠、Tris-HCl、PIPES或HEPES(pH范围约6國9)、约0.05-0.2%洗涤剂(例如，十二烷基石黄酸钠)，或0.5-20mMEDTA、FICOLL(PharmaciaInc)(约300-500kdal)、聚乙烯吡咯烷酮(约250-500kdal)和血清白蛋白。还包括在典型的杂交溶液中的是约0.1到5mg/mL的未标记的载体核酸、片段化的核DNA(例如，小牛胸腺或鲑鱼精子DNA,或酵母RNA),和任选的约0.5到2%wt/vol甘氨酸。其他添加剂还可以包括，例如体积排阻试剂，其包括各种极性水可溶的或可膨胀试剂(例如，聚乙二醇)、阴离子聚合物(例如，聚丙烯酸酯或聚甲基丙烯酸甲酯)和阴离子糖聚合物(例如，硫酸葡聚糖)。核酸杂交可适应各种分析形式。最适合的一种是夹心分析形式。夹心分析特别适合于在非变性条件下的杂交。夹心型分析的基本元件是固相支持物。固相支持物具有吸附在其上或共价联结到其上的固定的核酸探针，所述核酸探针是未标记的并与序列的一部分互补。分离方法在此鉴定的高山被孢霉Ofom々e〃aa/pz，)C16/18脂肪酸延伸酶可以用于从相同的或其他的细菌、藻类、真菌或植物物种鉴定和分离编码同源蛋白质的基因，基于序列依赖性的方案。例如，这些方案包括但不限于1)核酸杂交的方法，2)DNA和RNA扩增的方法，例如核酸扩增技术的各种应用[例如，聚合酶链式反应(PCR)Mullis等人，美国专利4,683,202,连接酶链式反应(LCR)Tabor,S.等人，Proc.NatlAcadSciUSA.,89392(1992)]，和3)库构建和通过互补筛选的方法。例如，编码与在此描述的脂肪酸延伸酶相似的蛋白质或多肽的基因可以利用本领域技术人员公知的方法通过使用本核酸片段的全部或部分作为DNA杂交探针筛选来自任何期望的酵母或真菌(其中产生PUFA的那些酵母或真菌将是优选的)的库来直接分离。基于当前核酸序列的特定寡核苷酸探针可以通过本领域已知的方法来设计和合成(Maniatis,同上)。此外，整个序列可以通过熟练的技术人员已知的方法直接使用来合成DNA探针(例如，随机《I物DNA标记、切口转译或末端标记技术)，或合成体外转录系统中可用的RNA探针。此外，可以涉及特定引物并用于控制当前序列的一部分(或全长)。产生的扩增产物可以在扩增反应期间直接标记或在扩增反应之后标记，并用作探针来在合适严格度的条件下分离全长DNA片段。一般地，在PCR型扩增技术中，引物具有不同的序列并且相互不互补。取决于期望的试验条件，引物的序列将被设计以提供目标核酸的有效和可靠的复制。PCR引物设计的方法是本领域常见和公知的(ThemandWallace,"TheuseofoligonucleotidesasspecifichybridizationprobesintheDiagnosisofGeneticDisorders",inZf謂朋Gewe"cDz'se^xs^s.爿尸n2c"ca/^4p/^oac/z,KEDavisEd,(1986)pp33-50,IRLHerndon,VA,andRychhk,W,InMethodsinMolecularBiology,White,BAEd,(1993)Vol15,pp31-39,PCRProtocolsCurrentMethodsandApplicationsHumaniaTotowa,NJ)。一般地，当前EL03序列的两个短片段可以用于PCR方案中来从DNA或RNA扩增编码同源基因的更长的核酸片l殳。PCR也可以在克隆的核酸片段的库上进行，其中一个引物的序列来自当前核酸片段，另一个引物的序列利用了mRNA前体编码微生物基因的3'末端的多聚腺苷酸段的存在。或者，笫二引物序列可以基于来自克隆载体的序列，例如，使用RACE方案(Frohman等人，尸A^SV&4858998(1988))通过使用PCR来扩增转录产物中的单个点和3'或5'末端之间的区域的拷贝来产生cDNA。在3'和5'方向上定向的引物可以从当前序列设计。利用商业上可获得的3'RACE或5'RACE系统(Gibco/BRL,Ga池ersburg,MD),可以分离特定的3'或5'cDNA片段(Ohara等人，/WJSV&4865673(1989),Loh等人，S"e"ce243217(1989))。当前核苷酸和推断的氨基酸C16/18脂肪酸延伸酶序列的可用性便于DNA表达库的免疫学筛选。可以合成代表当前氨基酸序列的部分的合成肽。这些肽可以用于免疫动物来产生具有对包含该氨基酸序列的肽或蛋白质的特异性的多克隆或单克隆抗体。这些抗体然后可以用于筛选DNA表达库来分离感兴趣的全长DNA克隆(Lerner,RA/mmwwo/.361(1984);Maniatis,J:义改善异源表达的基因优化在鉴定和分离特定的(^16/18脂肪酸延伸酶(例如，SEQIDNO:1和2)之后，可以利用各种技术来改善感兴趣的d6/化脂肪酸延伸酶在可选择的宿主中的表达。两种这种技术包括密码子优化和基因的诱变。本领域技术人员理解的是，修改要在特定外源宿主中表达的、编码特定多肽的一部分密码子通常是有用的(从而修饰的多肽利用该可选择寄主优选的密码子)，因为这可以充分地提高编码多肽的外源基因的表达。本领域技术人员将熟悉确定特定宿主物种中宿主优选的密码子并计算和合成可选择的编码序列的技术(例如，参见WO2004/101753),因而，例如，在本发明的一个实施方式中，可能希望的是修改编码EL03多肽的一部分密码子来提高基因在解脂耶罗维亚酵母(K3Traw/a//po/y〃ca)中的表达。在可选择的实施方式中，诱变技术，例如体外诱变和选择、定点谦变、errorpronePCR(Melnikov等人，iVwc/ez.c爿c油i^earc/z,27(4)1056-1062(February15,1999))、"基因混洗"(US5,605,793、US5,811,238、US5,830,721和US5,837,458)或其他手段可以被采用来获得天然发生的延伸酶基因例如在此描述的(316/18脂肪酸延伸酶的突变体(其中这种突变体可以包括删除、插入、点突变或其组合)。这将允许产生具有体内脂肪酸延伸酶活性、对于在特定宿主细胞中起作用具有更期望的物理和动力学参数(例如，更长的半衰期或更高的期望脂肪酸的生产率)的多肽。或者，如果希望，对于酶活性重要的目标多肽的区域可以通过常规诱变、表达产生的突变多肽并测定它们的活性来确定。这些技术的综述在WO2004/101757中描述了。来自在此描述的d6A8脂肪酸延伸酶基因的所有这些突变的蛋白质和编码它们的核苷酸序列处于本发明的范围之内。并且，本发明的方法包括使用如附随的序列表中报道的C16/18脂肪酸延伸酶的完整序列、这种完整序列的互补物、这个序列的基本部分、由此衍生的密码子优化的延伸酶和与之基本上同源的那些序列。脂肪酸的微生物生物合成脂质代谢是几乎所有的动物、植物和微生物具有的基础代谢过程，因而，几乎所有这些有机体具有合成棕榈酸(160)、硬脂酸(180)和油酸(181)的能力(因为这些脂肪酸对于磷脂生物合成是必需的)。如附图3中所说明的，这些脂肪酸的每一个都来自肉豆蔻酸(140)。特别地，游离棕榈酸经由延伸反应从肉豆蔻酸产生(即，通过C14/15脂肪酸延伸酶催化)，随后，棕榈酸可以通过(:16/18脂肪酸延伸酶延伸来产生硬脂酸，或脱饱和来产生棕榈油酸(161)。由于棕榈酸的原始结局是延伸，然而，断定的是d6A8脂肪酸延伸酶在确定进入脂肪酸生物合成途径的总体碳通量方面起到重要作用，因为这些酶控制了微生物细胞中产生的硬脂酸的数量。