专利名称：重组美洲大蠊过敏原蛋白的表达方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体的说，涉及一种重组蛋白的表达方法。
背景技术：
变态反应疾病被世界卫生组织列为21世纪重点防治的三大疾病之一。变态反应疾病的发生极为广泛，全世界有1/3的人口患有变态反应疾病。在变态反应疾病中，支气管哮喘(简称哮喘)约占全部病例的1/4。2004年，世界卫生组织在《全球哮喘负担报告》中公布，全球有3亿哮喘患者。我国哮喘的发病率为0.5～1.5％，全国有哮喘患者约2000万。尽管我国的哮喘发病率明显低于西方发达国家，但我国哮喘患者的死亡率却高达36.7/10万，位居全球第一。哮喘可以由多种因素引发，其中过敏原，尤其是室内过敏原，具有十分重要的作用。室内过敏原主要包括动物皮屑、尘螨和蟑螂等。蟑螂可以引起哮喘的报道最早出现在上世纪60年代。但直到近年来，蟑螂在哮喘发病中的作用才逐渐受到人们的关注。这是因为空调设备的大量使用以及取暖设施的改进，为耐寒力较差的蟑螂提供了适宜的生活环境，加上蟑螂的种类繁多，繁殖力极强，不易清除等特点，使得居室内蟑螂污染程度加剧，蟑螂过敏原的水平普遍提高，使蟑螂过敏的发生率也显著上升。在美国，哮喘患者中蟑螂过敏率为27.5～42％，欧洲为3.9～24.5％，非洲为30～44.6％，我国北京、上海等大城市中儿童哮喘患者的蟑螂过敏率为27.8～43.8％。因此，蟑螂已经成为诱发哮喘的主要危险因素之一。蟑螂在哮喘等变态反应疾病中的作用受到人们越来越多的关注。
美洲大蠊是我国南方地区蟑螂的主要种属，几乎无处不在。作为主要室内过敏原的美洲大蠊过敏原蛋白，不仅其本身的危害是人们无法规避的，而且美洲大蠊过敏原与其它类型的过敏原之间存在着交叉反应，极易引发过敏人群出现过敏反应。
过敏症治疗的最佳方法是使用特异性抗原进行免疫耐受治疗。传统的免疫治疗使用的是蟑螂浸提物，含有多种抗原成分，其相对效价和特异性抗原水平存在明显差异，很难进行标准化定量，容易引起患者出现治疗性过敏反应，因此限制了免疫治疗的应用。而重组过敏原蛋白的产量高，生产条件恒定，有利于进行过敏原的标准化，更适合进行临床诊断与治疗。
发明内容
本发明的目的是针对蟑螂过敏原浸提液进行免疫耐受治疗的不足，从常见的蟑螂种属美洲大蠊组织中提取总RNA，扩增出美洲大蠊主要过敏原蛋白Per a1.0101、Per a 1.0102、Per a 1.0104、Per a 7.01的编码基因，通过基因工程手段，在大肠杆菌中低温诱导表达重组蟑螂过敏原蛋白，可用于蟑螂引起的过敏反应疾病的诊断和治疗，避免了天然提取物的非单一性及标准化难的障碍。
本发明涉及的重组美洲大蠊过敏原蛋Per a 1.0101、Per a 1.0102、Per a1.0104或Per a 7.01的表达方法，包括如下步骤(1)从美洲大蠊组织中提取总RNA；(2)合成引物pET-Per a 1.0101-P1 CATATGGAGTTCCAGAGCATTATCTCAACpET-Per a 1.0101-P2 AAGCTTTCAGGGCAGGCCGAACAAGpET-Per a 1.0102-P1 CATATGAGCATTATCTCAACTCTAAATGCCATGCCpET-Per a 1.0102-P2 AAGCTTTCAGGGCAGGCCGAACAAGCTGCpET-Per a 1.0104-P1 CATATGGTTGGTGTCGATGGTCTCATAGACpET-Per a 1.0104-P2 AAGCTTTCAGGGCAGGCCGAACCAGpET-Per a 7.01-P1GAATTCGACGCGATCAAGAAGAAGATGpET-Per a 7.01-P2GCGGCCGCGTTGCCAATAAGTTCGGTGAAAG(3)以总RNA为模板，通过RT-PCR获得美洲大蠊过敏原蛋白编码基因片段；(4)将编码基因克隆入原核表达载体中，转化宿主菌，培养所得重组工程菌，然后诱导其表达目的蛋白；(5)采用亲和层析方法对目的蛋白进行纯化，从而获得纯化的重组美洲大蠊过敏原蛋白Per a 1.0101、Per a 1.0102、Per a 1.0104或Per a 7.01。
