专利名称：黄色短杆菌突变株及其在发酵法生产l－异亮氨酸中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生化工程领域，涉及一种棒杆菌属(Brevibacteriumflavum)菌种以及应用该菌种发酵生产L-异亮氨酸的方法。
背景技术：
L-异亮氨酸(L-Isoleucine)的化学名为L-a-氨基-β-甲基戊酸，L-异亮氨酸是人体八种必需氨基酸之一，又是三种支链氨基酸之一，因其特殊的结构和功能，因此，在人类生命代谢中具有特别重要的地位。
L-异亮氨酸生产方法有提取法、化学合成法和发酵法三类，但目前在工业生产上实施的只有发酵法。由于提取法和化学合成法生产的L-异亮氨酸与其它异构体分离困难，因而均未能实现工业化生产。
发酵法就是利用微生物的代谢作用，生物合成并过量积累L-异亮氨酸，包括添加前体物发酵法和直接发酵法两类。
添加前体物发酵法又称微生物转化法。这种方法使用葡萄糖作为发酵碳源、能源，再添加特异的前体物质即在氨基酸生物合成途径中的一些合适中间代谢产物，以避免氨基酸生物合成途径中的反馈调节作用，经微生物作用将其有效转化为目的氨基酸。由于其前体物质稀少或价格昂贵，目前已很少采用此法生产L-异亮氨酸。
直接发酵法是借助于微生物具有合成自身所需氨基酸的能力，通过对特定微生物的诱变处理，选育出营养缺陷型及氨基酸结构类似物抗性突变株，以解除代谢调节中的反馈抑制和反馈阻遏，从而达到过量积累某种氨基酸的目的。目前，异亮氨酸产生菌大多由谷氨酸产生菌黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳糖发酵短杆菌诱变选育而来。
该法具有原料成本低，来源广泛，产品纯度高，反应条件温和等优点，具有工业化生产的潜力。
发明内容本发明目的之一是提供一种新的棒杆菌属的黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)，该菌具有提高L-异亮氨酸产率的能力。
本发明需要解决的技术问题之二是提供采用上述菌种发酵生产L-异亮氨酸的生产方法。
本发明提供的黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)突变株TC21，具有L-异亮氨酸生产能力，遗传标记为蛋氨酸缺陷，乙硫氨酸，α-氨基丁酸，S-2-氨基乙基-L-半胱氨酸抗性(Met-+Ethr+α-ABr+AECr)。
(注黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)突变株TC21(Met-+Ethr+α-ABr+AECr)曾于2004年6月在《天津科技大学学报》第19卷第2期发表，现保藏于天津科技大学代谢控制发酵研究室，公众如有需要，可径直与该研究室联系。)其诱变方法是，以棒杆菌属的黄色短杆菌HL41(保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 10135)为出发菌种，经硫酸二乙酯(DES)和紫外线诱变处理，定向选育出一株L-异亮氨酸生产菌株TC21，其遗传标记为蛋氨酸缺陷，乙硫氨酸，α-氨基丁酸，S-2-氨基乙基-L-半胱氨酸抗性(Met-+Ethr+α-ABr+AECr)，使其具有L-异亮氨酸的生物合成能力。
黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)突变株TC21在发酵法生产L-异亮氨酸中的应用，该方法A、将黄色短杆菌突变株加入发酵培养基中发酵培养，其中，发酵培养基中碳源含量应为1％～30％，氮碳比N∶C应介于5∶100～50∶100之间，无机盐含量应为0.0001～10％，发酵培养基的初始PH6.0～8.0，培养温度20℃～40℃，振荡培养或发酵罐培养2～5天，接种量为1％～15％(V/V)；发酵过程中，添加碳酸钙和流加尿素、氨水调节发酵培养基的PH6.0～8.0，发酵结束L-异亮氨酸最大产量可达24.82g/L；B、L-异亮氨酸的提取步骤将上述培养液采用金属膜过滤除菌体和蛋白，而后通过阳离子交换树脂提取，洗脱流速为1～6倍床体积/h，洗脱液为0.1～10mol/L氨水，或氯化铵溶液，或硫酸铵溶液，或醋酸铵溶液，或乙醇溶液，然后采用活性炭对滤液进行脱色处理，得到L-异亮氨酸粗品，最后采用95％乙醇精制，得到纯品。
