专利名称：木糖的酶法制备方法
技术领域：
本发明涉及一种木糖的制备方法，具体地涉及一种木糖的酶法制备方法，涉及食品工业、清洁生产、酶学和分子生物学等领域。
背景技术：
木糖是五个碳原子的醛糖(CH2OH(CHOH)3CHO)，白色结晶粉末，有甜味，熔点144℃，溶于水。木糖作为食品添加剂主要用于糖尿病患者的甜味剂，在工业上是印染和制革业中的助剂。随着木糖醇作为糖尿病患者治疗剂的广泛应用，以及木糖醇作为甜味剂用作防龋齿口香糖、糖果、饮料等的开发，作为木糖醇生产原料木糖的制备技术，也倍受人们广泛关注。
农作物废弃物主要包括秸杆、玉米芯、甘蔗渣、麦麸、米糠、甜菜渣等，其主要化学成份是纤维素、半纤维素、木质素等，木糖就存在于这些农作物废弃物的半纤维素多缩戊糖中，是亟待开发的重要可再生资源。我国是一个农业大国，每年秸秆产量达9亿吨，占世界秸秆总产量的25％～30％。江苏省农业生产水平在全国名列前茅，每年粮食总产量达3500多万吨，同时产出秸秆4000万吨，麦麸和米糠产量都超过270万吨，这些下脚料半纤维素的含量都在50％以上。目前米糠、麦麸的综合利用率不到20％，其余基本上为工业废料。而秸秆，除少量是直接还田外，大部分或被燃烧，或被堆积没有利用，造成资源的浪费，同时对环境也造成污染。如果人们能利用先进的技术使纤维素和半纤维素得到充分降解和有效转化，农作物废弃物就可以替代粮食用作发酵原料，成为丰富的生物资源。随着科学技术的发展，已经出现了多种多样农作物废弃物的利用方法。
但是目前有关从农作物废弃物中提取木糖的方法一般都使用酸水解法。具体是将农作物废弃物原料粉碎，加入原料重量4-6倍的水，在高温蒸煮预处理后；然后加酸在105-125℃温度进行水解处理，水解液经中和、过滤、活性碳脱色、层析分离、离子交换、超滤等方法提纯，最后再经真空浓缩、结晶分离、喷雾干燥等方法得到木糖产品。
但是酸水解的方法存在着多种不足之处，主要体现在1、农作物废弃物中不仅含纤维素、多缩戊糖、木质素等有利用价值的成份，还含有蛋白质、淀粉、脂肪、果胶、色素、金属离子、无机盐、单宁以及化肥和农药等成份，已有的利用方法，不能将这些成份去除，而在高温与强酸水解时，这些主要成分和无用的杂质一起被水解，会产生或释放出大量对酵母有毒的物质，主要包括糠醛(降解副产物)，醋酸(由乙酰化木聚糖释放)，某些木质素衍生物(如酚类化合物)，重金属离子等。这不仅对环境造成很大的污染，而且用于微生物发酵生产前还需对半纤维素水解液进行脱毒。2、稀酸水解虽然可以降低毒物含量，但水解物中往往含有大量不可发酵的低聚糖，最终影响木糖和木糖醇收得率。同时采用低温水解方法，不仅水解效果差、速度慢，而且必须加入高浓度的酸液才能进行水解，这样又带来了水解液中酸液的处理问题，由此在水解后必须进行中和处理，增加了成本。3、由于酸水解的糖液杂质多，使得后处理效率低、化工程序多、对设备要求高，增加环保负担。
而采用酶法水解虽然具有高效、专一、环保等优点，但由于自然界存在的很多具有能够降解木聚糖类半纤维素的复合酶系的菌株，往往适合于营养贫乏的环境，生长缓慢，细胞密度低，不能满足生产需求；同时酶法水解木聚糖存在的底物作用浓度低、易污染所带来的效率低和成本高，所以目前在木糖的生产中至今未采用酶法水解。
发明内容
本发明的目的是提供一种酶法制备木糖的方法。
