MNSFβ基因在胚胎着床过程中的功能及其应用的制作方法

专利名称：MNSFβ基因在胚胎着床过程中的功能及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术和医学领域，具体地说，本发明涉及MNSFβ基因在胚胎着床过程中的功能及其应用。
背景技术：
MNSF(单克隆非特异性抑制因子，monoclonal nonspecific suppressor factor)最初被发现是由小鼠T细胞杂交瘤生成的一种具有非特异性免疫抑制效应的淋巴细胞因子(Nakamura M等，(1986)，Isolation and characterization of amonoclonal nonspecific suppressor factor(MNSF)produced by a T cell hybridoma.Journal of Immunology，1362904-2909)。而MNSFβ是MNSF的一个亚单位，也是MNSF发挥其生物学功能的最主要成分(Nakamura M等，(1996)，Ubiquitin-likemoiety of the monoclonal nonspecific suppressor factor beta is responsible for itsactivity.Journal of Immunology，156532-538)，能抑制IgG的合成分泌，以及T细胞和B细胞的增殖(Kondoh T等，(1999)，Ubiquitin-like polypeptide inhibits theproliferative response of T cells in vivo.Immunobiology，200140-149)。
对于母体子宫组织来说，胚胎及其后的胎儿都属于半同种异体组织，是外源性免疫物质，因此，在整个妊娠过程中，必须在母体免疫系统和胚胎/胎儿细胞之间建立一种特殊的相容性，以保证胎儿存活并正常发育。虽然这种母胎界面间的免疫耐受状态形成的分子机制尚未完全清楚，但一些细胞因子的局部免疫抑制功能，以及Th1细胞/Th2细胞平衡的改变，在母-胎间免疫耐受状态的形成过程中发挥了极为重要的作用。
由于MNSFβ是一种具有非特异性免疫抑制作用的细胞因子，因此很自然地就会想到在胚胎着床期间该基因的表达水平应提高，从而有利于抑制母-胎间的免疫反应。但根据文献报道(Nie GY，等，(2000)，Identification of monoclonalnonspecific suppressor factor beta(MNSFβ)as one of the genes differentiallyexpressed at implantation sites compared to interimplantation sits in the mouseuterus.Molecular Reproductive and Development，55351～363)，MNSFβ基因在未孕及胚胎着床前小鼠子宫组织中都有高水平的表达，且表达水平无明显变化；但在小鼠胚胎着床期间，MNSFβ基因在着床位点的表达水平相对于非着床位点呈明显的下调趋势，并因此推测该基因在胚胎着床过程中不是直接发挥其免疫抑制作用，而可能是通过其表达水平的下降，促进着床部位子宫内膜组织中Th2细胞的增殖和IL4的合成，使得Th1细胞/Th2细胞平衡偏向Th2细胞，从而有助于免疫耐受状态的形成。
综上，目前人们对MNSFβ基因及其表达产物对胚胎着床及怀孕期间的影响作用了解甚少，且认为其在胚胎着床过程中不是直接发挥免疫抑制作用。然而，上述的研究结果只是表面的推测，还有必要深入研究MNSFβ基因在胚胎着床及怀孕期间的作用机制。

发明内容
本发明的目的是提供一种MNSFβ基因在调节胚胎着床中的应用。
本发明的另一目的是提供MNSFβ的拮抗剂或激动剂的用途，用于调节胚胎的着床。
在本发明的第一方面，提供一种MNSFβ基因或其编码蛋白的用途，所述的MNSFβ基因或其编码蛋白被用作促进胚胎着床的促进剂。
在本发明的第二方面，提供一种MNSFβ基因或其编码蛋白的用途，所述的MNSFβ基因或其编码蛋白被用于制备促进胚胎着床的药物。
在本发明的第三方面，提供一种MNSFβ拮抗剂的用途，所述的MNSFβ拮抗剂被用作抑制胚胎着床的抑制剂。
在本发明的第四方面，提供一种MNSFβ拮抗剂的用途，所述的MNSFβ拮抗剂被用于制备抑制胚胎着床的药物。
在本发明的一个优选例中，所述的药物为避孕药。
