专利名称：耐低温杜氏藻的诱变、选育及其鉴定方法
技术领域：
本发明涉及一种杜氏藻，尤其是涉及一种单细胞绿藻——杜氏藻属中的两个种，巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)和盐生杜氏藻(Dunaliella salina)，以及采用紫外线诱变、选育获得这两种杜氏藻的耐低温突变株及其鉴定的方法。
背景技术：
杜氏藻(Dunaliella sp.)又称盐藻，是一类单细胞真核绿藻，天然没有细胞壁，容易被消化。杜氏藻细胞中灰分含量较低，富含甘油、蛋白质、β-胡萝卜素、碳水化合物以及一定量的不饱和脂肪酸和维生素，是较为理想的保健食品之一，也可以作为动物的优质饵料和饲料，因此成为人类主要的养殖微藻之一，在商业开发中具有很高的利用价值。杜氏藻最适生长温度为25～30℃，当温度低于10℃时，杜氏藻生长缓慢，甚至不生长，形成胞囊细胞。冬季气温低，杜氏藻难以露天养殖。因此世界几个主要的杜氏藻养殖国家，如澳大利亚、美国和以色列都只能在热带或亚热带的气温较高的地区进行养殖，在气温较低的冬季整个养殖场只能闲置，导致养殖场的经济效益不够高。如果能获得一种能在较低温度(5～10℃)下还能基本正常生长的杜氏藻，则既能明显提高现有杜氏藻养殖场的经济效益，又能使杜氏藻的养殖区北移(北半球)和/或南移(南半球)，具有十分显著的作用。参见以下文献1.Ben-Amotz A，Avron M.The biotechnology of mass culturing Dunaliella forproducts of commercial interest.InCresswell R C et al.eds.Algal andCyanobacterial Biotechnology.Longman Scientific and Technocial Press.198990～114.
2.Sambrook J，Fritsch E F，Maniantis T.Molecular CloningA Laboratory Mannual(2nd).Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989.(金冬雁，黎孟枫等译.分子克隆实验指南(第二版).北京科学出版社，1996).
3.Ginzburg M.Dunaliellaa Green Alga Adapted to Salt[J].Advances in BotanicalResearch，1987，1493-183.
4.张会勇，刘广发，林慧馨.杜氏藻种间关系RAPD分析[J].厦门大学学报(自然科学版)，2001，40(6)1289-1294.
5.游兰英，刘广发，林建明.杜氏藻同步化生长及核型分析[J].厦门大学学报(自然科学版)，1997，36(2)276-281.
6.古玉环，陈军.盐生杜氏藻Dunaliella salina的生物学特性与培养研究[J].西北师范大学学报，1995，4(31)52-55.
7.郑维发，曾昭琪.淡水蓝藻的低温适应.湖泊科学，1994，6(4)356-361.
8.姜建国，朱跃辉，黄洋.10L容积光生物反应器批次培养盐藻的初步研究[J].食品与发酵工业，2004，30(11)6～10.
发明内容
本发明的目的在于针对现有的杜氏藻难以在低温下诱变、选育等问题，提供一种耐低温杜氏藻突变株以及采用紫外线诱变、选育耐低温杜氏藻的技术路线及其鉴定方法。本发明的技术方案是以紫外线诱变的方法获得在低温(3～10℃)下还能基本正常生长的突变藻株。
本发明所述的耐低温杜氏藻突变株的特征为(1)在3～10℃下光照培养还能基本正常生长，达到(1.05～8.11)×106个细胞/mL；(2)杜氏藻耐低温突变株与野生型原出发株之间的遗传相似系数I为0.680～0.910；(3)杜氏藻耐低温突变株与野生型原出发株相比，在进行SDS-PAGE电泳时将出现一至若干条新的蛋白带，如在大约36和158kDa处各多出一条新的蛋白带，同时也可能丧失一至若干条蛋白带；或在某一位置的蛋白带前者比后者的表达量高，如在大约27和29kDa处耐低温突变株表达的蛋白量比野生型原出发株高，或者反过来的情况也有出现。