本发明所述的木糖的酶法制备方法，其步骤如下步骤1农作物废弃物经碱抽提法或汽瀑法进行预处理，制成木聚糖或汽瀑物；步骤2向缓冲液中加入木聚糖酶、双活性木糖/阿拉伯糖苷酶和α-葡萄糖醛酸酶制得多酶混合液；步骤3边搅拌边将木聚糖或者汽爆物加至多酶混合液中进行酶解；步骤4水解结束后，向木聚糖酶解液中加入乙醇，如果是汽爆物酶解液则经过滤去渣后加入乙醇；然后取上清液进一步浓缩结晶得到木糖产品。
发明人经过大量实验，发现用耐热性木聚糖酶、双活性木糖/阿拉伯糖苷酶和α-葡萄糖醛酸酶制备木糖，能满足工业化生产的需要，并且，采用多酶作用，对经预处理的农作物废弃物进行酶解，使原料中的木聚糖达到彻底水解的目的，不仅酶水解效率大大提高，而且可提高酶作用底物的浓度，加快反应速度，减少污染危险，是目前最直接有效的途径。虽然多酶作用就能实现本明的目的，但发明人的进一步研究显示，适当的酶用量比，能达到更好的经济效益。
在制备木糖的方法中，所述的步骤2具体是用pH4-7的磷酸缓冲液或柠檬酸缓冲液配制多酶混合液，多酶混合液中各酶用量按照木聚糖酶∶木糖/阿拉伯糖苷酶∶α-葡萄糖醛酸酶酶为1∶0.5-1.5∶0.5-1.25的比例添加，最好1∶1∶0.75。
在制备过程中，具体的酶用量推荐以木聚糖酶10-20(U/g)为基础(文中所述酶用量均以木聚糖或汽瀑物的重量计)。
因为热稳定性酶在生物处理过程中具有减少污染危险、加快反应速度、可提高酶作用底物溶解度和有较高的抗化学变性等优势，本发明中使用的酶推荐耐热性酶，优选嗜高温菌海栖热袍菌Thermotoga maritima的木聚糖酶，双活性木糖/阿拉伯糖苷酶和α-葡萄糖醛酸酶。
上述制备方法中所说的步骤3，具体的酶解温度为55-100℃，本发明推荐55-85℃，优选60-80℃，最好的是80℃。
为了达到较好的效果，在上述制备方法中的步骤3，木聚糖与酶液的比推荐为1∶3-10(w/v)，汽爆物与酶液的比为1∶6-20(w/v)。
本发明制备方法中，所述农作物废弃物是麦秸秆、稻草、玉米芯、甘蔗渣或甜菜渣等植物纤维原料。本发明方法中所使用的木聚糖酶，双活性木糖/阿拉伯糖苷酶和α-葡萄糖醛酸酶是由高效表达的基因工程菌发酵生产。
制备方法中的步骤4，所述乙醇的用量，推荐使用浓度等于或高于80％的乙醇，用量为酶解液的4-5倍体积。
经验证，采用本发明的方法，木糖的释放率可达采用木聚糖酶和木糖苷酶的2倍多，大大提高了生产效率。由于酶法制备木糖，具有高效、专一，反应条件温和的优势，因此，整个加工过程作用条件温和，不使用酸碱等化学物质，能耗低，污染小，操作简单易控，同时产物易纯化，产品保持天然品质；同时利用酶法制备的木糖对菌种无毒害性，可直接用于酵母菌生物转化木糖醇，不需脱毒，发酵性能好，利于木糖转化为木糖醇，并且酶法水解后的植物纤维材料是很好的农业菌肥膨松剂，不给环境带来污染，因此，具有重要的经济效益和社会效益。
图1是酶法制备木糖的流程。
图2木聚糖酶和木糖/阿拉伯糖苷酶水解桦木木聚糖的酶解产物离子色谱图，HPLC分析柱Sugarpak 1；6.5mm×300mm糖柱分析，色谱条件柱温85℃；流动相水；流速0.5mL/min；示差折光检测器灵敏度4，外标法标定，进样量为10μL。标准样品购于Sigma公司，根据标样，10.7min木三糖；12.5min木二糖；15.3min木糖。