在本发明的另外一个优选例中，所述的拮抗剂是MNSFβ的反义核酸，MNSFβ的配体，或抗MNSFβ多肽的抗体。
在本发明的第五方面，提供一种MNSFβ激动剂的用途，它被用作促进胚胎着床的促进剂。
在本发明的第六方面，提供一种MNSFβ激动剂的用途，它被用于制备促进胚胎着床的药物。
在本发明的一个优选例中，所述的药物为辅助生育药物。
在本发明的第七方面，提供一种确定测试化合物是否是MNSFβ的拮抗剂或激动剂的方法，它包括步骤(a)将测试化合物和MNSFβ多肽加入体外培养的胚胎作为测试组，并将MNSFβ多肽加入体外培养的胚胎作为对照组；(b)观察测试组和对照组胚胎着床情况，如果测试组的胚胎着床数量大于对照组，则表示测试化合物是MNSFβ的激动剂；如果测试组的胚胎着床数量小于对照组，则表示测试化合物是MNSFβ的拮抗剂。
在本发明的第八方面，提供一种药物组合物，它含有安全有效量的MNSFβ多肽、其激动剂或其拮抗剂以及药学上可接受的载体。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。


图1显示了MNSFβ蛋白在小鼠卵细胞和早期胚胎中的表达，其中1为卵细胞；2为2-细胞期胚胎；3为囊胚。(标尺＝10μm)图2显示了小鼠子宫组织中Sprr2f基因表达水平的定量实时PCR检测数据，其中，A图为荧光定量检测数据，其纵坐标为荧光值，横坐标为循环数，各曲线的对应说明见表4；B图为标准曲线，其纵坐标为达到阈值所经循环数，横坐标为浓度。
图3显示了小鼠子宫组织中Ovpg1基因表达水平的定量实时PCR检测数据，其中，A图为荧光定量检测数据，其纵坐标为荧光值，横坐标为循环数，各曲线的对应说明见表5；B图为标准曲线，其纵坐标为达到阈值所经循环数，横坐标为浓度。
具体实施例方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现单克隆非特异性抑制因子β(MNSFβ)蛋白是胚胎着床所必需的；并且还首次证实MNSFβ的拮抗剂(如MNSFβ的抗体或反义核酸)能特异性地抑制胚胎的着床。基于此完成了本发明。
已有的研究认为MNSFβ在胚胎着床过程中不是直接发挥免疫抑制作用的。然而，本发明人经过详细研究和论证，发现MNSFβ是胚胎着床所必需的，MNSFβ在小鼠早期妊娠过程中具有多重生物学功能(如抑制母胎界面的免疫反应)。其还能够调节其它多种基因的表达。而抗MNSFβ抗体能够通过增强母胎界面的免疫反应，从而抑制胚胎的着床。
在本发明中，术语“MNSFβ蛋白”、“MNSFβ多肽”、“MNSFβ因子”或“单克隆非特异性抑制因子β”等可互换使用，都指具有单克隆非特异性抑制因子β氨基酸序列(SEQ ID NO2)的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始的甲硫氨酸。此外，这些术语还包括在其他哺乳动物(如人、狗、牛、羊、猴)中的具有同种功能的同系物或同源蛋白。
小鼠MNSFβ基因cDNA序列(GenBank登录号D26610)如SEQ ID NO1，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO2。
小鼠MNSFβ蛋白分子中含有2个功能区域，第一个功能域是由70个aa残基组成的泛素序列(ubiquitin，UBQ)(第1-70aa)；第二个功能域是由60个aa残基组成的核糖体S30蛋白序列(Ribosomal protein S30)(第74-133aa)。
已有研究报道(Xavier R，等，(1995)，Human nonspecific suppressor factor(hNSF)cell source and effects on T and B lymphocytes.Immunology，192262-271)，从一名SLE患者的腹水中已经分离纯化到与小鼠MNSFβ蛋白同源的人hNSFβ(人非特异抑制因子β，human nonspecific suppressor factor-beta)蛋白，并经研究证实，人hNSFβ蛋白也具有与小鼠MNSFβ类似的生物学功能，即能抑制IgG的合成，以及B细胞和T细胞的增殖。
应理解，由于鼠等哺乳动物的MNSFβ蛋白的核酸序列和氨基酸序列都是已知的，可以用本领域常规的DNA重组技术而获得其蛋白。
一类特别优选的蛋白是MNSFβ类似物，即在其他哺乳动物(如牛、羊、兔、狗、猴、人等)中MNSFβ的同源蛋白。这些其他物种的同源蛋白的编码序列，可根据MNSFβ的序列，通过杂交或扩增的方法而获得，进而通过常规重组方法获得这些同源蛋白。