上述活性炭用量为0.1％～5％，pH范围0～14，操作温度为0～40℃，脱色时间为1～60min。
离子交换过程中的上柱料液的pH范围0～14，操作温度为0～40℃，流速为1～6倍床体积/h。离子交换柱是几根串连而成，将上柱后流出的发酵液注入另一根离子交换柱。
离子交换树脂采用强酸型阳离子交换树脂，JK006，HD-8，001×7，D061，D001-CC和HZ014。
发酵培养基中的碳源为糖，即葡萄糖，蔗糖，果糖，麦芽糖，甘露糖，淀粉和糖浆；或糖醇，甘油；或有机酸，醋酸；或低分子醇，乙醇；碳源含量最佳为10％～20％。
氮源为氨或铵盐硫酸铵，醋酸铵，硝酸铵，磷酸铵，乙酸铵或氯化铵；或有机氮蛋白胨，牛肉膏，玉米浆，或豆饼水解液。
无机盐为磷酸钾盐，硫酸镁，碳酸钙，硫酸亚铁，或硫酸锰。
发酵培养基中可加入营养物，氨基酸及维生素。
发酵培养基中的发酵液预处理过程中，用碱将发酵液pH调至9～14，搅拌并加热到80℃，加入0.1％～0.5％硅藻土后注入不锈钢管式膜分离系统，操作温度控制在50～60℃，进膜压力与出膜压力差0.3～0.8kg/cm2，滤速控制在200～300ml/min。
L-异亮氨酸的提取步骤中的金属膜采用不锈钢管式膜分离系统，其孔径为50nm～100nm，截留分子量2000～50000MW，pH范围0～14，操作温度为0～40℃，操作压差为0.2～1.0MPa。
利用离子交换提取L-异亮氨酸的方法，采用强酸型阳离子树脂填充于离子交换柱中，在使用前将该树脂处理成氢型或钠型，用酸将上述方法预处理的发酵液pH调至2～6上柱交换吸附，操作温度为0～40℃，流速为1～6倍床体积/h。
提纯精制L-异亮氨酸的方法是，将按照上述提取方法处理过的L-异亮氨酸溶液pH调至4.5，加入0.5％～2％粉末状活性炭，60℃～80℃下脱色1h，过滤后使用旋转蒸发仪在60℃～70℃减压蒸发至出结晶，加入一倍体积95％乙醇，冷藏过夜，过滤后得粗结晶；用蒸馏水全部溶解粗结晶，再加入等体积的95％乙醇，冷藏过夜，过滤晶体，烘干后得L-异亮氨酸结晶。
本发明的优点和积极效果本发明利用黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)突变株发酵生产L-异亮氨酸，在10L全自动控制发酵罐采用该生产工艺发酵生产L-异亮氨酸，可以大大提高L-异亮氨酸的产率，最高产量可达25g/L。本发明利用金属膜过滤法预处理发酵液，并以离子交换法提取L-异亮氨酸，纯度可达98％以上，提取率50％在L-异亮氨酸生物合成过程中，由于琥珀酰高丝氨酸合成酶活性比高丝氨酸激酶高，代谢优先向合成蛋氨酸方向进行，利用蛋氨酸缺陷(Met-)可以使生物转变为苏氨酸和异亮氨酸优先合成，而且蛋氨酸缺陷，使其对于高丝氨酸脱氢酶和高丝氨酸激酶这两个反馈阻遏解除，也使更多的碳架转向苏氨酸和异亮氨酸的合成。
选育赖氨酸的结构类似物S-2-氨基乙基L-半胱氨酸抗性(AECr)可解除赖氨酸、苏氨酸对天冬氨酸激酶的协同反馈抑制，有利于L-异亮氨酸的前体物苏氨酸的积累。
α-氨基丁酸(α-AB)是缬氨酸的结构类似物。选育α-AB抗性突变株，可遗传性的解除支链氨基酸对乙酰羟基酸合成酶的协同反馈阻遏和缬氨酸对乙酰羟基酸合成酶的反馈抑制，也可以遗传性地解除异亮氨酸对苏氨酸脱水酶的反馈调节，从而促使苏氨酸大量转化为异亮氨酸，结果有利于异亮氨酸的积累。
利用金属膜过滤预处理可以有效除去发酵液中的菌体、杂蛋白质等悬浮物，有利于L-异亮氨酸的吸附。使用HZ014丙烯酸强酸型阳离子交换树脂，发酵液用草酸酸化至pH＝2，双柱串连吸附，用pH＝9的0.5mol/LNH4Cl洗脱，经过活性炭吸附脱色后，用95％乙醇结晶纯化，纯度可达98％以上，提取率50％。