图3木聚糖酶、木糖/阿拉伯糖苷酶和α-葡萄糖醛酸酶联合作用桦木木聚糖的酶解产物离子色谱图，HPLC分析柱及色谱条件同上，图中10.7min木三糖；12.5min木二糖；15.2min木糖。
图4木聚糖酶和β-木糖苷酶水解燕麦木聚糖的酶解产物离子色谱图，HPLC分析柱及色谱条件同上，图中10.283min木三糖；11.447min木二糖；15.104min木糖。
图5木聚糖酶、β-木糖苷酶和阿拉伯糖苷酶联合作用燕麦木聚糖的酶解产物离子色谱图，HPLC分析柱及色谱条件同上，图中10.7min木三糖；11.706min木二糖；14.795min木糖。
图6是木糖产品中的成分分析图谱。HPLC分析柱及色谱条件同上，根据标样，14.2min木糖；11.7min木二糖；9.9min木三糖。
图7是木聚糖酶、木糖苷酶和阿拉伯糖苷酶和α-葡萄糖醛酸酶联合作用稻草木聚糖的TLC图谱.其中X1是木糖，X2是木二糖，X3是木三糖；1是低聚木糖标样；2是木聚糖酶作用稻草木聚糖；3是木聚糖酶和木糖苷酶作用稻草木聚糖；4是木聚糖酶、木糖苷酶和阿拉伯糖苷酶联合作用稻草木聚糖；5是木聚糖酶、木糖苷酶和α-葡萄糖醛酸酶联合作用稻草木聚糖；6是木聚糖酶、木糖苷酶、阿拉伯糖苷酶和α-葡萄糖醛酸酶联合作用稻草木聚糖。
具体实施例方式
以下结合附图进一步说明本发明方法实施例1(1)制备耐热性木聚糖降解酶根据Genbank中木聚糖酶，木糖苷酶、阿拉伯糖苷酶和α-葡萄糖醛酸酶基因序列设计引物，Tm-xynB-N5’-CCGTTCCATGGACTACAGGATGTGC-3’Tm-xynB-C5’-CCGCTCGAGCGGATATATCTTTCTTCCCTT-3’Tm-xyl-N5’-CATGCCATGGAACTGTACAGGGATC-3’Tm-xyl-C5’-ATAAGAATGCGGCCGCCTCCTCGCAGGCTTCC-3’
Tm-aguA-N5’-GGAATTCCATATGAAAATATTACCTTCTGTGTTGAT-3’Tm-aguA-C5’-CCC TCGAGTCTTTCTTCTATCTTTTTCTCCAG-3’以Thmotiga maritima菌的基因组DNA为模板进行PCR扩增。
将木聚糖酶、木糖/阿拉伯糖苷酶和α-葡萄糖醛酸酶的PCR产物分别插入质粒pET-20b和pET-28a后，构建重组表达质粒pET-20b-xynB、pET-28a-xyl和pET-28a-aguA。
分别取0.01μg重组表达质粒pET-20b-xynB、pET-28a-xyl和pET-28a-aguA电转化到50μL大肠杆菌JM109(DE3)或BL21-CodonPlus(DE3)-RIL感受态细胞中后，在500μL的SOC培养基中振荡培养1h，取100μL菌液涂布于LB含氯霉素Cm(60μg/mL)抗性，并外加氨苄青霉素Amp(100μg/mL)或卡那霉素Kna(30μg/mL)抗性平板，37℃培养过夜，从而获得基因工程菌E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL/pET-20b-xynB、E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL/pET-28a-xyl和E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL/pET-28a-aguA，记作EC1、EC和EC3。
