专利名称：用于检测对虾白斑综合症病毒的引物序列及检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术中的DNA序列，使用该序列对一种病毒进行检测的试剂盒，特别是涉及一种用于检测对虾病毒的引物序列及检测试剂盒。
背景技术：
上世纪80年代以来，我国水产业迅速发展，并且在农业产值中所占的比重逐年上升，已成为我国农业的四大支柱产业之一。但令人遗憾的是水生动物疾病，尤其是因病毒引起的暴发性流行病明显增多，危害极为严重。在1992年，由于对虾白斑综合症病毒的蔓延与流行，给水产养殖业造成了上亿元的经济损失。
水生动物病毒病具有潜伏期长短不一、症状复杂多变、传染性强和导致高死亡率的特点。特别是病毒个体微小，侵染动物后在宿主细胞内复制，而抗生素对病毒基本无抑制作用，而化学药物在杀灭病毒前就可能使宿主动物受损或致死。由于水生动物水生的特性和病毒的细胞内寄生的特性，要从根本上消除细胞内的病毒而不影响宿主细胞在目前是不可能的。因此必须做好水生动物病毒病的预防工作，做好此项工作的基础就是要建立病毒的快速诊断与检测技术。
对病毒病检测技术的研究多依赖于对病毒病病理和病原的研究基础，主要采用的方法有形态学、组织病理学、免疫学等研究方法。主要包括现场目视观察法、生物测定法、光学显微镜检查法、电子显微镜检查法、免疫荧光检查法等。这些方法耗时长，且大多要依靠经验判断，这对病毒的检测造成了一定的困难。
多聚酶链式反应(Polymerase chain reaction，简称PCR)技术检测灵敏度高，特异性强，检验周期短，操作相对简便。但目前尚无用此种方法对对虾白斑综合症病毒快速诊断与检测的报导。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种用于检测对虾白斑综合症病毒的引物序列。
本发明的第二个目的是提供一种对养殖南美白对虾、中国对虾、斑节对虾等的对虾白斑综合症病毒进行跟踪监测，并具有简便、快速、灵敏、特异特点的对虾白斑综合症病毒检测试剂盒。
本发明的技术方案概述如下一种用于检测对虾白斑综合症病毒的引物序列，它由上游引物和下游引物组成，所述上游引物具有序列表中SEQ ID No1所述的核苷酸序列，所述下游引物具有序列表中SEQID No2所述的核苷酸序列。
一种对虾白斑综合症病毒检测试剂盒，由下述试剂组成试剂A将1-3g的十六烷基三甲基溴化胺加入100ml的水，使其中含有0.5-2.5M NaCl、10-30mM乙二胺四乙酸和10-30mM羟基甲基氨基甲烷-盐酸，调节pH＝7.5制成；试剂B浓度为0.05g/mL-0.5g/mL的硅胶水溶液；试剂C体积百分浓度为60％-90％的乙醇水溶液；试剂D将10倍PCR反应缓冲液2.5-5.0μL、Taq DNA聚合酶1-2.5U、灭菌双蒸水12-18μL混合制成；试剂E将10μM SEQ ID No1所述的核苷酸序列0.2-1.0μL，10μM SEQ ID No2所述的核苷酸序列0.2-1.0μL，10mM dNTPs 0.2-0.8μL，25mM MgCl21.5-3.5μL混合制成；试剂F对虾白斑综合症病毒的基因组总DNA；试剂G灭菌双蒸水；试剂H取50mL 20倍TBE电泳缓冲液，使其中含有0.09mol羟基甲基氨基甲烷-硼酸，2mmol乙二胺四乙酸制成；试剂I0.3-0.6g琼脂糖，使其中含溴化乙锭15-30μg。
一种对虾白斑综合症病毒检测试剂盒，优选的方案是试剂A为将2g的十六烷基三甲基溴化胺加入100ml的水，使其中含有1.4M NaCl、20mM乙二胺四乙酸和20mM羟基甲基氨基甲烷-盐酸，调节pH＝7.5制成；试剂B为浓度为0.3g/mL的硅胶水溶液；试剂C为体积百分浓度为75％的乙醇水溶液；试剂D为将10倍PCR反应缓冲液2.5μL、Taq DNA聚合酶1.25U、灭菌双蒸水16.75μL混合制成；试剂E为将10μM SEQ ID No1所述的核苷酸序列0.5μL，10μM SEQ ID No2所述的核苷酸序列0.5μL，10mM dNTPs 0.5μL，25mM MgCl22.5μL混合制成；试剂F对虾白斑综合症病毒的基因组总DNA；试剂G灭菌双蒸水；试剂H取50mL 20倍TBE电泳缓冲液，使其中含有0.09mol羟基甲基氨基甲烷-硼酸，2mmol乙二胺四乙酸制成；试剂I为0.3g琼脂糖，使其中含溴化乙锭20μg。
