专利名称：人促甲状腺素受体胞外区羧基端基因表达产物及制备方法和该产物在酶免技术中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，是人促甲状腺素受体胞外区氨基端、羧基端、中间段三片段中的羧基端基因表达产物及其制备方法和该产物在酶免及发光酶免技术中的应用。
背景技术：
自身免疫性甲状腺病(AITD)是一类多发病，包括Graves’病(GD)、慢性淋巴细胞性甲状腺炎(HT)等，其发病机制至今尚未完全明了。
促甲状腺素受体(TSHR)是存在甲状腺滤泡上皮细胞(TEC)膜上的一种糖蛋白，它与促甲状腺素(TSH)结合后，调节TEC的生长、分化及其合成和释放甲状腺激素的功能。在环境和遗传因素基础上，机体免疫功能异常变化导致AITD，TSHR是AITD的主要自身抗原之一，刺激机体产生促甲状腺素受体抗体(TRAb)，该自身抗体属于异质性抗体，包括甲状腺刺激性抗体(TSAb)和甲状腺阻断性抗体(TSBAb)，前者模拟TSH功能，长期持续地刺激甲状腺激素合成释放而导致Graves’病，表现功能亢进；后者与TSHR特异位点结合而阻止TSH与TSHR的结合及其生理作用的发挥，表现为甲状腺功能低下。TSHR属于G蛋白偶联受体家族，它是由764氨基酸组成的糖蛋白，包括胞外段、跨膜段及很短的胞内段三部分，亲水性的胞外区由418个氨基酸残基组成，该区由9个外显子编码。TSH、TSAb和TSBAb的抗原决定簇主要分布于TSHR胞外段(TSHR-ecd)，TSHR-ecd是TSH发挥生理作用或TRAb致病的关键环节。因此，探讨TSHR的抗原决定簇有助于了解它们的结构和功能，特别是针对不同自身抗体的相应抗原决定簇，对探索AITD的发病机制、AITD诊断分型、疗效判断乃至治疗都具有明显的理论意义，十分重要的临床应用价值和很好的开发前景。
目前的研究认为TSAb主要结合于TSHR-ecd的氨基端(N-端)，有报道TSHR-ecd N-端的aa22-61是TSAb的重要靶区；TSBAb的靶位点则集中于TSHR-ecd的羧基端(C-端)，其中Cys301、Cys381和Try390是TSBAb结合的关键部位；对TSHR-中间段抗原决定簇的报道十分有限。目前有关TSHRAb抗原决定簇的研究主要来自基因删除或替换、合成肽与AITD患者血清和动物模型来源的抗血清之间的结合反应以及基因工程表达产物的研究结果，但是前两者由于缺乏或不能正确反应hTSHR-ecd的空间构象，而获取hTSHR蛋白作为hTSHR蛋白抗原决定簇研究材料已成为对该领域展开深入研究的瓶颈。由于TSHR在甲状腺滤泡上皮细胞膜上的分布非常稀少且极不稳定，因此，难以直接从TEC获取足够量的TSHR进行相关研究；虽然TSHR在真核系统已获得成功表达，而且该系统表达产物克服TSHR蛋白空间构象的难题，但其产量低、工艺相对复杂、生产成本高的缺点，其表达产量仍然无法满足TSHR抗原决定簇的研究；相对而言，原核表达系统技术成熟、产量高、工艺简单、生产成本低，仍然是本研究获取大量目的蛋白的最佳手段。近年国内外学者也先后使用不同的表达载体在大肠杆菌中表达出了可溶性的hTSHR全长或胞外区蛋白，我室报道已在大肠杆菌中成功表达了可溶性TSHR-ecd蛋白，经过反复实践表达产物的产量也逐步提高。由于在TSHR-ecd上分布着两种自身抗体的的抗原表位，目前仍难以区分它们的确切位点，将该段基因进行粗略的分隔并表达后，再进行抗原决定簇的研究所获得的结果会较合成肽方法所得结果更具有说服力。日本学者Akira Nakai等人曾将TSHR胞外区分为两个片段进行原核表达，但迄今为止，尚无将hTSHR胞外区分三段(氨基端、羧基端和中间段)表达的报道。
目前国外常用的TRAb检测技术有两种1.放射受体分析，其缺点是只能测TRAb不能分辨TSAb与TSBAb。2.生物学分析可区分TSAb和TSBAb，但操作复杂，不宜常规使用。而且其商品药盒都很昂贵，国内虽有引进，却不能推广。因而创建我国自己的检测TRAb且对TSAb和TSBAb能有所区分的新技术十分必要。
发明内容
本发明的目的在于将TSHR-ecd cDNA分为三段(hTSHR-N端、hTSHR-C端和hTSHR-M段)分别进行、特别是对hTSHR-C端进行基因克隆、表达载体构建、E.coli原核表达，并进一步以此基因工程片段蛋白为抗原建立TRAb(包括TSAb、TSBAb)ELISA检测技术。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的 本发明人促甲状腺素受体胞外区氨基端、羧基端、中间段基因表达产物其中氨基端、羧基端是具有人的促甲状腺素受体蛋白抗原性的重组片段蛋白。所说的hTSHR-C片段进行表达获重组片段蛋白(TrxFus-hTSHR-C)，其cDNA的核苷酸和氨基酸序列为 GCT TTT AAG AAT CAG AAG AAA ATC AGA GGA ATC CTT GAG TCC TTG ATG 1000bp Ala Phe lys Asn Gln lys lys Ile Arg Gly Ile Leu Glu Ser Leu Met 16AA 1 7 13 TGT AAT GAG AGC AGT ATG CAG AGC TTG CGC CAG AGA AAA TCT GTG AAT 1048bp Cys Asn Glu Ser Ser Met Gln Ser Leu Arg Gln Arg Lys Ser Val Asn 32AA 19 25 31 GCC TTG AAT AGC CCC CTC CAC CAG GAA TAT GAA GAG AAT CTG GGT GAC 1096bp Ala Leu Asn Ser Pro Leu His Gln Glu Tyr Glu Glu Asn Leu Gly Asp 48AA 37 43 AGC ATT GTT GGG TAC AAG GAA AAG