专利名称：星状诺卡氏菌多重pcr快速检测试剂盒和检测方法
技术领域：
本发明涉及医学诊断技术，特别是一种星状诺卡氏菌多重PCR快速检测试剂盒和检测方法。利用PCR技术特异性多重扩增16S-23S核糖体RNA转录间区，达到区分星状诺卡氏菌(Nocardia asteroides)和相近致病菌的目的，能够大大提高临床诊断星状诺卡氏菌的效率。
背景技术：
星状诺卡氏菌(Nocardia asteroides)是一种条件致病菌，对于免疫力低下人群如器官移植病人，艾滋病患者，部分免疫缺陷病人有极大的危害性，致死率高达30％以上。目前国际上对于诺卡氏菌的诊断主要基于生化检验，对于星状诺卡氏菌的诊断需要排除在生化性状上极其相近的其它种，并且要经过数目众多的一组反应才能确诊，而且在某些情况下结果并不准确。由于该菌生长缓慢(至少1周)，再加上生化反应所用时间长，种类多，使得对于该致病菌的检测效率十分低下，完全确诊需要2-4周的时间。
发明内容
本发明的目的是提供一种星状诺卡氏菌多重PCR快速检测试剂盒和检测方法。运用多重PCR技术检测星状诺卡氏菌的方法，提高了检测效率和检测的准确度，本发明通过分析特异性DNA检测星状诺卡氏菌，不需要像生化鉴定那样进行多组实验，可大大节省时间，劳动力和检验成本，结果重现性好，检测精确。
本发明提供的星状诺卡氏菌多重PCR快速检测试剂盒包括1)DNA提取试剂TE缓冲液(5-15mM Tris，0.5-1.5mM EDTA，pH 8.0)；溶菌酶(浓度10-20mg/mL，pH8.0)；蛋白酶K溶液(浓度10-20mg/mL，pH8.0)；Tris饱和酚(pH8.0)；乙酸钠(浓度2-5mol/L)；乙醇(浓度95％)；2)PCR试剂管成分为10×buffer，含100mM Tris-HCl，450-550mM KCl，pH 8.3；dNTPs(dATP，dTTP，dCTP，dGTP的混合物，每种浓度5-15mmol/L)；特异性寡核苷酸引物引物1、引物2、引物3、引物4、引物5、引物6(以上各引物浓度均为5-15μmol/L)；双蒸水；Taq DNA聚合酶(5u/μL)；MgCl2(10-20mmol/L)；3)所述的特异性寡核苷酸引物包括下述的的特异性寡核苷酸引物与该特异性寡核苷酸引物互补的寡核苷酸序列，特异性寡核苷酸引物与该特异性寡核苷酸引物互补的寡核苷酸序列的差别不大于八个碱基引物15’GGCAAACCATCAGAGCATG3’引物25’CGAAGAAGTCTAATTTCGGTA3’引物35’CTGAGGAAAATTCCGAATTCG3’引物45’ACTGAAGAACCAGTCTCAGAG3’引物55’TCGGGGCAAAGTCTTCAACCG3’引物65’TCGAATCGAATACTTGGTTCAG3’使用星状诺卡氏菌多重PCR快速检测试剂盒的检测方法程序如下一)DNA抽提挑取疑似菌落加入到0.4mL TE缓冲液(pH8.0)中振荡混匀。加入100μL溶菌酶溶液，37℃保温10分钟，再加蛋白酶K溶液10μL于55℃保温1-2小时，加同体积Tris饱和酚(pH8.0)，强烈振荡，11000g离心3分钟，取上清液，重复酚抽提；取上清液，加入0.1倍体积的乙酸钠(3mol/L)，混匀，再加等体积的冰乙醇，混匀后低温静置30分钟，15000g离心5分钟，弃上清，加70％冷乙醇洗涤一次，室温下15000g离心5分钟，弃上清，加入50μL TE溶液，置-20℃保存；二)多重PCR扩增在PCR试剂管内加入(1)PCR反应混合物成分，体系均为50μL体系1.成分 体系中各组分最终浓度PCR缓冲液 10mM Tris-HCl，50mM KClMgCl21.5mmol/LTaq DNA聚合酶 1.5u引物1 0.3μmol/L引物2 0.3μmol/LdNTPs 每种80nmol/LDNA样品 50ng双蒸水35.3μL2.成分 体系中各组分最终浓度PCR缓冲液 10mM Tris-HCl，50mM KClMgCl21.5mmol/LTaq DNA聚合酶 1.5u引物3 0.3μmol/L引物4 0.3μmol/LdNTPs 每种80nmol/LDNA样品 50ng双蒸水35.3μL
