专利名称：中药川木通聚合酶链反应鉴定引物、试剂盒及鉴定方法
技术领域：
本发明涉及中药川木通的鉴定，具体地，是采用聚合酶链反应鉴定引物进行中药 材鉴定，属药物领域。
背景技术：
川木通为常用中药，有清热利尿，通经下乳等功能，药用历史悠久，《中华人民 共和国药典》(一部)2005年版收载为毛茛科铁线莲属植物小木通(C7e挑fl他.a/7Mfl/irf/i Franch.)或绣球藤(C. 3/o"tomi Buch-Ham)的茎。但是毛茛科13余种植物的茎藤在 不同的地区都不同程度的被作为川木通用，药材使用混杂，关系临床用药的安全有效。 由于市场流通的川木通类药材都为毛茛科铁线莲属植物，药材本身相似性大，常规鉴 定区别困难，且不准确。缺乏有效的鉴别方法，造成市场流通混乱，为临床应用带来 隐患。基于植物DNA序列的分子标记技术适合于物种鉴别，因此急需'建立一种可靠的 分子标记技术对〗11木通进行鉴定的方法。
目前，在分子标记技术在动植物品种鉴别方面得到广泛的应用。在药材鉴定方面， 已经成功应用聚合酶链反应技术(PCR)用于龟甲等中药的鉴别。但是，这种方法对 不同的中药材，鉴定的引物和鉴定的方法都不相同。
发明内容
本发明的技术方案是提供了中药川木通的鉴定方法，具体地，是中药川木通聚合 酶链反应鉴定引物进行鉴定；本发明还提供了含有该鉴定引物的试剂盒。
本发明提供了一种中药川木通聚合酶链反应鉴定引物，其中，鉴定引物DNA序列 为上游引物5'-TGCCCAGCCTGCACAAGA-3'，下游引物 5'-TGCCCAGCCTCAACAGTGT-3'，引物合成采用全自动DNA合成仪进行合成。
本发明还提供了使用该鉴定引物对中药川木通进行鉴定的方法，它包括如下鉴定 步骤
① 药材DNA提取按照常规方法进行提取(如改进的CTAB法，见干滟，曾凡亚， 赵云等，油菜单株总DNA的快速制备，四川大学学报.1999.36(5):936-939.)，提取后 采用紫外分光光度法测定DNA浓度后稀释到80-100ng/pl。 .
② 模板DNA质量的鉴定采用琼脂糖电泳分析法结合紫外分光光度法进行检测， 提取得到的DNA样品用2y。的琼脂糖电泳分析鉴定;得到的条带应该为一条亮的条带， 无拖尾现象；紫外分光光度法测定A260/A280等于1.8，表明DNA纯度较高，可以进 行PCR扩增；
③ 鉴别性PCR:以反应体系为25fil计算，PCR体系中试剂的用量为 10xPCR反应缓冲液 2-3pl
25mM的MgCl2 1.5-3.0^1 2.5mM的dNTP 1.0-2.5^1
上游引物、下游引物各 0.5-1.5^U TaqDNA聚合酶 1个单位
供试DNA模板 1.0-2.0^1
去离子水 加到25jll;
在该范围内可以进行正常的PCR反应获得清晰的条带。
④ PCR循环在PCR仪上，94'C预变性5min，然后按下列参数进入30个循环 变性94。C: 30-45 s
复性50-55'C: 30-45s 延伸72。C: 30-45 s，
循环结束后72'C保持5-10min;
⑤ 电泳检测取出PCR反应缓冲液5jU与10x加样缓冲液0.5^1混合，2%琼脂糖 凝胶电泳，用含0.005%的溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果；
其中加样缓冲液是电泳专用加样缓冲液，均采用市售产品。
如PCR反应体积不为25^1，反应物品的用量以25^1反应剂量的比例为参考点，
相应的增加或减少；
若扩增有条带，则供试品为川木通；若无扩增条带，则供试品不为川木通。 其中，供试DNA模板和阳性对照品(川木通DNA模板)均为按相同的常规方
