专利名称：含有重组几丁质酶的果蔬防腐保鲜剂的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术与农产品保鲜相结合的产物，特别涉及一种含有重组几丁质酶 的果蔬防腐保鲜剂及其生产过程及在新鲜果蔬保鲜中的应用。
背景技术：
真菌病害是导致采收后果蔬腐烂的主要原因，由此造成的损失非常巨大。为有效地 防治真菌病害，近一个世纪以来，相关的科研工作者付出了许多艰辛的劳动，也获得了 一些行之有效的成果，如利用构建工程菌培育抗病品种，这一途径由于影响因素复杂， 抗真菌效果不一而未能商业化应用。而对于采后果蔬常见的真菌病害，目前国内外仍以 化学杀菌剂为主，在很长一段时间内以其高效、低成本、使用方便等特点得到推广使用， 但也造成了环境污染，安全性影响等一系列负面问题；此外， 一些杀菌剂虽对环境和人 体健康相对安全，但由于长期使用导致病原菌抗性增加，防治效果逐年下降，用量不断 增加，引起的农药残留问题日趋严重。随着人们对"绿色无公害食品"的重视，对农药 公害的不断认识，给化学农药的使用带来很大的冲击。转基因研究的迅速发展为解决这 一问题提供了一条新途径，通过这一途径，可将外源抗病基因，如几丁质酶基因、e-l，
3- 葡萄糖酶基因、核糖体灭活蛋白基因(RIP)等等重组入酵母细胞，再分离、纯化出 此活性蛋白，将一种或几种活性蛋白协同作用，增强抗菌防腐效果，用于果蔬采后保鲜， 安全、营养、高效，目前在国际上是一个全新领域。
植物致病真菌的细胞壁主要几丁质组成，它是一种由N-乙酰-D-葡萄糖胺以e-i，
4- 糖苷键连接形成的直链化合物。水解几丁质的几丁质酶几乎存在于所有的高等植物 中，而且植物体内并无几丁质酶的作用底物，因此几丁质酶被看作是植物抗真菌病害的 潜在物质，成为目前抗真菌基因工程的研究热点之一。几丁质酶能将真菌细胞壁的主要 成分几丁质降解为几丁质单糖，破坏细胞壁的骨架，从而具备抗真菌作用。通过几丁质 酶的作用可使大多数病害真菌丧失侵染能力和致病能力。此外，毕赤酵母作为真核表达 系统，可对表达的蛋白进行翻译后的加工和修饰，使其具有生物活性，并且在发酵罐中 可高密度发酵生产，可促使表达的蛋白大规模推广应用。
目前，国内关于将植物几丁质酶基因转入水稻、烟草、油菜、小麦等作物中以增强 植株抗真菌病害的报道很多，而将其转化毕赤酵母，以获得足量蛋白质进行体外抗菌能
力研究的报道仅有一例，有人将新型芥菜几丁质酶基因转入毕赤酵母中，但对诱导表达 的条件和抑菌效果未作深入研究。所以到目前为止，还没有一种有效的，成本较低的且 可以规模化生产重组几丁质酶的方法及在果蔬采后贮藏保鲜中应用的果蔬防腐保鲜剂。
发明内容
本发明目的所要解决的技术问题是提供一种含有重组几丁质酶的果蔬防腐保鲜 剂。它含有从毕赤酵母中诱导分泌表达的重组几丁质酶及制备方法，适用于多种水果蔬 菜的保鲜。
本发明的技术方案
一种含有重组几丁质酶的果蔬防腐保鲜剂，其特征在于其主要组分为重组几 丁质酶2%，离子缓冲液0.001%，低聚糖1%,其余为水。
含有重组几丁质酶，它是将ClassI型碱性几丁质酶基因通过分子生物学手段转
入毕赤酵母，再用甲醇诱导其分泌于发酵液中，然后从发酵后的上清液中提取。 重组几丁质酶是从摇瓶发酵而来或者用发酵罐工业化发酵生产得到。离子缓冲液