对虾白斑综合症病毒的基因组总DNA是用下述方法提取的用灭菌剪刀取已感染对虾白斑综合症病毒的对虾的鳃丝50-100mg，置于灭菌的1.5mlEppendorf管内，加入150μL质量百分比为1％的十六烷基三甲基溴化胺水溶液，充分剪碎组织，加700μL质量百分比为1％的十六烷基三甲基溴化胺水溶液，25℃作用2h，加入600μL体积比为25∶24∶1的苯酚/氯仿/异戊醇，混匀30s，经12000r/m离心5min，取上层水相，加入700μL体积比为24∶1的氯仿/异戊醇，混匀30s，12000r/m离心5min，取上层水相，加入两倍体积的-20℃无水乙醇，沉淀8-12小时，15000r/m离心30min，弃掉上清液，晾干，100ul灭菌双蒸水溶解，-20℃保存。
本发明的优点利用对虾白斑综合症病毒的基因保守序列设计一对引物，优化PCR反应条件和反应体系，建立起检测对虾白斑综合症病毒的PCR检测方法，在此基础上装配出简便、快速、灵敏、特异的一种对虾白斑综合症病毒检测试剂盒，该试剂盒可用于对养殖南美白对虾、中国对虾、斑节对虾等的对虾白斑综合症病毒的跟踪监测，具有很高的实用价值。
图1为检测对虾白斑综合症病毒电泳结果图。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1一种用于检测对虾白斑综合症病毒的引物序列，是它由上游引物和下游引物组成，所述上游引物具有序列表中SEQ ID No1所述的核苷酸序列，所述下游引物具有序列表中SEQID No2所述的核苷酸序列。
序列表SEQ ID No15’--CCAAGACATACTAGCGGATA--3’SEQ ID No25’--GACGACCCTGACAGAATTAC--3’实施例2一种对虾白斑综合症病毒检测试剂盒，由下述试剂组成试剂A为将2g的十六烷基三甲基溴化胺加入100ml的水，使其中含有1.4M NaCl、20mM乙二胺四乙酸(EDTA)和20mM羟基甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)，调节pH＝7.5制成；试剂B为浓度为0.3g/mL的硅胶水溶液；试剂C为体积百分浓度为75％的乙醇水溶液；(试剂A、试剂B和试剂C为对虾白斑综合症病毒基因组DNA提取试剂)试剂D(PCR反应预混试剂)将10倍PCR反应缓冲液2.5μL、Taq DNA聚合酶1.25U、灭菌双蒸水16.75μL混合制成；试剂E(PCR反应引物试剂)将10μM SEQ ID No1所述的核苷酸序列0.5μL，10μM SEQ ID No2所述的核苷酸序列0.5μL，10mM dNTPs 0.5μL，25mM MgCl22.5μL混合制成；试剂F(阳性对照)对虾白斑综合症病毒的基因组总DNA；对虾白斑综合症病毒的基因组总DNA是用下述方法提取的用灭菌剪刀取已感染对虾白斑综合症病毒的对虾的鳃丝100mg，置于灭菌的1.5mlEppendorf管内，加入150μL质量百分比为1％的十六烷基三甲基溴化胺水溶液，充分剪碎组织，加700μL质量百分比为1％的十六烷基三甲基溴化胺水溶液，25℃作用2h，加入600μL体积比为25∶24∶1的苯酚/氯仿/异戊醇，混匀30s，经12000r/m离心5min，取上层水相，加入700μL体积比为24∶1的氯仿/异戊醇，混匀30s，12000r/m离心5min，取上层水相，加入两倍体积的-20℃无水乙醇，沉淀10小时，15000r/m离心30min，弃掉上清液，晾干，100ul灭菌双蒸水溶解，-20℃保存。