法提取总DNA。
进一步地，所述的鉴别性PCR，以反应体系为25^1计算，PCR体系中试剂的用
量为
10xPCR反应缓冲液 2.5^ 25mM的MgCl2
2.5mM的dNTP 1.5jU 上游引物、下游引物各 1.0^1 TaqDNA聚合酶 1个单位
供试DNA模板 1.0^1 去离子水加到 25jU。
本发明还提供了该鉴定引物在制备中药川木通聚合酶链反应试剂盒中的应用。
本发明提供了一种用于鉴定中药川木通真伪的试剂盒，包括下列部分
a、特异性鉴定引物上游引物5'-TGCCCAGCCTGCACAAGA-3'，下游引物
5'-TGCCCAGCCTCAACAGTGT陽3'，各U)fig/ml;
b、阳性对照品川木通DNA模板。 ' 进一歩地，还包括下列部分
10xPCR反应缓冲液、25mM的MgCI2、 2.5mM的dNTP、 TaqDNA聚合酶。
本发明解决了川木通的正品鉴别难题。发明人在对川木通的鉴别中，设计了鉴别 川木通的-对高特异性引物，该鉴定引物在给定的PCR条件下，只能特异性的鉴别川 木通，而对川木通的混淆品不能扩增出片段。当供试样品用本鉴定引物进行PCR扩增 后，经琼脂糖电泳检测有无扩增条带的出现，可准确的判定药材的真伪，且本发明鉴 定方法稳定性强，重现性高，
本发明对于中药材收购、销售、中药生产、销售部门快速、准确的鉴别川木通药 材，搞好药材质量控制是非常必要的，对于药检部门打击假冒伪劣，净化药材市场具 有十分重要的意义。
图l:特异性鉴定引物扩增市售川木通品种电泳图仅l、 2号正品川木通出现条 带，可以快速鉴别川木通的真伪。其中，l:小木通(川木通正品)2:绣球藤(川木通
正品)3:钝萼铁线莲；4:粗齿铁线莲5:甘川铁线莲6:铁线莲7:毛果铁线莲8:
山木通9:威灵仙；10:尾叶铁线莲。
具体实施例方式
实施例1本发明试剂盒的制备
a、 特异性鉴定引物上游引物5'-TGCCCAGCCTGCACAAGA-3'，下游引物 5'-TGCCCAGCCTCAACAGTGT-3'，引物合成采用全自动DNA合成仪进行合成；各
l一；
b、 阳性对照品川木通DNA模板1.0jll;
c、 TaqDNA聚合酶l个单位、10xPCR反应缓冲液、MgCl2、 dNTP;
d、 DNA提取试剂；(本发明采用的试剂均采用市售常规试剂)
其中，10xPCR反应缓冲液2.5pl、 25mM的MgCl22.0jil、 2.5mM的dNTP 1.5pl。 实施例2本发明试剂盒的制备
a、 特异性鉴定引物上游引物5'-TGCCCAGCCTGCACAAGA-3'，下游引物 5'-TGCCCAGCCTCAACAGTGT-3'，引物合成采用全自动DNA合成仪进行合成；各
b、 阳性对照品川木通DNA模板l.O(ll;
c、 TaqDNA聚合酶l个单位、10xPCR反应缓冲液、MgCl2、 dNTP (市售)；
d、 DNA提取试剂(市售);
其中，IOxPCR反应缓冲液2^1、 25mM的MgCl21.5nl、 2.5mM的dNTP l.Opl 。
实施例3本发明试剂盒的制备
a、 特异性鉴定引物上游引物5'-TGCCCAGCCTGCACAAGA-3',下游引物 5'-TGCCCAGCCTCAACAGTGT-3'，引物合成采用全自动DNA合成仪进行合成；各
b、 阳性对照品川木通DNA模板2.0fll;
c、 TaqDNA聚合酶l个单位、10xPCR反应缓冲液、MgCl2、 dNTP (市售)；
d、 DNA提取试剂(市售)；
其中，10xPCR反应缓冲液3^1、 25mM的MgCl2 3.0pl、 2.5mM的dNTP 2.5jil。