TCC AAG TTC CAG GAT ACT CAT AAC 1144bp Ser Ile Val Gly Tyr lys Glu lys Ser lys Phe Gln Asp Thr His Asn 64AA 49 55 61 AAC GCT CAT TAT TAC GTC TTC TTT GAA GAA CAA GAG GAT GAG ATC ATT 1192bp Asn Ala His Tyr Tyr Val Phe Phe Glu Glu Gln Glu Asp Glu Ile Ile 80AA 67 73 79 GGT TTT GGC CAG GAG CTC AAA AAC CCC CAG GAA GAG ACT CTA CAA GCT 1240bp Gly Phe Gly Gln Glu Leu lys Asn Pro Gln Glu Glu Thr Leu Gln Ala 96AA 85 91 TTT GAC AGC CAT TAT GAC TAC ACC ATA TGT GGG GAC AGT GAA GAC ATG 1288bp Phe Asp Ser His Tyr Asp Tyr Thr Ile Cys Gly Asp Ser Glu Asp Met 112AA 97 103 109 GTG TGT ACC CCC AAG TCC GAT GAG TTC AAC CCG TGT GAA GAC ATA ATG 1336bp Val Cys Thr Pro lys Ser Asp Glu Phe Asn Pro Cys Glu Asp Ile Met 128AA 115 121 127 GGC TAC AAG TTC CTG AGA ATT 1357bp Gly Tyr lys Phe Leu Arg Ile 135AA 133 。
人促甲状腺素受体胞外区氨基端、羧基端、中间段基因三种表达产物以融合蛋白形式存在，融合蛋白分子量分别为34.4kD、29.8kD、30.1kD(其中重组蛋白分别为21.2kD，16.6kD，16.9kD；硫氧还蛋白为13.2kD)。
人促甲状腺素受体胞外区羧基端(也包括氨基端、中间段)基因表达产物的制备方法，采用TRIzol一步法从Graves’病患者手术治疗切下的甲状腺组织中提取总RNA，经RT-PCR合成并扩增hTSHR-C端(还有hTSHR-N端、hTSHR-M段)编码基因，定向克隆插入载体pET102/D-His。热休克法将pET102/hTSHRc(还有pET102/hTSHRn、pET102/hTSHRm)重组表达质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中，进行原核表达。表达条件为以0.4-1.2mM·L-1异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)为诱导剂，25℃-37℃，诱导1-12小时。采用变性Ni2+-NTA亲和层析纯化系统纯化，经过梯度透析、复性、浓缩，获得TrxFus-hTSHRc(还有TrxFus-hTSHRn、TrxFus-hTSHRm)重组蛋白。
本发明在人促甲状腺素受体胞外区氨基端、羧基端、中间段基因表达产物上探索TSAb、TSBAb抗原决定簇分布，将富含TSAb、TSBAb抗原决定簇的TrxFus-hTSHRn和TrxFus-hTSHRc分别作抗原，应用于建立人血清TRAb(包括TSAb、TSBAb)酶联免疫吸附(ELISA)检测技术和建立发光酶免技术。
本发明的积极效果 1、在国内外首先将hTSHR胞外区分三段进行基因克隆和表达并成功地获得了三段目的基因及其重组融和蛋白。
2、在国内外首次在三个片段的基因工程产品上研究TSAb、TSBAb在不同片段的结合表位(即抗原决定簇)及其分布。TrxFus-hTSHRc和TrxFus-hTSHRn两目的蛋白具有与甲状腺阻断性抗体(TSBAb)和刺激性抗体(TSAb)结合的抗原性，其中前者与TSBAb结合更敏感，说明该片段是TSBAb结合位点占优势。
3、率先利用hTSHRN、C二端的重组蛋白成功地建立了二个ELISA方法可检测人血清TRAb并可区分TSAb和TSBAb谁占优势，方法灵敏、特异、精密、稳定并已初步用于临床，为AITD病因诊断试剂盒的开发做好了准备。此外，为进一步探讨抗原决定簇及其分布和研究用于治疗AITD的生物制剂奠定了基础。
图1为PCR扩增目的基因的鉴定； 图2为重组质粒pET102-hTSHRn的双酶切鉴定； 图3为重组质粒pET102-hTSHRm的酶切鉴定； 图4为重组质粒pET102-hTSHRc的酶切鉴定； 图5为诱导时间对pET102-TSHRn融合蛋白表达产量的影响； 图6为亲和层析纯化产物的SDS-PAGE电泳； 图7为蛋白标准曲线； 图8为诱导时间对融合蛋白表达产量的影响； 图9为诱导时间对融合蛋白表达产量的影响； 图10为hTSHR-ecd氨基端原核表达蛋白免疫活性鉴定(Westernblot)。
具体实施例方式 一、人促甲状腺素受体胞外区氨基端、中间段和羧基端基因克隆、表达质粒的构建及鉴定 (一)人促甲状腺素受体胞外区氨基端、中间段和羧基端基因克隆 采用TRIzol一步法从Graves’病患者手术治疗切下的甲状腺组织中提取总RNA逆转录合成人甲状腺cDNA第一链，用自行设计的引物行RT-PCR分别扩增hTSHR-N端、hTSH-C端和hTSHR-M编码基因。以核酸分子量标准为参照，用1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定该PCR扩增产物，结果显示在462bp、417bp和405bp处分别可见一条清晰的、特异电泳条带，与预期基因片段大小相符(见图1)。图1中 泳道1DNA Marker； 泳道2PCR hTSHRc扩增产物； 泳道3PCR hTSHRm扩增产物； 泳道4PCR hTSHRn扩增产物。