本发明所述的耐低温杜氏藻的诱变、选育及其鉴定方法的具体步骤如下1)将杜氏藻的人工海水培养基分装封口、灭菌；2)取出灭菌过的培养基，冷却至室温后，接种杜氏藻；3)分别经光照和黑暗的光周期诱导，杜氏藻出现同步化生长；4)取出藻液，以碘液或溴酚蓝液混匀藻液，灭活杜氏藻，取样计算藻液中杜氏藻细胞的密度；5)取处于指数生长期细胞分裂阶段的杜氏藻藻液，倾注于培养皿中，置紫外灯下照射进行诱变，然后暗培养；6)将暗培养后的藻液和新鲜培养液混匀，涂布到杜氏藻固体培养基上，低温光照培养；7)挑取生长迅速的单藻落分别接种到少量培养液中，在低温光照下扩大培养；8)取步骤7)所得的杜氏藻和野生型原出发株移接到含新鲜培养液的容器中扩大培养；9)取样检测、比较杜氏藻耐低温突变株和野生型原出发株在低温光照下的生长曲线；10)提取各杜氏藻耐低温突变株和野生型原出发株的总DNA，并以10聚核苷酸随机引物对这些总DNA进行随机扩增多态DNA(RAPD)比较；
11)根据比较的统计数字计算杜氏藻耐低温突变株和野生型原出发株之间的遗传相似系数；12)提取杜氏藻耐低温突变株和野生型原出发株的总蛋白质进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，电泳结束后用考马斯亮蓝R250染色，扫描记录结果；13)比较杜氏藻耐低温突变株和野生型原出发株两者的蛋白电泳图谱，找出杜氏藻耐低温突变株和野生型原出发株之间的共同点与不同之处；14)根据在低温环境下基本能正常生长的新特征和RAPD研究及蛋白质分析结果，确认获得耐低温杜氏藻突变株。
在步骤1)中，配制培养杜氏藻的人工海水培养液的组成如表1。将人工海水培养液分装在100～250mL的锥形瓶中，每瓶装量20～50mL，棉花塞塞紧或用8层纱布封口，包上牛皮纸。将包装好的培养液放置在高压蒸汽灭菌锅中，121℃，压力0.1mPa灭菌15～20min。
在步骤2)中，取出灭菌过的培养液，冷却至室温后，在超净工作台中取1～5mL杜氏藻藻液接种在无菌培养液中，轻轻摇匀，重新塞上棉花塞或封好纱布。
在步骤3)中，所述的光照和黑暗的光周期诱导是在20～30℃的培养箱中每天2000～4000烛光(lx)光照12h，黑暗12h，连续培养2～5d；可以是静止培养，每天手摇数次，每次10～20s；或在摇床上以30～150rpm的速度摇动。获得同步化生长的杜氏藻。
表1杜氏藻培养液组成
在步骤4)中，可每天或隔天取出0.3～0.5mL藻液，以等量的碘液或溴酚蓝液混匀藻液，灭活杜氏藻。立即取样在血球计数板上计算藻液中杜氏藻的密度。重复计数3次，取平均值，绘制杜氏藻的生长曲线。所用的碘液为碘1g，碘化钾2g，蒸馏水100mL。先用少量蒸馏水溶解碘和碘化钾，待完全溶解后再定容到100mL。所用的溴酚蓝溶液为0.25％的溴酚蓝溶解在40％的蔗糖溶液中。杜氏藻藻液细胞密度的计算也可以用光密度法。即取出适量藻液，注入比色杯中，在OD630处读取数值，依据公式“细胞密度＝899.08×OD630-12.544”换算成藻液细胞密度。以杜氏藻培养时间为横轴，以培养液中的藻细胞密度为纵轴，绘制杜氏藻的生长曲线。
在步骤5)中，取处于指数生长期细胞分裂阶段的杜氏藻藻液倾注于无菌培养皿中，置超净工作台中紫外灯下照射进行诱变，所用超净工作台应事先擦净并以紫外线杀菌15～20min；每个无菌培养皿中约盛5～30mL藻液；超净工作台中的紫外灯为20～30瓦，紫外灯与培养皿的距离为12～18cm，紫外线照射时间为50～100s；照射后关闭紫外灯，盖上培养皿盖，用不透光的纸包好培养皿进行暗培养；暗培养的温度为20～30℃，时间为48～72h。
在步骤6)中，可将暗培养后的藻液和新鲜培养液按1∶(1～10)的比例混匀，吸取均匀藻液50～500μL涂布到杜氏藻固体培养基上。杜氏藻涂抹到固体培养基上后，培养皿要倒扣培养防止水珠产生，并以封口膜密封上下皿盖间的缝隙，防止培养基水分逃逸。所述的杜氏藻固体培养基指的是在杜氏藻人工海水培养液中添加1.0％～2.0％的琼脂；在低温3～10℃、光照度1000～4000lx、24h光照培养。
在步骤7)中，所述的单藻落是指由单个杜氏藻细胞长成的细胞集落；所述的生长迅速的单藻落是指在同等条件下长得比较大的藻落；以无菌接种环挑取较大藻落的藻细胞分别接种到含3～8mL杜氏藻培养液的试管中，在低温3～10℃、光照度1000～4000lx、24h光照的光照培养箱中扩大培养。所述的培养杜氏藻的试管应斜放成15～45°，每天手工摇动数次，每次10～20s，或在摇床上以30～150rpm的速度摇动。
在步骤8)中，所述的扩大培养可在无菌超净工作台中取各诱变藻液和对照藻液0.5～2.0mL，加入到装有50～200mL杜氏藻培养液的锥形瓶中，塞上棉花塞或封好纱布，其标准就是使各藻液的起始细胞密度(OD值)尽可能一致或十分接近；放在3～10℃、1000～4000lx、24h光照的光照培养箱中，每天手工摇动数次，每次10～20s；或在摇床上以30～150rpm的速度摇动。