计的是，在合适的启动子的控制下导入编码在此描述的(316/18脂肪酸延伸酶的嵌合基因将引起转化的宿主有机体中硬脂酸的提高的产生。因而，本发明的一个目的是提供在产油酵母中产生硬脂酸的方法，其中向所述产油酵母提供(a)编码SEQIDNO:2所示(:16/18脂肪酸延伸酶的分离的核酸片段，和(b)包含棕榈酸的延伸酶底物的来源，其中所述酵母在一定条件下生长从而所述嵌合延伸酶基因被表达并且棕榈酸被转化成硬脂酸，其中任选的回收所述硬脂酸。此外，在此描述的(:16/18脂肪酸延伸酶基因和它相应的酶产物可以间接地地用于oo-3和/或oo-6PUFA的产生。特别地，预期的是在此描述的C16/18脂肪酸延伸酶可以与编码其他酶的一种或多种基因一同表达，从而发生一系列的反应来产生期望的PUFA产物。虽然许多微生物(包括藻类、细菌、霉菌、真菌和酵母)可以在普通的细胞代谢过程中合成PUFA和Q脂肪酸，还可能的是将这种能力导入不天然地产生PUFA的有机体中(或产生期望的PUFA和/或脂质分布型)。本领域技术人员将熟悉将编码用于PUFA生物合成的合适的酶的表达盒导入所选宿主有机体所必需的考虑和技术。为了这些目的，已经通过遗传学方法鉴定了涉及PUFA产生的多种脱饱和酶和延伸酶基因，这些基因的某一些的DNA序列是公众可获得的(例如，对于在GenBank中可获得基因和/或关于选择具有脱饱和酶或者延伸酶活性的特定多肽的专利文献和考虑的综述，参见WO2004/101757)。并且，虽然在此没有详细描述，在文献中提供了大量教导，其中各种有机体被工程化来产生特定PUFA,以下提供了某些说明性的参考文献，而这些不应^皮看作是限制性的WO98/46763,WO98/46764,WO98/46765,WO99/64616,WO2002/077213，WO2003/093482,WO2004/057001,WO2004/090123,WO2004/087902,US6,140,486,U.S6,459,018,US6,136,574,US.2003/0172399,US2004/0172682,US.2004/098762;US2004/0111763,US2004/0053379,US2004/0049805，US2004/0237139;U.S04/0172682,BeaudoinF等人，尸A^4S97(12).6421-6426(2000),Dyer,JM等人，^7//.A^'cra&o/,59224-230(2002),Domergue，F.等人丄Aoc/zew.2694105-4113(2002)，Qi,B等人,淑騰所Wec/.22739-745(2004)和Abbadi等人，77ze尸/""fCe仏162734-2748(2004))。因此，例如，在此描述的d6m脂肪酸延伸酶可以与编码PUFA酶的一种或多种PUFA生物合成途径基因一同表达，从而发生一系列的反应来产生期望的PUFA产物。在优选的实施方式中，例如，宿主有机体可以用1)编码本发明的高山被孢霉(Ma//z>2a)(:16/18脂肪酸延伸酶的嵌合基因，和2)包含编码PUFA生物合成途径的酶(例如，A9脱饱和酶、A12脱饱和酶、A6脱饱和酶、C18/20脂肪酸延伸酶、A5脱饱和酶、A17脱饱和酶、C20/22脂肪酸延伸酶、A4脱饱和酶、△15脱饱和酶、A9脂肪酸延伸酶和/或A8脱饱和酶)的其他基因的载体转化。与在未表达本发明的编码高山被孢霉(M.a/p/wa)€;16/18脂肪酸延伸酶的嵌合基因的相同转化宿主中发生的相比，这种转化宿主预计将产生提高数量的w-3和/或co-6脂肪酸(例如，LA、ALA、EDA、GLA、STA、ETrA、DGLA、ETA、ARA、EPA、DPA和DHA,参见附图3)。包括在特定表达盒内的特定基因将取决于宿主细胞(和它的PUFA分布型和/或脱饱和酶/延伸酶分布型)、底物的可用性、以及期望的终产物。在可选择的实施方式中，可能有用的是破坏宿主有机体的天然。16/18脂肪酸延伸酶，根据在此描述的完整序列、那些完整序列的互补物、那些序列的基本部分、由此衍生的密码子优化的脱饱和酶和那些与之基本上同源的序列。例如，宿主有机体中d6A8脂肪酸延伸酶的定向破坏产生了不能合成硬脂酸的突变菌林，因而为了存活需要C化脂肪酸的补充。在可选择的实施方式中，包含其天然C!6A8脂肪酸延伸酶的破坏或钝化的转化宿主有机体然后可以被有益地转化来表达异源d6A8脂肪酸延伸酶(例如，如果异源(:16/18脂肪酸延伸酶具有与天然C6m脂肪酸延伸酶相比不同的底物特异性)。这种操作可以降低天然和异源c16/18脂肪酸延伸酶之间的底物竟争。因而，与相应的天然解脂耶罗维亚酵母(l^rmW"/^o/;^ca)d6n8脂肪酸延伸酶的敲除一同、异源(316/18脂肪酸延伸酶(即，SEQIDNO:2)的表达可以显著地提高在为PUFA生物合成工程化的转化体解脂耶罗维亚酵母(K一o/y"ca)宿主细胞中产生的总体长链co-3/oo-6PUFA。对于基因破坏，外源DNA片段(一般是可选择标记基因)被插入要破坏的结构基因中来打断它的编码序列从而功能上钝化该基因。破坏盒对宿主细胞中的转化引起功能性天然基因通过同源重组被无功能的破坏的基因替换(参见，例如Hamilton等人，丄Sa"e"o/1714617-4622(1989),Balbas等人,G匿136211-213(1993),Gueldener等人，A^c/e,.d^242519-2524(1996)，和Smith等人，Mo/.Ce〃^o/5270-277(1996))。反义技术是当目标基因的序列已知时减量调节基因的另一种方法。为了实现这一点，来自期望基因的核酸片段被克隆并可操纵地连接到启动子，从而将转录RNA的反义链。这个构建体然后#:导入宿主细胞，产生RNA的反义链。反义RNA通过防止编码目标蛋白质的mRNA的积累来抑制基因表达。本领域的技术人员将知道，与使用反义技术以降低特定基因的表达相关的专门的考虑。例如，反义基因的适当表达水平可能需要使用利用熟练的技术人员已知的不同调节元件的不同嵌合基因。虽然当序列已知时目标基因破坏和反义技术提供了减量调节基因的有效手段，已经开发了不基于序列的其他较低特异性的方法(例如，经由UV照射/化学试剂的诱变，或使用可转座元件/转座子；参见USSN10/840579)。表达系统、盒和载体在此描述的本序列的基因和基因产物可以在异源微生物宿主细胞中、特别是在产油酵母(例如，解脂耶罗维亚酵母(]^TovW"/i^o"ca))的细胞中产生。含有指导外源蛋白的高水平表达的调节序列的微生物表达系统和表达载体是本领域技术人员公知的。任何这些可以用于构建嵌合基因，用于产生当前脂肪酸延伸酶序列的基因产物。这些嵌合基因然后可以经由转化被导入合适的微生物中以提供所编码的酶的高水平表达。对于转化适合的宿主细胞有用的载体或DNA盒是本领域公知的。在构建体中存在的序列的特定选择取决于期望的表达产物(上文)、宿主细胞的性质以及分离转化的细胞与未转化的细胞的预计手段。然而，一般地，载体或盒含有指导相关基因的转录和翻译的序列、可选择标记以及容许自主复制或染色体整合的序列。适合的载体包含基因5'的控制转录起始的区域，和DNA片段的3'的控制转录终止的区域。当两个控制区域都来源于来自被转化宿主细胞的基因时是最优选的，然而要理解的是这种控制区域不必来源于对于选择作为生产宿主的特定物种是天然的基因(对于有用的起始控制区域和终止子，参见，例如，USSN10/840579)。