(二)重组表达质粒pET102-hTSHRn的构建与鉴定 将hTSHRn基因定向克隆插入pET102/D-His载体，重组表达质粒命名为pET102-hTSHRn热休克法转化入表达菌E.coli BL21。
1.重组质粒pET102-hTSHRn的酶切鉴定 pET102-hTSHRn重组表达载体经Pst I单酶切，切得6770kb单一条带；Ssp I酶切，切得1105bp和5669bp两条带，均与理论计算结果相符合(见图2)。图中 1、2DNA Marker； 3重组质粒； 4Pst I酶切重组质粒； 5Ssp I酶切重组质粒。
2.重组质粒pET102-hTSHRn的测序鉴定 以重组质粒pET102-hTSHRn为模板，分别以TrxFus、T7Reverse为测序引物，对该重组质粒进行部分序列测定，测出长约700bp的序列，结果显示该载体包涵的目的基因片段与Nagayama报告序列完全一致、插入方向正确，与pET102载体的上下游接口正确吻合。
硫氧还蛋白酶切位点 TTC CTC GAC GCT AAC CTG GCC GGC TCT GGA TCC GGT GAT GAC GAT GAC Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly Ser Gly Asp Asp Asp Asp 上游接口 AAG CTG GGA ATT GAT CCC TTC ACC ATG GGG TGT TCG TCT CCA CCC TGC Lys Leu Gly Ile Asp Pro Phe Thr Met Gly Cys Ser Ser Pro Pro Cys GAG TGC CAT CAG GAG GAG GAC TTC AGA GTC ACC TGC AAG GAT ATT CAA Glu Cys His Gln Glu Glu Asp Phe Arg Val Thr Cys lys Asp Ile Gln CGC ATC CCC AGC TTA CCG CCC AGT ACG CAG ACT CTG AAG CTT ATT GAG Arg Ile Pro Ser Leu Pro Pro Ser Thr Gln Thr Leu lys Leu Ile Glu ACT CAC CTG AGA ACT ATT CCA AGT CAT GCA TTT TCT AAT CTG CCC AAT Thr His Leu Arg Thr Ile Pro Ser His Ala Phe Ser Asn Leu Pro Asn ATT TCC AGA ATC TAC GTA TCT ATA GAT GTG ACT CTG CAG CAG CTG GAA Ile Ser Arg Ile Tyr Val Ser Ile Asp Val Thr Leu Gln Gln Leu Glu TCA CAC TCC TTC TAC AAT TTG AGT AAA GTG ACT CAC ATA GAA ATT CGG Ser His Ser Phe Tyr Asn Leu Ser lys Val Thr His Ile Glu Ile Arg AAT ACC AGG AAC TTA ACT TAC ATA GAC CCT GAT GCC CTC AAA GAG CTC Asn Thr Arg Asn Leu Thr Tyr Ile Asp Pro Asp Ala Leu lys Glu Leu CCC CAC CTA AAG TTC CTT GGC ATT TTC AAC ACT GGA CTT AAA ATG TTC Pro His Leu lys Phe Leu Gly Ile Phe Asn Thr Gly Leu lys Met Phe CCT GAC CTG ACC AAA GTT TAT TCC ACT GAT ATA TTC TTT ATA CTT GAA Pro Asp Leu Thr lys Val Tyr Ser Thr Asp Ile Phe Phe Ile Leu Glu ATT ACA GAC AAC CCT TAC ATG ACG TCA ATC CCT GTG AAT GCT TTT CAG Ile Thr Asp Asn Pro Tyr Met Thr Ser Ile Pro Val Asn Ala Phe Gln 下游接口 GGA CTA AAG GGC GAG CTC AAG CTT GAA GGT AAG CCT ATC CCT AAC CCT Gly Leu Lys Gly Glu Leu Lys Leu Glu Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro 6*His标签 CTC CTC GGT CTC GAT TCT ACG CGT ACC GGT CAT CAT CAC CAT CAC CAT Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr Arg Thr Gly His His His His His His TGA GTT TGA TCC GGC TGC TAA CAA AGC CCG AAA GGA AGC TGA GTT GGC TGC TGC CAC CGC TGA GCA ATA ACT A (三)重组表达质粒pET102-hTSHRm的构建与鉴定 将hTSHRm基因定向克隆插入pET102/D-His载体，重组表达质粒命名为pET102-hTSHRm热休克法转化入表达菌E.coli BL21。
1.重组质粒pET102/hTSHRm的酶切鉴定 pET102-hTSHRm重组表达载体经Pst I和Stu I分别酶切后，均切得6770kb单一条带；经Pst I+Stu I双酶切后，切得1530bp和5191bp两条带，均与理论计算结果相符(见图3所示)。图中 1、2DNA Marker； 3重组质粒； 4Pst I+Stu I双酶切重组质粒； 5Stu I单酶切重组质粒； 6Pst I酶切重组质粒。