在步骤9)中，所述的取样检测是指每1～3d取出0.5～4.0mL藻液，按步骤4)所述方法测定各藻液的细胞密度。
在步骤10)中，所述的提取总DNA，是指按常规方法提取植物总DNA，在紫外分光光度计上检测该DNA的OD260与OD280的比值。若该比值小于1.8，则说明DNA的纯度不够，应进一步提纯；若该比值大于或等于1.8，则可以进行下述实验。所述的10聚核苷酸随机引物是指计算机随机设计的、由10个脱氧核糖核苷酸组成的单链DNA；所述的随机引物对总DNA进行随机多态性扩增是指以各藻的总DNA为模板，分别以单链10聚核苷酸为引物进行的PCR扩增反应。反应产物经琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖含量0.8％～1.2％)，在凝胶成像系统扫描和记录。所选取的引物至少要达到25～30个，每个引物至少重复进行两次PCR反应，两次都出现同样的条带才能认可该引物的扩增结果。从这些扩增结果中遴选条带清晰、重复性良好的引物进行正式扩增。
在步骤11)中，所述的计算杜氏藻耐低温突变株和野生型原出发株之间的遗传相似系数，其公式为I＝2Nij/(Ni+Nj)。式中Ni+Nj为两样品经过随机引物扩增后各自显示的带数之和，Nij为两样品共有的带数。
在步骤12)中，所述的提取杜氏藻耐低温突变株和野生型原出发株的总蛋白质可采用对细胞反复冻融裂解的方法分别提取杜氏藻耐低温突变株和野生型原出发株的总蛋白质，保持两者蛋白浓度的一致性；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的分离胶浓度为10％～12％，浓缩胶浓度为4％～5％。
在步骤13)中，所述的比较杜氏藻耐低温突变株和野生型原出发株两者的蛋白电泳图谱是指检测杜氏藻耐低温突变株和野生型原出发株两者之间的蛋白泳带是否有增加或/和减少，或者在两者蛋白浓度基本一致的条件下，其中一条或几条的蛋白泳带比对方相对位置上的蛋白更浓些(含量更高)或更淡些(含量更低)。
由于突变株具有稳定的可在较低温度(3～10℃)下生长的新特点，同时RAPD和SDS-PAGE检测都证明突变株与原出发株在DNA和蛋白质水平基本相同，但也都各自出现一些不同的突变，因此可以确定已经获得耐低温杜氏藻突变株。
杜氏藻养殖一般都是在露天的浅池中进行，气候因素对其生长具有决定性的影响。具备耐低温特征的杜氏藻将能显著延长杜氏藻的露天养殖时间，大大提高养殖场的生产效率；此外耐低温杜氏藻还能使杜氏藻的养殖区域北移，有利于开辟我国北方养殖杜氏藻的新局面。可见，本发明获得在低温(3～10℃)下还能基本正常生长的突变藻株，这必将对延长杜氏藻的一年中的养殖周期、提高养殖场的经济效益具有重要意义。成功诱变、培育耐低温的杜氏藻具有重要的经济意义和应用价值。
图1为耐低温巴氏杜氏藻突变株L-5和野生型原出发株在5℃的生长曲线。在图1中，横坐标为培养天数/d，纵坐标为细胞数量(×106个/cm3)，Ba代表野生型原出发株。
图2为耐低温巴氏杜氏藻突变株L-5和野生型原出发株的RAPD扩增图谱。在图2中，M代表DNA分子量标志物，其单位为bp，即碱基对；图上方的英文字母和数字的组合(S260、S264、S265)代表各种10聚寡核苷酸随机引物；5148、2027、1375和831分别代表DNA分子量为5148、2027、1375和831个碱基对。
图3为耐低温巴氏杜氏藻突变株L-5和野生型原出发株用另三种10聚寡核苷酸随机引物的RAPD扩增图谱。在图3中，M代表DNA分子量标志物，其单位为bp，即碱基对；图上方的英文字母和数字的组合(S282、S283、S284)代表各种10聚寡核苷酸随机引物；5148、2027、1375和947代表分别代表DNA分子量为5148、2027、1375和947个碱基对。
图4为耐低温巴氏杜氏藻突变株L-5与野生型原出发株的蛋白SDS-PAGE电泳图谱。其中M代表蛋白质分子量标志物，其单位为kDa(千道尔顿)；Ba代表野生型原出发株。在大约36和158kDa处L-5比野生型原出发株各多出一条新的蛋白带，同时在大约27和29kDa处L-5表达的蛋白量比对照高得多。图右侧的数字158、116、66、56、43、36和27分别代表蛋白质分子量为158、116、66、56、43、36和27kDa(千道尔顿)。
具体实施例方式以下实施例将对本发明作进一步说明。