如本文所用，“分离的MNSFβ蛋白或多肽”是指MNSFβ多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化MNSFβ多肽。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括MNSFβ多肽的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然MNSFβ因子相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中，术语“MNSFβ多肽”指具有直接或间接调节胚胎着床活性的SEQ ID NO2序列的多肽。该术语还包括具有与MNSFβ因子相同功能的、SEQ IDNO2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或多个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括MNSFβ因子的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与MNSFβDNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗MNSFβ多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含MNSFβ多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了MNSFβ多肽的可溶性片段。通常，该片段具有MNSFβ多肽序列的至少约50个连续氨基酸，通常至少约100个连续氨基酸，较佳地至少约150个连续氨基酸，更佳地至少约200个连续氨基酸，最佳地至少约300个连续氨基酸。
本发明还涉及MNSFβ多肽的类似物。这些类似物与天然MNSFβ多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
本发明的MNSFβ核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
MNSFβ多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)直接做为药物治疗MNSFβ因子功能低下或丧失所致的疾病(如因胚胎着床能力低下而导致的不孕)，和用于筛选促进或对抗MNSFβ因子功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组MNSFβ因子筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激MNSFβ因子功能的多肽分子。
另一方面，本发明还包括对MNSFβDNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于MNSFβ基因产物或片段。较佳地，指那些能与MNSFβ基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制MNSFβ因子的分子，也包括那些并不影响MNSFβ因子功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的MNSFβ基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的MNSFβ基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达MNSFβ因子或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断MNSFβ功能的抗体以及不影响MNSFβ功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用MNSFβ基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与MNSFβ基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
抗MNSFβ的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的MNSFβ。
本发明中的抗体作为MNSFβ的拮抗剂，还可用于抑制胚胎着床，从而用于避孕。给予适当剂量的抗体可以阻断MNSFβ的产生或活性。
