专利名称：一种肺癌易感性检测试剂盒的制作方法
—种肺痛易感性检拥试剂盒技术自本发明涉及一种疾病易感性检測甩的试剂盒，尤其是一种检測肺痛易感性&^射盒，m^4^除修复寞合物2 ( Excision Repair Cross>coqiptemeiiting Rodent Repair Deficiency, Compiementition Groiq> 2, ERCC2)的单核苷黢多态性(SNP)位点来预測个体对肺痛的易感性。
背景技术：
原发性支气管肺痛，简称肺痛，为当前世界各地最常见的恶性肿瘤之一，是一种严重rtft人^Nt康和 生兪的疾病.肿瘇细胞源于支气管粘腆或臃体，常有区域性淋巴结和血行转移，早期常有刺壤自嗽、澳 中带血等呼吸道症状，病情进展速度与细胞的生物特性有关，半个世纪以来,世界各国肺痛的发病率和病死率都有明显增布趋势,世界卫生组织(WHO)20抑年报吿 1997年^1tt界死于恶性肿瘇的共706.5万人，占死亡人数的12.6%,其中肺痛占恶性^NS究亡的19%,居 恶性肿癍死因的第一位。我国1990 1992年的抽样调査显示,在城市人口的肿痛死亡中，肺痛由原来的 第4位上升为第1位，农村上升最快的也是肺癌。云南锡矿的肺痛发病率在1954 1959年间为28.02/10 万，1960 l邻9年间为197.87/10万，1970 1979年间上升到219.10/10万，这在全世界也是罕见的，英国 著名肿癯学家R.Peto预言如果我国不及时控制吸烟和空气污染，到2025年我頃每年肺痛将超过1加万， 成为世界第一肺癌大国。病因和发病机制迄今尚未明确.一致认为肺癌的发病与下列因素有关(PR烟(包括主,烟和被动 吸烟)；②职业致痛因子，已被确认的致人类肺痛的职业因素包括石棉、无机珅化合物、二氣甲鹏、络及 其化合物、镍、氡、芥子气、氣乙烯、煤烟、焦油和石油中的多环芳烃、烟草的加热产物等；(D空气污染 (包括室内小环境和室外大环境污染)；④电离辐射⑤饮食与营养，美国纽约和芝加哥开展的前瞻性人 群观察的结果说明，食物中天然维生素A类、P胡萝卜素的摄入量与十儿年后痛症的发生虽负相关，其中 虽突出的是肺痛；⑥其他，美国癌症学会将结核列为肺癌的发病因素之一。有结核病者患肺癌的危险性是 正常人群的10倍，其主要组织学类型是鹏，此外，病毒感染、真菌毒素(黄曲雾)、机体免疫功能低下、 内分泌失调以及家族遗传等因素，对肺痛的发生可能也起一定的综合作用。近年研究表明，肺痛的发生与某些痛基因的活化及抑痛基因的失活密切相关。己经证明的几个痛基因 家族包括弓應突变的ras族、放大基因的myc族、C《rB2、机制不明的bcl-2、 Kit及由野生型变异的抗痛 基因p53、 p16和RB等。大量研究表明C-myc、 L"inyc、 N-myc和RAF在小细跑肺痛中均有过度表达。 非小细胞肺痛中则常可见ras族基因的过度表达。这些深入的研究将为基因预防和治疗肺 供理论基础.ERCC2，位于第13号染色体19ql3.3位置，共有23个外显子，基因全长19.咏b， mRNA全长2355bp, 编码含761个氨基酸的蛋白。由ERCC2编码的蛋白参与转录偶联的核苷酸切除修复，它可识别与修复结 构无关的大范围的损伤，如大的加合物和胸腺" 啶二聚体，并且是基本转录因子复合物BTF2/TFIffl的一 个组成成分。该蛋白具有ATP依赖性的DNA解旋活性，并且属于RAD3/XPD解旋酶亚家族。ERCC2的 功能缺失导致基本转录因子复合物不能正确识别DNA损伤位点，从而使碱基切除條复无法正确进行，导 致DNA上的致癌损伤积累。ERCC2基因的突变或者失活可能导致的疾病包括癌症、着色性千皮病、毛 发瑰营养不良、柯凯因氏综合症。SNP(single nucleotide polymorphism),即单核苷酸多态性标记，是一类基于单 ￡$异引起的鹏A 多Stt,被遗传学界称为第三代遗传标记。主要是指由基因组核苷酸水平上的变昇引起的DNA序列多态性，包括单碱基转换、頫换，以及单碱基的插入/缺失等。它是基因组中最为广泛存在的一类多态性标记，占 大约90%。这些基因组序列变异可以导致个体间表型的差异以及不同个体对疾病，特别是寞杂疾麻的易感 性、和对环境因素、药物反应的差异。rel799793是位于第19号染色体ERCC2基因第十号外显子段Asp312Asn的G/A多态.世界人群中的 频率约为G:A=0.778:0.222，中国人群中的频率约为G:A=0.94:0.06。