在上述表达方法中，步骤(3)所述RT-PCR反应条件为94℃，3min；94℃，30S；60℃，45S；72℃，1min；30个循环，72℃延伸10min。
在上述表达方法中，步骤(4)所述原核表达载体pET-28a。
在上述表达方法中，步骤(4)所述宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
在上述表达方法中，步骤(4)所述培养的培养基是LB液体培养基，培养温度是20～37℃，培养时间6～16小时。
在上述表达方法中，步骤(4)所述诱导的诱导剂是IPTG，浓度为0.2～1.0mM，诱导温度是16℃～30℃。
在上述表达方法中，步骤(5)所述纯化的方法为将美洲大蠊过敏原蛋白表达工程菌在24℃培养16小时，离心收集菌体，冷冻过夜；将菌体置于冰上融化，而后加入细菌裂解液，湿重菌体；在室温条件下完全裂解后，离心，而后取上清液与50％Ni-NTA琼脂糖树脂室温下混合，加载到层析柱进行层析；后用等体积的洗液冲洗，最后用1/2体积的洗脱液洗脱；纯化后的蛋白经透析后冻干保存。所述细菌裂解液为50mM NaH2PO4，300mM NaCl，10mM imdazole，pH8.0；所述洗液50mM NaH2PO4，300mM NaCl，20mM imdazole，pH8.0；所述洗脱液为50mM NaH2PO4，300mM NaCl，250mM imdazole，pH8.0。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果本发明从常见的蟑螂种属美洲大蠊组织中提取总RNA，扩增出美洲大蠊主要过敏原蛋白Per a 1.0101、Per a1.0102、Per a 1.0104、Per a 7.01的编码基因，通过基因工程手段，在大肠杆菌中低温诱导可溶性表达重组蟑螂过敏原蛋白，所获得的重组蟑螂过敏原蛋白保持了生物学活性，可用于蟑螂引起的过敏性疾病的诊断和治疗，避免了天然提取物的非单一性及标准化难的障碍。
图1为从美洲大蠊组织中提取的总RNA电泳图；图2为RT-PCR获得的美洲大蠊过敏原蛋白基因片段电泳图；图3为克隆质粒pMD-Per a的PCR鉴定电泳图；图4为克隆质粒pMD-Per a的双酶切鉴定电泳图；图5为表达质粒pET-Per a的PCR鉴定电泳图；图6为表达质粒pET-Per a的双酶切鉴定电泳图；图7-A为美洲大蠊过敏原蛋白P1.0101 SDS-PAGE检测电泳图；
图7-B为美洲大蠊过敏原蛋白P1.0102 SDS-PAGE检测电泳图；图7-C为美洲大蠊过敏原蛋白P1.0104 SDS-PAGE检测电泳图；图7-D为美洲大蠊过敏原蛋白P7.01 SDS-PAGE检测电泳图；图8为低温诱导的可溶性表达电泳图；图9-A为纯化的P1.0101蛋白电泳图；图9-B为纯化的P1.0102蛋白电泳图；图9-C为纯化的P1.0101蛋白电泳图；图9-D为纯化的P1.0101蛋白电泳图；图10为重组美洲大蠊过敏原的免疫印记检测图；其中，图2中，1、2Per a 1.0101；3、4Per a 1.0102；5、6Per a 1.0104；7、8Per a 7.01；MDL2000DNA marker。图3中，1、2Per a 1.0101；3、4Per a 1.0102；5、6Per a 1.0104；7、8Per a 7.01；MDL2000DNA marker。图4中，1Pera 1.0101；2Per a 1.0102；3Per a 1.0104；4Per a 7.01；MDL2000DNA marker。图5中，1、2Per a 1.0101；3、4Per a 1.0102；5、6Per a 1.0104；7、8Pera 7.01；MDL2000DNAmarker。