利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与MNSFβ发生相互作用的物质，如受体、抑制剂、激动剂或拮抗剂等。例如，能与MNSFβ结合的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸结合于固相物组成的随机多肽库而获得。
本发明蛋白及其抗体、抑制剂、激动剂、拮抗剂或受体等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)口服、透皮、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、阴道内或局部给药。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明MNSFβ多肽或其激动剂、拮抗剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约10毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的MNSFβ蛋白或其拮抗剂、激动剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
MNSFβ的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于MNSFβ的无表达或异常/无活性的MNSFβ的表达所致的胚胎着床水平低下。反义核苷酸可以抑制胚胎着床，从而用于避孕。
本发明还涉及定量和定位检测MNSFβ水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，包括放射免疫测定等方法。试验中所检测的MNSFβ水平，可以用作解释MNSFβ因子在不孕等疾病中的重要性和用于诊断。
一种检测检测样品中是否存在MNSFβ因子的方法是利用MNSFβ因子的特异性抗体进行检测，它包括将样品与MNSFβ因子特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在MNSFβ因子。
本发明的主要优点在于(1)首次发现MNSFβ蛋白是胚胎着床所必需的，否定了已有研究认为MNSFβ不是直接发挥免疫抑制作用的论点。
(2)首次证实MNSFβ的拮抗剂(如MNSFβ的抗体或反义核酸)能特异性地抑制胚胎的着床。
(3)发现MNSFβ在小鼠早期妊娠过程中具有多重生物学功能，其还能够调节其它多种妊娠相关基因的表达。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1小鼠卵细胞及着床前的早期胚胎中有MNSFβ蛋白的表达本发明人对卵细胞、2-细胞期胚胎和囊胚进行了免疫荧光分析。结果见图1，发现在卵细胞(1)、2-细胞期胚胎(2)和囊胚(3)中均检测到MNSFβ蛋白的阳性信号。
由于曝光系数固定，所以信号的强弱从一定程度上可反映出待测蛋白的表达量，因此根据荧光强度推测，MNSFβ蛋白在早期胚胎中的表达量可能随孕期而提高。
实施例2抗体封闭实验证实抗MNSFβ抗体能特异性抑制小鼠胚胎的着床在本实施例中，用常规的PCR方法获得MNSFβ的完全的ORF编码序列，然后插入pGEX-4T-2的多克隆位点(购自Amersham Pharmacia Biotech公司)，从而获得表达质粒pGEX-4T-2/MNSFβ。用该质粒在大肠杆菌中表达GST-MNSFβ融合蛋白；然后用牛凝血酶处理纯化的GST-MNSFβ融合蛋白，分离出重组MNSFβ蛋白，并将其作为免疫原，以福氏佐剂为免疫刺激剂，按常规方法免疫家兔，制备得到高滴度的兔抗MNSFβ血清；再通过Protein A Sepharose CL-4B柱层析，从抗血清中分离出具有生物活性的重组MNSFβ(rMNSFβ)，以及能有效中和MNSFβ生物活性的兔抗MNSFβ-IgG。
用上述类似的常规方法，本发明人还构建了重组表达质粒pVL 1392/MNSFβ(昆虫杆状病毒转移载体pVL1392购自Invitrogen公司)，与线性化核型多角体病毒(AcNPV)DNA(购自Invitrogen公司)共转染Sf9昆虫细胞后，鉴定并收集含重组MNSFβ蛋白(rMNSFβ)的Sf9昆虫细胞(购自Invitrogen公司)条件培液(rMNSFβ+Sf9条件培液)。本发明人利用LPS能诱导小鼠脾细胞合成分泌IgG，而MNSFβ具有抑制该效应的生物活性这一特征，根据Nakamura描述的方法(见Nakamura M等，J.Immunol.，156532，1996)，通过生物测定，证实昆虫细胞表达的rMNSFβ蛋白具有天然MNSFβ的生物活性，而兔抗MNSFβ-IgG能有效中和rMNSFβ的生物活性，说明所制备的rMNSFβ和兔抗MNSFβ抗体适用于抗体封闭实验。