3.成分 体系中各组分最终浓度PCR缓冲液 10mM Tris-HCl，50mM KClMgCl21.5mmol/LTaq DNA聚合酶 1.5u引物5 0.3μmol/L引物6 0.3μmol/LdNTPs 每种80nmol/LDNA样品 50ng双蒸水35.3μL(2)PCR方法中扩增程序(1)95℃ 10分钟(2)95℃ 80秒(3)64℃ 25秒(4)回到第2步，重复30次。
3.被检测样品目的PCR扩增和电泳检验PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳后用溴化乙锭染色。电泳结果在紫外分析仪下观察，如果发现有特异性扩增产生的DNA片段，引物1、引物21扩增结果得到230-280bp的特异片段，引物3、引物4扩增结果得到100-120bp的特异片段，引物5、引物6扩增结果得到120-150bp的特异片段，说明样品有星状诺卡氏菌(Nocardia asteroides)感染或污染，反之则没有。
本发明利用星状诺卡氏菌几个特异性基因，使用几对特异性引物通过PCR方法产生多个特异性片段，在已试验的30种不同种或同种的其它致病细菌中均未发现假阳性结果。
本发明与现有技术相比的优点在于基于DNA的鉴定方法适用于直接从患者含菌体液、组织等临床样品中直接运用多重PCR方法扩增多个特异性靶基因，从而检测星状诺卡氏菌(Nocardia asteroides)。PCR方法具有检测准确、特异性强的特点，可以快速、准确地鉴定特异的目标细菌。首先，它用多重PCR的方法扩增细菌多个特异性靶基因，避免了反复培养，冗长的一系列生化反应，节约时间，劳动力和成本；PCR鉴定方法不受培养条件和细菌生理状态的影响，较生理生化鉴定方法更为准确；能够排除一些生理生化鉴定方法不能排除的干扰菌。
图1引物特异性测试图。
图2病人样本1检测结果图。
具体实施例方式
下面结合附图与具体实施方式
对本发明作进一步详细描述。
实施例1病人样本培养物11.DNA抽提挑取疑似菌落加入到0.4mL TE缓冲液(pH8.0)中振荡混匀。加入100μL 20mg/mL，pH8.0的溶菌酶溶液，37℃保温10分钟，再加蛋白酶K溶液10μL于55℃保温1-2小时。加同体积Tris饱和酚(pH8.0)，强烈振荡，11000g离心3分钟，取上清液，重复酚抽提。取上清液，加入0.1倍体积的乙酸钠(3mol/L)，混匀，再加等体积的冰乙醇，混匀后低温静置30分钟，15000g离心5分钟，弃上清，加70％冷乙醇洗涤一次，室温下15000g离心5分钟，弃上清，加入50μL TE溶液，置-20℃保存。
2.PCR扩增(1)PCR反应混合物成分，体系均为50μL体系1.成分 体系中各组分最终浓度PCR缓冲液10mM Tris-HCl，50mM KClMgCl21.5mmol/LTaq DNA聚合酶1.5u引物10.3μmol/L引物20.3μmol/LdNTPs每种80nmol/LDNA样品 50ng双蒸水 35.3μL2.成分 体系中各组分最终浓度PCR缓冲液10mM Tris-HCl，50mM KClMgCl21.5mmol/LTaq DNA聚合酶1.5u引物30.3μmol/L引物40.3μmol/LdNTPs每种80nmol/LDNA样品 50ng双蒸水 35.3μL3.成分 体系中各组分最终浓度PCR缓冲液10mM Tris-HCl，50mM KClMgCl21.5mmol/LTaq DNA聚合酶1.5u引物50.3μmol/L引物60.3μmol/LdNTPs每种80nmol/LDNA样品 50ng
