专利名称：一种检测copd的snp的pcr试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和医学领域。更具体地涉及SMAD3基因的单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，缩写为SNP)及其与慢性阻塞性肺部疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，缩写为COPD)的相关性，涉及检测这些SNP的试剂盒。
背景技术：
慢性阻塞性肺疾病(COPD)是具有气流受限特征的疾病，且气流受限不完全可逆，可伴有气道高反应性，并呈进行性发展，与肺部对有害气体或有害颗粒的异常炎症反应有关。COPD患病率和病死率之高日益引起人们的重视，COPD居世界当前死亡原因的第4位，据推测，到2020年，全球范围内对社会造成危害最大的疾病中COPD将排至第5位。美国2001年有288万人死于COPD，并且发病率不断呈上升趋势。我国COPD的发病率也呈上升趋势，近年来对我国北部及中部地区农村102230成年人群进行调查时发现，我国15岁以上人群的COPD发病率约为3.17％。每年约有100万人死于COPD。
COPD的诊断应根据病史、症状、体征、肺功能检查和影像检查综合分析确定，但存在不完全可逆性气流受限是诊断COPD的必备条件。目前常用的诊断方法包括(1)当患者有咳嗽、咯痰、呼吸困难症状和(或)有危险因素接触史时，应考虑COPD，但须经肺功能检查明确诊断。慢性咳嗽、咳痰常先于气流受限存在许多年，但不是所有有咳嗽、咳痰症状的患者均会发展为COPD，少数患者仅有不可逆性气流受限改变而无慢性咳嗽、咳痰症状。
(2)体征早期体征可不明显，随着病情进展可出现桶状胸，肺部叩诊过清音，听诊双肺呼吸音减弱，呼气时间延长，可闻及湿性啰音。
(3)肺功能检查。肺功能检查对于COPD的诊断、病情严重程度评估、病情进展、治疗反应、预后判断均有重要的临床意义，是诊断COPD的金标准。吸入支气管扩张剂后，FEV小于80预计值，同时FEV/FVC小于70时，表明存在气流受限，并且不能完全逆转，可诊断为COPD。
(4)COPD的影像诊断。影像检查对确定肺部过度充气和并发症及与其它肺部疾病鉴别有重要意义。常规胸片征象主要表现为双肺纹理增多，当出现肺气肿时，肺透光度增加，横膈低平，肺门血管纹理呈残根状，肺野外围血管纤细，数目减少等。但常规胸片对肺气肿的早期诊断价值有限，其主要作用是用于确定肺部过度充气的程度及其与其它疾病的鉴别诊断。CT检查尤其是高分辨率CT(HRCT)是诊断肺气肿最敏感的影像学检查方法，对明确肺气种的类型、分布和严重程度均优于常规胸片。肺气肿的CT表现为无壁和壁很薄的肺组织透亮区，气肿腔与周围正常组织分界清楚。但受层厚和照射剂量的影响，CT(HRCT)不能用于对全肺的评估，对慢性支气管炎的诊断价值有限。
众所周知，COPD是遗传因素和环境因素共同作用的结果。遗传因素，现已证明的是α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)缺乏；环境危险因素，主要是吸烟因素。COPD患者中有85％为长期吸烟者，然而仅有10％～20％的人发展为有症状的COPD患者，说明个体对COPD的易感性不同，而这种易感性是基因多态性的表型。国内外学者对于COPD的易感性做了大量的研究，探讨了基因多态性在COPD发生发展中的作用。
但是，还没有报道SMAD基因与慢性阻塞性肺疾病(COPD)之间的相关性报道的研究，更没有证实SMAD基因的单核苷酸多态性(SNP)与慢性阻塞性肺疾病(COPD)之间相关性的报道。
已经有研究表明TGF-β1(转化生长因子-β1)在COPD疾病的发生发展中起到非常重要的作用。而TGF信号主要由Smad家族介导，TGF-β作为配体形成受体复合物，激活Smad进入核，共同激活或抑制它们调节的靶基因的转录。