为pH5 8的磷酸缓冲液。
一种含有重组几丁质酶的果蔬防腐保鲜剂，其使用方法采收前喷雾或者采收后
喷雾、浸蘸处理，应用于果蔬的果实、茎、叶的贮藏保鲜，提高果蔬对主要采后病原真 菌灰霉菌、根霉等的抗病性，减少贮藏过程中的常见病原菌引起的腐烂，延长果蔬贮藏 保鲜时间。
本发明技术特点及效果1.生产工艺简单，易于操作。2.成本低廉，可工厂化 大批量生产。3.施用方法简单，受外界环境影响较小。4.采收前或采收后应用都能起 到防治作用。5.无污染，无公害，无毒副作用。6.采用浸蘸或喷雾方式处理均可。
含有重组几丁质酶的果蔬防腐保鲜剂的抑菌效果
此果蔬防腐保鲜剂对于多种病原真菌具有一定的抑制效果，能够有效的抵御病原
真菌的侵染以及杀死新生菌丝体。下面我们以其对草莓根霉的抑制效果为例进行说明
在试验条件下，草莓根霉的菌丝生长很快，对照在48h时已长满整个平板，而用发酵上 清液处理的平板菌落扩展比较缓慢，在抑菌率达到66.5% (图1)。 30h时抑菌率有所下 降，为51.5%%
图1 发酵上清液对草莓根霉的抑制效果曲线图
图2发酵上清液对根骞生长的抑制效果是实验实物图A处理后30h B处理后50h
在实验过程中也发现几丁质酶不仅能够抑制菌丝生长，还能够抑制孢子萌发。50h 后观察到对照与处理的培养皿中都已布满菌丝，不同的是对照的菌丝细长，并产生大量 孢子，而此时用上清液(含几丁质酶)处理的菌丝粗短，且无孢子产生。
具体实施例
含有重组几丁质酶的果蔬防腐保鲜剂，其主要组分为重组几丁质酶2%，离子缓 冲液0.001%,低聚糖1%,其余为水。
重组几丁质酶的果蔬防腐保鲜剂的制备
将ClassI型碱性几丁质酶基因通过分子生物学手段转入毕赤酵母，再用甲醇诱导 其分泌于发酵液中，然后从发酵后的上清液中提取。
一、摇瓶发酵l.种子培养基YPD(W酵母抽提物，2%蛋白胨，1%葡萄糖)斜面培 养基则为上述成分再加入1. 5%的琼脂制得。
2. 发酵培养基BMGY(19fe酵母抽提物，1%甘油，2%蛋白胨，0. 1M磷酸缓冲液，
1.34XYNB,4+10-5X生物素)。BMMY (1%酵母抽提物，0.5%甲醇，2%蛋白胨，0.1M 磷酸缓冲液，1.34%YNB, 4*10-5%生物素)。
3. 培养方法
于30'C生长两天的新鲜平板上取两环单菌落接到种子培养基中培养约18h，再以10 %的接种量转接到BMGY中培养24h左右，离心弃上清液，菌体转接到BMMY开始诱导， 每隔12h补加甲醇至预设浓度。摇床温度为30°C，转速200rpm，装液量为30mL/150mL。
在诱导过程中可以添加0.01% 3%的油酸、非离子乳化剂、氧载体等物质中一种或 几种促进目的蛋白酶的分泌表达。 二、工业化技术发酵工艺
技术路线1
YPD种子放大一接种基础盐(BSM)培养基一甘油生长阶段一甘油分批补料阶段一 甲醇分批补料阶段一甲醇诱导阶段 技术路线2
YPD种子放大一接种BMGY培养基一甘油生长阶段一甘油分批补料阶段一甲醇分 批补料阶段一甲醇诱导阶段 发酵条件
生长期温度29°C，转速300rpm， pH5.0，溶氧30%以上；诱导期29°C，转速 300rpm， pH6. 0,溶氧20%以上，28%的氨水维持pH值，采用泡敌作消泡剂，浓度为4%。