具体实施方式实施例1突变株TC21的制备本发明提供的黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)突变株TC21，以棒杆菌属的黄色短杆菌HL41为出发菌株，经硫酸二乙酯(DES)和紫外线诱变处理，定向选育出两株L-异亮氨酸生产菌株TC21，TC21的遗传标记为蛋氨酸缺陷，α-氨基丁酸抗性，S-2-氨基乙基-L-半胱氨酸抗性，乙硫氨酸抗性(Met-+AECr+α-ABr+Ethr)，其具有L-异亮氨酸的生物合成能力。
L-异亮氨酸生产菌株的选育第一步、诱变初筛将经DES常规诱变后菌株，经离心洗涤制成菌悬液，稀释后涂布于基本培养基平板(葡萄糖20g/L，(NH4)2SO410g/L，KH2PO4·3H2O 1g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，MnSO4·H2O 0.01g/L，生物素100μg/L，VB1100μg/L，琼脂粉20g/L，PH 7.0～7.2)，再在每块平板内放置一沾有缺陷物质液的无菌滤纸片，31℃恒温静置培养4～6天，挑选滤纸片周围抑菌圈内的单菌落，并于斜面内保存待筛。
第二步、诱变复筛摇瓶水平上对原菌株与各突变株产L-异亮氨酸性能比较从新鲜斜面分别挑取一环原菌株与各突变株菌苔于种子培养基中(葡萄糖25g/L，(NH4)2SO43g/L，豆饼水解液21mL/L，KH2PO4·3H2O 1.5g/L，MgSO4·7H2O0.4g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，MnSO4·H2O 0.01g/L，生物素0.5mg/L，VB12.5mg/LpH7.0～7.2)，500mL三角瓶装液量55mL，9层纱布封口。置于旋转式摇床上(200r/min)，31℃振荡培养36小时。以接种量10％，初始pH7.0，接入发酵培养基中(葡萄糖160g/L，(NH4)2SO412.5g/L，KH2PO4·3H2O 1.5g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，CaCO330g/L，K2HPO4·3H2O 3g/L，，FeSO4·7H2O 15mg/L，MnSO4·H2O15mg/L，生物素140μg/L，VB11mg/L，Met 20mg/L，豆饼水解液20mL/L)。500mL三角瓶装液量25mL。31℃振荡培养96小时，转速为200r/min，间歇流加30％尿素控制pH在7.0左右。对原菌株与各突变株产L-异亮氨酸性能比较见表1。
表1 异亮氨酸高产菌株的筛选及摇瓶发酵结果
由表1可见，突变株TC21的产L-异亮氨酸性能最强。
实施例2利用本发明的菌种生产L-异亮氨酸通过在培养基中培养如上述所获得的黄色短杆菌和在培养基中积累L-异亮氨酸，可以有效的生产L-异亮氨酸。
为了利用本发明的黄色短杆菌生产L-异亮氨酸，可以利用含有碳源，氮源以及无机盐和微量的其它营养物质如氨基酸和维生素的培养基进行培养。
从新鲜斜面挑取一环TC21菌株的菌苔于种子培养基中，斜面种子培养及种子与发酵培养条件均同实施例1，种子培养基成分包括葡萄糖25g/L，(NH4)2SO43g/L，豆饼水解液21mL/L，KH2PO4·3H2O 1.5g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，MnSO4·H2O 0.01g/L，生物素0.5mg/L，VB12.5mg/L，pH7.0～7.2。500mL三角瓶装液量55mL，9层纱布封口。置于旋转式摇床上(200r/min)，31℃振荡培养36小时。以接种量10％，初始pH7.0，接入发酵培养基中，成分包括葡萄糖160g/L，(NH4)2SO412.5g/L，KH2PO4·3H2O 1.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，CaCO330g/L，K2HPO4·3H2O 3g/L，，FeSO4·7H2O 15mg/L，MnSO4·H2O 15mg/L，生物素140μg/L，VB11mg/L，Met 20mg/L，豆饼水解液20mL/L。500mL三角瓶装液量25mL。31℃振荡培养96小时，转速为200r/min，间歇流加30％尿素控制pH在7.0左右。