实施例1采用紫外线诱变、培育耐低温杜氏藻，先配制培养巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)的人工海水培养液，将各成分事先分组配成50～1000倍的母液，使用时再按需稀释配制成培养液。配制培养杜氏藻的人工海水培养液的组成如表1所示。将人工海水培养液分装在100mL的锥形瓶中，每瓶装量20mL，棉花塞塞紧，包上牛皮纸。把包装好的上述培养液放置在高压灭菌锅中，121℃，压力0.1mPa灭菌15min。取出灭菌过的培养基，冷却至室温后，取1mL巴氏杜氏藻藻液接种在无菌培养液中，轻轻摇匀，塞上棉花塞。在20℃的培养箱中每天光照12h，4000Lx，黑暗12h。连续培养2d，获得同步化生长的巴氏杜氏藻，即从暗培养6h后到光照培养开始2h内，巴氏杜氏藻出现大量的细胞分裂现象。每天定时取出藻液0.3mL，以等量的碘液灭活巴氏杜氏藻，取样用血球计数板计算藻液中巴氏杜氏藻细胞的密度。超净工作台事先打开紫外灯杀菌15min。取处于指数生长期的细胞分裂阶段(即从暗培养6h后到光照培养开始2h内)的巴氏杜氏藻藻液，倾注于无菌培养皿中，每皿5mL。置超净工作台中20w紫外灯下，距离12cm照射100s进行诱变，20℃暗培养72h。将暗培养后的藻液和新鲜培养液以1∶1混匀，吸取混匀藻液50μL涂布到含琼脂1.0％的杜氏藻固体培养基上，低温5℃光照1000lx，不间断光照培养。挑取生长迅速的单藻落分别接种到含3mL杜氏藻培养液的试管中，15°斜放，在5℃以1000lx的光照强度不间断培养，每天手摇数次至藻液呈深绿色。取0.5mL上述长成的杜氏藻藻液移接到含50mL新鲜培养液的锥形瓶中，在5℃以1000lx的光照强度不间断培养，每天手摇数次，每次10～20s。每3天取样0.5mL在血球计数板计数藻液中耐低温杜氏藻突变株和野生型原出发株在低温培养时的细胞密度，描绘出各自的生长曲线(参见图1)。由图1可见，L-5在低温5℃的情况下仍能基本正常生长，而野生型原出发株在第48d就已进入生长平衡期，且藻液的细胞密度低得多。实验观察到，在5℃光照培养箱中培养，耐低温杜氏藻突变株L-5藻液的细胞密度逐渐增大，经过57d培养，其藻液细胞密度达到8.11×106个细胞/mL，是原始细胞密度的33.8倍，是野生型原出发株的2.59倍；野生型原出发株一直到第24d都没有明显增长，从第27d才缓慢进入指数生长期，而到第48d就已经达到生长平衡期，其最终藻液密度仅为3.13×106个细胞/mL。提取各杜氏藻总DNA，经检测纯度合格后，以25个10聚核苷酸随机引物对这些总DNA进行随机扩增多态DNA(RAPD)比较研究；每个引物至少重复进行两次PCR反应，并将反应产物在含琼脂糖0.8％的凝胶上进行电泳。两次都出现同样的条带才能认可该引物的扩增结果。实验发现，其中1个引物不产生任何条带，7个引物产生不清晰和无法检测的产物，17个能产生多态性条带。从中遴选条带清晰、重复性良好的12个引物(参见表2)进行正式扩增。实验共检测到125个位点，其中11个引物扩增出差异条带(参见图2)。
表2 12个10聚核苷酸随机引物序列及其扩增结果
根据上述统计数字计算耐低温杜氏藻突变株与野生型原出发株间的遗传相似系数I，I＝2Nij/(Ni+Nj)。式中Ni+Nj为两样品经过随机引物扩增后各自显示的带数之和，Nij为两样品共有的带数。根据表1计算耐低温杜氏藻突变株L-5和野生型原出发株间的遗传相似系数I为0.768，符合变异株的特征。提取耐低温杜氏藻突变株和野生型原出发株的总蛋白质进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。分离胶浓度为10％，浓缩胶浓度为4％。电泳结束后用考马斯亮蓝R250染色，扫描记录结果(参见图3)。比较两者(耐低温杜氏藻突变株和野生型原出发株)的蛋白电泳图谱(参见图3)，可以看到，在大约36kDa和158kDa处耐低温杜氏藻突变株L-5比野生型原出发株各多出一条新的蛋白带，同时在大约27kDa和29kDa处耐低温杜氏藻突变株L-5表达的蛋白量比原出发株高得多(箭头指处)。根据在低温环境(5℃)下基本能正常生长的新特征和RAPD研究及蛋白质分析结果，确认已经获得耐低温巴氏杜氏藻突变株。