实验中，将同一批孕第1天的ICR小鼠随机分为10组，每个子宫角的注射溶液分别为第I组30μL生理盐水；第II组含300μg正兔血清-IgG的30μL生理盐水；第III组含300μg兔抗GST-IgG的30μL生理盐水；第IV组含500μg兔抗MNSFβ-IgG的30μL生理盐水；第V组含300μg兔抗MNSFβ-IgG的30μL生理盐水；第VI组含100μg兔抗MNSFβ-IgG的30μL生理盐水；第VII组含500μL rMNSFβ+Sf9条件培液冻干粉剂的30μL生理盐水；第VIII组含500μL Sf9条件培液冻干粉剂的30μL生理盐水；第IX组含100μg兔抗MNSFβ-IgG和500μL rMNSFβ+Sf9条件培液冻干粉剂的30μL生理盐水；第X组含100μg兔抗MNSFβ-IgG和500μL Sf9条件培液冻干粉剂的30μL生理盐水。
所有受试动物都是在孕第3天上午注射，并于孕第8天上午处死，对每个子宫角的胚胎数量进行计数和统计分析。其中，第IX组和第X组的实验动物在注射前，先将注射溶液置于35℃下孵育1小时，以便抗原、抗体之间先发生中和反应。
结果见表1，表明正兔血清-IgG对小鼠胚胎着床无影响；与正兔血清-IgG相比，兔抗GST-IgG对小鼠胚胎的着床也没有影响；而兔抗MNSFβ-IgG则显示出对小鼠胚胎着床的抑制作用，而且这种抑制作用随着兔抗MNSFβ-IgG剂量的增加而加强，存在明显的剂量效应；重组MNSFβ蛋白虽然不影响胚胎的着床，但将兔抗MNSFβ-IgG与重组MNSFβ温育后，则兔抗MNSFβ-IgG不再显示出对胚胎着床的抑制作用，即兔抗MNSFβ-IgG对胚胎的抑制作用可以被rMNSFβ中和，说明这种抑制作用是抗MNSFβ抗体特异的。这一结果表明，抗MNSFβ抗体对胚胎的着床具有特异性的抑制作用，而具有生物活性的rMNSFβ却对胚胎的着床没有抑制作用。
因此，子宫组织合成分泌的MNSFβ蛋白是胚胎着床所必需的，着床位点MNSFβ基因表达水平的下降只是由于基质细胞分化为蜕膜细胞而造成的，而非着床位点子宫组织合成分泌的MNSFβ蛋白，以及胚胎组织合成分泌的MNSFβ蛋白是直接发挥其免疫抑制功能，从而在母-胎间免疫耐受状态的形成过程中发挥重要作用。
表1 抗MNSFβ抗体对小鼠胚胎着床的抑制作用

a注射前置于35℃下温育1hr。
b用t-检验方法计算P值时，与第II组数据进行比较。
实施例3 cDNA芯片技术分析抗MNSFβ抗体抑制胚胎着床的分子机制为了进一步深入了解MNSFβ基因在妊娠过程中的生物学功能，本发明人应用cDNA芯片技术，使用Affymetrix MOUSE 430A基因表达谱芯片，对经抗MNSFβ抗体处理的和未经抗MNSFβ抗体处理的这样一对子宫组织之间，在基因表达上的差异进行了分析，结果采用Affymetrix基因芯片扫描仪进行扫描，并用微列阵分析软件Microarray Suite5.0(Affymetrix公司)读取和处理数据，差异基因筛选标准为“Change”为I或MI、Ratio＞或＝1、“实验组”Detection为“P”的定为上调基因；“Change”为D或MD、Ratio＜或＝-1、“对照组”Detection为“P”的定为下调基因表2；并应用定量实时PCR技术对其部分分析结果进行了验证。随机选取了SPRR2f(小脯氨酸富集蛋白2F，small proline-rich protein2F)、DCK(脱氧胞苷激酶，deoxycytidine kinase)、INHBB(抑制素βB，inhibin betaB)、ISP1(着床丝氨酸蛋白酶1，implantation serine proteinase 1)、OVPG1(oviductal糖蛋白1，oviductal glycoprotein 1)和NPR2等6个cDNA芯片技术筛选到的差异基因为待测基因，以β-肌动蛋白为管家基因，分别进行实时荧光定量PCR反应。根据绘制的梯度稀释DNA标准曲线，各待测基因和管家基因的浓度结果直接由仪器生成。每个待测基因浓度除以其管家基因的浓度，即为此待测基因的校正后相对含量(表3，图2，图3)。