双蒸水35.3μL(2)PCR方法中扩增程序(1)95℃ 10分钟(2)95℃ 80秒(3)64℃ 25秒(4)回到第2步，重复30次3.被检测样品目的PCR扩增和电泳检验PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳后用溴化乙锭染色。电泳结果在紫外分析仪下观察，可发现对星状诺卡氏菌(Nocardia asteroides)进行特异性扩增产生的DNA片段，其中引物1、引物2扩增结果可得到230-280bp的特异片段，引物3、引物4扩增结果可得到100-120bp的特异片段。引物5、引物6扩增结果可得到120-150bp的特异片段。
结果如图2.实验表明样品中含有星状诺卡氏菌(Nocardia asteroides)。
图1引物特异性测试图(纯培养检测，以相近种细菌及临床常见病源细菌的纯培养物DNA作为阴性对照，没有发现非特异扩增)。
泳道1、9、17星状诺卡氏菌(Nocardia asteroides)；2、10、18N.brasiliensis；3、11、19N.otitidiscaviarum；4、12、20N.farcinica；5、13、21N.transvalensis；6、14、22N.flavorosea；7、15、23Escherichia coli；8、16、24Staphylococcus aureus；其中泳道1至泳道8所用引物1和引物2；其中泳道9至泳道16所用引物3和引物4；其中泳道17至泳道24所用引物5和引物6。
图2.图2病人样本1检测结果图。泳道1.病人样本PCR扩增产物，所用引物为引物1和引物2；2.病人样本PCR扩增产物，所用引物为引物3和引物4。3.病人样本PCR扩增产物，所用引物为引物5和引物6。
4天后，通过16S rDNA测序证明，所检验的目的菌落98％为星状诺卡氏菌(Nocardiaasteroides)实施例2病人样本培养物21.DNA抽提挑取疑似菌落加入到0.4mL TE缓冲液(pH8.0)中振荡混匀。加入100μL 20mg/mL，pH8.0的溶菌酶溶液，37℃保温10分钟，再加蛋白酶K溶液10μL于55℃保温1-2小时。加同体积Tris饱和酚(pH8.0)，强烈振荡，11000g离心3分钟，取上清液，重复酚抽提。取上清液，加入0.1倍体积的乙酸钠(3mol/L)，混匀，再加等体积的冰乙醇，混匀后低温静置30分钟，15000g离心5分钟，弃上清，加70％冷乙醇洗涤一次，室温下15000g离心5分钟，弃上清，加入50μL TE溶液，置-20℃保存。
2.PCR扩增(1)PCR反应混合物成分，体系均为50μL体系
1.成分体系中各组分最终浓度PCR缓冲液 10mM Tris-HCl，50mM KClMgCl21.5mmol/LTaq DNA聚合酶 1.5u引物1 0.3μmol/L引物2 0.3μmol/LdNTPs 每种80nmol/LDNA样品 50ng双蒸水35.3μL2.成分 体系中各组分最终浓度PCR缓冲液 10mM Tris-HCl，50mM KClMgCl21.5mmol/LTaq DNA聚合酶 1.5u引物3 0.3μmol/L引物4 0.3μmol/LdNTPs 每种80nmol/LDNA样品 50ng双蒸水35.3μL3.成分 体系中各组分最终浓度PCR缓冲液 10mM Tris-HCl，50mM KClMgCl21.5mmol/LTaq DNA聚合酶 1.5u引物5 0.3μmol/L引物6 0.3μmol/LdNTPs 每种80nmol/LDNA样品 50ng双蒸水35.3μL(2)PCR方法中扩增程序(1)95℃ 10分钟(2)95℃ 80秒(3)64℃ 25秒(4)回到第2步，重复30次。