在哺乳类中共发现了有8种不同的Smad蛋白，这些蛋白可分为3个不同的亚族R-Smad(receptor-regulated Smads)；Co-Smad(common-partner Smads)和I-Smad(inhibitory Smads)。R-Smad亚族可以进一步分为两组，即BMP-Smad和TGF-β/activin-Smad。Smad1、Smad5、Smad8是由BMP型受体(ALK22、ALK23和ALK26)和ALK21磷酸化；Smad2和Smad3是由TGF-β/activin型受体(ALK25和ALK24)和孤儿受体ALK27所活化。Co-Smad可以与所有磷酸化的R-Smad形成异聚复合体，所以它是TGF-β/activin和BMP信号转导通路上的共享成分。迄今为止，在哺乳类中只发现了一种Co-Smad，即Smad4。I-Smad，即Smad6、Smad7，通过阻断R-Smad与Co-Smad的激活而抑制TGF-B超家族的信号转导。Smad蛋白是由人类基因组编码的，编码Smad2、Smad4和Smad7的基因位于18q21-22；编码Smad3和Smad6的基因位于15q21-22；编码Smad5、Smad1和Smad8的基因分别位于15q31.4和13。
综上所述，为了最终实现治疗COPD疾病，本领域迫切需要寻找COPD疾病的易感基因，并由此开发出检测COPD疾病的试剂盒，以及相关的治疗药物。
为此，本申请人在2006年6月29是向中国国家知识产权局提交了申请号为200610021293.7的发明专利申请，在该发明专利申请中，本申请人提供了一种检测与慢性阻塞性肺部疾病相关的SNP的PCR试剂盒，其特征是由分离包装的引物smad7PA、引物smad7PB、无MgCl2的缓冲液、DNA聚合酶、MgCl2、脱氧核苷酸单位DNTP和水组成。其中，引物smad7PA、smad7PB的序列为smad7PA 5-gtgtcttcattctaggagtc-3smad7PB 5-cacccacacaccatccacct-3实验结果表明，由于利用该发明试剂盒所检测出的SNP与COPD具有非常高的关联性，因此不仅可以较为准确地诊断和治疗COPD疾病，而且可以使易感COPD疾病者在未发病之前就采取合理的预防措施(如适当改变生活环境、生活习惯等)，从而提高COPD易感者的生存期和生活质量，因此具有极其重大的应用价值和社会效益。
当然，众所周知，无论是从检测操作的简易性来说，还是从检测操作的成本和检测结果的准确性等多种角度来说，仅仅具有一种检测SNP的试剂盒是远远不够的。因此，有必要在上述现有技术的基础上，提供新的用于检测COPD的SNP的PCR试剂盒。
发明内查本发明的目的即是提供一种新的用于诊断(尤其是早期诊断)COPD疾病的试剂盒。
本申请人经过深入而广泛的研究，对大量候选基因的SNP进行深入的研究。首次发现和证明了SMAD3基因的部分SNP与COPD密切相关，而且发现它的新功能。SMAD3基因的差异是COPD疾病发病的一个重要因素，其中SNP(+239A/G)在病例和对照组中的基因分布具有显著性差异(p＜0.05)，因此可以作为检测COPD疾病的特异性的SNP，并在此基础上我们完成了本发明。
依据本发明的试剂盒，可以提供一种对个体的COPD疾病易感性进行诊断的方法，该方法为检测个体的SMAD 3基因，并与正常人的SMAD 3基因相比较，存在差异就表明该个体患COPD的可能性高于正常人群。
在本发明中，所述SMAD3基因的单核苷酸多态性(SNP)位于SMAD3基因的第3个内含子上+239A→G在本发明中，提供了一种检测样本中是否存在SMAD3基因的单核酸多态性(SNP)的方法，该方法包括如下步骤(1)利用我们自己设计的试剂盒扩增SMAD3基因，得到PCR扩增产物。