目前的多项9F究表明，该位点的多态 会导致ERCC2参与构成的转录因子复合物的性能发生弱化，从而使得对DNA拫伤修复的能力下降，转录 因于的酡力也同时发生下降，导致一系列诸如肺癌，前列腺痛等疾病的发生，BRCC2Asp3! A幼多东性与 肺痛特别是肺艉痛发生有显著关联，该位点的多态现象被认为是中国人群中脚痛通传昼感因素之一， rel799793位点携带A型即为肺痛易感型。发明内容基于ERCC2基因上的rsl799793号SNP位点可用来评估个体对HWt的易感性的^illl上，本发明提供 一种^M肺痛易感性的试剂盒。该试剂盒包括检渕ERCC2基因SEQ ID NO: 1中第156位SNP的特异性引物对及特异性荧光mK Taq瞎、dNTP混合液、MgCl:溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、去离子水.本试剂盒中所述的特异性引物对是指针对SEQ ID NO: 1中第156位SNP位点而设计，,异性扩坩 出SEQ ID NO: 1中包含第156位SNP位点的DNA片段的引物对。设计这类引物对是本领^ft术人员能够 轻驀完成的.优选地，试剂盒中包含具有SEQ ID NO: 2和3所示序列的引物对.特异性争l物对可用常规 的合成技术进行合成.本领域的技术人员能够理解，本发明的引物不限于这两对引物。本试剂盒中所述的特异性荧光探针是指针对SEQ ID NO: 1中第156位SNP位点而设计，能通过荧光 定量PCR技术特异性检翻出这个SNP位点肺痛易感基因型的探针。设计这类探针是本领域技术人员齙够轻 易完成的，优选地，试剂盒中包含具有SEQ ID NO: 4所示序列的T叫man探针，特异性荧光探针可甩常规 的合成技术进行合成，本领域的技术人员能够理解，本发明的特异性荧光探针不限于这条探针，所有可用 于荧光定量PCR检測SEQ ID NO: 1中第156位SNP位点的探针均在本发明范围内。本发明试剂盒的组分和含量包括10 X荧光定量PCR反应缓冲液， 0. 25nM dNTP混合液， 0.6pl 25dM MgCl,溶液， 0.025pl (5units/(xl) Taq DNA i^瞎， 20jiM特异性引物对(两条)各0.225ji1, 10|iM特异性荧光探针0.25nl ， 去离子水5. 575|il。本试剂盒供一人份检測应用，试剂盒的保存温度为-20r,具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步鹏述本发明.下列实施併中未注明具体条件的实验方法，通常接照常规 条件，或按照厂商所建议的条件。实膽例l.检拥试剂盒的使用 步ilh DNA模板的抽取 用硅胶吸附法抽提口腔上皮细胞的基因组咖A。 步,2:荧光定量PCR反应使用可检測肺痛易感性的荧光定撒PCR检测试剂盒，其中，含有下列引物对和荧光探针 有义引物5' - ATCAAAGAGACAGACGAGCA -3'(SEQ ID NO: 2) Tm值为58X7 反义引物5' - TCAGGAAGCCCAGGAAAT -3' (SEQ ID NO: 3) "nn值为54lC 荧光探针5,墨TCCCCAACGAAGTGCTGCAG -3' (SEQ ID NO: 4) Tm值为64TC 荧光定l:rcR反应体系为总体积10nl，包含浓度为20ngAi1的DNA模板2jd、 10X荧光定l: PCR
反应缓冲液、0. lpl 25nU dNTP混合液、0.6 tl 25nM MgCl,溶液、0.025 il (5units/|il) T關DNA聚合酶、 20一的有义引物和反义引物各0.225(*1、 10(iM的荧光探针0.25n1,去离子水5. 575(il。在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为501C、 2分钟，诉1C、 IO分钟，进行60个循环的 951C、 30秒，601C、 l分钟。反应结束后在旭I7900型荧光定豕PCR仪上读取样品荧光量，步骤3: SNP基因型分析将荧光定量PCR仪上显示的康终样品荧光量和正常对照相对比，荧光探针最终的荧光侑号明显高于正 常对照，说明被检測DNA的ERCC2基因上nil799793号SNP位点基因型携带有A型，为肺痛易感型，实旌树2.指导人们主动预防肺癌的服务目前在上海主健生物工程有限公司已经开展了这项股务。 步骤l: DNA提取对被检翻者进行胆务前咨询，由被检Sf者签署知情同意书，填写生活饮食习愤问巻调査表。依照取样 盒中的指示使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用硅胶吸附法进行口腔上皮细魔的加A抽提。 