专利名称：人类组织因子途径抑制因子突变基因m的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体地说涉及组织因子途径抑制因子突变基因、含有该基因的重组载体、用该载体转化的重组酵母菌及其表达的蛋白。
背景技术：
人类组织因子途径抑制因子(Tissue Factor Pathway Inhibitor，TFPI)是组织因子途径的重要抑制因子，作为TF:FVIIa复合物的生理抑制剂对凝血过程有重要的影响作用。TFPI能抑制血栓形成及血管平滑肌细胞增殖等，因此，对血管再狭窄、动脉粥样硬化和心肌梗塞等的发生与发展有减缓作用。此外，动物实验证明，人类TFPI重组蛋白(hrTFPI)对血栓形成、感染性休克、血管再狭窄、内毒素血症和DIC(弥散性血管内凝血)等有防治作用。因此，TFPI有巨大的药用价值，在临床上有广泛的应用前景。
目前，国内外已有多个公司和实验室利用不同表达系统进行TFPI重组蛋白的制备，且中国医学科学院中国协和医科大学生物医学工程研究所基因工程实验室已用毕氏酵母表达系统稳定表达出成本较低的高比活性TFPI重组蛋白。
但是，由于TFPI在血循环中被快速清除，需要大剂量(约20mg/kg/d)才能达到临床治疗目的，用药不便和高昂的费用极大限制了其在临床上的应用和治疗效果(Palmier MO，Hall LJ，Reisch CM，et al.Clearance of recombinant tissue factor pathway inhibitor(TFPI)in rabbits.Thromb Haemost，1992.68(1)33-36.Warshawsky I，Bu G，Mast A，et al.The carboxy terminus of tissue factor pathway inhibitor is required forinteracting with hepatoma cells in vitro and in vivo.J Clin Invest，1995.95(4)1773-1781.Ho G，Narita M，Broze GJ，Jr.，et al.Recombinant full-length tissuefactor pathway inhibitor fails to bind to the cell surfaceimplications forcatabolism in vitro and in vivo.Blood，2000.95(6)1973-1978.Bai H，Ma D，ZhangYG，et al.Molecular design and characterization of recombinant long half-lifemutants of human tissue factor pathway inhibitor.Thromb Haemost，2005.93(6)1055-1060.)。
因此延长TFPI重组蛋白在血循环中的代谢时间，将大大降低治疗费用，对促进其在临床上的应用具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是为延长TFPI重组蛋白在血循环中的代谢时间，提供一种人类组织因子途径抑制因子突变基因m2TFPI。
本发明的第二个目的是提供一种由人类组织因子途径抑制因子突变基因m2TFPI编码的多肽。
本发明的第三个目的是提供一种包含有人类组织因子途径抑制因子突变基因m2TFPI的重组载体。
本发明的最后一个目的是提供一种利用人类组织因子途径抑制因子突变基因m2TFPI的重组载体转化的重组酵母菌。
本发明的技术方案概述如下一种人类组织因子途径抑制因子突变基因m2TFPI，它具有序列表中SEQ ID No.1所述的核苷酸序列。
一种由人类组织因子途径抑制因子突变基因m2TFPI编码的多肽，它具有序列表中SEQID No.2所述的氨基酸序列。
一种包含人类组织因子途径抑制因子突变基因m2TFPI的重组载体，它是将人类组织因子途径抑制因子突变基因m2TFPI DNA用XhoI和EcoRI消化的片段与pPIC9载体，加入T4连接酶，进行连接反应，制成m2TFPI-pPIC9。