然而，在某些优选的实施方式中，转录起始调节区域获自甘油醛-3-磷酸-脱氢酶(USSN10/869630,共同待决美国专利申请No.11/183664)、磷酸甘油酸变位酶(USSN10/869630)、果糖-二磷酸醛缩酶(USSN10/987548)、甘油-3-磷酸O-酰基转移酶(美国专利申请No.60/610060)、铵转运蛋白(共同待决美国专利申请No.11/185301)和翻i奪延伸因子EFl-a(TEF)蛋白(US6,265,185)。技术人员了解，仅仅将基因插入克隆载体中不能确保它将以所需的水平成功地表达。响应于高表达速度的需求，许多专业化表达载体已经通过操作许多不同的遗传元件来创建，所述遗传元件控制转录、翻译、蛋白质稳定性、氧显著、从宿主细胞的分泌的方面。更具体地，被操作来控制基因表达的一些分子特征包括1)相关转录启动子和终止子序列的性质，2)克隆的基因的拷贝数，无论该基因是质粒携带的还是整合到宿主细胞的基因组中的，3)合成的外源蛋白质的最终的细胞位置，4)在宿主有机体中的翻译效力，5)克隆的基因蛋白质在宿主细胞内的固有稳定性；和6)克隆的基因内的密码子利用率，从而它的频率接近宿主细胞的优选的密码子利用的频率。这些修饰类型的每一种都包括在本发明中，作为进一步优化在此描述的(316/18脂肪酸延伸酶的表达的手段。Cww脂肪酸延伸酶的重组表达的优选的微生物宿主用于表达当前C16/18脂肪酸延伸酶基因和核酸片段的宿主细胞可以包括微生物宿主，其在广泛的温度和pH值下在各种进料(feedstock)上生长，包括简单的或复杂的碳水化物、有机酸和醇类、和/或烃类。虽然本发明中描述的基因被分离用于在产油酵母、特别是解脂耶罗维亚酵母(}^7^>1^//^/_)^^)中表达，预期的是，由于转录、翻译和蛋白质生物合成机构是高度保守的，任何细菌、酵母、藻类和/或丝状真菌将是表达当前核酸片段的适合的宿主。优选的微生物宿主是产油有机体，例如产油酵母。这些产油有机体天然能够进行油合成和积累，其中总油含量可以包括大于约25%的细胞干重，更优选的大于约30%的细胞干重，以及最优选的大于约40%的细胞干重。另外，存在着使用这些有机体用于产生PUFA的基础，如在USSN10/840579和共同待决美国专利申请No.60/624812中所见。一般地鉴定为产油酵母的属包括但不限于耶罗维亚酵母属(y"mw&)、假丝酵母属(Ca"A^)、红酵母属(W/zo^ton^0、红冬孢酵母属("/zo(iovoh(i/i/m)、隐J求菌属(Oy/^ococcM)、丝孢酵母属(7Wc/zc^/ora")和油月旨酵母属(Z/powycM)。更具体地，i兌明性的油合成酵母包括圆红冬孢酵母属(i^o^^/on'^wmMrw/o/t/e力、斯达氏油脂酵母CWr—cafe、C.她7&、7Wc/zc^/oraw戶〃朋s、Z！cz^aweiw、A/zcxioforw/ag/z^ww^兄gram/"z's和解月旨耶罗维亚酵母(K37rovn'"//po(y〃ca)f之前分类为C朋(i油/—/,'ca义最优选的是产油酵母解脂耶罗维亚酵母(/z>o/;/"ca);以及，在进一步的实施方式中，最优选的是指定为ATCC#20362、ATCC#8862、ATCC#18944、ATCC#76982、ATCC#90812和/或LGAMS(7)l(PapanikolaouS,andAggelisG.,所omsow门7fec/mo/82(1)43-9(2002))的解脂耶罗维亚酵母(K/^0/"/ca)菌林。微生物宿主的转化一旦获得了编码适合于在产油酵母中表达的多肽的DNA,它被置于能够在宿主细胞中自主复制的质粒载体中，或它被直接整合到宿主细胞的基因组中。表达盒的整合可以在宿主基因组内随机地发生，或可以通过使用含有与宿主基因组同源的区域的构建体，其足以将重组物把向宿主基因座。当构建体被粑向内源基因座时，全部或某些转录和翻译调节区域可以由内源基因座提供。当从独立复制的载体表达两种或多种基因时，期望的是每种载体具有不同的选择手段并缺少与另一个构建体的同源性，以维持稳定表达和防止构建体之间元件的重新分配。导入的构建体的调节区、选择手段和增殖方法的明智选择可以实验上地确定，从而所有导入的基因以必要的水平表达以提供期望产物的合成。包含感兴趣的C16/18脂肪酸延伸酶基因的构建体可以通过任何标准技术导入宿主细胞。这些技术包括转化(例如，乙酸锂转化[MethodsinEnzymology,194186-187(1991)])、原生质体融合、基因枪(biohsticimpact)、电穿孔、显微注射或将感兴趣的基因导入宿主细胞的任何其他方法。适合于产油酵母(即，解脂耶罗维亚酵母(FamnWa/^o/Wca))的更具体的教导包括美国专利NO.4,880,741和NO.5,071,764以及Chen,DCetal(J///A^cro^o/说o&c/"o/48(2)232-235(1997))为了方便起见，已经通过任何方法操作来接受DNA序列(例如，表达盒)的宿主细胞在此将称为"转化的"或"重组的"。转化的宿主将具有表达构建体的至少一个拷贝，可以具有两个或多个，取决于基因是整合到基因组中、扩增还是存在于具有多个拷贝数的染色体外元件上。转化的宿主细胞可以通过各种选择技术来鉴别，如USSN10/840579和USSN10/869630中所描述的。在此使用的一些优选的选择方法是对卡那霉素、匀霉素、氨基糖苷G418的抗性，以及在缺乏尿嘧啶、亮氨酸、赖氨酸、色氨酸或组氨酸的培养基上生长的能力。在转化之后，适合于当前016/18脂肪酸延伸酶(以及，在宿主细胞内共表达的任选的其他PUFA酶)的底物可以通过宿主天然地或转基因地生产，或者可以外源地提供它们。硬脂酸生产的发酵过程转化的微生物宿主细胞在一定条件下生长，所述条件优化脂肪酸生物合成基因的活性并产生最大和最经济的脂肪酸产量(例如，硬脂酸，其可以随后提高各种oo-3和/或co-6脂肪酸的产量)。一般地，可以被优化的培养基条件包括碳源的类型和数量、氮源的类型和数量、碳氮比例、含氧量、生长温度、pH值、生物质生产阶段的长度、油积累阶段的长度以及细胞收获的时间。感兴趣的微生物，例如产油酵母在复合培养基(例如，酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖肉汤(YPD))中生长，或在缺乏生长必需成分的限定的基本培养基中生长从而促使选择期望的表达盒(例如YeastNitrogenBase(DIFCOLaboratories,Detroit,Ml))。本发明中的发酵培养基必需含有适合的碳源。适合的碳源可以包括，但不限于单糖(例如，葡萄糖、果糖)、二糖(例如，乳糖或蔗糖)、低聚糖、多糖(例如，淀粉、纤维素或其混合物)、糖醇(例如，甘油)或来自可更新进料的混合物(例如，干酪乳清渗透物、玉米浸泡液、甜菜糖蜜、大麦芽)。另外，碳源可以包括烷烃、脂肪酸、脂肪酸的酯、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、磷脂和各种脂肪酸的商业来源，包括植物油(例如，大豆油)和动物脂肪。此外，碳底物可以包括一碳底物(例如，二氧化碳或曱醇)，已经展现了它们代谢转变成关键的生物化学中间物。因此预期的是，在本发明中利用的碳源可以包括各种各样的含碳底物，将仅由宿主有机体的选择来限制。虽然所有以上提及的碳底物和其混合物预计在本发明中是适合的，优选的碳底物是糖类和/或脂肪酸。最优选的是葡萄糖和/或含有10-22个碳之间的脂肪酸。氮可以从无机的(例如，(NH4)2S04)或有机的(例如，尿素或谷氨酸)来源提供。除了合适的碳和氮源之外，发酵培养基还必需含有适合的矿物质、盐、辅助因子、緩冲液、维生素和本领域技术人员已知的其他成分，适合于微生物的生长并促进PUFA生产所必需的酶途径。