(2)利用TAQMAN技术检测扩增产物中是否存在单核苷酸多态性+239A→G本发明中，扩增产物大小为78bp，其中含有+239A→G为实现本发明的目的，本发明的基本技术路线是一种鉴定SMAD3基因的第3个内含子中SNP分子标记的方法，通过提取宿主细胞的基因组DNA，采用本发明提供的试剂盒进行PCR扩增，扩增目的基因，利用TAQMAN技术进行检测，发现SNP存在，利用DNA测序方法证实该SNP的存在以及存在的位置。
SMAD3基因内含子序列可以从Genbank基因库中获得，原始基因组完整序列在Genbank基因库中的编号为AC012568。
本领域的技术人员都清楚，有很多分析方法可以用于检测基因内含子序列中存在单核酸多态性分布频率。这些技术包括DNA测序、PCR-SSCP、PCR-HPLC、PCR-TAQMAN等。
本发明特别地提供了一种使用方便、灵敏度高的检测上述SNP的检测试剂盒，它含有PCR特异扩增引物和用于PCR扩增检测的PCR反应液(如试剂、缓冲液等常规组件)等，本领域技术人员熟知这些常规组件和检测方法。在采用TAQMAN技术检测扩增产物与正常SMAD7基因序列是否存在突变的比对时，还需要TAQMAN所需要的一些常规试剂等。
具体来说，本发明提供了一种检测COPD的SNP的PCR试剂盒，其特征是由分离包装的引物smad3PA、引物smad3PB、探针YBW60315-FAM(a)、探针YBW60315-VIC(g)和PCR反应液构成，其中，引物smad3PA、smad3PB的序列为Smad3PA5-TGCACTGATCACTGTTCCTGTACTT-3Smad3PB5-CATCGGTGTTTCCAGAGTCAGA-3探针YBW60315-FAM(a)、探针YBW60315-VIC(g)的序列为YBW60315-FAM(a)FAM-CCGCCCCATTaCCCATCCATAGA-TAMRAYBW60315-VIC(g)VIC-CGCCCCATTgCCCATCCAT-TAMRA在本发明中，分别位于探针YBW60315-FAM(a)和探针YBW60315-VIC(g)上的FAM和VIC分别为不同颜色的二种荧光标记物。
就本发明来说，试剂盒中的PCR反应液可以直接由市售的现有产品充当，如ABI公司生产的TaqMan universal master mix PCR反应液等；但也可以仍然采用前述申请号为200610021293.7的发明专利申请中所提及的由分离包装的无MgCl2的缓冲液、DNA聚合酶、MgCl2、脱氧核苷酸单位DNTP和水组成的PCR反应液。在本发明中，分别位于探针YBW60315-FAM(a)和探针YBW60315-VIC(g)上的FAM和VIC分别为不同颜色的二种荧光标记物，该荧光标记物亦为现有的市售产品，如本申请人在中国发明专利ZL03135755.5号(专利名称Y染色体多色荧光复合扩增试剂盒)中给出的荧光标记物等。
本发明的主要技术项献在于①、研究并证实了SMAD3基因的差异是COPD疾病发病的一个重要因素，其中SNP(+239A/G)在病例和对照组中的基因分布具有显著性差异(p＜0.05)，因此可以作为检测COPD疾病的特异性的SNP；②、针对上述突变点设计出了用于PCR扩增的扩增引物smad3PA和smad3PB。
③、利用TAQMAN技术检测PCR扩增产物中是否存在单核苷酸多态性+239A→G并为此专门设计了探针YBW60315-FAM(a)和探针YBW60315-VIC(g)。
因此，需要特别说明的是，就本发明的试剂盒来说，引物smad3PA、引物smad3PB、探针YBW60315-FAM(a)、探针YBW60315-VIC(g)和PCR反应液之间的用量比例的选取是次要的，即该用量比例的选取并不构成本发明技术方案的必要条件。例如，参照前面的叙述可以发现，当试剂盒中的PCR反应液直接采用市售的现有产品(如ABI公司生产的TaqMan universal master mix PCR反应液)时，PCR反应液与引物smad3PA、引物smad3PB、探针YBW60315-FAM(a)、探针YBW60315-VIC(g)之间的用量比例会因市售产品的不同而有所不同，同时，当仍然采用由无MgCl2的缓冲液、DNA聚合酶、MgCl2、脱氧核苷酸单位DNTP和水组成的PCR反应液时，PCR反应液与引物smad3PA、引物smad3PB、探针YBW60315-FAM(a)、探针YBW60315-VIC(g)之间的用量比例也会发生变化。同时，在试剂盒产品中，引物smad3PA、引物smad3PB、探针YBW60315-FAM(a)和探针YBW60315-VIC(g)之间的比例也会针对不同的用户要求而做出调整。