2.重组质粒pET102-hTSHRm的测序鉴定 以重组质粒pET102-hTSHRm为模板，以TrxFus为测序引物，对该重组质粒进行部分序列测定，测出包含上下游接口、目的基因片段在内长约700bp的序列，结果显示目的基因片段与Nagayama等报告的序列完全一致、插入方向正确，与pET102载体上下游接口正确吻合。
硫氧还蛋白酶切位点 TTC CTC GAC GCT AAC CTG GCC GGC TCT GGA TCC GGT GAT GAC GAT GAC Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly Ser Gly Asp Asp Asp Asp 上游接口 AAG CTG GGA ATT GAT CCC TTC ACC AAC CCT TAC ATG ACG TCA ATC CCT Lys Leu Gly Ile Asp Pro Phe Thr Asn Pro Tyr Met Thr Ser Ile Pro GTG AAT GCT TTT CAG GGA CTA TGC AAT GAA ACC TTG ACA CTG AAG CTG Val Asn Ala Phe Gln Gly Leu Cys Asn Glu Thr Leu Thr Leu lys Leu TAC AAC AAC GGC TTT ACT TCA GTC CAA GGA TAT GCT TTC AAT GGG ACA Tyr Asn Asn Gly Phe Thr Ser Val Gln Gly Tyr Ala Phe Asn Gly Thr AAG CTG GAT GCT GTT TAC CTA AAC AAG AAT AAA TAC CTG ACA GTT ATT lys Leu Asp Ala Val Tyr Leu Asn lys Asn lys Tyr Leu Thr Val Ile GAC AAA GAT GCA TTT GGA GGA GTA TAC AGT GGA CCA AGC TTG CTG GAC Asp lys Asp Ala Phe Gly Gly Val Tyr Ser Gly Pro Ser Leu Leu Asp GTG TCT CAA ACC AGT GTC ACT GCC CTT CCA TCC AAA GGC CTG GAG CAC Val Ser Gln Thr Ser Val Thr Ala Leu Pro Ser lys Gly Leu Glu His CTG AAG GAA CTG ATA GCA AGA AAC ACC TGG ACT CTT AAG AAA CTT CCA Leu lys Glu Leu Ile Ala Arg Asn Thr Trp Thr Leu lys lys Leu Pro CTT TCC TTG AGT TTC CTT CAC CTC ACA CGG GCT GAC CTT TCT TAC CCA Leu Ser Leu Ser Phe Leu His Leu Thr Arg Ala Asp Leu Ser Tyr Pro AGC CAC TGC TGT GCT TTT AAG AAT CAG AAG AAA ATC AGA GGA ATC CTT Ser His Cys Cys Ala Phe lys Asn Gln lys lys Ile Arg Gly Ile Leu GAG TCC TTG ATG AGC CAC TGC TGT GCT TTT AAG AAT CAG AAG AAA ATC Glu Ser Leu Met Ser His Cys Cys Ala Phe lys Asn Gln lys lys Ile 下游接口 AGA GGA ATC CTT GAG TCC TTG AAG GGC GAG CTC AAG CTT GAA GGT AAG Arg Gly Ile Leu Glu Ser Leu Lys Gly Glu Leu Lys Leu Glu Gly Lys CCT ATC CCT AAC CCT CTC CTC GGT CTC GAT TCT ACG CGT ACC GGT CAT Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr Arg Thr Gly His 6*His标签 CAT CAC CAT CAC CAT TGA GTT TGA TCC GGC TGC TAA CAA AGC CCG AAA His His His His His GGA AGC TGA GTT GGC TGC TGC CAC CGC TGA GCA ATA ACT A (四)重组表达质粒pET102-hTSHRc的构建与鉴定 将hTSHRc基因定向克隆插入pET102/D-His载体，重组表达质粒命名为pET102-hTSHRc热休克法转化入表达菌E.coli BL21。
1.重组质粒pET102/hTSHRc的酶切鉴定 pET102-hTSHRc重组表达载体经Pst I酶切后，切得6770kb单一条带；经Pst I+Ndl I双酶切后，切得1469bp和5247bp两条带，与理论计算结果相符合(见图4所示)。图中； 1、2DNA Marker； 3重组质粒； 4Pst I单酶切重组质粒； 5Pst I/Ndl I双酶切重组质粒。
2.重组质粒pET102-hTSHRc的测序鉴定 以纯化后重组质粒pET102-hTSHRc为模板，以TrxFus为测序引物，对该重组质粒进行部分序列测定，测出包含上下游接口、目的基因片段在内长约700bp的序列，结果显示目的基因片段与Nagayama等报告的序列完全一致、插入方向正确，与pET102载体的上下游接口正确吻合，确保了读码框架的正确性。