实施例2与实施例1类似，其区别在于配制培养盐生杜氏藻(Dunaliella salina)的人工海水培养液，将人工海水培养液分装在250mL的锥形瓶中，每瓶装量50mL，8层纱布封口，包上牛皮纸。把包装好的上述培养液放置在高压灭菌锅中，121℃，压力0.1mPa灭菌20min。取出灭菌过的培养液，冷却至室温后，取5mL盐生杜氏藻藻液接种在无菌培养液中，轻轻摇匀，8层纱布封口。在30℃的培养箱中每天光照12h，2000Lx，黑暗12h。连续培养5d，获得同步化生长的盐生杜氏藻，即从暗培养6h后到光照培养开始2h内，盐生杜氏藻出现大量细胞分裂。隔天定时取出藻液0.5mL，以等量的溴酚蓝液混匀藻液，灭活盐生杜氏藻，取样用血球计数板计算藻液中盐生杜氏藻细胞的密度。超净工作台事先打开紫外灯杀菌20min。取处于指数生长期的细胞分裂阶段(即从暗培养6h后到光照培养开始2h内)的盐生杜氏藻藻液，倾注于无菌培养皿中，每皿30mL。置超净工作台中30w紫外灯下距离18cm照射50s进行诱变，30℃暗培养48h。将暗培养后的藻液和新鲜培养液以1∶10的比例混匀，吸取混匀藻液500μL涂布到含琼脂2.0％的杜氏藻固体培养基上，低温3℃光照强度4000lx，不间断光照培养。挑取生长迅速的单藻落分别接种到含8mL杜氏藻培养液的试管中，45°斜放，在3℃以4000lx的光照强度，10rpm摇床培养至藻液呈深绿色。取2.0mL上述长成的盐生杜氏藻藻液移接到装有200mL新鲜培养液的锥形瓶中，在3℃以3000lx的光照强度，150rpm摇床培养。每天取样4.0mL在分光光度计检测耐低温盐生杜氏藻突变株和野生型原出发株在低温培养时的藻液细胞密度，描绘出各自的生长曲线。实验观察到，在本培养条件下，耐低温盐生杜氏藻突变株藻液的细胞密度逐渐增大，经过60d培养，其藻液密度达到1.05×106个细胞/mL，是原始细胞密度的29.2倍。野生型原出发株一直没有明显增长，实验结束时其最终藻液细胞密度仅为0.051×106个细胞/mL。提取耐低温盐生杜氏藻突变株和野生型原出发株总DNA，经检测纯度合格后，以30个10聚核苷酸随机引物对这些总DNA进行随机扩增多态DNA(RAPD)比较研究。每个引物至少重复进行两次PCR反应，并将反应产物在含琼脂糖1.2％的凝胶上进行电泳。两次都出现同样的条带才能认可该引物的扩增结果。实验发现，其中2个引物不产生任何条带，9个引物产生不清晰和无法检测的产物，19个引物能产生多态性条带。从中遴选条带清晰、重复性良好的16个引物进行正式扩增。实验共检测到136个位点，其中14个引物扩增出差异条带。
根据上述统计数字计算耐低温盐生杜氏藻突变株与野生型原出发株间的遗传相似系数I，I＝0.680，符合变异株的特征。提取耐低温盐生杜氏藻突变株和野生型原出发株的总蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。分离胶浓度为12％，浓缩胶浓度为5％。电泳结束后用考马斯亮蓝R250染色，扫描记录结果。比较两者(耐低温盐生杜氏藻突变株与野生型原出发株)的蛋白电泳图谱。可以看到，在大约37kDa和150kDa处耐低温盐生杜氏藻突变株比野生型原出发株各多出一条新的蛋白带。根据在低温环境(3℃)下基本能正常生长的新特征和RAPD研究及蛋白分析结果，确认已经获得耐低温盐生杜氏藻突变株。
实施例3与实施例1类似，其区别在于配制培养巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)的人工海水培养液，将人工海水培养液分装在150mL的锥形瓶中，每瓶装量30mL，棉花塞塞紧，包上牛皮纸。把包装好的上述培养液放置在高压灭菌锅中，121℃，压力0.1mPa灭菌15min。取出灭菌过的培养液，冷却至室温后，取3mL巴氏杜氏藻藻液接种在无菌培养液中，轻轻摇匀，塞上棉花塞。在25℃的培养箱中每天光照12h，3000Lx，黑暗12h。连续培养3d，获得同步化生长的巴氏杜氏藻，即从暗培养6h后到光照培养开始2h内，巴氏杜氏藻出现大量的细胞分裂。每天定时取出藻液5mL，在分光光度计检测藻液的OD630数值，换算成藻液中巴氏杜氏藻细胞的密度。超净工作台事先打开紫外灯杀菌15min。取处于指数生长期的细胞分裂阶段(即从暗培养6h后到光照培养开始2h内)的巴氏杜氏藻藻液，倾注于无菌培养皿中，每皿20mL。置超净工作台中25w紫外灯下距离15cm照射70s进行诱变，25℃暗培养60h。将暗培养后的藻液和新鲜培养液以1∶5的比例混匀，吸取200μL涂布到含琼脂1.5％的杜氏藻固体培养基上，低温10℃，光强3000lx，不间断光照培养。挑取生长迅速的单藻落分别接种到含5mL杜氏藻培养液的试管中，30°斜放，在10℃以3000lx的光照强度不间断培养，每天手摇数次，每次10～20s，培养至藻液呈深绿色。取1.0mL上述长成的巴氏杜氏藻藻液移接到含100mL新鲜培养液的锥形瓶中，在10℃以2000lx的光照强度不间断培养，每天手摇数次，每次10～20s。每3天取样1.5mL在分光光度计测OD630数值，换算成藻液中耐低温巴氏杜氏藻突变株和野生型原出发株在低温培养时的细胞密度，描绘出各自的生长曲线。