特别注意的是给予促进脂质和PUFA合成的几种金属离子(例如，Mn+2、Co+2、Zn+2、Mg+2)(Nakahara,T等人，/^M/p/.Ce〃。7"DJKyleandRColin,edspp61-97(1992))。本发明中优选的生长培养基是常见的商业上制备的培养基，例如YeastNitrogenBase(DIFCOLaboratories,Detroit,Ml)。其他限定的或合成的生长培养基也可以使用，对于特定微生物的生长适合的培养基将是微生物学或发酵科学领域的技术人员已知的。发酵的适合的pH值范围一般在约pH4.0到pH8.0之间，其中pH5.5到pH7.0是初始生长条件优选的范围。发酵可以在有氧或缺氧条件下进行，其中微有氧条件是优选的。一般地，产油酵母细胞中高水平的PUFA的积累需要两个阶段的过程，因为代谢状态必需在生长和脂肪的合成/储存之间"平衡"。因而，最优选地，二阶段发酵过程是产油酵母中PUFA的生产所必需的。在WO2004/101757中描述了这种方法，以及各种适合的发酵过程设计(即，分批、进料分批和连续)和生长期间的考虑。PUFA的纯化脂肪酸、包括PUFA可以在宿主微生物中作为游离脂肪酸或以酯化的形式存在，例如酰基甘油、磷脂、硫脂或糖脂，可以通过各种本领域公知的方式从宿主细胞提取。酵母脂质的提取技术、质量分析和4妻受标准的一篇综述是ZJacobs的综述(Cn"ca/Aevzews肠&c/mo/ogy12(5/6)463-491(1992))。下游加工的简要综述也是可获得的，ASingh和OWard(颠勿/.Mc油o/45271-312(1997))。一般地，纯化PUFA的方法可以包括用有机溶剂提取、超声处理、超临界流体提取(例如，使用二氧化碳)、皂化、和物理方式，例如压榨，或其组合。对于其他细节参考WO2004/101757的教导。优选实施方式的说明在此描述的工作的最终目标是开发积累在oo-3和/或co-6PUFA中富集的油的产油酵母。为此，必需鉴定在产油酵母中有效地起作用的脂肪酸延伸酶，以允许在这些宿主中优选的PUFA的合成和高积累。在早先的工作中，申请人过量表达了大鼠(316/18脂肪酸延伸酶蛋白质(来自Rattusnorvegicus的rEL02,GenBankAccessionNo.AB071986),虽然rEL02在解脂耶罗维亚酵母(JanwWa/00〃ca)中被成功地表达作为提高下游PUFA的产量的手段(美国专利申请No.60/624812),在转化的宿主中这个基因的存在无助于管理批号的获得。结果，进行了当前的工作来鉴定更合适的。16/18脂肪酸延伸酶。根据BLAST分析，在专有的高山被孢霉(A/oW/ere〃a"/p&a)cDNA库中鉴定了cDNA片段。该基因的编码区(暂定名称"elo3")在强天然启动子的控制下在解脂耶罗维亚酵母(Kmw/a/)Jpoma)中过量表达，从而产生与对照菌林相比产生多35%的C18脂肪酸(180,C181,C182和GLA)和少31%的C!6脂肪酸。因此，这些数据表明高山被孢霉(M"/;z"")EL03使用C16脂肪酸作为底物来产生ds脂肪酸。预计的是，高山被孢霉(Ma/;z"a)EL03将适合于提高进入co誦3/w-6脂肪酸生物合成途径的碳通量，从而提高工程化的耶罗维亚酵母属(r^row^)菌株中更长链的脂肪酸油含量。因而，本发明的一个实施方式是改变产油酵母中脂肪酸分布型的方法，其中高山被孢霉(Ma///"")EL03被单独表达或与其他PUFA生物合成途径基因(例如，△9脱饱和酶、A12脱饱和酶、A6脱饱和酶、ds/2。脂肪酸延伸酶、A5脱饱和酶、A17脱饱和酶、C20/22脂肪酸延伸酶、A4脱饱和酶、△15脱饱和酶、A9脂肪酸延伸酶和/或A8脱饱和酶)一同表达以允许长链PUFA(例如LA、ALA、EDA、GLA、STA、ETrA、DGLA、ETA、ARA、EPA、DPA和/或DHA)的提高的产生。实施例在以下实施例中进一步定义本发明。要理解的是，代表本发明的优选的实施方式的这些实施例仅通过例示的方式给出。根据以上的说明和这些实施例，本领域技术人员可以容易地确定本发明的基本特征而不背离本发明的精神和范围，可以进行本发明的各种变化和修改来4吏其适应各种用途和状况。一般方法在实施例中使用的标准重组DNA和分子扩增技术是本领域公知的,由1)Sambrook，J,Fntsch,EFandManiatis，T.M/ecw/arC7om."g.爿Z^6ora紐少Mwwa/，ColdSpringHarborLaboratoryColdSpringHarbor,NY(1989)(Maniatis);2)TJSilhavy，MLBennan,andLWEnquist，ExperimentswithGeneFusions,ColdSpringHarborLaboratoryColdSpringHarbor,NY(1984)和3)Ausubel,FM等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology,publishedbyGreenePublishingAssocandWiley-lnterscience(1987)戶斤4笛述。适合于细菌培养物的维持和生长的材料和方法是本领域公知的。适用于以下实施例的4支术可以在ManualofMethodsforGeneralBacteriology(PhilhppGerhardt，R.GEMurray,RalphN.Costilow,EugeneWNester,WillisAWood,NoelRKnegandGBnggsPhillips,Eds)、AmericanSocietyforMicrobiologyWashington,DC(1994))或ThomasDBrockinBiotechnologyATextbookofIndustrialMicrobiology,2nded,SinauerAssociatesSunderland,MA(1989)中找到。对于细菌细胞的生长与维持使用的所有试剂、限制性内切酶和材料是从AldnchChemicals(Milwaukee,Wl)、DIFCOLaboratories(Detroit,Ml)、GIBCO/BRL(Gaithersburg,MD)或SigmaChemicalCompany(StLouis,MO)获得的，除非另作说明。co"TOP10细月包和co〃ElectromaxDH10B细月包获自Invitrogen(Carlsbad,CA)。E.coliDH5a的最大效力感受态细胞获自GIBCO/BRL(Gaithersburg,MD)。￡co//广XL1-Blue)感受态细月包购自StratageneCompany(SanDiego,CA)。所有Eco"菌株一般在37。C在LunaBertani(LB)平板上生长。一般的，根据标准方法(Sambrook等人，上文)进行分子克隆。通过Sigma-Genosy(Spring,TX)合成寡核苷酸。PCR产物克隆到Promega的pGEM國T-easy载体(Madison,WI)中。利用载体和间插特异性引物的组合使用染料终止子技术(US5,366,860、EP272,007)在ABI自动测序仪上产生DNA序列。序列编辑在Sequencher(GeneCodesCorporation,AnnArbor,MI)中进行。所有序列在两个方向上呈现覆盖至少两次。遗传序列的比较使用DNASTAR软件(DNASTARInc,Madison,WI)进行。