3.被检测样品目的PCR扩增和电泳检验PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳后用溴化乙锭染色。电泳结果在紫外分析仪下观察，可发现对星状诺卡氏菌(Nocardia asteroides)进行特异性扩增产生的DNA片段，其中引物1、引物2扩增结果可得到230-280bp的特异片段，引物3、引物4扩增结果可得到100-120bp的特异片段。引物5、引物6扩增结果可得到120-150bp的特异片段。实验表明样品中含有星状诺卡氏菌(Nocardia asteroides)。
病人样本培养物31.DNA抽提挑取疑似菌落加入到0.4mL TE缓冲液(pH8.0)中振荡混匀。加入100μL 20mg/mL，pH8.0的溶菌酶溶液，37℃保温10分钟，再加蛋白酶K溶液10μL于55℃保温1-2小时。加同体积Tris饱和酚(pH8.0)，强烈振荡，11000g离心3分钟，取上清液，重复酚抽提。取上清液，加入0.1倍体积的乙酸钠(3mol/L)，混匀，再加等体积的冰乙醇，混匀后低温静置30分钟，15000g离心5分钟，弃上清，加70％冷乙醇洗涤一次，室温下15000g离心5分钟，弃上清，加入50μLTE溶液，置-20℃保存。
2.PCR扩增(1)PCR反应混合物成分，体系均为50μL体系1.成分 体系中各组分最终浓度PCR缓冲液 10mM Tris-HCl，50mM KClMgCl21.5mmol/LTaq DNA聚合酶 1.5u引物1 0.3μmol/L引物2 0.3μmol/LdNTPs 每种80nmol/LDNA样品 50ng双蒸水35.3μL2.成分 体系中各组分最终浓度PCR缓冲液 10mM Tris-HCl，50mM KClMgCl21.5mmol/LTaq DNA聚合酶 1.5u引物3 0.3μmol/L引物4 0.3μmol/LdNTPs 每种80nmol/LDNA样品 50ng双蒸水35.3μL3.成分 体系中各组分最终浓度PCR缓冲液 10mM Tris-HCl，50mM KClMgCl21.5mmol/LTaq DNA聚合酶 1.5u引物5 0.3mol/L引物6 0.3μmol/LdNTPs 每种80nmol/LDNA样品 50ng
双蒸水 35.3μL(2)PCR方法中扩增程序(1)95℃ 10分钟(2)95℃ 80秒(3)64℃ 25秒(4)回到第2步，重复30次3.被检测样品目的PCR扩增和电泳检验PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳后用溴化乙锭染色。电泳结果在紫外分析仪下观察，发现对星状诺卡氏菌(Nocardia asteroides)进行特异性扩增产生的DNA片段，其中引物1、引物2扩增结果可得到230-280bp的特异片段，引物3、引物4扩增结果可得到100-120bp的特异片段。引物5、引物6扩增结果可得到120-150bp的特异片段。实验表明样品中含有星状诺卡氏菌(Nocardia asteroides)。
权利要求
1.一种星状诺卡氏菌多重PCR快速检测试剂盒，其特征在于它盒包括1)DNA提取试剂TE缓冲液，5-15mM Tris，0.5-1.5mM EDTA，pH 8.0；溶菌酶，浓度10-20mg/mL，pH8.0；蛋白酶K溶液，浓度10-20mg/mL，pH8.0；Tris饱和酚，pH8.0；乙酸钠，浓度2-5mol/L；乙醇，浓度95％；2)PCR试剂管成分为10×buffer，含100mM Tris-HCl，450-550mM KCl，pH 8.3；dNTPsdATP，dTTP，dCTP，dGTP的混合物，每种浓度5-15mmol/L；特异性寡核苷酸引物引物1、引物2、引物3、引物4、引物5、引物6，以上各引物浓度均为5-15μmol/L；双蒸水；Taq DNA聚合酶5u/μL；MgCl210-20mmol/L。