实验观察到，在10℃光照培养下，耐低温巴氏杜氏藻突变株藻液的细胞密度逐渐增大，经过60d培养，其藻液细胞密度可达7.88×106个细胞/mL，是原始细胞密度的31.2倍，是野生型原出发株的2.32倍；野生型原出发株一直到第21d都没有明显增长，从第24d开始才缓慢进入指数生长期，而到第45d就已经达到生长平衡期，其最终藻液细胞密度仅为3.40×106个细胞/mL。分别提取耐低温巴氏杜氏藻突变株和野生型原出发株的总DNA，经检测纯度合格后，以28个10聚核苷酸随机引物对这些总DNA进行随机扩增多态DNA(RAPD)比较研究。每个引物至少重复进行两次PCR反应，并将反应产物在含琼脂糖1.0％的凝胶上进行电泳。两次都出现同样的条带才能认可该引物的扩增结果。实验发现，其中3个引物不产生任何条带，5个引物产生不清晰和无法检测的产物，20个能产生多态性条带。从中遴选条带清晰、重复性良好的15个引物进行正式扩增。实验共检测到135个位点，其中13个引物扩增出差异条带。
根据上述统计数字计算耐低温巴氏杜氏藻突变株与野生型原出发株间的遗传相似系数I，I＝2Nij/(Ni+Nj)。式中Ni+Nj为两样品经过随机引物扩增后各自显示的带数之和，Nij为两样品共有的带数。经计算，耐低温巴氏杜氏藻突变株和野生型原出发株间的遗传相似系数I为0.910，符合变异株的特征。分别提取耐低温巴氏杜氏藻突变株和野生型原出发株的总蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。分离胶浓度为11％，浓缩胶浓度为4％。电泳结束后用考马斯亮蓝R250染色，扫描记录结果。比较两者(耐低温巴氏杜氏藻突变株和野生型原出发株)的蛋白电泳图谱。可以看到，耐低温巴氏杜氏藻突变株比野生型原出发株多出两条新的蛋白带，同时在大约67kDa处，前者表达的蛋白量比后者高得多。根据在低温环境(10℃)下基本能正常生长的新特征和RAPD研究及蛋白质分析结果，确认已经获得耐低温巴氏杜氏藻突变株。
实施例4与实施例1类似，其区别在于配制培养盐生杜氏藻(Dunaliella salina)的人工海水培养液，将人工海水培养液分装在200mL的锥形瓶中，每瓶装量40mL，8层纱布封口，包上牛皮纸。把包装好的上述培养液放置在高压灭菌锅中，121℃，压力0.1mPa灭菌20min。取出灭菌过的培养液，冷却至室温后，取4mL盐生杜氏藻藻液接种在无菌培养液中，轻轻摇匀，8层纱布封口。在28℃的培养箱中每天光照12h，2500Lx，黑暗12h。连续培养4d，获得同步化生长的盐生杜氏藻，即从暗培养6h后到光照培养开始2h内，盐生杜氏藻集中出现大量的细胞分裂。隔天定时取出藻液4mL，在分光光度计测藻液的OD630数值，换算成藻液中盐生杜氏藻细胞的密度。超净工作台事先打开紫外灯杀菌20min。取处于指数生长期的细胞分裂阶段(即从暗培养6h后到光照培养开始2h内)的盐生杜氏藻藻液，倾注于无菌培养皿中，每皿10mL。置超净工作台中25w紫外灯下，距离17cm照射60s进行诱变，28℃暗培养52h。将暗培养后的藻液和新鲜培养液以1∶3的比例混匀，吸取300μL涂布到含琼脂1.5％的杜氏藻固体培养基上，低温7℃，光强2000lx，不间断光照培养。挑取生长迅速的单藻落分别接种到含4mL杜氏藻培养基的试管中，20°斜放，在7℃以2000lx的光照强度不间断培养，以150rpm的速度摇床培养至藻液呈深绿色。取1.5mL上述长成的盐生杜氏藻藻液移接到含200mL新鲜培养液的锥形瓶中，在7℃以4000lx的光照强度，150rpm的速度摇床培养。每3天取样3.0mL在分光光度计测OD630数值，换算成藻液中耐低温盐生杜氏藻突变株和野生型原出发株在低温培养时的细胞密度，描绘出各自的生长曲线。实验观察到，在7℃光照培养下，耐低温盐生杜氏藻突变株藻液的细胞密度逐渐增大，经过60d培养，其藻液细胞密度可达6.01×106个细胞/mL，是原始细胞密度的31.9倍，是野生型原出发株的2.11倍；野生型原出发株一直到第18d都没有明显增长，从第21d开始才缓慢进入指数生长期，而到第48d就已经达到生长平衡期，其最终藻液密度仅为2.84×106个细胞/mL。分别提取耐低温盐生杜氏藻和野生型原出发株的总DNA，经检测纯度合格后，以27个10聚核苷酸随机引物对这些总DNA进行随机扩增多态DNA(RAPD)比较研究。每个引物至少重复进行两次PCR反应，并将反应产物在含琼脂糖0.9％的凝胶上进行电泳。两次都出现同样的条带才能认可该引物的扩增结果。实验发现，其中3个引物不产生任何条带，6个引物产生不清晰和无法检测的产物，18个能产生多态性条带。从中遴选条带清晰、重复性良好的14个引物进行正式扩增。实验共检测到121个位点，其中12个引物扩增出差异条带。