缩写的含义如下"sec"是指秒，"min"是指分钟，"h"是指小时，"d"是指天，'V1"是指微升，"ml"是指毫升，"L"是指升，>M"是指微摩，"mM"是指毫摩，"M"是指摩，"mmol"是指毫摩尔，'Vmole"是指微摩尔，"g"是指克，"(iig"是指微克，"ng"是指纳克，"U"是指单位，"bp"是指碱基对，"kB"是指千碱基解脂耶罗维亚酵母(T"m銜'a/^0/Wca)的培养解脂耶罗维亚酵母(r^7YnWa/,)o/,'ca)菌株ATCC#76982和ATCC#90812购自美国典型培养物保藏所(Rockville,MD)。解脂耶罗维亚酵母(K/^o/,c")菌株通常在28。C在YPD琼脂(1%酵母提取物、2%bactopeptone、2%葡萄糖、2%琼脂)上生长。解脂耶罗维亚酵母(l^ra術"/00(y"ca)的转化根据Chen,DC等人Mc油WW咖W48(2)232-235(1997))的方法进行，除非另作说明。简要地，Yarrowia在YPD平板上划线，在3(TC生长大约18小时。从平板上刮下几个大菌环的细胞，重悬浮在1mL转化緩冲液中，所述转化緩冲液含有2.25ml50%PEG、平均MW3350,0.125mL2M醋酸锂，pH6.0,0.125mL2MDTT,和50|ng剪切的鮭鱼精子DNA。然后，约500ng线性化的质粒DNA在100pl重悬浮细胞中孵育，以15分钟间隔的涡旋混合维持在39°C1小时。细胞平铺到选择培养基平板上，在30。C维持2到3天。对于转化体的选择，一般使用基本培养基("MM"),其中MM的纟且成Jt口下0.17%yeastnitrogenbase(DIFCOLaboratories,Detroit,Ml),没有硫酸铵或氨基酸，2%葡萄糖，0.1%脯氨酸，pH6.1)。视情况添加尿嘧，定的补充到0.01%的终浓度(从而产生"MMU"选择培养基，用20g/L琼脂制备)。做为选择，在5-氟乳清酸("FOA",也称5-氟尿嘧啶-6-羧酸一水合物)选择培养基上选择转化体，其包含0.17%酵母氮碱(DIFCOLaboratories,Detroit,Ml),没有硫酸铵或氨基酸、2%葡萄糖、0.1%月甫氨酸、75mg/L尿嘧啶、75mg/L尿嘧咬核苷、900mg/LFOA(ZymoResearchCorp,Orange,CA)和20g/L琼脂。最后，如下制备高葡萄糖培养基("HGM"):14g/LKH2P04、4g/LK2HP04、2g/LMgS047H20、80g/L葡萄糖(pH6.5)。设计这种培养基以促进油的条件。解脂耶罗维亚酵母(T^nnWa//po/W/ca)的脂肪酸分析对于脂肪酸分析，通过离心收集细胞，如Bligh,EG&Dyer,WJ.(Om.丄所oc/^m.尸/z;^'o/.37.911-917(1959))中描述的提取脂质。通过用甲醇钠转酯化脂质提取物制备脂肪酸曱酯(Roughan,G,andNishidaly^c/z说oc/^m^op/z"276(1)38-46(1990)),随后用装备有30國mX025mm(id)HP陽INNO.WAX(Hewlett-Packard)柱的Hewlett-Packard6890GC分析。烘箱温度以3.5°C/min从170°C(保持25分钟)到185°C。对于直接碱转酯化，收获耶罗维亚酵母属(K^To術'a)培养物(3mL),在蒸馏水中洗涤一次，在在Speed-Vac中真空度中干燥5-10分钟。甲醇钠(1%的100jil)添加到样品，然后涡旋和摇摆样品20min。在添加3滴1MNaCl和400pi己烷之后，涡旋和旋转样品。除去上层，如上所述通过GC分析。实施例1高山被孢霉(^foWere〃aa/p/m)cDNA库的构建本实施例描述了利用BD-ClontechCreatorSmartcDNA库试剂盒(Mississauga,ON,Canada)根据厂家的方案构建高山被孢霉(MWere〃<2a///—的cDNA库。特别地，高山被孢霉(M"/^mO菌株ATCC#16266在60mLYPD培养基(2%Bacto酵母提取物，3%Bactor蛋白胨，2%葡萄糖)中在23。C生长3天。通过在BeckmanGH38转子中在3750rpm离心10min来团化细胞，重悬浮在6x0.6mLTrizole试剂(Invitrogen)中。重悬浮的细胞转移到六个2mL螺旋盖管中，各含有0.6mL的0.5mm玻璃珠。在Biospec(Bartlesville,OK)迷你珠子搅拌器上以HOMOGENIZE设置匀化细胞2min。试管短暂旋转来沉淀珠子。液体转移到4个新鲜的1.5mL微离心试管中，向每个试管添加0.2mL氯仿/异戊醇(24:1)。用手摇动试管1min,放置3min。试管然后在4。C在14,000rpm旋转10min。上层转移到4个新试管中。向每个试管添加异丙醇(0.5mL)。在室温下孵育试管15min,随后在4。C以14,000rpm离心10min。团粒各用1mL的75%乙醇(用无RNase的水制成)洗涤并风干。总RNA样品然后重新溶解在500ili1水中，使用1:50稀释的RNA样品通过A26onm测量RNA的数量。获得总共3.14mgRNA。这个总RNA样品进一步用QiagenRNeasy总RNAMidi试剂盒根据厂家的方案纯化。这样，总RNA样品稀释到2mL，与具有80plP-巯基乙醇和5.6mL100%乙醇的8mL緩沖液RLT混合。样品分成4个部分，加载到4个RNeasymidid柱上。柱然后在4500xg离心5min。为了洗涤柱，加载2ml緩沖液RPE,柱在4500xg离心2min。洗涤步骤重复一次，只是离心时间延长到5min。通过向每个柱施加250pl无RNase的水，等待lmin并在4500xg离心3min来洗脱总RNA。然后根据AmershamBiosciences的mRNA纯化试剂盒的方案，从上述总RNA样品分离PolyA(+)RNA。简要地，使用2oligo-dT-纤维素柱。每次用1mL高盐緩冲液洗涤柱两次。来自前面步骤的总RNA样品稀释到2mL总体积，调节到10mMTris/HCl、pH8.0、1mMEDTA。样品在65。C加热5min,然后置于水上。添加样品纟爰沖液(0.4mL)，然后将样品自动供料地加载到两个oligo-dt-纤维素柱上。柱在350xg离心2min,每次用0.25mL高盐緩冲液洗涤2x,每次随后是350xg离心2min。用低盐緩冲液进一步洗涤柱3次，随后是相同的常规离心。Poly(A)十RNA通过每次用0.25mL预热到65。C的洗脱緩冲液洗涤柱4次、随后是相同的离心操作来洗脱。整个纯化过程重复一次。纯化的poly(A)+RNA以30.4ng/pl的浓度获得。产生cDNA,使用BD-Clontech说明的LD-PCR方法和0.1吗polyA(+)RNA样品。具体地，对于第一链cDNA合成，3pl的poly(A)+RNA样品与1pl的SMARTIV寡核苷酸(SEQIDNO:3)和1的CDSin/3'PCR引物(SEQIDNO:4)混合。混合物在72。C加热2min，在水上冷却2min。向试管中添加以下2[d第一链緩冲液、1(xl20mMDTT、1pl10mMdNTP混合物和1^1Powersc叩t逆转录酶。混合物在42"C孵育1hr并在水上冷却。第一链cDNA合成混合物用作PCR反应的才莫板。具体地，反应混合物含有以下2pi第一链cDNA混合物、2pl5'PCR引物(SEQIDNO:5)、2piCDSIII/3'PCR引物(SEQIDNO:4)、80pi水、10pi10xAdvantage2PCR緩冲液、2jil50xdNTP混合物和2pi50xAdvantage2聚合酶混合物。