一种利用人类组织因子途径抑制因子突变基因m2TFPI的重组载体转化的重组酵母菌，它是将含有人类组织因子途径抑制因子突变基因m2TFPI的重组载体导入宿主毕赤酵母菌GS115，成为GS115/m2TFPI-pPIC9。
本发明中的人类组织因子途径抑制因子突变基因m2TFPI特点在于在其他已经报道的TFPI多核苷酸序列的基础上进行了部分核苷酸序列的改变；其编码的部分羧基端氨基酸序列与野生型的TFPI不同；在血循环中的代谢时间比野生型TFPI(mTFPI)延长，且其在体外、内抑制FXa的活性、与肝素的协同能力未出现明显减弱。
在本发明完成的基础上，可以延长TFPI重组蛋白在血循环中的代谢时间，同时，尽量保持其生物学特性，如抗凝血活性，与肝素的结合能力等。从而可以大大减少TFPI的给药次数，降低治疗费用，促进TFPI重组蛋白在临床上的应用。
图1m2TFPI-cDNA构建策略图；图2一种含有m2TFPI-cDNA重组(克隆)载体及含该重组载体的宿主细胞的构建策略图；图3m2TFPI重组蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱；
图4不同浓度m2TFPI重组蛋白对FXa的抑制作用；图5不同温育时间m2TFPI对FXa的抑制作用；图6不同温育时间m2TFPI对FXa的抑制作用(肝素钠存在时)；图7肝素对m2TFPI重组蛋白抑制FXa作用的影响；图8不同浓度肝素对m2TFPI重组蛋白抑制FXa的影响；图9m2TFPI重组蛋白在血浆中的代谢含量活性比。
具体实施例方式
制备本发明的一种人类组织因子途径抑制因子突变基因m2TFPI、重组载体、重组宿主菌及重组蛋白突变体m2TFPI的方法包括如下步骤1.以mTFPI-pPIC9质粒DNA(中国医学科学院中国协和医科大学生物医学工程研究所基因工程实验室构建)为模板，用PCR法对mTFPI的部分DNA序列进行突变。重新连接到pPIC9载体上m2TFPI-pPIC9并转化到大肠杆菌TB1。
2.提取m2TFPI-pPIC9质粒DNA，用限制性内切酶将其线性化后，转化到酵母感受态细胞GS115(美国Invitrogen公司)中，获得重组酵母菌GS115/m2TFPI-pPIC9。
3.在可使TFPI突变基因(m2TFPI)表达的条件下培养该重组菌，用底物发色法测定TFPI蛋白的活性；并经SDS-PAGE分析，证明m2TFPI蛋白大量表达。
4.用同位素标记后，测定TFPI蛋白突变体(m2TFPI)在动物体内的代谢情况，证明TFPI蛋白突变体m2TFPI在血循环中的代谢时间比野生型TFPI延长。
5.用底物发色法测定TFPI蛋白突变体m2TFPI的活性，证明其活性与野生型TFPI相比，未出现明显降低。
TFPI突变基因m2TFPI核苷酸序列见SEQ ID No.1。TFPI突变基因m2TFPI全长828bp，和其他野生型的TFPI基因比较，除与mTFPI基因有相同的突变位点外，还在其羧基端发生了部分序列突变。
根据核苷酸序列SEQ ID No.1，推测表达的m2TFPI蛋白的氨基酸序列SEQ ID No.2。该m2TFPI的氨基酸序列由276个氨基酸组成，分子量为42Da。通过对本发明涉及的mTFPI突变基因(m2TFPI)推导的氨基酸序列与其他野生型TFPI蛋白氨基酸序列进行比对分析，结果表明其羧基端部分氨基酸序列突变(参见Thomas JG，Roger E，Robin LW，et al.Structureof the human lipoprotein-associated coagulation inhibitor gene.The Journal ofBiological Chemistry.1991.226(8)5036-5041.)。从而使其在基本保持生物学特性的同时，延长了血浆代谢时间。
下面通过实施例对本发明进行进一步详细说明。应该理解的是，所述的实施例仅仅是用于说明而不是限制本发明。