2.按照权利要求1所述的星状诺卡氏菌多重PCR快速检测试剂盒，所述的特异性寡核苷酸引物包括下述的的特异性寡核苷酸引物与该特异性寡核苷酸引物互补的寡核苷酸序列，特异性寡核苷酸引物与该特异性寡核苷酸引物互补的寡核苷酸序列的差别不大于八个碱基引物15’GGCAAACCATCAGAGCATG3’引物25’CGAAGAAGTCTAATTTCGGTA3’引物35’CTGAGGAAAATTCCGAATTCG3’引物45’ACTGAAGAACCAGTCTCAGAG3’引物55’TCGGGGCAAAGTCTTCAACCG3’引物65’TCGAATCGAATACTTGGTTCAG3’。
3.一种使用星状诺卡氏菌多重PCR快速检测试剂盒的检测方法，其特征在于程序如下一)DNA抽提挑取疑似菌落加入到pH8.0的0.4mL TE缓冲液中振荡混匀，加入100μL溶菌酶溶液，37℃保温10分钟，再加蛋白酶K溶液10μL于55℃保温1-2小时，加同体积Tris饱和酚，pH8.0，强烈振荡，11000g离心3分钟，取上清液，重复酚抽提；取上清液，加入0.1倍体积的乙酸钠(3mol/L)，混匀，再加等体积的冰乙醇，混匀后低温静置30分钟，15000g离心5分钟，弃上清，加70％冷乙醇洗涤一次，室温下15000g离心5分钟，弃上清，加入50μL TE溶液，置-20℃保存；二)多重PCR扩增在PCR试剂管内加入(1)PCR反应混合物成分，体系均为50μL体系1)成分体系中各组分最终浓度PCR缓冲液 10mM Tris-HCl，50mM KClMgCl21.5mmol/LTaq DNA聚合酶 1.5u引物1 0.3μmol/L引物2 0.3μmol/LdNTPs 每种80nmol/LDNA样品 50ng双蒸水35.3μL2)成分体系中各组分最终浓度PCR缓冲液 10mM Tris-HCl，50mM KClMgCl21.5mmol/LTaq DNA聚合酶 1.5u引物3 0.3μmol/L引物4 0.3μmol/LdNTPs 每种80nmol/LDNA样品 50ng双蒸水35.3μL3)成分体系中各组分最终浓度PCR缓冲液 10mM Tris-HCl，50mM KClMgCl21.5mmol/LTaq DNA聚合酶 1.5u引物5 0.3μmol/L引物6 0.3μmol/LdNTPs 每种80nmol/LDNA样品 50ng双蒸水35.3μL(2)PCR方法中扩增程序(1)95℃10分钟(2)95℃80秒(3)64℃25秒(4)回到第2步，重复30次；(3)被检测样品目的PCR扩增和电泳检验PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳后用溴化乙锭染色；电泳结果在紫外分析仪下观察，如果发现有特异性扩增产生的DNA片段，引物1、引物21扩增结果得到230-280bp的特异片段，引物3、引物4扩增结果得到100-120bp的特异片段，引物5、引物6扩增结果得到120-150bp的特异片段，说明样品有星状诺卡氏菌感染或污染，反之则没有。
全文摘要
本发明涉及一种星状诺卡氏菌多重PCR快速检测试剂盒和检测方法。利用PCR技术特异性多重扩增16S－23S核糖体RNA转录间区，达到区分星状诺卡氏菌(Nocardiaasteroides)和相近致病菌的目的，能够大大提高临床诊断星状诺卡氏菌的效率。与传统方法相比能大大缩短诊断时间和准确度，节省劳动力和成本，并且能够排除一些用传统的生化鉴定难以排除的与星状诺卡氏菌非常相近的几个致病种。
文档编号C12Q1/04GK1904064SQ20061001435
公开日2007年1月31日 申请日期2006年6月15日 优先权日2006年6月15日
发明者黄熙泰, 郑泽军, 魏晓娜, 刘寅, 李永君, 周浩 申请人:南开大学