试剂G(空白对照)灭菌双蒸水；(二次蒸馏水)试剂H(电泳试剂)取50mL 20倍TBE电泳缓冲液，使其中含有0.09mol羟基甲基氨基甲烷-硼酸(Tris-硼酸)，2mmol乙二胺四乙酸制成(按此比例，可获得任何体积的试剂H)；试剂I(显色试剂)0.3g琼脂糖，使其中含溴化乙锭20μg。
灭菌牙签一包。
实施例3一种对虾白斑综合症病毒检测试剂盒的检测对虾白斑综合症病毒的步骤1、无菌状态下取待检样品组织约50-100mg，加入200μL试剂A，用灭菌牙签捣碎1-2min；2、12000rpm/min离心3min，取上清，加入20μL试剂B(用前需摇匀)，室温放置3-5min，其间不断摇匀；3、10000rpm/min离心30sec，弃掉上清液，加入200μL试剂C，10000rpm/min离心30sec，弃掉上清液；4、打开离心管盖，放置60℃3min，加20μL试剂G悬浮沉淀，稍离心，取上清作为PCR反应的模板；5、PCR扩增取19μL试剂D与4μL试剂E混合，加入2μL PCR反应模板(用20μL试剂G溶解的试剂F)，同时取2μL试剂F和试剂G分别加入另外两个19μL试剂D与4μL试剂E混合的PCR反应管中，分别作为阳性对照和空白对照，在PCR仪上进行扩增，反应条件为94℃ 4min预变性，94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min，29个循环，72℃10min，4℃保存；6、反应结束后，取试剂H用蒸馏水做40倍稀释。将试剂I倒入100mL的三角瓶内，加入稀释后的试剂H，加热，直至溶液清亮，稍冷却，倒入制胶槽；7、取5-10μL PCR反应产物加2μL上样缓冲液，经1％琼脂糖凝胶电泳30-35min后于紫外仪上观察。若在235bp处出现反应条带，则为对虾白斑综合症病毒阳性，若无条带为阴性，阳标应在235bp处出现反应条带，空白应无反应条带(见图1，图中1为235bp处)。
本试剂盒所建立的PCR方法可在5-6h内从病料中检测出对虾白斑综合症病毒。
本发明主要涉及对象为养殖南美白对虾、中国对虾、斑节对虾等的病原对虾白斑综合症病毒(white spot sydrome virus，简称WSSV)。对虾白斑综合症病毒是采用中华人民共和国质量监督检验检疫总局发布的中华人民共和国出入境检验检疫行业标准中的对虾白斑病毒聚合酶链式反应(PCR)检测方法进行检测的。
实施例4一种对虾白斑综合症病毒检测试剂盒，由下述试剂组成试剂A将1g的十六烷基三甲基溴化胺加入100ml的水，使其中含有0.5M NaCl、10mM乙二胺四乙酸和10mM羟基甲基氨基甲烷-盐酸，调节pH＝7.5制成；试剂B浓度为0.05g/mL的硅胶水溶液；试剂C体积百分浓度为90％的乙醇水溶液；试剂D将10倍PCR反应缓冲液2.5μL、Taq DNA聚合酶1U、灭菌双蒸水12μL混合制成；试剂E将10μM SEQ ID No1所述的核苷酸序列0.2μL，10μM SEQ ID No2所述的核苷酸序列0.2μL，10mM dNTPs 0.2μL，25mM MgCl21.5μL混合制成；试剂F对虾白斑综合症病毒的基因组总DNA；试剂G灭菌双蒸水；试剂H取50mL 20倍TBE电泳缓冲液，使其中含有0.09mol羟基甲基氨基甲烷-硼酸，2mmol乙二胺四乙酸制成；试剂I0.3琼脂糖，使其中含溴化乙锭15μg。
实施例5一种对虾白斑综合症病毒检测试剂盒，由下述试剂组成试剂A将3g的十六烷基三甲基溴化胺加入100ml的水，使其中含有2.5M NaCl、30mM乙二胺四乙酸和30mM羟基甲基氨基甲烷-盐酸，调节pH＝7.5制成；试剂B浓度为0.05g/mL的硅胶水溶液；试剂C体积百分浓度为60％的乙醇水溶液；试剂D将10倍PCR反应缓冲液5.0μL、Taq DNA聚合酶2.5U、灭菌双蒸水18μL混合制成；试剂E将10μM SEQ ID No1所述的核苷酸序列1.0μL，10μM SEQ ID No2所述的核苷酸序列1.0μL，10mM dNTPs 0.8μL，25mM MgCl23.5μL混合制成；试剂F对虾白斑综合症病毒的基因组总DNA；试剂G灭菌双蒸水；试剂H取100mL 20倍TBE电泳缓冲液，使其中含有0.18mol羟基甲基氨基甲烷-硼酸，4mmol乙二胺四乙酸制成；试剂I0.6g琼脂糖，使其中含溴化乙锭30μg。