实例1:含有重组几丁质酶的果蔬防腐保鲜剂对葡萄的保鲜效果
采前一周用20(kg/l含有重组几丁质酶的果蔬防腐保鲜剂对葡萄果实进行喷雾处
理，采收后及时预冷，按照目前生产中葡萄贮藏保鲜的常规保鲜工艺，葡萄保鲜期可延
长28天，腐烂率降低30%。
实例2:含有重组几丁质酶的果蔬防腐保鲜剂对草莓的保鲜效果
采后用500mg/l含有重组几丁质酶的果蔬防腐保鲜剂对草莓进行喷雾处理，15t下
贮藏25天时商品率比未经该防腐保鲜剂处理提高20%，保鲜期可延长8天。 实例3:含有重组几丁质酶的果蔬防腐保鲜剂对蒜薹的保鲜效果 预冷后用500mg/l含有重组几丁质酶的果蔬防腐保鲜剂对蒜薹进行喷雾处理，贮藏
保鲜过程中定期与专用保鲜剂配伍喷雾处理，贮藏8个月后，腐烂率比未经该重组几丁
质酶的果蔬防腐保鲜剂处理的蒜薑降低28%，保鲜期可延长30天。
如图2所示的在实验过程中也发现几丁质酶不仅能够抑制菌丝生长，还能够抑制孢 子萌发。50h后观察到对照与处理的培养皿中都已布满菌丝，不同的是对照的菌丝细长， 并产生大量孢子，而此时用上清液(含几丁质酶)处理的菌丝粗短，且无孢子产生。
权利要求
1.一种含有重组几丁质酶的果蔬防腐保鲜剂，其特征在于其主要组分为重组几丁质酶2％，离子缓冲液0.001％，低聚糖1％，其余为水。
2. 根据权利要求1所述的含有重组几丁质酶的果蔬防腐保鲜剂，其特征在于含有重组几丁质酶，它是将ClassI型碱性几丁质酶基因通过分子生物学手段转入毕赤酵母，再用甲醇诱导其分泌于发酵液中，然后从发酵后的上清液中提取。
3. 根据权利要求1所述的含有重组几丁质酶的果蔬防腐保鲜剂，其特征在于重组几 丁质酶是从摇瓶发酵而来或者用发酵罐工业化发酵生产得到。
4. 根据权利要求1所述的含有重组几丁质酶的果蔬防腐保鲜剂，其特征在于离子缓冲液为Ph5~8的磷酸缓冲液。
5. —种含有重组几丁质酶的果蔬防腐保鲜剂，其使用方法:采收前喷雾或者采收后喷雾、 浸蘸处理，应用于果蔬的果实、茎、叶的贮藏保鲜，提高果蔬对主要采后病原真菌灰霉 菌、根霉等的抗病性，减少贮藏过程中的常见病原菌引起的腐烂，延长果蔬贮藏保鲜时 间。
全文摘要
一种含有重组几丁质酶的果蔬防腐保鲜剂，该果蔬防腐保鲜剂主要活性成分为重组几丁质酶，是将ClassI型碱性几丁质酶基因通过分子生物学手段转入毕赤酵母，再用甲醇诱导其分泌于发酵液中，然后从发酵后的上清液中提取。此外还含有维持其活性的离子缓冲液，协同抗菌作用的低聚糖等。它作为果蔬防腐保鲜剂，在采收前使用能够诱导新鲜果蔬抗病性反应；采收后应用则能够抵御病原菌的侵染或杀死新生菌丝体，用于防治果蔬采后灰霉菌、根霉及曲霉等病原真菌引起的腐烂。本发明属生物技术在果蔬采后病害腐烂防治上的应用，其生产工艺成熟，生产和使用的成本低廉，为果蔬采后防腐保鲜提供了低成本、高效、无毒的无公害生物诱导抗病保鲜剂，应用前景广阔。
文档编号A23B7/14GK101112209SQ200610015008
公开日2008年1月30日 申请日期2006年7月28日 优先权日2006年7月28日
发明者关文强, 仲 吴, 李丽秀, 阎瑞香, 黄艳凤 申请人:国家农产品保鲜工程技术研究中心(天津)