实施例4本发明中药川木通的鉴定方法 采用实施例1制备的试剂盒进行以下鉴定试验。
首先从市售川木通药材不同种的原植物中提取总DNA，用RAPD方法从160对引 物中筛选出可以进行良好扩增的10条引物进行分别扩增，扩增出多个基因片段，选取 仅存在于川木通正品小木通和绣球藤中存在的条带进行胶回收连接转化到pMD18-T 载体中后进行DNA测序，根据测序结果分别在原有随机引物的基础上延伸后设计不同 的引物(20bp左右)，分别用所有市售已经正确鉴定品种的DNA作为模板进行PCR 扩增，抛弃假阳性引物(可以在非川木通品种上扩增出条带的)，选取一对阳性PCR 引物作为最终的鉴别性引物，该引物可以在川木通正品(小木通和绣球藤)中扩增出 478bp的片段，其他品种不能扩增出片段。
上游引物5'-TGCCCAGCCTGCACAAGA-3'
下游引物5'-TGCCCAGCCTCAACAGTGT國3'
引物合成采用国际通用的全自动DNA合成仪进行合成，IODI管，每管稀释到 lO^ig/ml即可用于PCR鉴定反应。
① 药材DNA提取按照常规方法进行，提取后采用紫外分光广度法测定DNA 浓度后稀释到80-100ng^l;比如改进的CTAB法，见干滟，曾凡亚，赵云等，油菜单 株总DNA的快速制备，四川大学学报.1999.36(5):936-939.。
② 模板DNA质量的鉴定采用琼脂糖电泳分析法结合紫外分光光度法进行检测， 提取得到的DNA样品用2V。的琼脂糖电泳分析，得到的条带应该为一条亮的条带，无 拖尾现象；紫外分光光度法测定A260/A280约等于1.8，表明DNA纯度较高，可以进 行PCR扩增。
(D鉴别性PCR:以反应体系为25pl计算，PCR体系中各种试剂的用量为 10xPCR反应缓冲液 2.5nl MgCl2(25mM) 2%1
dNTP (2.5mM) 1.5jil 上游、下游引物 l.Ojd TaqDNA聚合酶 1个单位
供试DNA模板 l.Opl 去离子水 加到25^1
PCR循环在PCR仪上，94。C予变性5min，然后按下列参数进入30个循环 变性94。C: 30-45 s
复性50-55。C: 30-45s 延伸72。C: 30-45 s，
循环结束后72。C保持5-10min。
⑤电泳检测取出PCR反应液5H1与lOx加样缓冲液0.5^1混合，2%琼脂糖凝胶 电泳检测(含0.005%的溴化乙锭)扩增结果。
如果出现条带，就为正品川木通，反之，则不是正品川木通。实结结果见图1。 实施例5本发明中药川木通的鉴定方法 采用实施例2制备的试剂盒进行以下鉴定试验
方法同实施例2，其中，③鉴别性PCR:以反应体系为25^1计算，PCR体系中
试剂的用量为
10xPCR反应缓冲液 2^1 25mM的MgCl2 1.5^1 2.5mM的dNTP 1.0^1 上游引物、下游引物各 0.5^1 TaqDNA聚合酶 1个单位
供试DNA模板 l.Opl 去离子水 加到25^1。
实施例6本发明中药川木通的鉴定方法
采用实施例3制备的试剂盒进行以下鉴定试验，试验方法同实施例2，其中，③ 鉴别性PCR:以反应体系为25jU计算，PCR体系中试剂的用量为 10xPCR反应缓冲液 3^1 25mM的MgCl2 3.0fU 2.5mM的dNTP 2.5pl 上游引物、下游引物各 1.5^1 TaqDNA聚合酶 1个单位
供试DNA模板 2.0fil 去离子水 加到25fil。
实施例5和实施例6均可以进行正常的PCR反应获得清晰的条带。
权利要求