硫氧还蛋白 酶切位点 TTC CTC GAC GCT AAC CTG GCC GGC TCT GGA TCC GGT GAT GAC GAT GAC Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly Ser Gly Asp Asp Asp Asp上游接口 AAG CTG GGA ATT GAT CCC TTC ACC GCT TTT AAG AAT CAG AAG AAA ATC Lys Leu Gly Ile Asp Pro Phe Thr Ala Phe lys Asn Gln lys lys Ile AGA GGA ATC CTT GAG TCC TTG ATG TGT AAT GAG AGC AGT ATG CAG AGC Arg Gly Ile Leu Glu Ser Leu Met Cys Asn Glu Ser Ser Met Gln Ser TTG CGC CAG AGA AAA TCT GTG AAT GCC TTG AAT AGC CCC CTC CAC CAG Leu Arg Gln Arg Lys Ser Val Asn Ala Leu Asn Ser Pro Leu His Gln GAA TAT GAA GAG AAT CTG GGT GAC AGC ATT GTT GGG TAC AAG GAA AAG Glu Tyr Glu Glu Asn Leu Gly Asp Ser Ile Val Gly Tyr lys Glu lys TCC AAG TTC CAG GAT ACT CAT AAC AAC GCT CAT TAT TAC GTC TTC TTT Ser lys Phe Gln Asp Thr His Asn Asn Ala His Tyr Tyr Val Phe Phe GAA GAA CAA GAG GAT GAG ATC ATT GGT TTT GGC CAG GAG CTC AAA AAC Glu Glu Gln Glu Asp Glu Ile Ile Gly Phe Gly Gln Glu Leu lys Asn CCC CAG GAA GAG ACT CTA CAA GCT TTT GAC AGC CAT TAT GAC TAC ACC Pro Gln Glu Glu Thr Leu Gln Ala Phe Asp Ser His Tyr Asp Tyr Thr ATA TGT GGG GAC AGT GAA GAC ATG GTG TGT ACC CCC AAG TCC GAT GAG Ile Cys Gly Asp Ser Glu Asp Met Val Cys Thr Pro lys Ser Asp Glu下游接口 TTC AAC CCG TGT GAA GAC ATA ATG GGC TAC AAG TTC CTG AGA ATT AAG Phe Asn Pro Cys Glu Asp Ile Met Gly Tyr lys Phe Leu Arg Ile Lys GGC GAG CTC AAG CTT GAA GGT AAG CCT ATC CCT AAC CCT CTC CTC GGT Gly Glu Leu Lys Leu Glu Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly6*His标签 CTC GAT TCT ACG CGT ACC GGT CAT CAT CAC CAT CAC CAT TGA GTT TGA Leu Asp Ser Thr Arg Thr Gly His His His His His His TCC GGC TGC TAA CAA AGC CCG AAA GGA AGC TGA GTT GGC TGC 二、人促甲状腺素受体胞外区氨基端、中间段和羧基端基因在原核系统的表达及其纯化 1.诱导表达条件的优化 首先固定诱导时间(均取4小时)，采用不同IPTG浓度，0.2、0.4、0.5、0.6、0.8和1.0mM·L-1；再固定IPTG浓度(1.0mM·L-1)，采用不同诱导时间，1、2、3、4、5和6小时。结果见图5，图中 1-2.pET102/D/LacZ质粒转化BL21TM(DE3)，未诱导和IPTG诱导表达； 3-4.BL21TM(DE3)空菌，未诱导和IPTG诱导表达； 5、蛋白质分子量标志100kD、75kD、50kD、35.0kD、25.0kD、15kD； 6-11.IPTG诱导时间对pET102-TSHRn表达(诱导表达0h、1h、2h、3h、4h、5h和6h)。
2.亲和层析纯化融合蛋白 重组质粒pET102-TSHRn诱导表达产物在层析产物中含量的粗略测定对SDS-PAGE照片扫描分析，融合蛋白条带光密度约占总蛋白条带的91.2％(见图6所示)。图中 1.包涵体裂解液； 2.包涵体裂解液过柱液； 3-10.不同阶段的洗涤缓冲液； 11.蛋白质分子量标志100kD、75kD、50kD、35kD、25kD； 12-16.亲和层析纯化后产物. 3分子量测定 通过标准蛋白分子量及其Rf值推导回归方程计算TrxFus-TSHRn分子量为37.33kD。
4.表达产物的定量 根据标准蛋白样品浓度建立标准曲线(见图7所示)，计算Trx-TSHRn产率为20.6mg/L培养基。图中y-样品OD590nm x-纯化后融合蛋白样品浓度。
(二)hTSHR-ecd中间段基因(hTSHRm)在原核宿主菌中的表达与纯化 1.诱导表达条件的优化 首先固定诱导时间(均取4小时)，采用不同IPTG浓度，0.1、0.3、0.5、0.6、0.8和1.0mM·L-1；再固定IPTG浓度(1.0mM·L-1)，采用不同诱导时间，1、2、3、4、5和6小时。结果见图8所示，图中 1、蛋白质分子量标志100kD、75 kD、50kD、35kD、25kD、15kD； 2、3、pET102/D/LacZ质粒转化的BL21TM(DE3)诱导、未诱导表达； 4、5、BL21TM(DE3)空菌未诱导和诱导表达； 6-12、1.0mM·L-1IPTG诱导pET102-TSHRm表达(诱导表达0h、1h、2h、3h、4h、5h和6h)。