海栖热袍菌的培养是将培养基经加热驱氧、充氮、冷却后加还原剂Na2S 0.5g/L，并分装于预先充氮的100mL血清瓶中，加盖密封并灭菌冷却后，用注射器按0.5％接种量接入种液，80℃静置培养8-10h即可。
所用的培养基配方为(1L)10g胰蛋白胨，5g酵母粉，27g NaCl，1mg树脂天青(resazurin)，15ml微量元素trace(Difco Maritima Broth medium)，0.5g Na2S，pH 7.0。微量元素的制备按如下配方，Nitrilotriacetic acid 1.5g，MgSO4·7H2O 3.0g，MnSO4·H2O 500.0mg，NaCl 1.0g，FeSO4·7H2O 100.0mg，Co(NO3)2·6H2O 100.0mg，CaCl2(无水)100.0mg，ZnSO4·7H2O 100.0mg，CuSO4·5H2O 10.0mg，AlK(SO4)2(无水)10.0mg，Boric acid 10.0mg，Na2MoO4·2H2O 10.0mg，Na2SeO3(无水)1.0g。先将Nitrilotriacetic acid溶于500mL水，用2-3M的KOH将pH调制6.5。再加入其他成分，定容至1L。
分别挑取基因工程菌EC1、EC和EC3的单菌落接种于5mL含有Amp或Kna抗性的LB液体培养基，37℃过夜培养，然后以1％的接种量再接入LB抗性液体培养基，转速200r/min，37℃振荡培养至OD600达0.8～1.0作液体种子，接入到发酵罐中。
LB培养基组成1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，调pH 7.0，灭菌冷却至37℃后，加接入0.006％Cm，并外加Amp或0.003％Kna，装液量70％。发酵罐起始pH 7.0，最终pH 7.9，通气量1∶1，温度为30℃，转速250r/min。培养至OD600达0.6-0.8，流加IPTG至浓度0.8mmol/L，继续培养6h，放罐。
以4,800×g离心10min收集细胞，用150mL磷酸钾缓冲液(50mmol/L，pH 6.8)重悬，经超声波或高压细胞破碎仪(French Pressure，Thermo)破碎细胞，9,600×g离心20min，取上清于70℃下热处理20min后，9,600×g离心30min，上清液即为酶液。
(2)以添加比例为1∶1∶0.75向缓冲液中依次加入木聚糖酶、木糖/阿拉伯糖苷酶和α-葡萄糖醛酸酶制得多酶混合液，其中木聚糖酶的用量为10U/g，木糖/阿拉伯糖苷酶10U/g和α-葡萄糖醛酸酶7.5U/g，木聚糖与多酶液的比为1∶3(w/v)。