当然，为了让本试剂盒的制作更为简便，本发明推荐采用如下用量比例方案当以25-μl反应体系为基准时，试剂盒中包含12.5μl TaqMan universalmaster mix PCR反应液(ABI公司生产)，300nM引物smad3PA、300nM引物smad3PB、250nM探针YBW60315-FAM(a)和250nM探针YBW60315-VIC(g)。在检测时，取用5μl DNA样本加入上述反应体系。通过调节加入的水量，让引物smad3PA和引物smad3PB的浓度均为300nM，探针YBW60315-FAM(a)和探针YBW60315-VIC(g)的浓度均为250nM。
由于利用本发明试剂盒所检测出的SNP与COPD具有非常高的关联性，因此不仅可以较为准确地诊断和治疗COPD疾病，而且可以使易感COPD疾病者在未发病之前就采取合理的预防措施(如适当改变生活环境、生活习惯等)，从而提高COPD易感者的生存期和生活质量，因此具有极其重大的应用价值和社会效益。另外，与前述本申请人的200610021293.7号发明专利申请所公开的技术方案相比较，本发明的主要区别如下1、使用的目的基因有差异。试剂盒中的引物smad3PA、smad3PB是针对个体的SMAD3基因设计的，而个体的SMAD3基因的部分SNP与COPD密切相关。实验结果表明，SMAD3基因的差异是COPD疾病发病的一个重要因素，其中SNP(+239A/G)在病例和对照组中的基因分布具有显著性差异(p＜0.05)，因此可以作为检测COPD疾病的特异性的SNP。
2、使用的检测方法有差异。在本发明的试剂盒是针对PCR-TAQMAN检测方法设计的，而前述发明专利申请的试剂盒是针对PCR-HPLC检测方法设计的，因此，二者的设计方案和与该设计方案相对应的试剂盒的使用方法不同。
3、PCR反应时所采用的引物不同。由于需要扩增的基因位点发生了改变，因此重新设计了针对新位点的扩增引物smad3PA、smad3PB。
4、针对突变点设计了探针YBW60315-FAM(a)、探针YBW60315-VIC(g)。本领域的技术人员都知道，TAQMAN技术中的探针设计是十分重要的，但也是十分困难的，本申请人通过艰苦的创造性劳动，才设计出了探针YBW60315-FAM(a)、探针YBW60315-VIC(g)。
还需说明的是，TAQMAN技术是一种本领域技术人员熟知的技术，但据申请人所知，迄今为止，尚无人将其应用于检测COPD的SNP。为了便于理解，现对TAQMAN技术简述如下点突变SNP分析可以用不同的荧光报告基团标记的Taqman探针进行检测。探针可以标记上不同颜色的发光基团，两个探针之间的差异主要是两个的碱基构成差异，取决于SNP突变的类型。意思就是一种探针只能与一种SNP类型相结合，从而发出一种颜色的荧光。探针分别与野生型和突变基因杂交。探针杂交的效率和其后的切除与杂交有关。如果一种染料的荧光信号明显强于另一种则说明它是一个纯合子，如果两种荧光信号都增加则表明是一个杂合子。
实时定量PCR的数据被标在xy坐标轴上来区分特异的基因型。利用这种方法，能在不到两个小时内很快对96个样本进行基因分型。这一方法最先由Sevall在2001年的《Methods》中发表的文章“Rapid allelic discriminationfrom real-time DNA amplification”中提及。