图6中，1Per a 1.0101；2Per a 1.0102；3Per a 1.0104；4Per a 7.01；MDL2000 DNA marker。图7-A中，1-8表达的目的蛋白；M低分子量标准蛋白；C诱导前对照。图7-B中，1-8表达的目的蛋白；M低分子量标准蛋白；C诱导前对照。图7-C中，1-7表达的目的蛋白；M低分子量标准蛋白；C诱导前对照。图7-D中，1-7表达的目的蛋白；M低分子量标准蛋白；C诱导前对照。图8中，M低分子量标准蛋白；1、2P1.0101上清和沉淀；3、4P1.0102上清和沉淀；5、6P1.0104上清和沉淀；5、6P7.01上清和沉淀。图9-A中，M低分子量标准蛋白；1-9为不同洗脱液中含有的蛋白。图9-B中，M低分子量标准蛋白；1-10为不同洗脱液中含有的蛋白。图9-C中，M低分子量标准蛋白；1-8为不同洗脱液中含有的蛋白。图9-C中，M低分子量标准蛋白；1-8为不同洗脱液中含有的蛋白。图9-D中，M低分子量标准蛋白；1-6为不同洗脱液中含有的蛋白。
图10中，1P1.0101；2P1.0102；3P1.0104；4P7.01。
具体实施例方式
实施例11材料与方法1.1材料1.1.1美洲大蠊美洲大蠊成虫，取自汕头市民居，新鲜取样，液氮冷冻，后移入-70℃保存。
1.1.2菌株与载体大肠杆菌JM109、BL21(DE3)菌株、pET-28a表达载体为汕头大学变态反应研究所保存，pMD18-T克隆载体购自TAKARA宝生物工程(大连)有限公司。
1.1.3主要酶和试剂Ex Taq酶(TaKaRa)、DNA快速回收试剂盒、质粒小量抽提试剂盒(QIAGEN)、限制性内切酶(NEB)；T4DNA连接酶、ImProm-IITM反转录试剂盒、琼脂糖(Promega公司)；TRIZOL Reagent(GIBCO BRL公司)；过氧化物酶标记的羊抗人IgE(ε)(KPL)；液体DAB+底物发光系统(DAKO)；His Bind蛋白纯化试剂盒(Novagen)其余常规试剂均为进口原装试剂。
1.1.4血清标本血清采自汕头潮阳医院变态反应科，临床上对蟑螂过敏原皮试呈阳性反应的哮喘患者。而后使用Parmacia CAP过敏原自动检测系统，确定德国小蠊过敏原粗提物特异性IgE Ab＞2的为阳性血清。贮存于-70℃备用，对照血清采自无过敏史的健康成人。
1.1.5主要仪器PCR扩增仪(Gene Amp PCR System 9600，美国)；高速冷冻离心机(日本)；-70℃超低温冰箱(SANYO)；DYY-III型电泳仪(北京六一仪器厂)；TGL-16G高速台式离心机(上海医用分析仪器厂)；DNA/RNA calculator(Pharmaciabiotech)；SDS-PAGE电泳设备(BIO-RAD)；凝胶成像系统(上海天能公司)；TH2-82型恒温振荡器(上海跃进医疗器械厂)；恒温培养箱(上海跃进仪器厂)。
1.2方法1.2.1总RNA的提取(Trizol法)采用TRIZOL Reagent试剂盒提取总RNA取冻存的美洲大蠊，剪碎，液氮研磨，按200～300mg组织/ml Trizol加入Trizol试剂，总量10ml。静置10min，而后按300ul/ml Trizol加入氯仿，混匀，静置20min，4℃，12000g离心15min。取上清，按500ul/ml Trizol加入异丙醇，混匀，静置10min。4℃，12000g离心10min，弃上清，管底沉淀即为RNA。加入75％乙醇悬浮沉淀，4℃，12000g离心5min，弃上清。室温干燥5分钟，加入50ul无Rnase的双蒸水溶解。
