一种高通量筛选能分泌有活性脂肪酶的工程菌的方法

专利名称：：一种高通量筛选能分泌有活性脂肪酶的工程菌的方法
技术领域：
：本发明属于生物工程
技术领域：
，更具体的，本发明涉及一种筛选脂肪酶生产菌的方法。
背景技术：
：微生物脂酶和脂肪酶近年来倍受关注，因为它们在食品加工、表面活性剂、造纸、石油、诊断、制药等诸多方面都有很高的应用价值。然而有些有价值的脂肪酶对热不稳定，如在25'C以上活力会骤降。因此构建能大量表达脂肪酶的工程菌、或从脂肪酶文库中高通量筛选活性高或稳定性强的脂肪酶具有重要意义。在表达脂肪酶的酵母丁程菌筛选方而，目前的筛选方法是将转化获得的酵母菌落首先转移至BMGY(196酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖，lOOmM磷酸钾缓冲液，冊6.0，1.34%YNB，1.5%琼脂)平板，3CTC培养过夜后，这些克隆点种于BMMY(iy。酵母提取物，2%蛋白胨，0.5°/。甲醇，lOOmM磷酸钾缓冲液，PH6.0，1.34%YNB，1.5%琼脂，并补以2%橄榄油，0.0002。/。罗丹明B)平板，3(TC培养2-3天后，能分泌有活性的脂肪酶的菌落周围会出现有罗丹明指示剂的圈。但是这种方法的缺点是不能确定分泌高温下稳定的脂肪酶的重组克隆，这是由于作为脂肪酶的底物的橄榄油需要直接配制在培养基中，其在菌体表达脂肪酶的同时被分解；而在经历高温后再在培养基上涂抹橄榄油则无法达到敏感、精确的筛选要求，甚至无法在短时间显示指示圈。因此，随着脂肪酶被越来越多地被应用在各个领域中以及对其使用要求的提高，在脂肪酶生产菌筛选方面迫切需要一种方-便、灵敏的筛选方法，更特别的，需要一种筛选高温下稳定的脂肪酶的工程菌的方法，为脂肪酶筛选提供新的途径。
发明内容本发明的目的在于提供一种筛选脂肪酶生产菌的方法，更特别的，为一种筛选能够表达有活性的且高温下稳定的脂肪酶的工程菌的方法。在本发明的第一方面，提供一种筛选表达脂肪酶的菌株的方法，所述的方法包括以下步骤(1)在培养基上培养脂肪酶基因表达菌，所述的脂肪酶表达菌中转化有含脂肪酶基因表达盒的表达载体，使所述的脂肪酶表达菌表达脂肪酶；和(2)将对硝基苯酚脂肪酸酯施加于培养基上，观察培养基上的菌落颜色，菌落颜色变黄的为可表达脂肪酶的菌株。在本发明的一个优选例中，所述的培养基为固体培养基，其在凝固前的PH值为7.5-9.O(优选的为7.5-8.5，更优选的为7.8-8.0)。在本发明的另一优选例中，所述的培养基为MM固体培养基，并且其中含有ra7.5-9.O的磷酸盐缓冲液。在本发明的另一优选例中，所述的对硝基苯酚脂肪酸酯选自下组碳链长为C2—U的脂肪酸的对硝基苯酚酯的一种或几种。优选的，所述的对硝基苯酚脂肪酸酯选自碳链长为C2—C8的脂肪酸的对硝基苯酚酯的一种或几种。在本发明的另一优选例中，所述的所述的碳链具有10、12、14、16或18个碳原子。在本发明的另一优选例中，在步骤(1)和(2)之间，还包括步骤将生长有所述的表达菌的培养基在40-75r的温度下放置0.5-6小时，从而在之后的步骤中获得表达高温下稳定的脂肪酶的菌株。在本发明的另一优选例中，在所述温度下放置l-5小时；更优选的，放置1.5-4小时；比如3小时。在本发明的另一优选例中，所述的表达菌选自酵母、细菌。更优选的，所述的表达菌为酵母。在本发明的另一优选例中，所述的酵母表达菌包括但不限于尸J'C力^/asfor/s1KM71、或/astorj.sX33。在本发明的另一优选例中，所述的表达载体为酵母表达载体。更优选的，所述的酵母表达载体为含有A0X1启动子的载体；更优选的，所述的酵母表达载体包括但不限于pPIC9K，或pPICZa。在本发明的另一优选例中，用无水甲醇诱导表达菌表达脂肪酶；更优选的，诱导时间约为2天。在本发明的另一优选—例中，所述的步骤包括-(a)将克隆有脂肪酶基因的酵母表达载体转化到酵母表达菌中，在MD固体培养基上培养所述的酵母表达菌，26-3rC(更优选的为27-30°C;最优选的为28-3(TC)培养至长出菌落；(b)将MD固体培养基上的酵母表达菌转接于BMGY固体培养基，26-3rC(更优选的为27-3(TC;最优选的为28-3(TC)培养24-48小时(如48小时)；(c)将BMGY固体培养基上的酵母表达菌转接于應固体培养基(PH7.5-8.5;更优选的，PH为7.8-8.0;最优选的，PH为8.0)，26-3CTC(更优选的为27-30°C;最优选的为28)培养，每隔24小时补充诱导剂诱导脂肪酶的表达；(d)将诱导适当时间的平板置于高温下放置0.5-6小时；(e)将对硝基苯酚脂肪酸酯混合物喷于固体培养基，观察固体培养基上的菌落颜色变化，菌落颜色变黄的为可表达脂肪酶的菌株。