为了检测突变体，可以设计两种不同颜色的探针一个探针设计来检测野生型，可以标记FAM，另一个探针设计来检测突变体，可以标记VIC。通常两个探针的差别只有1个bp，由于两个探针相差极小，因此一般推荐使用严格的反应条件。
通过分析数据，两个通道的结果会呈现在一个屏幕中，没有标记物的曲线是CH1结果，有循环数的是CH2，最多可以有四个探针(两个突变体)可以被分析，在编辑好基因型名称，将域值调整到0以上后，结果就会在图下方的表格中显示出来。
本发明的内容结合以下实施例作更进一步的说明，但本发明的内容不仅限于实施例中所涉及的内容。
图1是实施例中的基因分型结果图。
具体实施例方式
实施例本实施例中的试剂盒是针对一次PCR扩增制作的。
本实施例中的试剂盒是是由分离包装的引物smad3PA、引物smad3PB、探针YBW60315-FAM(a)、探针YBW60315-VIC(g)和PCR反应液构成，其中，引物smad3PA、smad3PB的序列为Smad3PA5-TGCACTGATCACTGTTCCTGTACTT-3Smad3PB5-CATCGGTGTTTCCAGAGTCAGA-3探针YBW60315-FAM(a)、探针YBW60315-VIC(g)的序列为YBW60315-FAM(a)FAM-CCGCCCCATTaCCCATCCATAGA-TAMRAYBW60315-VIC(g)VIC-CGCCCCATTgCCCATCCAT-TAMRA在所述探针YBW60315-FAM(a)和探针YBW60315-VIC(g)上，FAM和VIC分别为不同颜色的二种荧光标记物。
本实施例中的试剂盒是以25-μl反应体系为基准制作的，试剂盒中包含12.5μlTaqMan universal master mix PCR反应液(ABI公司生产)，300nM引物smad3PA、300nM引物smad3PB、250nM探针YBW60315-FAM(a)和250nM探针YBW60315-VIC(g)。在检测时，取用5μl DNA样本加入反应体系。
为了进一步说明本实施例中所制作试剂盒的使用方法和使用效果，下面继续说明将上述试剂盒用于检测与慢性阻塞性肺部疾病相关的SNP时的具体过程及使用效果。
实验步骤1.DNA提取按照常规的DNA提取方法进行DNA提取。
2.目的基因的PCR扩增(扩增体系为一个样本)采用上述试剂盒对目的基因SMAD3进行PCR扩增。扩增时使用的机器是美国ABI公司Prism 7900HT。条件是50℃，2分钟，95℃ 10分钟，激活AmpliTaqGold酶(DNA聚合酶)。PCR条件40循环95℃，15s；60℃，1min。
3.点突变SNP分析。
用不同的荧光报告基团标记的Taqman探针进行检测。为了检测突变体，如前所述，本实施例的试剂盒中设计了两种不同颜色的探针，即探针YBW60315-FAM(a)和探针YBW60315-VIC(g)，其中YBW60315-FAM(a)为FAM-CCGCCCCATTaCCCATCCATAGA-TAMRAYBW60315-VIC(g)为VIC-CGCCCCATTgCCCATCCAT-TAMRA此处，一个探针设计来检测野生型，标记为FAM，另一个探针用来检测突变体，标记为VIC，两个探针的差别只有1个bp。探针上标记了不同颜色的发光基团，即FAM基团和VIC基团。这两个探针之间的差异主要是两个的碱基构成差异，取决于SNP突变的类型。意思就是一种探针只能与一种SNP类型相结合，从而发出一种颜色的荧光。在实验过程中，探针YBW60315-FAM(a)和探针YBW60315-VIC(g)分别与野生型和突变基因杂交。探针杂交的效率和其后的切除与杂交有关。如果一种染料的荧光信号明显强于另一种则说明它是一个纯合子，如果两种荧光信号都增加则表明是一个杂合子。
在实验过程中，PCR的数据被标在x、y坐标轴上来区分特异的基因型。利用这种方法，能在不到两个小时内很快对96个样本进行基因分型。