1.2.2.RT-PCR扩增美洲大蠊过敏原蛋白基因采用ImProm-IITM反转录试剂盒，以提取的美洲大蠊总RNA为模板，以Oligo-dT为引物(工作浓度为10pmol/μl)进行RT反应。从NCBI的GenBank(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库中取得美洲大蠊过敏原Per a 1.0101、Per a1.0102、Per a 1.0104、Per a 7.01的序列，设计引物如下pET-Per a 1.0101 sense 5′CATATGGAGTTCCAGAGCATTATCTCAAC 3′pET-Per a 1.0101 antisense 5′AAGCTTTCAGGGCAGGCCGAACAAG 3′pET-Per a 1.0102 sense 5′CATATGAGCATTATCTCAACTCTAAATGCCATGCC 3′pET-Per a 1.0102 antisense 5′AAGCTTTCAGGGCAGGCCGAACAAGCTGC 3′pET-Per a 1.0104 sense 5′CATATGGTTGGTGTCGATGGTCTCATAGAC 3′pET-Per a 1.0104 antisense 5′AAGCTTTCAGGGCAGGCCGAACCAG 3′pET-Per a 7.01 sense 5′GAATTCGACGCGATCAAGAAGAAGATG 3′pET-Per a 7.01 antisense 5′GCGGCCGCGTTGCCAATAAGTTCGGTGAAAG 3′其中Per a 1.0101、Per a 1.0102、Per a 1.0104的5′端加Nde I酶切位点，3′端加Hind III酶切位点，所扩增的片段分别为693bp、684bp和822bp，编码的蛋白为26.23kDa、25.8kDa和31.15kDa；Per a 7.01的5′端和3′端分别为EcoR I和Not I酶切位点，所扩增的片段为852bp，编码的蛋白为32.78kDa。全部引物由上海英俊生物技术有限公司合成。
以反转录合成的cDNA为模板，使用上述引物分别进行PCR扩增。PCR反应条件为94℃，3min；94℃，30S；60℃，45S；72℃，1min；30个循环，72℃延伸10min。使用QIAGEN的琼脂糖凝胶回收试剂盒进行PCR产物的回收。
1.2.3美洲大蠊过敏原蛋白基因的克隆将回收到的PCR产物分别与pMD18-T载体连接，16℃连接过夜。构建成重组克隆质粒pMD-Per a 1。用CaCl2法制备E.coli JM109感受态细胞，将连接产物转化新鲜制备的E.coli JM109感受态细胞，采用QIAGEN公司的质粒小量抽提试剂盒提取重组质粒DNA，PCR和双酶切鉴定正确后，将阳性菌落过夜培养，制成甘油菌，送上海英俊生物技术有限公司进行序列测定。
1.2.4美洲大蠊过敏原蛋白基因原核表达载体的构建将测序正确的美洲大蠊过敏原蛋白基因克隆质粒pMD-Per a及原核表达载体pET-28a分别使用相应的核酸内切酶进行酶切，目的基因片段和载体大片段回收后进行连接，构建美洲大蠊过敏原基因原核表达质粒pET-Per a。连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，采用PCR及双酶切的方法对重组表达质粒进行鉴定。
1.2.3重组美洲大蠊过敏原蛋白在大肠杆菌细胞中的诱导表达将鉴定正确的pET-Per a表达质粒转化入E.coli BL21(DE3)感受态细胞，构建人美洲大蠊过敏原蛋白Per a表达工程菌pET-Per a-BL21(DE3)。提取质粒，双酶切鉴定正确后，对阳性重组菌进行诱导表达。(1)将阳性表达菌株pETPer a-BL21(DE3)接种于含Kan的LB液体培养基中，37℃培养过夜；(2)按千分之一量，将上述表达菌液接种于含Kana的LB培养基中，37℃ 200rpm振荡培养至OD600＝0.4～1(大约3h)；(3)取出1ml菌液留作对照(0h)，加IPTG至终浓度为1mmol/L，继续诱导培养，于1、2、3、4、5h后收集菌液。(4)离心收集菌体，将菌体沉淀用100mmol/L Tris(pH 8.0)洗一次，冰浴超声至悬浮液透明。