2.亲和层析纯化融合蛋白 本段亲和层析产物的SDS-PAGE电泳结果与Trx-TSHRn的图片相似(图片略)。对SDS-PAGE照片经凝胶分析系统扫描，层析后目的融合蛋白条带光密度约占总蛋白条带光密度的92.1％。
3.分子量测定 通过标准蛋白分子量及其Rf值推导回归方程TrxFus-TSHRm分子量为30.75D。
4.表达产物的定量 以测定的蛋白样品OD值(经稀释后)从该曲线查得样品浓度，换算出总蛋白浓度为42.75mg/dl，根据融合蛋白所占百分比，计算Trx-TSHRm产率为35.44mg/L培养基。
(三)hTSHR-ecd羧基端基因(hTSHRc)在原核宿主菌中的表达与纯化 1.诱导表达条件的优化 首先固定诱导时间(均取5小时)，采用不同IPTG浓度，0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mM·L-1；再固定IPTG浓度(1.0mM·L-1)，采用不同诱导时间，1、2、3、4、5和6小时。结果见图9所示，图中 1、蛋白质分子量标志150kD、100kD、75kD、50kD、35kD、25kD； 2-3、pET102/D/LacZ质粒转化的BL21TM(DE3)，未诱导和诱导表达； 4-5、BL21TM(DE3)空菌，不诱导和诱导表达； 6-12、1.0mM·L-1IPTG诱导表达(0h、1h、2h、3h、4h、5h和6h)。
2.亲和层析纯化融合蛋白 本段亲和层析产物的SDS-PAGE电泳结果与Trx-TSHRn的图片相似(图片略)。对该SDS-PAGE照片扫描分析，计算求得层析后目的融合蛋白条带光密度约占总蛋白条带光密度的90.0％。
3.分子量测定 通过标准蛋白分子量及其Rf值推导回归方程。计算TrxFus-TSHRn分子量为28.96kD。
4.表达产物的定量 以测定的蛋白样品OD值(经稀释后)从该曲线查得样品浓度，换算出总蛋白浓度为21.83mg/dl，根据融合蛋白所占百分比，计算Trx-TSHRc产率为28.3mg/L培养基。
三、人促甲状腺素受体胞外区氨基端、中间段和羧基端原核表达蛋白免疫学活性的鉴定 (一)采用Western blot方法鉴定人促甲状腺素受体胞外区氨基端原核表达蛋白免疫活性，步骤如下 1.SDS-PAGE电泳 取纯化TrxTSHRn蛋白20μl，100V电压，SDS-PAGE电泳4小时。
2.转膜 ①剪裁大小与凝胶吻合的硝酸纤维素膜1张和3M滤纸6张，浸泡水中5分钟除净气泡与3M滤纸6张浸入转移缓冲液中(39mmol/L甘氨酸，48mmol/L Tris碱，0.037％SDS，20％甲醇)，取出滤纸。
②电转仪的阳极在下，从下向上依次放置3层3M滤纸、硝酸纤维素膜、凝胶、3层3M滤纸、盖上阴板极。根据凝胶面积选择电流，0.65mA/cm2，室温下，电转移2小时。
3.封闭 将硝酸纤维素膜用20ml漂洗缓冲液(150mmol/L NaCl，50mmol/LTris.Cl pH7.5)室温漂洗10分钟，重复3次以除去硝酸纤维素膜上的SDS，防止影响后来的抗体结合，然后将膜置于5％BSA封闭液中，4℃过夜放置，以封闭未与蛋白结合的位点。
4.加一抗 弃去封闭液，按每平方厘米滤膜0.2ml的量分别加入阳性混合血清、正常混合血清，4℃平坦放置2小时。然后弃去抗体，用PBS漂洗3次，每次10分钟。
5.与碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG二抗结合 取出硝酸纤维素膜用20ml漂洗缓冲液室温漂洗10分钟，弃净漂洗液，按每平方厘米滤膜0.2ml的量加入5％BSA稀释的1∶500山羊抗兔IgG-AP二抗，室温结合1小时，然后将滤膜应用20ml漂洗缓冲液漂洗3次，每次10分钟。
6.显色 按每平方厘米滤膜0.1ml的量加入生色底物混合物(66μl NBT溶液、10ml碱性磷酸酶缓冲液、33μl BCIP溶液)，20分钟可观察到蛋白带，见图10所示。
(二)ELISA方法鉴定人促甲状腺素受体胞外区氨基端、中间段和羧基端原核表达蛋白免疫活性 以纯化的三种重组融合蛋白为抗原，分别以GD患者和正常人血清为一抗，以辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG为二抗，利用优化的ELISA反应条件测定三段重组蛋白免疫活性，以TrxFuS-hTSHRn为抗原，38例GD患者的OD值为
为0.59±0.14，20例正常对照的OD值
为0.45±0.08，两者有显著性差异(P＜0.01)，以TrxFuS-hTSHRm为抗原GD患者OD值
为0.81±0.40，正常对照OD值
为1.01±0.46，两者无显著性差异(P＞0.05)，以TrxFuS-hTSHRc为抗原GD患者OD值
为0.88±0.25，正常对照OD值
为0.64±0.18，两者有显著性差异(P＜0.05)，结果显示TrxFuS-hTSHRn和TrxFuS-hTSHRc能与GD患者血清发生特异性结合反应，表明这两个片段具有TSAb的结合位点，前者更显著。
同样以纯化的三种融合蛋白为抗原，以35例桥本甲状腺炎伴甲低患者(HT)和58例正常人血清为一抗，以碱磷酶标记的羊抗人IgG为二抗，利用优化的ELISA反应条件测定三段蛋白免疫活性，其结果如下 由此可见TrxFuS-hTSHRn和TrxFuS-hTSHRc能与HT患者血清发生特异性结合反应，表明这两个片段具TSBAb的结合位点，后者更显著。