通过分析数据，两个通道的结果会呈现在一个屏幕中，没有标记物的曲线是CH1结果，有循环数的是CH2，最多可以有四个探针(两个突变体)可以被分析，在编辑好基因型名称，将域值调整到0以上后，结果就会在屏幕下方的表格中显示出来，如图1所示。
在图1中，标号1所示的区域内有蓝色的多个点，它们反映的是纯合子AA，标号2所示的区域内有红色的多个点，它们反映的是纯合子GG，而标号3所示的区域内有绿色的多个点，它们反映的是杂合子AG。
如前所述，本实施例的实验条件如下反应成分25-μl反应体系。包含12.5μl TaqMan universal master mixPCR反应液(ABI公司生产)，300nM引物smad3PA，300nM引物smad3PB，250nM探针YBW60315-FAM(a)，250nM YBW60315-VIC(g)，5μl DNA样本。
需要说明的是我们采用上述试剂盒，首次通过PCR-TAQMAN技术，在中国人群200名COPD患者和200名年龄、性别匹配正常的对照人群中检测出在SMAD3第3内含子+239区域存在A/G多态性SNP标记位点。通过DNA测序，证实了突变点的存在。
附本发明所涉及的基因组序列表<210>1<211>78<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>PCR Production_region<222>44<400>1TGCACTGATC ACTGTTCCTG TACTTCTGTC TTACCGCCCC ATTACCCATC CATAGATCTG 60ACTCTGGAAA CACCGATG 78
权利要求
1.一种检测COPD的SNP的PCR试剂盒，其特征是由分离包装的引物smad3PA、引物smad3PB、探针YBW60315-FAM(a)、探针YBW60315-VIC(g)和PCR反应液构成，其中，引物smad3PA、smad3PB的序列为Smad3PA5-TGCACTGATCACTGTTCCTGTACTT-3Smad3PB5-CATCGGTGTTTCCAGAGTCAGA-3探针YBW60315-FAM(a)、探针YBW60315-VIC(g)的序列为YBW60315-FAM(a)FAM-CCGCCCCATTaCCCATCCATAGA-TAMRAYBW60315-VIC(g)VIC-CGCCCCATTgCCCATCCAT-TAMRA在所述探针YBW60315-FAM(a)和探针YBW60315-VIC(g)上，FAM和VIC分别为不同颜色的二种荧光标记物。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征是当以25-μl反应体系为基准时，试剂盒中包含12.5μl TaqMan universal master mix PCR反应液，300nM引物smad3PA、300nM引物smad3PB、250nM探针YBW60315-FAM(a)和250nM探针YBW60315-VIC(g)。
全文摘要
一种检测COPD的SNP的PCR试剂盒，由分离包装的引物smad3PA、引物smad3PB、探针YBW60315－FAM(a)、探针YBW60315－VIC(g)和PCR反应液构成，引物smad3PA、smad3PB的序列为Smad3PA5－TGCACTGATCACTGTTCCTGTACTT－3；Smad3PB5－CATCGGTGT TTCCAGAGTCAGA－3；探针YBW60315－FAM(a)、探针YBW60315－VIC(g)的序列为YBW60315－FAM(a) FAM－CCGCCCCATta CCCATCCATAGA－TAMRA；YBW60315－VIC(g) VIC－CGCCCCATTgCCCATCCAT－TAMRA。
文档编号C12Q1/68GK101078025SQ20061002253
公开日2007年11月28日 申请日期2006年12月19日 优先权日2006年12月19日
发明者文富强, 应斌武 申请人:四川大学华西医院