1.2.4表达产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测取菌体裂解物1.0ml，10000转离心，弃上清；向菌体裂解物沉淀中加入pH8.0的TE 100μl和3倍上样缓冲液50μl；煮沸2～5min，10000rpm离心5min；灌制12％分离胶及5％积层胶。每孔上样10μl，Marker全部上样，做不连续垂直电泳。电泳结束后用考马斯亮蓝R-250染色。
1.2.5重组美洲大蠊过敏原蛋白在大肠杆菌细胞中的低温诱导表达及表达条件的优化将鉴定正确的表达菌株在16℃-30℃之间进行低温诱导，同时调整诱导剂的浓度和诱导时间，目的是最大限度地减少包涵体的形成，实现目的蛋白的可溶性表达，获得有生物活性的重组美洲大蠊过敏原蛋白。最后确定在24℃，16h，IPTG浓度为0.6mM的条件下可以实现重组美洲大蠊过敏原蛋白的可溶性表达。
1.2.6重组美洲大蠊过敏原蛋白的纯化通过Ni-NTA琼脂糖为固相亲和层析系统进行目的蛋白的纯化。具体操作步骤如下将美洲大蠊过敏原蛋白表达工程菌在24℃培养16h，4000g离心20分钟收集菌体，-20℃冷冻过夜。将菌体置于冰上融化，而后加入细菌裂解液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，10mM imdazole，pH8.0)，5ml/g湿重菌体。在室温条件下完全裂解后，10000g/min进行离心，而后取上清液与50％Ni-NTA琼脂糖树脂(4∶1)混合，室温下结合1h，加载到层析柱进行层析。而后用等体积的洗液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，20mM imdazole，pH8.0)冲洗2次，最后用1/2体积的洗脱液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，250mM imdazole，pH8.0)洗脱4次。纯化后的蛋白经透析后冻干保存。
1.2.7重组过敏原的免疫印记检测表达产物经10％SDS2PAGE电泳分离，然后将蛋白质电转移到硝酸纤维素膜，用含20gPL小牛血清蛋白的TBST 37℃封闭2h；洗后与1∶5稀释的蟑螂过敏病人阳性血清4℃孵育过夜，洗后加入经TBST稀释(1∶1000)生物素标记的抗人IgE抗体，37℃孵育1h；洗后，加入经TBST稀释(1∶1000)的HRP标记的链霉亲和素，37℃孵育1h；经充分洗涤后，将膜片放入新鲜配制的二氨基联苯胺(DAB)底物溶液中，于室温振摇至褐色区带充分显现，膜放重蒸水中洗涤，终止显色反应。
2结果2.1美洲大蠊总RNA的提取利用Trizol法从人美洲大蠊组织提取总RNA。在甲醛变性的1％琼脂糖凝胶中进行电泳，紫外灯下观察，可以见到2条清晰的电泳条带，分别为28S和18S，说明RNA提取成功(见图1)。
2.2美洲大蠊过敏原蛋白Per a基因的PCR扩增以反转录合成的cDNA为模板进行PCR扩增，反应结束后用1％琼脂糖凝胶电泳分析，以DL-2000为DNA Marker，结果在各个目的基因相应的位置可以见到特异性的DNA扩增条带，与预期目的带大小相符，说明成功扩增了美洲大蠊过敏原蛋白Per a(见图2)。
2.3重组质粒pMD-Per a的鉴定将目的基因与pMD18-T载体连接，构建美洲大蠊过敏原基因的克隆载体。连接产物转化E.coli JM 109感受态细胞。提取质粒，分别用PCR和双酶切鉴定重组质粒，结果见图3和4。图中可以看出，无论是PCR扩增，还是双酶切鉴定，均可见到与目的带大小相符的清晰电泳条带，表明成功构建了重组美洲大蠊过敏原蛋白Per a基因克隆质粒pMD-Per a。