四、检测TRAb的ELISA方法的建立及临床应用的初步探讨 (1)检测TRAb ELISA方法的建立和方法学鉴定，分别以TrxFuS-hTSHRn和TrxFuS-hTSHRc为抗原，分别以已知含TSAb血清和TSBAb血清(阳性血清)以及正常人混合血清(阴性血清)为一抗，以碱磷酶标记的羊抗人IgG血清作二抗，成功地建立了二个TRAb ELISA方法。
二个ELISA方法的操作程序基本相同，如下 ELISA条件的优化按交叉连续稀释法进行条件实验，以阳性血清测得的OD值大于正常对照OD值
或2倍以上为最佳条件，确定ELISA的抗原量为TrxFuS-hTSHRn或TrxFuS-hTSHRc均为16ng/100ul，样品血清为1∶200稀释，取100ul；碱磷酶标记羊抗人工gG血清(二抗)1∶20000稀释，取100ul；显色剂PNPP1mg/ml取100ul；终止反应液16mmol/LEDTA或2N NaOH取100ul。
以TrxFuS-hTSHRn为抗原的ELISA方法学鉴定1)取63例血清，经商品ELISA药盒检测TSI与该法测得结果进行相关分析，结果相关系数r＝0.742P＜0.05显示显著相关。2)精密度取高中低含量的TSAb样品同次试验分别检测8样，批内变异cv％分别为3.96％、4.21％、4.67％；取高中低含量的TSAb样品分别检测8次，批间变异cv％分别为7.32％、7.94％、8.33％。3)正常值范围58例正常人检测结果
为0.42±0.12，正常值范围为0.18-0.66
4)检测GD患者95例
为0.90±0.26，显著高于正常对照P＜0.01，其中79例OD值＞0.66，阳性率为83.16％(79/95)。5)检测HT患者35例
为0.66±0.24，显著高于正常对照P值＜0.01，其中21例OD值＞0.66，阳性率60.0％(21/35)。
以TrxFuS-hTSHRc为抗原的ELISA方法学鉴定1)精密度取高中低含量的TSBAb样品同次试验分别检测8样，批内变异cv％分别为3.24％、4.63％、4.72％取高中低含量的TSBAb样品分别检测8次，批间变异cv％分别为7.22％、8.55％、8.09％。2)58例正常人检测结果
为0.32±0.11，正常值范围为0.10-0.54
3)检测HT患者35例
为1.06±0.30，显著高于正常对照P值＜0.001，其中33例OD值＞0.54，阳性率94.2％(33/35)。4)检测GD患者95例
为0.73±0.21，显著高于正常对照P＜0.01，其中66例OD值＞0.54，阳性率为69.4％(66/95)。
(2)临床应用共检测正常人108例，GD患者711人次，其中初诊患者436例，将hTSHRn和hTSHRc为抗原建立的二个ELISA方法同时检测每批样品总阳性率77.7％-93.3％；HT初诊患者35例，二个ELISA方法同时检测每批样品总阳性率94.2-97.1％；非毒性结节性甲状腺肿患者6例，总阳性率0％。
羧基端序列表
<110>天津医科大学总医院
<120>人促甲状腺素受体胞外区羧基端基因表达产物及制备方法和该产物在酶免技术中的应用
<160>1
<210>1
<211>405
<212>DNA
<213>人属(Homo)
<220>
<221>CDS
<222>(953)...(1357)
<400>1
GCT TTT AAG AAT CAG AAG AAA ATC AGA GGA ATC CTT GAG TCC TTG ATG 1000bp
Ala Phe lys Asn Gln lys lys Ile Arg Gly Ile Leu Glu Ser Leu Met 16AA
1 7 13
TGT AAT GAG AGC AGT ATG CAG AGC TTG CGC CAG AGA AAA TCT GTG AAT 1048bp
Cys Asn Glu Ser Ser Met Gln Ser Leu Arg Gln Arg Lys Ser Val Asn 32AA
19 25 31
GCC TTG AAT AGC CCC CTC CAC CAG GAA TAT GAA GAG AAT CTG GGT GAC 1096bp
Ala Leu Asn Ser Pro Leu His Gln Glu Tyr Glu Glu Asn Leu Gly Asp 48AA
37 43
AGC ATT GTT GGG TAC AAG GAA AAG TCC AAG TTC CAG GAT ACT CAT AAC 1144bp
Ser Ile Val Gly Tyr lys Glu lys Ser lys Phe Gln Asp Thr His Asn 64AA
49 55 61
AAG GCT CAT TAT TAC GTC TTC TTT GAA GAA CAA GAG GAT GAG ATC ATT 1192bp
Asn Ala His Tyr Tyr Val Phe Phe Glu Glu Gln Glu Asp Glu Ile Ile 80AA
67 73 79
GGT TTT GGC CAG GAG CTC AAA AAC CCC CAG GAA GAG ACT CTA CAA GCT 1240bp
Gly Phe Gly Gln Glu Leu lys Asn Pro Gln Glu Glu Thr Leu Gln Ala 96AA
85 91
TTT GAC AGC CAT TAT GAC TAC ACC ATA TGT GGG GAC AGT GAA GAC ATG 1288bp
Phe Asp Ser His Tyr Asp Tyr Thr Ile Cys Gly Asp Ser Glu Asp Met 112AA
97 103 109
GTG TGT ACC CCC AAG TCC GAT GAG TTC AAC CCG TGT GAA GAC ATA ATG 1336bp