根据上述统计数字计算耐低温盐生杜氏藻突变株与野生型原出发株间的遗传相似系数I，I＝2Nij/(Ni+Nj)。式中Ni+Nj为两样品经过随机引物扩增后各自显示的带数之和，Nij为两样品共有的带数。经计算，耐低温盐生杜氏藻突变株和野生型原出发株间的遗传相似系数I为0.831，符合变异株的特征。提取耐低温盐生杜氏藻突变株和野生型原出发株的总蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。分离胶浓度为11％，浓缩胶浓度为5％。电泳结束后用考马斯亮蓝R250染色，扫描记录结果。比较两者(耐低温盐生杜氏藻突变株和野生型原出发株)的蛋白电泳图谱。可以看到，前者比后者多出3条新的蛋白带，同时发现在大约56kDa处前者表达的蛋白量比后者低得多。根据在低温环境(7℃)下基本能正常生长的新特征和RAPD研究及蛋白质分析结果，确认已经获得耐低温盐生杜氏藻突变株。
权利要求
1.耐低温杜氏藻突变株，包括耐低温巴氏杜氏藻突变株和耐低温盐生杜氏藻突变株，其特征在于(1)在3～10℃不间断光照培养1000～4000lx下基本正常生长，达到1.05×106～8.11×106个细胞/mL；(2)巴氏杜氏藻耐低温突变株、盐生杜氏藻耐低温突变株与各自的野生型原出发株之间的遗传相似系数I为0.680～0.910；(3)巴氏杜氏藻耐低温突变株L-5比野生型原出发株在36kDa和158kDa处分别多出一条新的蛋白带，同时在大约27kDa和29kDa处L-5表达的蛋白量比对照高得多。
2.如权利要求1所述的耐低温巴氏杜氏藻突变株和耐低温盐生杜氏藻突变株的诱变、培育方法，其特征在于其步骤为1)将杜氏藻的人工海水培养基分装封口、灭菌；2)取出灭菌过的培养基，冷却至室温后，接种杜氏藻；3)分别经光照和黑暗的光周期诱导，杜氏藻出现同步化生长；4)取出藻液，以碘液或溴酚蓝液混匀藻液，灭活杜氏藻，取样计算藻液中杜氏藻细胞的密度；5)取处于指数生长期细胞分裂阶段的杜氏藻藻液，倾注于培养皿中，置紫外灯下照射进行诱变，然后暗培养；6)将暗培养后的藻液和新鲜培养液混匀，涂布到杜氏藻固体培养基上，低温光照培养；7)挑取生长迅速的单藻落分别接种到少量培养液中，在低温光照下扩大培养；8)取步骤7)培养所得的杜氏藻和野生型原出发株移接到含新鲜培养液的容器中扩大培养；9)取样检测、比较杜氏藻耐低温突变株和野生型原出发株在低温光照下的生长曲线；10)提取各杜氏藻耐低温突变株和野生型原出发株的总DNA，并以10聚核苷酸随机引物对这些总DNA进行随机扩增多态DNA研究比较；11)根据比较后的统计数字计算杜氏藻耐低温突变株和野生型原出发株之间的遗传相似系数；12)提取杜氏藻耐低温突变株和野生型原出发株的总蛋白质进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后用考马斯亮蓝R250染色，扫描记录结果；13)比较杜氏藻耐低温突变株和野生型原出发株两者的蛋白电泳图谱，找出杜氏藻耐低温突变株和野生型原出发株之间的共同点与不同之处；14)根据在低温环境下基本能正常生长的新特征和RAPD研究及蛋白质分析结果，确认获得耐低温杜氏藻突变株。
3.如权利要求2所述的耐低温巴氏杜氏藻突变株和耐低温盐生杜氏藻突变株的诱变、培育方法，其特征在于在步骤1)中，配制培养杜氏藻的人工海水培养液的组成如表1所示，表1杜氏藻培养液组成
将人工海水培养液分装在100～250mL的锥形瓶中，每瓶装量20～50mL，棉花塞塞紧或用8层纱布封口，包上牛皮纸，把包装好的培养液放置在高压蒸汽灭菌锅中，121℃，压力0.1mPa灭菌15～20min。
4.如权利要求2所述的耐低温巴氏杜氏藻突变株和耐低温盐生杜氏藻突变株的诱变、培育方法，其特征在于在步骤3)中，所述的光照和黑暗的光周期诱导是在20～30℃的培养箱中每天2000～4000lx光照12h，黑暗12h，连续培养2～5d，采用静止培养，每天手摇至少1次，每次10～20s；或在摇床上以30～150rpm的速度摇动，获得同步化生长的杜氏藻。
5.如权利要求2所述的耐低温巴氏杜氏藻突变株和耐低温盐生杜氏藻突变株的诱变、培育方法，其特征在于在步骤4)中，每天或隔天取出0.3～0.5mL藻液，以等量的碘液或溴酚蓝液混匀藻液，灭活杜氏藻，立即取样在血球计数板上计算藻液中杜氏藻的密度，重复计数至少2次，取平均值，绘制杜氏藻的生长曲线，所用的碘液为碘1g，碘化钾2g，蒸馏水100mL，先用少量蒸馏水溶解碘和碘化钾，待完全溶解后再定容到100mL，所用的溴酚蓝溶液为0.25％的溴酚蓝溶解在40％的蔗糖溶液中；杜氏藻藻液细胞密度的计算或用光密度法，即取出藻液注入比色杯中，在OD630处读取数值，依据公式“细胞密度＝899.08×OD630-12.544”换算成藻液细胞密度，以杜氏藻培养时间为横轴，以培养液中的藻细胞密度为纵轴，绘制杜氏藻的生长曲线。