2.4美洲大蠊过敏原蛋白Per a基因的序列测定将经PCR与双酶切鉴定正确的重组菌送上海英俊生物技术有限公司进行序列测定。用DNAsis软件，将测定序列与GenBank中发表的美洲大蠊过敏原蛋白Per a 1.0101、Per a 1.0102、Per a 1.0104和Per a 7.01基因的序列进行比对分析，本实验所获得的美洲大蠊过敏原蛋白Pera 1.0101、Per a 1.0102、Per a 1.0104和Per a 7.01的大小分别为696bp、687bp、825bp和855bp(均包括终止密码子)。其中Pera 1.0101基因有8个碱基发生突变，Per a 1.0102和Per a 1.0104基因均有28个碱基发生突变，Per a 7.01有1个碱基发生突变，与GenBank中发表的美洲大蠊过敏原蛋白Pera 1.0101、Per a 1.0102、Per a 1.0104和Per a 7.01的同源性分别为98％、95％、96％和99％，表明本实验正确克隆了美洲大蠊过敏原蛋白Pera1.0101、Per a 1.0102、Per a 1.0104和Per a 7.01的基因，与预期结果相符。基因的突变可能与所选择的美洲大蠊的不同来源有关。
2.5美洲大蠊过敏原蛋白Per a原核表达质粒pET-Per a的构建将测序鉴定正确的克隆质粒pMD-Per a以及表达载体pET-28a分别进行酶切并回收目的片段和载体的大片段，将目的片段与表达载体pET-28a片段进行连接，构建美洲大蠊过敏原蛋白Per a的表达质粒pET-Per a。连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，提取质粒，进行PCR和双酶切鉴定，结果见图5和6。
2.6美洲大蠊基因在E.coli BL21(DE3)细胞中的表达将构建好的原核表达质粒pET-Per a转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，使用1.0mM IPTG在37℃下进行诱导表达，诱导时间为5h。对菌体蛋白进行10％SDS-PAGE电泳检测。结果在约与目的蛋白大小相应的位置见到清晰的目的蛋白带(图7)，与预期分子量相符。
2.7重组美洲大蠊过敏原蛋白在大肠杆菌细胞中的低温诱导表达及表达条件的优化通过调整诱导温度、诱导剂的浓度和诱导时间，最后在24℃，16h，IPTG浓度为0.6mM的条件下实现了重组美洲大蠊过敏原蛋白的可溶性表达，结果见图8。
2.8重组美洲大蠊过敏原蛋白的纯化通过Ni-NTA琼脂糖为固相亲和层析系统进行目的蛋白的纯化，结果见图9。
2.9重组美洲大蠊过敏原的免疫印记检测使用美洲大蠊过敏患者的血清对纯化产物进行Western blot检测。结果表明纯化后的蟑螂过敏原蛋白可以与患者血清发生特异性免疫反应。证明所获得的蛋白为蟑螂过敏原蛋白。结果见图10。
重组美洲大蠊过敏原蛋白的表达方法序列表SEQUENCE LISTING<110>汕头大学医学院<120>重组美洲大蠊过敏原蛋白的表达方法<130>
<160>4<170>Patentln version 3.2<210>1<211>
<212>DNA<213>人工引物<400>1pET-Per a 1.0101-P1 CATATGGAGTTCCAGAGCATTATCTCAACpET-Per a 1.0101-P2 AAGCTTTCAGGGCAGGCCGAACAAG<210>2<211>
<212>DNA<213>人工引物<400>2pET-Per a 1.0102-P1 CATATGAGCATTATCTCAACTCTAAATGCCATGCCpET-Per a 1.0102-P2 AAGCTTTCAGGGCAGGCCGAACAAGCTGC<210>3<211>
<212>DNA<213>人工引物<400>3pET-Per a 1.0104-P1 CATATGGTTGGTGTCGATGGTCTCATAGACpET-Per a 1.0104-P2 AAGCTTTCAGGGCAGGCCGAACCAG<210>4<211>
<212>DNA<213>人工引物<400>4pET-Per a 7.01-P1 GAATTCGACGCGATCAAGAAGAAGATGpET-Per a 7.01-P2 GCGGCCGCGTTGCCAATAAGTTCGGTGAAAG
权利要求