Val Cys Thr Pro lys Ser Asp Glu Phe Asn Pro Cys Glu Asp Ile Met 128AA
115 121 127
GGC TAC AAG TTC CTG AGA ATT 1357bp
Gly Tyr lys Phe Leu Arg Ile 135AA
13权利要求
1.一种人促甲状腺素受体胞外区羧基端基因(hTSHRc)表达产物，
其特征在于该hTSHRc片段进行表达获重组片段蛋白(TrxFus-hTSHRc)，其cDNA的核苷酸和氨基酸序列为
GCT TTT AAG AAT CAG AAG AAA ATC AGA GGA ATC CTT GAG TCC TTG ATG 1000bp
Ala Phe lys Asn Gln lys lys Ile Arg Gly Ile Leu Glu Ser Leu Met 16AA
1 7 13
TGT AAT GAG AGC AGT ATG CAG AGC TTG CGC CAG AGA AAA TCT GTG AAT 1048bp
Cys Asn Glu Ser Ser Met Gln Ser Leu Arg Gln Arg Lys Ser Val Asn 32AA
19 25 31
GCC TTG AAT AGC CCC CTC CAC CAG GAA TAT GAA GAG AAT CTG GGT GAC 1096bp
Ala Leu Asn Ser Pro Leu His Gln Glu Tyr Glu Glu Asn Leu Gly Asp 48AA
37 43
AGC ATT GTT GGG TAC AAG GAA AAG TCC AAG TTC CAG GAT ACT CAT AAC 1144bp
Ser Ile Val Gly Tyr lys Glu lys Ser lys Phe Gln Asp Thr His Asn 64AA
49 55 61
AAC GCT CAT TAT TAC GTC TTC TTT GAA GAA CAA GAG GAT GAG ATC ATT 1192bp
Asn Ala His Tyr Tyr Val Phe Phe Glu Glu Gln Glu Asp Glu Ile Ile 80AA
67 73 79
GGT TTT GGC CAG GAG CTC AAA AAC CCC CAG GAA GAG ACT CTA CAA GCT 1240bp
Gly Phe Gly Gln Glu Leu lys Asn Pro Gln Glu Glu Thr Leu Gln Ala 96AA
85 91
TTT GAC AGC CAT TAT GAC TAC ACC ATA TGT GGG GAC AGT GAA GAC ATG 1288bp
Phe Asp Ser His Tyr Asp Tyr Thr Ile Cys Gly Asp Ser Glu Asp Met 112AA
97 103 109
GTG TGT ACC CCC AAG TCC GAT GAG TTC AAC CCG TGT GAA GAC ATA ATG 1336bp
Val Cys Thr Pro lys Ser Asp Glu Phe Asn Pro Cys Glu Asp Ile Met 128AA
115 121 127
GGC TAC AAG TTC CTG AGA ATT 1357bp
Gly Tyr lys Phe Leu Arg Ile 135AA
133 。
2.根据权利要求1所述的人促甲状腺素受体胞外区羧基端基因表达产物，其特征在于该表达产物是以融和蛋白形式存在，融和
蛋白hTSHRc分子量为29.8kD，其中目的蛋白为16.6kD，硫氧还蛋白分子量为13.2kD。
3.一种权利要求1的人促甲状腺素受体胞外区羧基端基因表达产物的制备方法，其特征在于由Graves’病患者手术治疗切下的甲状腺组织中提取总RNA，经RT-PCR合成并扩增出hTSHRc端编码基因，用定向克隆技术将目的基因插入载体pET102/D-His，用热休克法将所构建的表达载体转化E.coli TOP10，筛选阳性菌落，提取重组表达质粒pET102/hTSHRc转化入E.coli BL21原核表达菌中，表达条件以异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)为诱导剂，浓度0.3-1.1mM·L-1、温度25℃-37℃、时间2-10小时；表达产物主要为包涵体形式，故在变性条件下通过Ni2+-NTA亲和层析纯化融和蛋白，再经透析复性获得融和蛋白TrxFus-hTSHRc。
4.根据权利要求3所述的表达产物的制备方法，其特征在于目的基因与表达载体接口处的碱基序列为
AAG CTG GGA ATT GAT CCC TTC ACC GCT TTT AAG AAT CAG。
5.权利要求1的人促甲状腺素受体胞外区羧基端基因表达产物的用途，其特征在于hTSHR-ecd基因的hTSHRc端基因表达产物应用在酶联免疫分析技术(ELISA)、化学发光酶免疫分析技术(CLEIA)中。
全文摘要
本发明公开了人促甲状腺素受体胞外区羧基端基因表达产物及制备方法和该产物在酶免技术中的应用。本发明的目的在于将TSHR－ecd cDNA分为三段(hTSHR－N端、hTSHR－C端和hTSHR－M段)分别进行、特别是对hTSHR－C端进行基因克隆、表达载体构建、E.coli原核表达，并进一步以此基因工程片段蛋白为抗原建立TRAb(包括TSAb、TSBAb)ELISA检测技术。为今后进一步TSHR抗原决定簇的研究开辟新的途径并最终转化为TSAb、TSBAb临床诊断试剂盒奠定基础。
文档编号C12N15/09GK1952136SQ20061001538
公开日2007年4月25日 申请日期2006年8月22日 优先权日2006年8月22日
发明者方佩华, 陈慧, 李宁, 王少艳, 谭建 申请人:天津医科大学总医院