发酵结束L-异亮氨酸最大产量为21.45g/L实施例3从新鲜斜面挑取一环TC21菌株的菌苔于种子培养基中，斜面种子培养及种子培养条件均同实施例1，种子培养基成分包括葡萄糖35g/L，(NH4)2SO43g/L，豆饼水解液15mL/L，玉米浆15mL/L，KH2PO4.3H2O 1.5gg/L，MgSO4·7H2O 0.4gg/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，MnSO4·H2O 0.01g/L，生物素0.5mg/L，VB12.5mg/L，尿素2g/L，pH7.0～7.2。按15％接种量将种子液450mL接入5L发酵罐中，发酵培养基成分包括葡萄糖160g/L，(NH4)2SO412.5g/L，玉米浆30mL/L，KH2PO4·3H2O1.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，K2HPO4·3H2O 3g/L，，FeSO4·7H2O 15mg/L，MnSO4·H2O 15mg/L，生物素0.1mg/L，VB11mg/L，Met 20mg/L，豆饼水解液20mL/L。初始装液量3L，通风量500L/h，搅拌转速600r/min，培养温度31℃，通过自动流加氨水溶液控制pH7.0±0.05。发酵结束后L-异亮氨酸最大产量为22.8g/L实施例4从新鲜斜面挑取一环TC21菌株的菌苔于种子培养基中，斜面种子培养及种子均同实施例3，按15％接种量将种子液450mL接入5L发酵罐中，发酵培养基成分包括葡萄糖70g/L，(NH4)2SO412.5g/L，玉米浆30mL/L，KH2PO4·3H2O1.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，K2HPO4·3H2O 3g/L，，FeSO4·7H2O 15mg/L，MnSO4·H2O 15mg/L，生物素0.1mg/L，VB11mg/L，Met 20mg/L，豆饼水解液20mL/L。初始装液量3L，通风量500L/h，搅拌转速600r/min，培养温度31℃，通过自动流加氨水溶液控制pH7.0±0.05。发酵期间，每隔2h取样测残糖，当残糖降至2～3g/L即补入浓度80％葡萄糖。根据耗糖速率确定补料量，维持葡萄糖浓度2～3g/L。补料结束，残糖低于2g/L结束发酵。TC21菌株在发酵15h后进入产酸期，在大约60h达到产酸高峰期，其最高产酸量达24.82g/L。
实施例5 L-异亮氨酸的提取纯化用NaOH将10L异亮氨酸发酵液pH调至11，搅拌并80℃水浴加热10min，加入0.1％硅藻土，将发酵液倒入金属膜过滤器，控制温度50℃～60℃，进膜压力与出膜压力差0.6kg/cm2，当进出膜压差明显降低时，补入适量去离子水，滤速控制在200～300ml/min，用草酸或盐酸将过滤后的发酵液调至pH＝2备用。将处理成H+型的HZ014树脂装入直径2.4cm的离子交换柱中，装柱高12cm，两柱串连，操作温度为室温，上柱速度为0.5BV/h，上柱后，用两倍发酵液体积pH＝2的酸性水洗涤树脂，流速为1BV/h，将洗涤液收集准备再次上柱。用氨水将0.5mol/LNH4Cl调至pH＝9，0.6BV/h洗脱，收集pH＝2～9部分的洗脱液。
将洗脱液pH调至4.5，加入1％粉末状活性炭，60℃下脱色1h，过滤后使用旋转蒸发仪在60℃～70℃减压蒸发至出结晶，加入一倍体积95％乙醇，冷藏过夜，过滤后得粗结晶。用一定量的蒸馏水溶解粗结晶，再加入等体积的95％乙醇，冷藏过夜，过滤晶体，烘干后得L-异亮氨酸结晶。
权利要求
1.一种黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)突变株TC21，具有L-异亮氨酸生产能力；突变株TC21遗传标记为蛋氨酸缺陷，乙硫氨酸，α-氨基丁酸，S-2-氨基乙基-L-半胱氨酸抗性(Met-+Ethr+α-ABr+AECr)。
2.一种权利要求1所述的黄色短杆菌突变株TC21的诱变方法，其特征在于以棒杆菌属的黄色短杆菌HL41(保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 10135)为出发菌种，经硫酸二乙酯(DES)和紫外线诱变处理，定向选育出一株L-异亮氨酸生产菌株TC21，其遗传标记为蛋氨酸缺陷，乙硫氨酸，α-氨基丁酸，S-2-氨基乙基-L-半胱氨酸抗性(Met-+Ethr+α-ABr+AECr)，使其具有L-异亮氨酸的生物合成能力。