在本发明的第二方面，提供一种培养基，所述的培养基为丽固体培养基，并且其中含有PH7.5-9.0的磷酸盐(如磷酸钾)缓冲液。在本发明的另一优选例中，所述的培养基含有1.3-1.5%(更优选的1.34%)YNB，0.5-1%(更优选的为0.5%)甲醇，80-120mM(更优选的为90-110mM，如100mM)PH7.5-9,0的磷酸盐(如磷酸钾)缓冲液，1.5-2%(更优选为丄5%)琼脂。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。图1显示了KM71重组克隆在画(PH8.0)平板上的筛选，黄色菌落(即A、B箭头所指)为阳性克隆，白色克隆(即C箭头所指)为阴性克隆。图2显示了LIP2在KM71中表达6天的酶活，第6天酶活最高。具体实施例方式本发明人经过长期的研究和试验，首次发现在特定的弱碱性pH值条件下，脂肪酶(Lipase)可分解对硝基苯酚脂肪酸酯，产生黄色的对硝基苯酚，这一个颜色反应特别适用于脂肪酶生产菌的筛选，这种筛选方法不仅简便且准确，并且特别适合筛选能够分泌高温下稳定的脂肪酶的菌株。基于此完成了本发明。在一优选例中，本发明人还提供适用于该筛选方法的培养基。与该特定培养基配合使用时，可以省略筛选过程中调节pH至弱碱性的步骤，从而使得筛选方法更为简便。对硝基苯酚脂肪酸酯本发明的对硝基苯酚脂肪酸酯可选自碳链长为C2—Cw(优选的为CurC18)的脂肪酸的对硝基苯酚酯一种或几种。具体地，所述的对硝基苯酚脂肪酸酯具有如下的结构式OOCH2(CH2)nCH3N02其中，n=0-16，n为整数。脂肪酶基因可用于本发明的脂肪酶基因没有特别的限制，可以来源于细菌，也可以来源于酵母或高等真核生物。优选的脂肪酶基因来自耶氏解脂酵母(&27^^3表达宿主和表达载体用于本发明的表达菌可以是常规的酵母、细菌。优选的，所述的表达菌是酵母，比如可以是尸J'c力iapsston、KM71、或尸ic力ispsstorj'sX33等。优选的，所述的表达菌是在碱性条件下进行基因表达的菌。可用于本发明的表达载体没有特别的限制，本领域技术人员可根据所釆用的表达脂肪酶的表达菌的特性来选择合适的表达载体。优选的，本发明所用的表达载体为含有A0X1启动子的载体，所述的表达载体包括但不限于pPIC9K，或pPICZa等。培养基可用于本发明的筛选的培养基为任何一种脂肪酶生产菌能够在其上生长的培养基。更优选的，为了便于规模性筛选，所述的培养基为一种固体培养基。为了获得便于观察的颜色反应，本发明人将培养基配制成pH7.5-9.0。在本发明中，为了便于筛选到符合条件的脂肪酶生产菌，采用一种合适的固体培养基，所述的培养基能够特别明显地体现由脂肪酶介导的对硝基苯酚脂肪酸酯分解为对硝基苯酚这一颜色反应。作为本发明的一种优选方式，所述的固体培养基为一种Mi固体培养基，在配制该培养基时，其中还加入一种弱碱性的缓冲液(优选的为磷酸盐缓冲液)，从而调节其pH为7.5-9.0，然后凝固为固体培养基。所述的MM固体培养基含有1.3-1.5%(如1.34%)YNB，0.5-1%(如O.5%)甲醇，80-120mM(更优选的为90-110mM，如100mM)PH7.5-9.0的磷酸盐(如磷酸钾)缓冲液，1.5-2%(如1.5%)琼脂。本发明还提供了一种用于使脂肪酶基因的酵母表达菌稳定生长但抑制脂肪酶表达的固体培养基，即BMGY培养基。所述的BMGY固体培养基含有0.8-1.2%(更优选的为0.9-1.1%，比如1%)酵母提取物，1.5-2.5%(更优选的为1.8-2.2%，比如2%)蛋白胨，1.5-2.5%(更优选的为1.8-2.2%,比如2%)葡萄糖，80-120mM(更优选的为90-110mM，如100mM)磷酸钾缓冲液，1-1.5%(更优选的为1.2-1.4%，如1.34%)，1.2-1.8%(更优选为1.3-1.7%,如1.5%)琼脂。