在GenAmp9600仪器上，热循环仪条件设置为95°C20秒，随后是95。C5秒和68。C6分钟的14个循环。通过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色来测定PCR产物。75pl上述PCR产物(cDNA)与随试剂盒提供的320ng/pl蛋白酶K混合。混合物在45。C孵育20min,然后添加75^1水，用150jil苯酚氯仿异戊醇混合物(25:24:1)提取混合物。水相进一步用150(xl氯仿异戊醇(25:1)提取。水相然后与15pl3M醋酸钠、2ltd20ng/jal糖原和400(il的100%乙醇混合。混合物立即在微离心管中以14000rpm在室温下离心20min。团粒用150pl80%乙醇洗涤一次，风干，溶于79pl水中。溶解的cDNA随后用Sfil消化(79^11的cDNA与10pl的10xSfil緩冲液、10|nlSfil酶和1pl100xBSA混合，混合物在50。C孵育2小时)。添加二曱苯蓝染料(2pl1%)。完全根据厂家的操作，混合物然后在试剂盒提供的ChromaSpin-400柱上分级。通过琼脂糖凝胶电泳分析从柱收集的级分。集中含有cDNA的前三个级分，用乙醇沉淀cDNA。沉淀的cDNA重新溶解在7^1水中，连接到试剂盒提供的pDNR-LIB中。库测序使用连接产物来转化E.coliXL-1Blue电穿孔感受态细胞(Stratagene)。获得估计总共2xl()6个菌落。cDNA库的测序由AgencourtBioscienceCorporation(Beverly,MA),<吏用M13正向引4勿(SEQIDNO:6)进行。实施例2来自高山被孢霉(^foW/e"〃aafa/wa〗的部分脂肪酸延伸酶序列的鉴定本实施例描述了从9,984个cDNA序列中编码高山被孢霉(Ma/;z"a)脂肪酸延伸酶的cDNA片段(SEQIDNO:7)的鉴定。对于与BLAST"nr，，数据库(包括所有非冗余GenBankCDS翻译、来自3维结构Brookhaven蛋白质数据库的序列、SWISS-PROT蛋白质序列数据库、EMBL和DDBJ数据库)中含有的序列的相似性通过进行高山被孢霉(McDNA序列的BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool,Altschul,SF,等人，JA/o/Ao/215403-410(1993))检索来测定序列的同一性。在所有阅读框中翻译cDNA序列，使用NCBI提供的BLAST算法(Gish,WandStates,DJ淑,G置to3266-272(1993))与"nr"数据库中含有的所有公众可获得的蛋白质序列比较相似性。一个cDNA片段(SEQIDNO:7)带有与许多脂肪酸延伸酶的显著同源性，因而被暂时鉴定为延伸酶。概况了与SEQIDNO:7具有最大相似性的序列的BLAST比较的结果是根据同一性％、相似性％和期望值报告的。"同一性％"被定义为两个蛋白质之间相同的氨基酸的百分比。"相似性％"被定义为在两个蛋白质之间相同或保守的氨基酸的百分比。"期望值"使用给定的分值估计了匹配的统计显著性，指出了在这个绝对大小的数据库检索中偶然预期的匹配数量。因而，SEQIDNO:7的翻译的氨基酸序列与来自CandidaalbicansSC5314的潜在脂肪酸延伸酶的蛋白质序列(GenBankAccessionNo.EAL045101,其中注释为与酿酒酵母(S.ce^ww"e)EUR4、FEN1和ELOl类似的三种潜在脂肪酸延伸酶基因之一)具有32%同一性和46%相似性，期望值4e-13。另外，SEQIDNO:7与来自酉良酒酵母(S"cc力(3ram少cescerev/wae)的ELOl(GenBankAccessionNo.NC—001142,染色体X的碱基67849-68781)具有35%同一性和53%相似性。ce^v/w'aeELOl被描述为中链酰基延伸酶，其催化不饱和C12-C16脂肪酰基-CoA向C16-18脂肪酸的羧基末端延伸。在以上报道的同源性的基础上，SEQIDNO:7的解脂耶罗维亚酵母(yam銜a/0o/少"c力基因产物在此被称为"延伸酶3"或"EL03"。实施例3完整高山被孢霉(MEL03的测序部分脂肪酸延伸酶cDNA序列(SEQIDNO:7)的分析表明5'和3'末端都是不完整的。为了获得缺失的区域，利用了基因组步移技术。基因组步移来分离高山被孢霉(M"/p/wa)EL03的3'末端区域ClontechUniversalGenomeWalkerTM试剂盒被用于获得与高山被孢霉(Ma/pz"a)EL03的3'末端区域相应的基因组DNA的片段。简要地，25jxg每种高山被孢霉(Ma—"a)基因组DNA用Dral、EcoRV、PvuII或Stul分别消化，消化的DNA样品使用QiagenQiaquickPCR纯化试剂盒来纯化，各用30pg试剂盒緩沖液EB洗脱，纯化的样品然后与GenomeWalker接头(SEQIDNO:8[顶部链]和9[底部链])连接，^口下戶斤示GGCTGGT-3，3'-H2N-CCCGACCA-5'每种连接反应混合物含有1.9pl的25GenomeWalker接头，1.6pi10x连接緩冲液、0.5plT4DNA连接酶以及4^1纯化的消化基因组DNA样品之一。反应混合物在16。C孵育过夜。通过在7(TC孵育5min终止反应。然后，向每个连接反应混合物添加72pi10mMTrisHCl、1mMEDTA、pH7.4緩沖液。进;f亍四个独立的PCR反应，每个〗吏用四种连接混合物之一作为才莫板。PCR反应混合物含有1pi连接混合物、0.5(xl20引物MAElong3'l(SEQIDNO:10)、1pl10试剂盒引物API(SEQIDNO:11)、22，水和25piExTaqpremixTaq2xPCR溶液(TaKaRaBioInc,Otsu,Shiga,520-2l93,Japan)。PCR反应使用以下条件进行32个循环，在94°C30秒变性、在55。C30秒退火以及在72。C3分钟延伸。最后的延伸循环在72。C进行7分钟，随后在4。C反应终止。每个PCR反应的产物分别1:50稀释，用作第二轮PCR的模板。每个反应混合物含有1pl稀释的PCR产物之一作为模板，0.5(til20|LiM引物MAelong3'2(SEQIDNO:12)、1pllO)iM试剂盒引物AP2(SEQIDNO:13)、22.5pl水和25piExTaqpremixTaq2XPCR溶液(TaKaRa)。PCR反应使用如上所述相同的热循环仪条件进行32个循环。从第二轮PCR获得1041bpDNA片段(SEQIDNO:14)。这个片段被纯化并克隆到pCR2.1-TOPO中并测序。序列分析显示该片段含有EL03的3'末端，包括基因的"TAA"终止密码子的640bp下游。基因组步移来分离豸^被孩虞7Ma/p^q)EL03的5'末端区域在Clontech3'末端RACE(上文)中使用的相同的四个连接混合物集合也被用于获得高山被孢霉(MEL03的5'末端区域。具体地，使用如上所述相同的成分和条件进行第一轮PCR,只是MAElong5'1(SEQIDNO:15,在5'末端嵌套)和API作为引物(即，代替引物MAElong3'1和API)。第二轮PCR使用MAElong5'2(SEQIDNO:16,在5'末端嵌套)和AP2作为引物。获得了2223bpDNA片I殳(SEQIDNO:17)。它被纯化并克隆到pCR2.1-TOPO中，序列的了分析显示它含有EL03基因的5'区域。