(3)一边搅拌一边将入桦木木聚糖加至酶液中进行水解，水解温度是80℃，水解结束后，加入4倍体积的乙醇并搅拌均匀后，离心除去酶解液中的未水解的完全的木聚糖和酶蛋白分子后，所得到的酶解液采用HPLC高压液相色谱检测其中糖的成分及含量，结果表明，木糖含量比采用木聚糖酶和木糖/阿拉伯糖苷酶处理的明显增加(见附图3与图2比较)。木糖含量的分析在Waters HPLC 246-E高压液相色谱仪上，用Sugarpakl，6.5mm×300mm糖柱分析。色谱条件柱温85℃；流动相水；流速0.5mL/min；示差折光检测器灵敏度4，外标法标定，进样量为10μL。木糖、木二糖和木三糖标准样品购于Sigma公司。
实施例2与实施例1基本相同，不同之处在于，所用木聚糖为燕麦木聚糖，购于Sigma公司，木聚糖与多酶液的比为1∶10(w/v)，所得到的酶解液采用HPLC检测后表明，木糖含量比采用木聚糖酶和木糖/阿拉伯糖苷酶处理高一倍多(见附图5与图4比较)。
实施例3与实施例1基本相同，不同之处在于，采用经预处理后的玉米芯为原料，具体操作如下(1)原料预处理取切碎直径为3-20mm左右的风干玉米芯，先用清水浸泡后离心除去水分，按固液比7-10∶1加入氢氧化钠溶液，终浓度为1％-3％，在室温下或高温下浸提，然后收集滤液并用酸中和至微酸性，然后用3倍体积乙醇沉淀即得木聚糖。
(2)以添加比例为1∶1∶0.75向缓冲液中依次加入木聚糖酶、木糖/阿拉伯糖苷酶和α-葡萄糖醛酸酶制得多酶混合液，其中木聚糖酶的用量为20U/g，木糖/阿拉伯糖苷酶20U/g和α-葡萄糖醛酸酶15U/g，木聚糖与多酶液的比为1∶4(w/v)。
(3)一边搅拌一边将入木聚糖加至酶液中进行水解，水解温度是80℃，水解结束后，加入4倍体积的乙醇并搅拌均匀后，离心除去酶解液中未水解完全的木聚糖和酶蛋白后，取上清液进一步真空浓缩得到木糖产品，所得木糖产品采用HPLC高压液相色谱检测，结果见附图6。
实施例4与实施例1基本相同，不同之处在于，预处理原料选择的是麦草纤维，并以2％的NaOH溶液从麦草丝中浸提出木聚糖，然后进行多酶、双酶和单酶水解，所得酶解液采用TLC薄层层析检测。结果表明(见附图7)，3道比2道木糖、木二糖均有增加，说明木糖苷酶的加入有助于木聚糖酶对木聚糖的降解；4，6道比2，3道中的木三糖和更高聚和度的木寡糖显著减少，说明阿拉伯糖苷酶去除阿拉伯糖苷侧枝有利于木聚糖酶和木糖苷酶对木聚糖的降解；5道与3，4道相比木二糖明显增加，5道与3道相比高聚和度的木寡糖明显减少，说明α-葡萄糖醛酸酶去葡萄糖醛酸侧枝后使得木聚糖酶能结合和分解邻近这些侧枝的木聚糖骨架，从而使木二糖明显增加。泳道6的结果表明，木聚糖酶、木糖苷酶、阿拉伯糖苷酶和α-葡萄糖醛酸酶联合作用，最终将木聚糖彻底降解为单糖。
实施例5与实施例1基本相同，不同之处在于，预处理原料采用麦草汽爆物，具体操作如下(1)将无霉变麦草抖去灰尘并晒干后磨成3-20mm长的碎麦草丝；(2)称取麦草丝10kg，加水浸泡后，挤干弃水，控制含水量为30％，然后1.5Mpa下高温蒸煮10分钟后突然降压，冷却，干燥至含水量5％-10％即得汽爆物。
(3)以添加比例为1∶2∶1向缓冲液中依次加入木聚糖酶、木糖/阿拉伯糖苷酶和α-葡萄糖醛酸酶制得多酶混合液，其中木聚糖酶的用量为10U/g，木糖/阿拉伯糖苷酶20U/g和α-葡萄糖醛酸酶10U/g，汽爆物与多酶液的比为1∶10(w/v)。
(4)一边搅拌一边将汽爆物加至酶液中80℃保温12小时，水解结束后经过滤去渣后，加入4倍体积的乙醇并搅拌均匀后，离心取上清，维持75-80℃下进行蒸发浓缩，然后冷却至60℃，得木糖产品。