本发明人通过cDNA芯片技术，共筛选出在两种组织间存在表达差异的144个已知基因，有一部分基因是与生殖活动相关的，比如SPRR2F(小脯氨酸富集蛋白2F，small proline-rich protein 2F)等基因与配子细胞的发生和动情周期相关；SGK(丝氨酸/糖皮质激素调节的激酶，serum/glucocorticoid regulated kinase)等基因与胚胎发育有关；而ISP1等基因则直接与胚胎着床过程相关。根据文献报道，SGK、SPRR2F等这些经抗MNSFβ抗体处理后表达水平上调的基因，在正常围着床期小鼠子宫组织中的表达水平应是下调的；而ISP1等一些经抗MNSFβ抗体处理后表达水平下调的基因，在正常围着床期小鼠子宫组织中的表达水平应是上调的；这与抗MNSFβ抗体能抑制胚胎着床的现象是一致的。但这些基因在生殖过程中的生物学功能是不同的，提示MNSFβ基因在小鼠早期妊娠过程中具有多重生物学功能。
除了上述这些与生殖过程相关的基因外，还有一系列基因是参与调控机体免疫反应的，包括与抗原递呈和T细胞受体信号传导相关的PSMA6(α6型proteasome亚基，proteasome subunit，alpha type 6)等基因，与免疫细胞活化相关的DCK等基因，与淋巴细胞增殖分化相关的VAV3(vav3癌基因，vav 3 oncogene)等基因，以及与补体系统活化相关的CFI(补体成份因子1，complementcomponent factor I)等基因。同样，根据现有的文献报道，DCK等基因表达水平的提高和VAV3等基因表达水平的降低将会导致免疫反应的增强，因此，增强母胎界面的免疫反应是抗MNSFβ抗体抑制胚胎着床的一个作用途径。
除了增强母胎界面免疫反应这一途径，抗MNSFβ抗体还通过影响细胞间的粘附、细胞的侵润性、细胞代谢/胚胎发育等其它途径抑制胚胎着床。例如TFPI(组织因子旁路抑制子，tissue factor pathway inhibitor)等基因表达水平的上调会降低细胞的侵润性，INHBB等基因表达水平的提高则会抑制胚胎的发育；而MELA(黑色素瘤抗原，melanoma antigen)等基因表达水平的下调可减弱细胞间的粘附，SLC14A2(溶质传递体家族14(尿素转运子)，成员2；solute carrierfamily 14(urea transporter)，member 2)等基因表达水平的降低会导致细胞代谢异常。因此，本发明人可以确定，MNSFβ基因不仅通过直接发挥其免疫抑制功能而在母胎界面免疫耐受状态的形成过程中起重要作用，而且通过该基因在调控滋养层细胞侵润性和胚胎组织发育方面的潜在功能而在早期妊娠过程中发挥多重作用。
通过分析本发明人还发现，在144个筛选到的已知基因中，有近30个基因在不同的肿瘤细胞中也有表达。胚胎组织细胞高度增殖和分化的特性及其作为半异体组织对正常组织的侵润性都与肿瘤组织相似，因此，进一步深入分析MNSFβ基因在胚胎着床及胎儿发育中的作用和分子机制，还有助于了解肿瘤组织发生、发展的分子机制。
表3 各待测基因在两种组织中表达量的定量实时PCR测定结果1、实时定量测量值

2、内参校正后列表

表4 Sprr2f基因定量检测数据表

表5 Ovgp1基因定量检测数据表 实施例4筛选MNSFβ的拮抗剂按实施例2所述方法，将以下两组物质(替换反义核酸和转染剂)施用于怀孕小鼠，然后观察对胚胎着床的体内抑制作用(a)候选物质+MNSFβ因子；(b)MNSFβ因子。
如果组(a)的胚胎着床率在统计学上显著低于组(b)的胚胎着床率，则表明该候选物质是MNSFβ的拮抗剂。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>上海市计划生育科学研究所<120>MNSFβ基因在胚胎着床过程中的功能及其应用<130>059724<160>2<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>506<212>DNA<213>Mus musculus<400>1ctctttcttg actccatctt cgcggtagca gcagcggcgt ccgcgggcta gtagccaaca 60tgcagctctt tgtccgcgcc caggaactac acaccctcga ggtgaccgga caggagacgg120tcgcccagat caaagatcat gtggcctccc tggaaggcat tgcccccgaa gatcaagtcg180tgcttctggc aggctcgccg