因而，通过组合由基因组步移获得的(分别为SEQIDNO:14和17,在附图1中图示说明)、具有重叠的5'和3'序列的原始部分cDNA序列(SEQIDNO:7)获得了高山被孢霉(Ma/p，)EL03的完整cDNA序列(SEQIDNO:1)。这产生了3557bp的序列，在此标为SEQIDNO:18,包括EL03的推定的"ATG"翻译起始密码子的2091bp上游、828bpEL03ORF(即，SEQIDNO:1,相应于SEQIDNO:18的碱基2092-2919)和EL03终止密码子的638bp下游(相应于SEQIDNO:18的碱基2920-3557)。高山被孢霉(Ma/p/朋)EL03的相应基因组序列比SEQIDNO:18所提供的cDNA片段更长。具体地，在含有EL03基因的基因组DNA的ORF的318bp处存在542bp内含子(SEQIDNO:19);因而，在此由SEQIDNO:29所提供的基因组DNA片段是4,099bp(附图1)。根据BLAST程序分析(上文，实施例2)翻译的EL03蛋白质序列(SEQIDNO:2)具有与已知脂肪酸延伸酶的以下同源性与来自白假丝酵母(Candidaalbicans)SC5314的可能的脂肪酸延伸酶(GenBankAccessionNo.EAL045101)的37%同一性和51%相似性，4e-43的期望值。此外，翻译的EL03与来自Neurosporacrassa的XP—331368(其中注释为"假想的蛋白")享有33%的同一性和44%的相似性，3e-44的期望值。实施例4解脂耶罗维亚酵母(T^rovWa"po/Wc^)ATCC#20362菌抹Y2031的产生本实施例描述了来自解脂耶罗维亚酵母(l^rovWa/z>o(y"ca)ATCC#20362的菌抹Y2031的构建。通过将来自质粒pKUNT2的TEFY△12Pex20嵌合基因到ATCC#20362的Um3基因座，从而产生Ura基因型，来产生Y2031菌林。质粒pKUNT2含有以下组件表3质粒pKUNT2的描述(SEOIDNO:20)<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>用Ascl/Sphl消化pKUNT2质粒，然后用于根据一般方法的野生型KATCC#20362的转化。转化体细胞平铺在FOA选择培养基平板上，在3(TC维持2到3天。挑选FOA抗性菌落并在MM和MMU选择平板上划线。选择可以在MMU平板上生长但不能在M平板上生长的菌落作为Ura菌抹。然后在3(TC将Um菌抹的单个菌落接种到液体MMU中，在250rpm/min摇动2天。通过离心收集细胞，提取脂质，通过转酯化制备脂肪酸曱酯，随后用Hewlett-Packard6890GC分析。GC分析显示，与野生型ATCC#20362中的约20。/oLA相比，在两种Ura菌抹(菌抹#2和#3)中有约45%LA。转化体菌抹#2被称为菌抹"Y2031"。实施例5高山被孢霉a^)^g^〃"a/^力a)脂肪酸EL03在解脂耶罗维亚酵母(KjTTOw/a//po/v〃ca)菌4朱Y2031中的异源表达本实施例描述了在解脂耶罗维亚酵母(K//po/y"ca)菌株Y2031中在解脂耶罗维亚酵母(K/^o/_y"ca)启动子的控制下高山被孢霉(M"/^，)EL03ORF在嵌合基因中的过量表达，以及通过TAG含量分析确定的过量表达的效果。包含AFBAINEL03PEX16-3'嵌合基因的质粒pZUF6S-E3WT的构建高山被孢霉(Ma/z,"a)脂肪酸EL03ORF如下克隆引物MAElong5'Ncol3和MAElong3'Notl(SEQIDNO:23和24)被用于从高山被孢霉(Ma/;/冊)的cDNA(实施例1)通过PCR扩增EL03ORF。反应混合物含有1^cDNA、1^每种引物、22pi水和25piExTaqpremix2xTaqPCR溶液(TaKaRa)。扩增如下进行在94°C30秒首先变性，随后是94。C30秒变性、55。C30秒退火和72。C120秒延伸的32个循环。最后的延伸循环在72。C进行7min,随后在4。C终止反应。从PCR反应获得830bpDNA片段。使用Qiagen(Valencia,CA)PCR纯化试剂盒根据厂家的方案来纯化。纯化的PCR产物分成两个等份，其中一个用Ncol和Nspl消化，而另一个用Nspl和Notl消化。270bpNcol-Nspl和560bpNspl-Notl片l殳通过三片段连接克隆到Nco1-No.t1酶切的pZF5T-PPC载体中(附图2A;SEQIDNO:25),从而基因处于用于在解脂耶罗维亚酵母(K中表达的自我复制载体中解脂耶罗维亚酵母(K/00"ca)FBAIN启动子和PEX16-3'终止子区域(GenBankAccessionNo.U75433)的控制下。"FBAIN启动子"是指在fbal基因编码的果糖-二磷酸醛缩酶(EC41213)的"ATG"翻译起始密码子之前的5'上游非翻译区域，并且它是表达所必需的，加上具有fbal基因的内含子的一部分5'编码区(进一步细节参见WO2005/049805)。通过miniprep分析确认了正确的转化体，产生的质粒称为"pZF5T-PPC-E3"(SEQIDNO:26)。用Clal和Pad消化质粒pZF5T-PPC-E3,使用Qiagen凝胶提取试剂盒从琼脂糖凝胶纯化2.2kB条带(即，FBAINELO3PEX16-3'片段)。将该片段克隆到Clal-Pacl酶切的pZUF6S(附图2B,SEQIDNO:27)中，这是一种含有处在FBAIN启动子的控制下的高山被孢霉(Mm'er函—△A6脱饱和酶ORF("D6S，，，GenBankAccessionNo.AF465281)的自我复制质粒，具有Pex20-3'终止子(即,FBAIND6S.Pex20嵌合基因)和Ura3基因。通过miniprep分析确认了正确的转化体，产生的质粒称为"pZUF6S-E3WT"(SEQIDNO:28，附图2C)。过量表达高山^皮孢霉q^"/w力^)EL03的转化体解脂耶罗维亚酵母〖K"卯/v"ca)中脂质含量的分析用质粒pZUF6S(对照，包含FBAIND6SPex20嵌合基因)和质粒pZUF6S國E3WT(包含FBAIND6SPex20嵌合基因和FBAINELO3PEX16嵌合基因)根据一般方法转化解脂耶罗维亚酵母(K/^o/^/ca)菌林Y2031。转化体在补充有氨基酸的合成MM上生长2天，随后在HGM中4天。含有pZUF6S的六个克隆(克隆#1-6,来自单个的转化体)和含有pZUF6S-E3WT的22个克隆(来自四种不同的转化体[即，#3、5、6和7]的脂肪酸分布型以下在表4中显示，根据GC分析(如一般方法中所描述的)。脂肪酸被标示为160(椋榈酸)、161(棕榈油酸)、180、181(油酸)、182(LA)和GLA,每一种的组成表示为总脂肪酸的％。表4一皮工程化以过量表达高山^f皮孢霉(Ma/^w^)脂肪酸EL03的Yarrowia菌抹Y2031中的脂质含量<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>一些样品(以粗体和斜体字标记)偏离了预期读数。特别地，Y2031+pZUF6S-E3WT#3-3和Y2031+pZUF6S-E3WT#5陽6都不产生GLA。类似地，Y2031+pZUF6S-E3WT#7-1、#7-3和#7-4具有GC错误，其中160和161峰被GC读取为单个的峰。作为这些变体结果的结果，表5报道了在对照和表达EL03的转化体菌抹中的平均脂质。特别地，表5显示了来自表4中脂肪酸分布型的平均值，而在计算这平均值时在表4中通过粗体和斜体标示为不正确的抹系没有被包括。"