实施例6与实施例1基本相同，不同之处在于，木聚糖酶和α-葡萄糖醛酸酶是嗜热脂肪芽孢杆菌木聚糖酶和α-葡萄糖醛酸酶，水解温度是65℃。
实施例7与实施例1基本相同，不同之处在于，木聚糖酶和α-葡萄糖醛酸酶是海栖热袍菌木聚糖酶和α-葡萄糖醛酸酶，木糖/阿拉伯糖苷酶是嗜热厌氧乙醇菌双活性阿拉伯/木糖苷酶，水解温度是70℃。
实施例8与实施例1基本相同，不同之处在于木聚糖酶、木糖/阿拉伯糖苷酶和α-葡萄糖醛酸酶的添加比例为1∶1.5∶0.5，其中木聚糖酶的用量为20U/g，木糖/阿拉伯糖苷酶30U/g和α-葡萄糖醛酸酶10U/g。
实施例9与实施例5基本相同，不同之处在于所用原料为玉米芯汽爆物；木聚糖酶、木糖/阿拉伯糖苷酶和α-葡萄糖醛酸酶的添加比例为1∶0.5∶1.25，即木聚糖酶的用量为20U/g，木糖/阿拉伯糖苷酶10U/g和α-葡萄糖醛酸酶25U/g，汽爆物与多酶液的比为1∶8(w/v)。
实施例10与实施例5基本相同，不同之处在于所用原料为甘蔗渣汽爆物，汽爆物与多酶液的比为1∶20(w/v)。
权利要求
1.一种木糖的酶法制备方法，其步骤如下步骤1农作物废弃物经碱抽提法或汽瀑法进行预处理，制成木聚糖或汽瀑物；步骤2向缓冲液中加入木聚糖酶、双活性木糖/阿拉伯糖苷酶和α-葡萄糖醛酸酶制得多酶混合液；步骤3边搅拌边将木聚糖或者汽爆物加至多酶混合液中进行酶解；步骤4水解结束后，向木聚糖酶解液中加入乙醇，如果是汽爆物酶解液则经过滤去渣后加入乙醇；然后取上清液进一步浓缩结晶得到木糖产品。
2.根据权利要求1所说的制备方法，其特征在于步骤2是所说的缓冲液是用pH4-7的缓冲液；其中木聚糖酶、双活性木糖/阿拉伯糖苷酶和α-葡萄糖醛酸酶的用量比为1∶0.5-1.5∶0.5-1.25。
3.根据权利要求2所说制备方法，其特征在于木聚糖酶、双活性木糖/阿拉伯糖苷酶和-葡萄糖醛酸酶的用量比为1∶1∶0.75。
4.根据权利要求2所说制备方法，其特征在于步骤3所说的酶解是在55-100℃下进行；木聚糖与酶液的比为1∶3-10w/v，或者是汽爆物与酶液的比为1∶6-20w/v。
5.根据权利要求2所说制备方法，其特征在于步骤4为向木聚糖酶解液或过滤去渣的汽爆物酶解液中，加入酶解液的4-5倍体积的乙醇，然后取上清液进一步浓缩结晶得到木糖产品。
全文摘要
本发明涉及一种木糖的酶法制备方法。具体是将农作物废弃物经预处理，制成木聚糖或汽瀑物；再向缓冲液中加入木聚糖酶、双活性木糖/阿拉伯糖苷酶和α－葡萄糖醛酸酶制得多酶混合液；边搅拌边将木聚糖或者汽爆物加至多酶混合液中进行酶解；水解结束后，酶解液中加入乙醇，然后进一步浓缩结晶得到木糖产品。采用本发明的方法，木糖的释放率可达采用木聚糖酶和木糖苷酶的2倍多，提高了生产效率，且能耗低，污染小，操作简单易控，同时产物易纯化，产品保持天然品质；同时利用酶法制备的木糖对菌种无毒害性，可直接用于酵母菌生物转化木糖醇，不需脱毒，发酵性能好，利于木糖转化为木糖醇，具有重要的经济效益和社会效益。
文档编号C12P19/00GK1884569SQ20061004038
公开日2006年12月27日 申请日期2006年5月19日 优先权日2006年5月19日
发明者邵蔚蓝, 薛业敏, 吴爱莲, 曾红艳 申请人:南京师范大学