作为本发明的一种优选的筛选方法，包括(1)PCR扩增耶氏解脂酵母(Yarrowialipolytica)的脂肪酶基因LIP2;(2)PCR产物-构^pPIC9K-LIP2表达载体；(3)转化DH5a，酶切、测序鉴定pPIC9K-LIP2;(4)线性化(如采用SalD读框正确的pPIC9K-LIP2;(5)转化原生质体KM71;(6)转化菌液涂布于MD平板；(7)3(TC培养2天；(8)将MD平板上的转化子转接于BMGY平板，约30。C培养l天；(9)再将BMGY平板上的菌点种于醒(PH7.5-8.5)平板，约3CTC培养3天，每隔约24小时在盖子上加约150ul甲醇诱导脂肪酶的表达；(IO)将诱导适当时间的平板置于实验预期的高温下放置约3小时；(ll)将不同碳链长脂肪酸的对硝基苯酚酯喷于菌落，2-3分钟后显示与阳性同样黄色的菌落为能分泌有活性的高温稳定的脂肪酶的克隆。更优选的，还包括以培养条件和处理条件相同，但不含脂肪酶基因的表达菌为阴性对照。更优选的，还包括以其它培养条件和处理条件相同，但未放置高温的表达菌为阳性对照。本发明的主要优点在于(1)可方便地筛选到分泌有活性的脂肪酶的基因工程菌；更特别地，可方便地筛选到分泌有活性的且高温稳定的脂肪酶的基因工程菌。(2)可进行高通量筛选，结果准确、灵敏。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例l脂肪酶生产菌的筛选(1)PCR扩增脂肪酶基因LIP2根据GenBank中脂肪酶基因LIP2的基因序列设计引物，引物序列见表l。在引物上游序列的5'端引入了EcoRI位点，在引物下游序列引入了NotI位点，以将目的基因便克隆入载体pPIC9K(购自Invitrogen公司)。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>扩增程序为94。C，变性4分钟；94°C，30秒，58°C，30秒，72°C，l分30秒，扩增28个循环；72'C延伸10分钟，4。C保存。(2)表达载体pPIC9K-LIP2的构建PCR产物EcoRI，Notl(TaKaRa公司)酶切，胶回收后以T4DNA连接酶(TaKaRa公司)连入经同样酶切的载体pPIC9K(购自Irwitrogen公司)，连接产物转化大肠杆菌f.coh'DH5a感受态。酶切鉴定转化子，阳性克隆由Invitrogen公司测序。(3)毕赤酵母KM71:测序获得的读框正确的表达载体pPIC9K-LIP2经SalI(TaKaRa公司)线性化后转化KM71原生质体，转化液涂布于MD平板(包含1.34%YNB，2%葡萄糖，1.5%琼脂)，具体过程参考pPIC9K的说明书，3(TC培养至菌落形成。(4)将MD平板上的转化子转接于BMGY平板，3CTC培养1天。BMGY平板的配制:1%酵母抽提物，2%蛋白胨，1.34%YNB，1%甘油，100mM磷酸钾缓冲液，PH6.0(5)再将BMGY平板上的菌点种于MM(PH7.5-8.5)平板，30°C。培养3天，每隔24小时在盖子上加150ul无水甲醇(购自上海振兴化工一厂)诱导脂肪酶的表达。(6)将诱导3天的平板置于实验预期的高温4(TC下放置3小时。(7)鉴定能分泌有活性的脂肪酶的克隆甲醇诱导3天后，在菌落上喷25mM对硝基苯酚的不同碳链长的脂肪酸酯(脂肪酸分别具有IO、12、14、16和18个碳原子，购自Sigma公司)的等体积混合物，2分钟后观察颜色变化。同时以含空载体的KM71为阴性对照，诱导3天但未放置高温的克隆为阳性对照。变黄的菌落为阳性克隆，即为能分泌有活性的高温稳定的脂肪酶的克隆。颜色不变的克隆为阴性，如图1所示，C箭头所示的为颜色不变的克隆，A和B箭头所示的为颜色变黄的克隆。实施例2阳性克隆在液体培养基中的表达(1)接种一个经鉴定的阳性克隆于100mlBMGY(iy。酵母抽提物，2%蛋白胨，1.34%YNB，1%甘油，lOOmM磷酸钾缓冲液，ra6.0)培养液中，3CTC，250rpm培养至0D为2-6，离心获得的菌体重悬于20mlB醒Y(P/。酵母抽提物，2%蛋白胨，1.34%YNB，0.5%甲醇，lOOmM磷酸钾缓冲液，P服.O)中'每隔24小时加100ix1甲醇诱导表达，诱导表达6天。每天取样lml，离心取上清，进行SDS-PAGE电泳，第6天脂肪酶的表达量达至u最高。(2)比色法进行活性测定200iU体系中，89u1Tris-HC1，PH8.0，10ul底物pNP-myristate(对硝基苯酚癸酸酯，lul表达上清，4(TC反应10分钟，加入100nl无水乙醇终止反应。活性单位定义为每分钟水解pNP-myristate释放lug对硝基苯酚为l个酶活单位。