步拥2:基因分型检測使用本发明提供的试剂盒，对被检糖者鹏A的ERCC2基因上的rel799793号SNP位点进行荧光定量 PCR检測，确定该SNP位点的基因型。步骤3:指导人们主动预防肺癌通过对被检掷者SNP基因型的分析，出具基因分型检翻报吿和被检測者个体化镶康指导报吿.基因检 拥报吿详细说明了被检獮者肺痛易感程度的高低以及患病的概率大小*个体化錄寒指导报吿以被^M者的 基理分型检謝结果为基础，结合其生活饮食习惯问巻调査结果，评估被检獮者肺痛通传易感的柑对风险。 同时制定出针对于被检渊者的个性化健康行动方案，方案包括在饮食习愤、生活方式上的改进建议等，并 为被检糖者普及预防肺痛的健康知识。序列表aio>上海主健生物工程有限公司 <1加> —种肺鹰易感性检測试剂盒<1抑> 4<210> 1 <211> 300 <212> DNA<213>人厲，人种(H咖o sapiens, human)<柳> 1gcc稱ccccctcccagccccagctcatctctccgcaggatcaaagagacctgacgagcagc60gcc敏gggac胸taccggcgtctggt肪鄉ggctgcgg鹏gccagcgccgcccggg120agacggacgcccacctggccaaccccgtgct飲ccgacgaagtgctgcagggtgagcccc180gaccccccgctgcccccccagtccctttcccgcctccccgtcgccgctgatagcgtctcc240tcgcagaggcagtgcctggctccatccgcac鹏cgagc8tttcctgggcttcctgaggc加O<210> 2 <211> 20 <212>讽A <21 >人工序列<2加><223>引物 <柳> 2atcaaagaga cagacgagca 20<210> 3 <211> 18 〈212>咖A <213>人工序列<226><223>引物<400> 3toaggaagcc caggaaat6
<210> 4 <211> 20微腿 <213>人工序列<2加><223>探针 <柳〉4tgccc助c辟agtgctgcag 20
权利要求
1.一种用于检测肺癌易感性的试剂盒，其特征在于包括检测ERCC2基因SEQ ID NO1中第156位SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、去离子水。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的特异性引物对是指针对SEQIDNO: 1中第156位SNP位点而设计，能特异性扩增出包含SEQ ID NO: 1中第156位SNP位点的DNA片段的引物对.
3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的特异性荧光探针是指针对S抑IDNO: 1中第 156位SNP位点而设计，能通过荧光定重PCR技术特异性检渊出该SNP位点胂痛易感基因型的探针，
4. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所含的特异性引物对选自具有S印IDNO: 2和3所 示序列的引物对，
5. 根据权利要求l所述的试剂盒，其特征在于所含的特异性荧光探针选自具有SEttIDNO: 4所示 序列的Taqnan探针。
6. 根据权利要求l所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括lfil IOX荧光定量PCR反 应缓冲液，0. lfU 25mM dNTP混合液，0.6|il 25mM MgCl2溶液，0.025(il (5units/pl) Taq DNA聚合瞎， 20jiM特异性引物对(两条)各0.225fJ, 10fiM特异性荧光探针0.25fi1,去离子水5. 575jil。本试剂盒供 —人份检拥应用，试剂盒的保存温度为-20iC。
全文摘要
本发明公开了一种用于检测肺癌易感性的试剂盒。该试剂盒包括检测ERCC2基因SEQ ID NO1中第156位SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针、用于荧光定量PCR检测的常规组件等。本发明的试剂盒通过检测分析个体的ERCC2基因上SNP位点基因携带型来预测个体对肺癌的易感性。
文档编号C12Q1/68GK101131360SQ20061003038
公开日2008年2月27日 申请日期2006年8月25日 优先权日2006年8月25日
发明者冯哲民, 邹祖烨 申请人:上海主健生物工程有限公司