6.如权利要求2所述的耐低温巴氏杜氏藻突变株和耐低温盐生杜氏藻突变株的诱变、培育方法，其特征在于在步骤5)中，取处于指数生长期细胞分裂阶段的杜氏藻藻液倾注于无菌培养皿中，置超净工作台中紫外灯下照射进行诱变，所用超净工作台事先擦净并以紫外线杀菌15～20min；每个无菌培养皿中盛5～30mL藻液；超净工作台中的紫外灯为20～30瓦，紫外灯与培养皿的距离为12～18cm，紫外线照射时间为50～100s；照射后关闭紫外灯，盖上培养皿盖，用不透光的纸包好培养皿进行暗培养；暗培养的温度为20～30℃，时间为48～72h。
7.如权利要求2所述的耐低温巴氏杜氏藻突变株和耐低温盐生杜氏藻突变株的诱变、培育方法，其特征在于在步骤6)中，将暗培养后的藻液和新鲜培养液按1∶1～10的比例混匀，吸取均匀藻液50～500μL涂布到杜氏藻固体培养基上，杜氏藻涂抹到固体培养基上后，培养皿要倒扣培养防止水珠产生，并以封口膜密封上下皿盖间的缝隙，所述的杜氏藻固体培养基指的是在杜氏藻人工海水培养液中添加1.0％～2.0％的琼脂；在低温3～10℃、光照度1000～4000lx、24h光照培养。
8.如权利要求2所述的耐低温巴氏杜氏藻突变株和耐低温盐生杜氏藻突变株的诱变、培育方法，其特征在于在步骤7)中，所述的单藻落是指由单个杜氏藻细胞长成的细胞集落；所述的生长迅速的单藻落是指在同等条件下长得比较大的藻落；以无菌接种环挑取较大藻落的藻细胞分别接种到含3～8mL杜氏藻培养液的试管中，在低温3～10℃、光照度1000～4000lx、24h光照的光照培养箱中扩大培养，所述的培养杜氏藻的试管应斜放成15～45°，每天手工摇动至少1次，每次10～20s；或在摇床上以30～150rpm的速度摇动。
9.如权利要求2所述的耐低温巴氏杜氏藻突变株和耐低温盐生杜氏藻突变株的诱变、培育方法，其特征在于在步骤8)中，所述的扩大培养是在无菌超净工作台中取各诱变藻液和对照藻液0.5～2.0mL，加入到装有50～200mL杜氏藻培养液的锥形瓶中，塞上棉花塞或封好纱布，放在3～10℃、1000～4000lx、24h光照的光照培养箱中，每天手工摇动至少1次，每次10～20s；或在摇床上以30～150rpm的速度摇动。
10.如权利要求2所述的耐低温巴氏杜氏藻突变株和耐低温盐生杜氏藻突变株的诱变、培育方法，其特征在于在步骤10)中，所述的提取总DNA是指按常规方法提取植物总DNA，在紫外分光光度计上检测该DNA的OD260与OD280的比值，若该比值小于1.8，则说明DNA的纯度不够，应进一步提纯；若该比值大于或等于1.8，则可以进行下述实验；所述的10聚核苷酸随机引物是指计算机随机设计的、由10个脱氧核糖核苷酸组成的单链DNA；所述的随机引物对总DNA进行随机多态性扩增是指以各藻的总DNA为模板，分别以单链10聚核苷酸为引物进行的PCR扩增反应，反应产物经琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖含量为0.8％～1.2％，在凝胶成像系统扫描和记录；所选取的引物至少要达到25～30个，每个引物至少重复进行两次PCR反应，两次都出现同样的条带才能认可该引物的扩增结果，从这些扩增结果中遴选条带清晰、重复性良好的引物进行正式扩增。
全文摘要
耐低温杜氏藻的诱变、选育及其鉴定方法，涉及一种杜氏藻，提供一种耐低温杜氏藻突变株及采用紫外线诱变选育耐低温杜氏藻及其鉴定方法。取培养基接种杜氏藻；经光照和黑暗诱导后出现同步化生长；取藻液与碘液或溴酚蓝液混匀，灭活杜氏藻，取杜氏藻藻液注入培养皿，置紫外灯下诱变后暗培养，再与新鲜培养液混匀，涂在杜氏藻培养基上低温光照培养；取单藻落接种到培养液中，在低温光照下培养；取样检测比较杜氏藻耐低温突变株和野生型原出发株在低温光照下的生长曲线；提取总DNA进行RAPD比较；计算遗传相似系数；提取总蛋白质进行电泳后染色，记录结果；比较蛋白电泳图谱找出异同点；根据蛋白质分析结果确认获得耐低温杜氏藻突变株。
文档编号C12N13/00GK1888047SQ20061003663
公开日2007年1月3日 申请日期2006年7月24日 优先权日2006年7月24日
发明者刘广发, 周韬, 陈昱 申请人:厦门大学