ctggaggatg aggccaccct aggccagtgt ggcgtagagg240ccctgaccac tctggaagta gcaggccgca tgctgggagg taaagttcac ggttccctgg300ctcgggctgg aaaagtgaga ggtcagactc ccaaggtggc caaacaggaa aagaagaaga360agaagacagg ccgggccaag aggcgaatgc agtacaaccg gcgctttgtc aatgttgtgc420ccacctttgg gaagaagaag ggccccaatg ccaattccta agtcctattg ccaccctgcc480atgctaataa agccactgtg tccaga 506<210>2<211>133<212>PRT<213>Mus musculus<400>2Met Gln Leu Phe Val Arg Ala Gln Glu Leu His Thr Leu Glu Val Thr1 5 10 15Gly Gln Glu Thr Val Ala Gln Ile Lys Asp His Val Ala Ser Leu Glu20 25 30
Gly Ile Ala Pro Glu Asp Gln Val Val Leu Leu Ala Gly Ser Pro Leu35 40 45Glu Asp Glu Ala Thr Leu Gly Gln Cys Gly Val Glu Ala Leu Thr Thr50 55 60Leu Glu Val Ala Gly Arg Met Leu Gly Gly Lys Val His Gly Ser Leu65 70 75 80Ala Arg Ala Gly Lys Val Arg Gly Gln Thr Pro Lys Val Ala Lys Gln85 90 95Glu Lys Lys Lys Lys Lys Thr Gly Arg Ala Lys Arg Arg Met Gln Tyr100 105 110Asn Arg Arg Phe Val Asn Val Val Pro Thr Phe Gly Lys Lys Lys Gly115 120 125Pro Asn Ala Asn Ser130
权利要求
1.一种MNSFβ基因或其编码蛋白的用途，其特征在于，所述的MNSFβ基因或其编码蛋白被用作促进胚胎着床的促进剂。
2.一种MNSFβ基因或其编码蛋白的用途，其特征在于，所述的MNSFβ基因或其编码蛋白被用于制备促进胚胎着床的药物。
3.一种MNSFβ拮抗剂的用途，其特征在于，所述的MNSFβ拮抗剂被用作抑制胚胎着床的抑制剂。
4.一种MNSFβ拮抗剂的用途，其特征在于，所述的MNSFβ拮抗剂被用于制备抑制胚胎着床的药物。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的药物为避孕药。
6.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的拮抗剂是MNSFβ的反义核酸、MNSFβ的配体、或抗MNSFβ多肽的抗体。
7.一种MNSFβ激动剂的用途，其特征在于，它被用作促进胚胎着床的促进剂。
8.一种MNSFβ激动剂的用途，其特征在于，它被用于制备促进胚胎着床的药物。
9.一种确定测试化合物是否是MNSFβ的拮抗剂或激动剂的方法，其特征在于，它包括步骤(a)将测试化合物和MNSFβ多肽加入体外培养的胚胎作为测试组，并将MNSFβ多肽加入体外培养的胚胎作为对照组；(b)观察测试组和对照组胚胎着床情况，如果测试组的胚胎着床数量大于对照组，则表示测试化合物是MNSFβ的激动剂；如果测试组的胚胎着床数量小于对照组，则表示测试化合物是MNSFβ的拮抗剂。
10.一种药物组合物，其特征在于，它含有安全有效量的MNSFβ多肽、其激动剂或其拮抗剂以及药学上可接受的载体。
全文摘要
本发明公开了一种MNSFβ基因或其编码蛋白在调节胚胎着床中的应用，本发明还公开了MNSFβ的拮抗剂或激动剂的用途，用于调节胚胎的着床。本发明首次发现MNSFβ蛋白是胚胎着床所必需的，并且证实MNSFβ的拮抗剂(如MNSFβ的特异性抗体或反义核酸)能特异性地抑制胚胎的着床。
文档编号C12Q1/68GK101028522SQ200610024320
公开日2007年9月5日 申请日期2006年3月3日 优先权日2006年3月3日
发明者王健, 申庆祥, 黄哲平 申请人:上海市计划生育科学研究所