3.一种权利要求1所述的黄色短杆菌突变株TC21在发酵法生产L-异亮氨酸中的应用，其特征在于A、将黄色短杆菌突变株加入发酵培养基中发酵培养，其中，发酵培养基中碳源含量应为1％～30％，氮碳比N∶C应介于5∶100～50∶100之间，无机盐含量应为0.0001～10％，发酵培养基的初始PH6.0～8.0，培养温度20℃～40℃，振荡培养或发酵罐培养2～5天，接种量为1％～15％(V/V)；发酵过程中，添加碳酸钙和流加尿素、氨水调节发酵培养基的PH6.0～8.0；B、L-异亮氨酸的提取步骤将上述培养液采用金属膜过滤除菌体和蛋白，而后通过阳离子交换树脂提取，洗脱流速为1～6倍床体积/h，洗脱液为0.1～10mol/L氨水，或氯化铵溶液，或硫酸铵溶液，或醋酸铵溶液，或乙醇溶液，然后采用活性炭对滤液进行脱色处理，得到L-异亮氨酸粗品，最后采用95％乙醇精制，得到纯品。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于发酵培养基中的碳源为糖，即葡萄糖，蔗糖，果糖，麦芽糖，甘露糖，淀粉和糖浆；或糖醇，甘油；或有机酸，醋酸；或低分子醇，乙醇；碳源含量最佳为10％～20％。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于发酵培养基中的氮源为氨或铵盐硫酸铵，醋酸铵，硝酸铵，磷酸铵，乙酸铵或氯化铵；或有机氮蛋白胨，牛肉膏，玉米浆，或豆饼水解液。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于无机盐为磷酸钾盐，硫酸镁，碳酸钙，硫酸亚铁，或硫酸锰。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于发酵培养基中的发酵液预处理过程中，用碱将发酵液pH调至9～14，搅拌并加热到80℃，加入0.1％～0.5％硅藻土后注入不锈钢管式膜分离系统，操作温度控制在50～60℃，进膜压力与出膜压力差0.3～0.8kg/cm2，滤速控制在200～300ml/min。
8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于采用不锈钢管式膜分离系统，其孔径为50nm～100nm，截留分子量2000～50000MW，pH范围0～14，操作温度为0～40℃，操作压差为0.2～1.0MPa。
9.根据权利要求3、7所述的应用，其特征在于利用离子交换提取L-异亮氨酸的方法，采用强酸型阳离子树脂填充于离子交换柱中，在使用前将该树脂处理成氢型或钠型，，用酸将权利要求7所述方法处理的发酵液pH调至2～6上柱交换吸附，将上柱后流出的发酵液注入串连的另一根离子交换柱。操作温度为0～40℃，流速为1～6倍床体积/h。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于提纯精制L-异亮氨酸的方法是，将按照权利9所述方法处理过的L-异亮氨酸溶液pH调至4.5，加入0.5％～2％粉末状活性炭，60℃～80℃下脱色1h，过滤后使用旋转蒸发仪在60℃～70℃减压蒸发至出结晶，加入一倍体积95％乙醇，冷藏过夜，过滤后得粗结晶；用蒸馏水全部溶解粗结晶，再加入等体积的95％乙醇，冷藏过夜，过滤晶体，烘干后得L-异亮氨酸结晶。
全文摘要
以黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)HL41(保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 10135)为出发菌种，选育具有蛋氨酸缺陷(Met
文档编号C12P13/06GK1834228SQ200610013400
公开日2006年9月20日 申请日期2006年3月30日 优先权日2006年3月30日
发明者陈宁, 杨宁, 刘淑云, 徐庆阳 申请人:天津科技大学