1.一种重组美洲大蠊过敏原蛋白Per a 1.0101、Per a 1.0102、Per a 1.0104或Per a 7.01的表达方法，其特征在于包括如下步骤(1)从美洲大蠊组织中提取总RNA；(2)合成引物pET-Per a 1.0101-P1 CATATGGAGTTCCAGAGCATTATCTCAACpET-Per a 1.0101-P2 AAGCTTTCAGGGCAGGCCGAACAAGpET-Per a 1.0102-P1 CATATGAGCATTATCTCAACTCTAAATGCCATGCCpET-Per a 1.0102-P2 AAGCTTTCAGGGCAGGCCGAACAAGCTGCpET-Per a 1.0104-P1 CATATGGTTGGTGTCGATGGTCTCATAGACpET-Per a 1.0104-P2 AAGCTTTCAGGGCAGGCCGAACCAGpET-Per a 7.01-P1GAATTCGACGCGATCAAGAAGAAGATGpET-Per a 7.01-P2GCGGCCGCGTTGCCAATAAGTTCGGTGAAAG(3)以总RNA为模板，通过RT-PCR获得美洲大蠊过敏原蛋白编码基因片段；(4)将编码基因克隆入原核表达载体中，转化宿主菌，培养所得重组工程菌，然后诱导其表达目的蛋白；(5)采用亲和层析方法对目的蛋白进行纯化，从而获得重组美洲大蠊过敏原蛋白Per a 1.0101、Per a 1.0102、Per a 1.0104或Per a 7.01。
2.如权利要求1所述的表达方法，其特征在于，步骤(3)所述RT-PCR反应条件为94℃，3min；94℃，30S；60℃，45S；72℃，1min；30个循环，72℃延伸10min。
3.如权利要求1所述的表达方法，其特征在于，步骤(4)所述原核表达载体pET-28a。
4.如权利要求1所述的表达方法，其特征在于，步骤(4)所述宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
5.如权利要求1所述的表达方法，其特征在于，步骤(4)所述培养的培养基是LB液体培养基，培养温度是20～37℃，培养时间6～16小时。
6.如权利要求1所述的表达方法，其特征在于，步骤(4)所述诱导的诱导剂是IPTG，浓度为0.2～1.0mM，诱导温度是16℃～30℃。
7.如权利要求1所述的表达方法，其特征在于，步骤(5)所述纯化的方法为将美洲大蠊过敏原蛋白表达工程菌在24℃培养16小时，离心收集菌体，冷冻过夜；将菌体置于冰上融化，而后加入细菌裂解液，湿重菌体；在室温条件下完全裂解后，离心，而后取上清液与50％Ni-NTA琼脂糖树脂室温下混合，加载到层析柱进行层析；后用等体积的洗液冲洗，最后用1/2体积的洗脱液洗脱；纯化后的蛋白经透析后冻干保存。
8.如权利要求7所述的表达方法，其特征在于，所述细菌裂解液为50mMNaH2PO4，300mM NaCl，10mM imdazole，pH8.0；所述洗液50mM NaH2PO4，300mM NaCl，20mM imdazole，pH8.0；所述洗脱液为50mM NaH2PO4，300mMNaCl，250mM imdazole，pH8.0。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，公开了一种重组美洲大蠊过敏原蛋白的表达方法。本发明的目的是针对蟑螂过敏原浸提液进行免疫耐受治疗的不足，从常见的蟑螂种属美洲大蠊组织中提取总RNA，扩增出美洲大蠊主要过敏原基因Per a1.0101、Per a 1.0102、Per a 1.0104、Per a 7.01的编码基因，通过基因工程手段，在大肠杆菌中低温诱导表达重组蟑螂过敏原蛋白，可用于蟑螂引起的过敏反应疾病的诊断和治疗，避免了天然提取物的非单一性及标准化难的障碍。
文档编号C12N15/12GK1888065SQ20061003664
公开日2007年1月3日 申请日期2006年7月21日 优先权日2006年7月21日
发明者何韶衡, 张忠芳 申请人:汕头大学医学院