实施例1 mTFPI-pPIC9质粒DNA的提取100ul新鲜菌液TB1(含mTFPI-pPIC9质粒)接种于10ml LB培养基中37℃，250rpm过夜培养；取10个250ml的三角瓶，每瓶加入100ml培养基，并接种1ml上述菌液，37℃，250rpm过夜培养；离心取沉淀，用120mlGTE缓冲液重悬沉淀，并加入240mg溶解酶，剧烈震荡混匀，30℃水浴30min；加入240ml裂解液(0.2N NaOH 1％SDS新鲜制备)轻柔颠倒混匀，静置5min；加入180ml 5M的乙酸钾溶液(pH 5.5；3M乙酸钾，2M乙酸)，颠倒混匀，冰浴10min。8000rpm离心15min，用两层纱布过滤，取上清，并加入等体积的异丙醇，混匀后8000rpm离心20min，取沉淀；用4ml TE缓冲液重悬沉淀，等体积的酚-氯仿混合液(酚∶氯仿＝24∶1)抽提一次；加入1/2体积的7.5M乙酸铵溶液，混匀后冰浴20min，离心后取上清，加入2.5倍体积的冰冷的乙醇，混匀-20℃静置2h以上；4000rpm离心20min，取沉淀，并用0.6mlTNE(STE)缓冲液重悬，加入10ul 10mg/ml的RNaseA溶液，混匀后37℃水浴30min；依次用酚，酚-氯仿混合液，氯仿各抽提一次；加入等体积的PEG溶液(13％PEG 8000，0.8MNaCl)混匀，4℃静置30min，13000rpm离心20min，沉淀用冰冷的70％的乙醇漂洗两次，溶于适量TE缓冲液中(Tris-HCl 10mmol/L，EDTA1mmol/L，pH8.0)。
实施例2 构建含TFPI突变基因(m2TFPI)的载体以质粒DNA mTFPI-pPIC9(中国医学科学院中国协和医科大学生物医学工程所基因工程实验室构建)为模板，以突变引物m0(5’AAA GGA GGC CTA ATTGAT GAC GAT GAC(AAA ACC AAA AGA)AAA AGA AAG AAG CAG AGA 3’)，3’Aox(5’GAC TGG TTC CAATTG ACA AGC 3’)；为正反引物进行第一次PCR扩增。经琼脂糖凝胶电泳，用DNA凝胶回收试剂盒(北京鼎国生物技术发展中心)纯化PCR产物。仍以质粒DNA mTFPI-pPIC9为模板，以上述PCR产物及5’Aox(5’GCA AAT GGC ATT CTG ACA TCC 3’)为引物进行第二次PCR扩增(见图1，图中m0，m1，m2为突变引物，含突变位点。5’Aox和3’Aox为毕赤酵母表达载体pPIC9的通用引物。■表示突变位点)。用上述方法纯化PCR产物。用限制性内切酶XhoI和EcoRI不完全消化PCR产物及pPIC9载体，经琼脂糖凝胶电泳，用上述试剂盒回收后，取200ng pPIC9回收产物，与200ng回收的PCR产物，在20μL连接体系在16℃条件下过夜进行连接反应。连接体系含1ul连接缓冲液，1ulT4DNA连接酶，17ul水。取连接产物CaCl2转化到E.coli(大肠杆菌)TB1中，涂布在LB培养基平板上。
实施例3 构建及鉴定重组酵母菌GS115取50ug提取的质粒DNA(m2TFPI-pPIC9)用50u Sac1酶切1小时。将质粒用无水乙醇沉淀后，溶于20ul无菌水中。用PEG1000法制备酵母感受态细胞。将50ug DNA直接加入尚处于冷冻状态的感受态细胞中，于37℃水浴5分钟，然后加入1.2mlPEG溶液(40％PEG 1000，0.2M Bicine，pH 8.35)，30℃水浴1h。离心，用1.5ml NaCl溶液(0.15M NaCl，10mM Bicine，pH 8.35)重悬菌体。再次离心，用0.2ml NaCl溶液(0.15M NaCl，10mMBicine，pH 8.35)重悬菌体后涂布于RDB选择平板上，30℃孵育4-6日(见图2)。从RDB选择平板上挑取克隆接种于10ml YPD培养基中，30℃、250rpm培养18-24小时。用玻璃珠裂解法提取酵母基因组DNA。取5ul酵母基因组DNA作为摸板，5`Aox和3`Aox.作为正，反引物进行PCR扩增。琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，并根据扩增片段的大小来判断m2TFPI-pPIC9质粒是否插入酵母宿主菌基因组中。筛选m2TFPI-pPIC9质粒已插入的重组酵母菌GS115。
实施例4 m2TFPI重组蛋白的诱导表达将阳性克隆接种到10ml YPD培养基中，30℃250rpm培养18h；取100ul菌液接种于10mlBMGY培养基中，30℃250rpm培养至OD600≈3(约16-18h)；离心收集细胞，重悬于30ml BMMY培养基中。30℃250rpm，加100％的甲醇至终浓度为0.5％培养36h，并每隔12h加甲醇至终浓度为0.5％。并取上清进行生物活性分析及SDS-PAGE电泳(见图3，图中1.蛋白分子量标准 2.mTFPI重组蛋白 3.m0TFPI重组蛋白 4.m1TFPI重组蛋白 5.m2TFPI重组蛋白 6.pPIC9空白质粒蛋白)。