1、一种中药川木通聚合酶链反应鉴定引物，其特征在于鉴定引物DNA序列为上游引物5′-TGCCCAGCCTGCACAAGA-3′，下游引物5′-TGCCCAGCCTCAACAGTGT-3′。
2、 一种使用权利要求l所述的鉴定引物对中药川木通进行鉴定的方法，它包括如下鉴定步骤① 提取药材DNA，提取后采用紫外分光光度法测定DNA浓度后稀释到 80-100ng/jil;② 模板DNA质量的鉴定采用琼脂糖电泳分析法结合紫外分光光度法进行检测， 提取得到的DNA样品用2%的琼脂糖电泳分析鉴定；③ 鉴别性PCR:以反应体系为25^1计算，PCR体系中试剂的用量为 10xPCR反应缓冲液 2-3^U25mM的MgCh 1.5-3.0^1 2.5mM的dNTP 1.0-2.5fi1 上游引物、下游引物各 0.5-1.5jU TaqDNA聚合酶 1个单位供试DNA模板 1.0-2.0^1 去离子水 加到25pl; PCR循环在PCR仪上，94。C预变性5min，然后按下列参数进行30个循环 变性94。C: 30-45 s复性50-55 。C: 30-45s 延伸72。C: 30-45 s，循环结束后72'C保持5-10min;⑤电泳检测取出PCR反应液5fi1与10x加样缓冲液0.5^1混合，用含0.005%的溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果；如PCR反应体积不为25nl，反应物品的用量以25^1反应剂量的比例为参考点，相应的增加或减少；若扩增有条带，则供试品为川木通；若无扩增条带，则供试品不为川木通。
3、根据权利要求2所述的使用鉴定引物对中药川木通进行鉴定的方法，其特征在于所述的鉴别性PCR，以反应体系为25pl计算，PCR体系中试剂的用量为 10xPCR反应缓冲液 2.5nl25mM的MgCh 2.0jil2.5mM的dNTP 1.5jil上游引物、下游引物各 l.O^ilTaqDNA聚合酶 1个单位供试DNA模板 l.Ofil去离子水加到 25^1。
4、 权利要求1所述的鉴定引物在制备中药川木通聚合酶链反应试剂盒中的应用。
5、 一种用于鉴定中药川木通真伪的试剂盒，其特征在于含权利要求1所述的 鉴定引物。
6、 根据权利要求5所述的用于鉴定中药川木通真伪的试剂盒，其特征在于它 包括下列部分-a 、鉴定引物鉴定引物DNA序列为上游引物 5-TGCCCAGCCTGCACAAGA-3'，下游引物5-TGCCCAGCCTCAACAGTGT誦3'; b、阳性对照品川木通DNA模板。
7、 根据权利要求6所述的用于鉴定中药川木通真伪的试剂盒，其特征在于还 包括下列部分lOxPCR反应缓冲液、25mM的MgCl2、 2.5mM的dNTP、 TaqDNA聚合酶。
全文摘要
本发明涉及一种中药川木通聚合酶链反应鉴定引物，鉴定引物DNA序列为上游引物5′-TGCCCAGCCTGCACAAGA-3′，下游引物5′-TGCCCAGCCTCAACAGTGT-3′。本发明还提供了采用该鉴定引物对中药川木通进行鉴定的方法及鉴定中药川木通真伪的试剂盒。本发明解决了川木通的正品鉴别难题。发明人在对川木通的鉴别中，设计了鉴别川木通的一对高特异性引物，该鉴定引物在给定的PCR条件下，只能特异性的鉴别川木通，而对川木通的混淆品不能扩增出片段。当供试样品用本鉴定引物进行PCR扩增后，经琼脂糖电泳检测有无扩增条带的出现，即可准确的判定药材的真伪。
文档编号C12Q1/68GK101182569SQ20061002242
公开日2008年5月21日 申请日期2006年12月6日 优先权日2006年12月6日
发明者万德光, 国锦琳 申请人:成都中医药大学