总C16"代表160和161的平均面积，而"总C18"反映了180、181、182和GLA的平均面积。-故工程化以过量表达高山#1孢霉0^a/^力a)脂肪酸EL03的耶罗维亚酵母〖Yarrowia)菌抹Y2031中的平均脂质含量<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>根据以上报道的数据，相对于仅过量表达高山被孢霉(Ma/;/，)△6脱饱和酶的对照菌抹Y2031,当在解脂耶罗维亚酵母(K^ravWa/,)o"c")菌株Y2031中与高山被孢霉(M"/p力")A6脱饱和酶共表达时，高山被孢霉(M"/户/"a)EL03的过量表达产生C18的提高的百分比和C16的降低的百分比。这表明高山^皮孢霉(M！a/;/"a)EL03实际上是016/18脂肪酸延伸酶。对本领域技术人员明显的是，其他嵌合基因可以在工程化的Yarrowia中与高山被孢霉(Ma//,"")EL03基因共表达来提高各种其他脂肪酸的产生。例如，除了高山被孢霉(Ma/pz力")EL03(其任选的可以是为提高表达密码子优化的)之外，人们可以容易地表达Cum脂肪酸延伸酶和/或A9脱饱和酶作为允许流入脂质代谢的碳的增量调节的手段。在可选择的实施方式中，高山被孢霉(Ma/;/"a)EL03可以容易地与任何以下的PUFA生物合成途径基因共表达，包括，例如，A12脱饱和酶、A15脱饱和酶、A6脱饱和酶、A5脱饱和酶、A17脱饱和酶、A9脂肪酸延伸酶、A8脱饱和酶、C18/20脂肪酸延伸酶、C20/22脂肪酸延伸酶和/或A4脱饱和酶，以允许各种PUFA的提高的生产(附图3)。权利要求1.一种编码C16/18脂肪酸延伸酶的分离的核酸分子，所述分离的核酸分子选自(a)编码SEQIDNO2所示氨基酸序列的分离的核酸分子，(b)在以下杂交条件下与(a)杂交的分离的核酸分子0.1×SSC，0.1％SDS，65℃，以及用2×SSC、0.1％SDS随后用0.1×SSC、0.1％SDS洗涤，或与(a)或(b)完全互补的分离的核酸分子。2.权利要求l的分离的核酸分子，其中所述分离的核酸分子选自SEQIDNO:1、SEQIDNO:18和SEQIDNO:29。3.由权利要求1的分离的核酸分子编码的多肽。4.一种分离的核酸分子，其包含编码至少275个氨基酸的C16/18脂肪酸延伸酶的第一核苦酸序列，当根据BLAST比对方法与具有SEQIDNO:2中所示序列的多肽相比较时，所述(:16/18脂肪酸延伸酶具有至少90%的同一性，或包含所述第一核苷酸序列的互补物的第二核苷酸序列。5.—种嵌合基因，其包含与适合的调节序列可操纵地连接的权利要求1的分离的核酸分子。6.包含权利要求5的嵌合基因的转化的宿主细胞。7.权利要求6的转化的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自藻类、细菌、真菌和酵母。8.权利要求7的转化的宿主细胞，其中所述酵母是产油酵母。9.权利要求8的转化的宿主细胞，其中所述产油酵母选自耶罗维亚酵母属(F^ro銜'a)、假丝酵母属(Om^'^0、红酵母属(尺/wJWon^/a)、红冬孢酵母属(i^ot/c^;onWwm)、隐J求菌属(0>^、丝孑包酵母属(7Wc/zos^oraw)和、油月旨酵母属(/j)7omyces)。10.权利要求9的转化的宿主细胞，其中所述宿主细胞是解脂耶罗维亚酵母(fomnWa/—/,'ca)。11.权利要求10的转化的宿主细胞，其中所述解脂耶罗维亚酵母(KsrravWa/00"'ca)是选自解月旨耶罗维亚酵母(Ka^rcwz'a/^>o/_y/7'c<3)ATCC#20362、解脂耶罗维亚酵母(r^ro術a/*o/_y"ca)ATCC#8862、解脂耶罗维亚酵母(;^mnW"/巾o(y"ca)ATCC#18944、解脂耶罗维亚酵母(K^rovW"ATCC#76982、解脂耶罗维亚酵母(fomnW"ATCC#90812和解脂耶罗维亚酵母(7wraw/"/,>o(y"ca)LGAMS(7)l的菌株。12.—种产生硬脂酸的方法，所述方法包括a)提供产油酵母，所述产油酵母包含处在适合的调节序列的控制下的、编码如SEQIDNO:2中所示的具有C16/18脂肪酸延伸酶活性的多肽的分离的核酸片段，b)提供包含棕榈酸的延伸酶底物源，c)在一定条件下与(b)的延伸酶底物一起生长步骤(a)的产油酵母，在所述条件中步骤(a)(i)或步骤(a)(ii)的核酸分子被表达并且产生硬脂酸，和d)任选地回收步骤(c)的硬脂酸。13.—种生产多不饱和脂肪酸的方法，所述方法包括a)提供产油酵母，其包含(i)编码如SEQIDNO:2中所示具有C16/18脂肪酸延伸酶活性的多肽的分离的核酸片段，(ii)编码功能性多不饱和脂肪酸生物合成途径的基因，b)提供包含棕榈酸的延伸酶底物源，和c)在一定条件下与(b)的延伸酶底物一起生长步骤(a)的产油酵母，在所述条件下产生多不饱和脂肪酸，和d)任选地回收步骤(c)的多不饱和脂肪酸。14.根据权利要求13的方法，其中所述多不饱和脂肪酸选自亚油酸、Y-亚麻酸、二十碳二烯酸、二高-Y-亚麻S臾、花生四烯酸、oc-亚麻酸、stearidonicacid、二十石灰三烯酸、二十碳四烯酸、二十石友五烯酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸。15.根据权利要求13的方法，其中所述编码功能性多不饱和脂肪酸生物合成途径的基因编码选自A9脱饱和酶、A12脱饱和酶、A6脱饱和酶、C18/2。脂肪酸延伸酶、A5脱饱和酶、A17脱々包和酶、C20/22脂肪酸延伸酶、A4脱饱和酶、A15脱饱和酶、A9脂肪酸延伸酶和A8脱饱和酶的酶。16.根据权利要求12或13的任一项的方法，其中所述产油酵母选自耶罗维亚酵母属(l^ra術a平)、假丝酵母属(Ca"^/aw.)、红酵母属(7/z(K/ofonJa^.)、红冬孢酵母属(A/zc^(^pon't/^ws/7.)、隐球菌属(C，f(9Coc，攀)、丝孢酵母属(7Wc/呼ora"s/.)和油月旨酵母属(Z/Z^owyces平)。17.根据权利要求16的方法，其中所述耶罗维亚酵母属(K^7wWa乎)选自解脂耶罗维亚酵母(]^Tow,a/z)w"ca)ATCC#20362、解脂耶罗维亚酵母(K^ravW"///70/,c")ATCC#8862、解脂耶罗维亚酵母(旨腳/"/—/,ca)ATCC#18944、解脂耶罗维亚酵母(K^raw/"ATCC#76982和解脂耶罗维亚酵母(fo/ro術a—/,a)LGAMS(7)1。18.通过权利要求12或13的任一项的方法产生的微生物油。全文摘要本发明涉及能够催化棕榈酸(16:0)向硬脂酸(18:0)的转化的真菌C_16/18脂肪酸延伸酶。特别地，提供了高山被孢霉(Mortierellaalpina)C_16/18脂肪酸延伸酶的核苷酸序列(称为“ELO3”)。在此描述了通过过量表达C_16/18脂肪酸延伸酶来提高微生物油产量、提高进入多不饱和脂肪酸生物合成途径的碳通量以及提高多不饱和脂肪酸的含量的方法。最理想地，当前的ELO3的底物特异性将对于允许长链多不饱和脂肪酸在产油酵母例如解脂耶罗维亚酵母(Yarrowialipolytica)中的积累是特别有用的。文档编号C12N15/82GK101563356SQ200580051888公开日2009年10月21日申请日期2005年11月4日优先权日2005年10月19日发明者D·J·马库尔,Q·Q·朱,Z·薛申请人:纳幕尔杜邦公司