实施例5 m2TFPI重组蛋白在动物体内代谢将纯化的m2TFPI重组蛋白用125I标记后，注射入SD大鼠尾静脉，于注射后0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0min从眼眶静脉丛取血离心(1000g，15min)得血浆，各取血浆100ul进行125I放射性计数，测定m2TFPI重组蛋白在血浆中的代谢含量(见表1)。
实施例6 m2TFPI重组蛋白体外活性测定将FXa用TBSA(0.5％BSA，100mM NaCl，50mM Tris-HCl PH 7.8)配成2nM的溶液；将pPIC9(空白对照)、mTFPI(阳性对照)、m2TFPI用TBS(100mM NaCl，50mM Tris-HClPH 7.8)稀释成0.5-2.0nM不同浓度，取其各100ul与100ul FXa混合，置于96孔板37℃水浴30min；然后加入15ul 1mM S-2222混匀后于37℃水浴30min，其间用酶标仪测定OD405值。证明较野生型的TFPI蛋白(mTFPI)，m2TFPI重组蛋白在体外的活性未出现明显降低，具有良好活性(见图4、5)。
实施例7 肝素对m2TFPI重组蛋白体外活性影响的测定取1.0nM pPIC9、mTFPI、m2TFPI各100ul与100ul FXa混合，并加入肝素钠至终浓度为0.05-0.5U/ml，37℃水浴30min；然后加入15ul 1mM S-2222混匀后于37℃水浴30min，其间用酶标仪测定OD405值。证明较野生型的TFPI蛋白(mTFPI)，m2TFPI重组蛋白与肝素的结合力也未明显降低，肝素仍明显提高m2TFPI重组蛋白对FXa的抑制能力(见图6-8)。
实施例8 m2TFPI重组蛋白体内活性测定将24只SD大鼠(180-220g)随机分为四组(每组6只)，注射mTFPI、m2TFPI入SD大鼠尾静脉；于注射前、注射后0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0min从眼眶静脉丛取血；血样离心(1000g，15min)得血浆，用上述测定体外活性的方法测定体内活性。证明较野生型的TFPI蛋白(mTFPI)，m2TFPI重组蛋白在体内的活性未出现明显降低，在体内代谢过程中仍保持良好活性(见图9)。
表1 大鼠体内125I-rTFPI血浆代谢含量(％)
SEQ ID No.1 828gattctgagg aagatgaaga acacacaatt atcacagata cggagttgcc accactgaaa 60cttatgcatt cattttgtgc attcaaggcg gatgatggcc catgtaaagc aatcatgaaa 120agatttttct tcaatatttt cactcgacag tgcgaagaat ttatatatgg gggatgtgaa 180ggaaatcaga atcgatttga aagtctggaa gagtgcaaaa aaatgtgtac aagagataat 240gcaaacagga ttataaagac aacattgcaa caagaaaagc cagatttctg ctttttggaa 300gaagatcctg gaatatgtcg aggttatatt accaggtact tctacaacaa tcagacaaaa 360cagtgtgaac gtttcaagta tggtggatgc ctgggcaata tgaacaattt tgagacactg 420gaagaatgca agaacatttg tgaagatggt ccgaatggtt tccaggtgga taattatgga 480acccagctca atgctgtgaa taactccctg actccgcaat caaccaaggt tcccagcctt 540tttgaatttc acggtccctc atggtgtctc actccagcag acagaggatt gtgtcgtgcc 600aatgagaaca gattctacta caattcagtc attgggaaat gccgcccatt taagtacagt 660ggatgtgggg gaaatgaaaa caattttact tccaaacaag aatgtctgag ggcatgtaaa 720aaaggtttca tccaaagaat atcaaaagga ggcctaatta aaaccagctc gagctcgagc 780tcgcagagag tgaaaatagc atatgaagaa atttttgtta aaaatatg 828SEQ ID No.2