权利要求
1.一种用于检测对虾白斑综合症病毒的引物序列，其特征是它由上游引物和下游引物组成，所述上游引物具有序列表中SEQ ID No1所述的核苷酸序列，所述下游引物具有序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸序列。
2.一种对虾白斑综合症病毒检测试剂盒，其特征是由下述试剂组成试剂A将1-3g的十六烷基三甲基溴化胺加入100ml的水，使其中含有0.5-2.5M NaCl、10-30mM乙二胺四乙酸和10-30mM羟基甲基氨基甲烷-盐酸，调节pH＝7.5制成；试剂B浓度为0.05g/mL-0.5g/mL的硅胶水溶液；试剂C体积百分浓度为60％-90％的乙醇水溶液；试剂D将10倍PCR反应缓冲液2.5-5.0μL、Taq DNA聚合酶1-2.5U、灭菌双蒸水12-18μL混合制成；试剂E将10μM SEQ ID No1所述的核苷酸序列0.2-1.0μL，10μM SEQ ID No2所述的核苷酸序列0.2-1.0μL，10mM dNTPs 0.2-0.8μL，25mM MgCl21.5-3.5μL混合制成；试剂F对虾白斑综合症病毒的基因组总DNA；试剂G灭菌双蒸水；试剂H取50mL 20倍TBE电泳缓冲液，使其中含有0.09mol羟基甲基氨基甲烷-硼酸，2mmol乙二胺四乙酸制成；试剂I0.3-0.6g琼脂糖，使其中含溴化乙锭15-30μg。
3.根据权利要求2所述的一种对虾白斑综合症病毒检测试剂盒，其特征是所述试剂A为将2g的十六烷基三甲基溴化胺加入100ml的水，使其中含有1.4M NaCl、20mM乙二胺四乙酸和20mM羟基甲基氨基甲烷-盐酸，调节pH＝7.5制成；所述试剂B为浓度为0.3g/mL的硅胶水溶液；所述试剂C为体积百分浓度为75％的乙醇水溶液；所述试剂D为将10倍PCR反应缓冲液2.5μL、Taq DNA聚合酶1.25U、灭菌双蒸水16.75μL混合制成；所述试剂E为将10μM SEQ ID No1所述的核苷酸序列0.5μL，10μM SEQ ID No2所述的核苷酸序列0.5μL，10mM dNTPs 0.5μL，25mM MgCl22.5μL混合制成；所述试剂I为0.3g琼脂糖，使其中含溴化乙锭20μg。
4.根据权利要求2或3所述的一种对虾白斑综合症病毒检测试剂盒，其特征是所述对虾白斑综合症病毒的基因组总DNA是用下述方法提取的用灭菌剪刀取已感染对虾白斑综合症病毒的对虾的鳃丝50-100mg，置于灭菌的1.5ml Eppendorf管内，加入150μL质量百分比为1％的十六烷基三甲基溴化胺水溶液，充分剪碎组织，加700μL质量百分比为1％的十六烷基三甲基溴化胺水溶液，25℃作用2h，加入600μL体积比为25∶24∶1的苯酚/氯仿/异戊醇，混匀30s，经12000r/m离心5min，取上层水相，加入700μL体积比为24∶1的氯仿/异戊醇，混匀30s，12000r/m离心5min，取上层水相，加入两倍体积的-20℃无水乙醇，-20℃沉淀8-12小时，15000r/m离心30min，弃掉上清液，晾干，100ul灭菌双蒸水溶解，-20℃保存。
全文摘要
本发明公开了一种用于检测对虾白斑综合症病毒的引物序列及检测试剂盒，试剂盒组成是，试剂A十六烷基三甲基溴化胺加水，使含有NaCl、EDTA和Tris－HCl；试剂B硅胶水溶液；试剂C乙醇水溶液；试剂D将PCR反应缓冲液、Taq DNA聚合酶、灭菌双蒸水混合；试剂E将SEQ ID No1、SEQ ID No2序列，dNTPs，MgCl
文档编号C12Q1/68GK1944666SQ200610016169
公开日2007年4月11日 申请日期2006年10月19日 优先权日2006年10月19日
发明者孙金生, 薛淑霞, 刘爽 申请人:天津市水产研究所