表达第6天脂肪酶的活性达到最高。如图2所示。实施例3培养基条件的变化对于脂肪酶显色反应的影响1.培养基PH值的变化本发明人用弱酸性缓冲液(iM磷酸钾缓冲液)将培养基醒的PH值调节至ra6，MM培养基的配方等同前。检测在该培养基上进行脂肪酶显色反应、筛选菌株的情况。将BMGY平板上的菌点种于應(PH6)平板，30。C培养3天，每隔24小时在盖子上加150nl无水甲醇(购自上海振兴化工一厂)诱导脂肪酶的表达。将对硝基苯酚酯等体积混合物喷于醒平板2分钟后，几乎不显色。2.培养基状态的变化本发明人配制了液体状态的培养基(即采取与前述應培养基相同的配方，只是其中不加入琼脂)，将从BMGY平板上培养的菌接种于该液体培养基中，发现采用这种方法进行脂肪酶生产菌的筛选时，工作量太大，费时，费力，且容易污染、难以分离。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。序列表<110>上海中科伍佰豪生物工程有限公司<120>—种高通量筛选能分泌有活性脂肪酶的工程菌的方法<130>063517<160>2<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>27<212>DNA<213〉人工序列<220〉<221〉misc—feature<223>引物<400〉1caggaattcgtgtacacctctaccgag27<210〉2<211>28<212〉DNA<213〉人工序列<220〉〈221〉misc—feature<223>引物<400>2gagtttttgcggccgcttagataccaca28权利要求1.一种筛选可溶或分泌表达脂肪酶的工程菌的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤(1)在培养基上培养脂肪酶基因表达菌，所述的脂肪酶表达菌中转化有含脂肪酶基因表达盒的表达载体，使所述的脂肪酶表达菌表达脂肪酶；和(2)将对硝基苯酚脂肪酸酯施加于培养基上，观察培养基上的菌落颜色，菌落颜色变黄的为可表达脂肪酶的菌株。2.如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述的培养基为固体培养基，其在凝固前的pH值为7.5-9.0。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的培养基为MM固体培养基，并且其中含有TO7.5-9.0的磷酸盐缓冲液。4.如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述的对硝基苯酚脂肪酸酯选自碳链长为C2—dJ旨肪酸的对硝基苯酚酯的一种或几种。5.如权利要求l所述的方法，其特征在于，在步骤0)和(2)之间，还包括步骤将生长有所述的表达菌的培养基在40-75。C的温度下放置0.5-6小时。6.如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述的表达菌选自酵母、细菌。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的表达菌为酵母。8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的表达载体为酵母表达载体。9.一种培养基，其特征在于，所述的培养基为丽固体培养基，并且其中含有PH7.5-9.0的磷酸盐缓冲液。10.如权利要求9所述的培养基，其特征在于，所述的培养基含有1.3-1.5%YNB，0.5-1%甲醇，80-120mMPH7.5-9.O的磷酸盐缓冲液，1.5-2%琼脂。全文摘要本发明公开了一种筛选可溶或分泌表达脂肪酶的工程菌的方法，所述方法是利用脂肪酶能够在碱性条件下分解对硝基苯酚脂肪酸酯，产生黄色对硝基苯酚这样一个颜色反应来进行。本发明的方法可方便地筛选到可溶或分泌表达有活性的脂肪酶的基因工程菌；尤其是可溶或分泌表达有活性的且高温稳定的脂肪酶的基因工程菌。本发明的方法可进行高通量筛选，结果准确易辨。文档编号C12Q1/04GK101113464SQ20061002932公开日2008年1月30日申请日期2006年7月25日优先权日2006年7月25日发明者刘美云,魏东芝,毅龚申请人:上海中科伍佰豪生物工程有限公司