276AspSerGluGluAsp GluGluHisThrIle IleThrAspThrGlu LeuProProLeuLys1 5 10 15 20LeuMetHisSerPhe CysAlaPheLysAla AspAspGlyProCys LysAlaIleMetLys25 30 35 40ArgPhePhePheAsn IlePheThrArgGln CysGluGluPheIle TyrGlyGlyCysGlu45 50 55 60GlyAsnGlnAsnArg PheGluSerLeuGlu GluCysLysLysMet CysThrArgAspAsn65 70 75 80AlaAsnArgIleIle LysThrThrLeuGln GlnGluLysProAsp PheCysPheLeuGlu85 90 95 100GluAspProGlyIle CysArgGlyTyrIle ThrArgTyrPheTyr AsnAsnGlnThrLys105 110 115 120GlnCysGluArgPhe LysTyrGlyGlyCys LeuGlyAsnMetAsn AsnPheGluThrLeu125 130 135 140GluGluCysLysAsn IleCysGluAspGly ProAsnGlyPheGln VlaAspAsnTyrGly145 150 155 160ThrGlnLeuAsnAla VlaAsnAsnSerLeu ThrProGlnSerThr LysVlaProSerLeu165 170 175 180PheGluPheHisGly ProSerTrpCysLeu ThrProAlaAspArg GlyLeuCysArgAla185 190 195 200AsnGluAsnArgPhe TyrTyrAsnSerVla IleGlyLysCysArg ProPheLysTyrSer205 210 215 220GlyCysGlyGlyAsn GluAsnAsnPheThr SerLysGlnGluCys LeuArgAlaCysLys225 230 235 240LysGlyPhelleGln ArgIleSerLysGly GlyLeuIleLysThr SerSerSerSerSer245 250 255 260SerGlnArgVlaLys IleAlaTyrGluGlu IlePheVlaLysAsn Met265 270 27权利要求
1.一种人类组织因子途径抑制因子突变基因m2TFPI，其特征是它具有序列表中SEQ ID No.1所述的核苷酸序列。
2.一种由人类组织因子途径抑制因子突变基因m2TFPI编码的多肽，其特征是它具有序列表中SEQ ID No.2所述的氨基酸序列。
3.一种包含权利要求1人类组织因子途径抑制因子突变基因m2TFPI的重组载体，它是将人类组织因子途径抑制因子突变基因m2TFPI DNA用XhoI和EcoRI消化的片段与pPIC9载体，加入T4连接酶，进行连接反应，制成m2TFPI-pPIC9。
4.一种利用权利要求3人类组织因子途径抑制因子突变基因m2TFPI的重组载体转化的重组酵母菌，它是将含有人类组织因子途径抑制因子突变基因m2TFPI的重组载体导入宿主毕赤酵母菌6S115，成为GS115/m2TFPI-pPIC9。
全文摘要
本发明公开了一种人类组织因子途径抑制因子突变基因m
文档编号C12N15/81GK1924016SQ20061001565
公开日2007年3月7日 申请日期2006年9月14日 优先权日2006年9月14日
发明者冷希岗, 余波, 张海玲, 刘兰霞, 宋丽萍 申请人:中国医学科学院生物医学工程研究所