专利名称：一种用于细胞核移植/克隆电融合的针状微电极的制作方法
技术领域：
本发明属于农业生物技术领域，涉及用于细胞核移植(克隆)过程中的电融合操作辅助器具，特别是一种用于细胞核移植/克隆电融合的针状微电极。
背景技术：
随着生物技术的发展，各项学科技术的横向联合也越来越广泛，细胞核移植(克隆)技术已经成为生产转基因动物、制作乳腺生物反应器、治疗性克隆等前沿领域的一个不可替代的技术平台，其价值及在生物技术领域中的地位是不言而喻的。但到目前为止，核移植的总体效率比较低，这归结为核移植整个技术体系的各个环节效率不高累积的结果，电融合作为核移植技术体系的一个重要环节，其效率的高低直接影响了整个核移植的总体成功率。传统的电融合方法是以电融合槽为操作装置进行电融合，把核移植重组体放入两根平行排列的电极之间，然后以异物针拨动重组体，使被移植的两细胞膜接触面与电极平行。电融合槽法的不足之处在于电融合是在普通的体视显微镜下操作，由于体视显微镜放大倍数较低，在实际操作过程中，如果是以颗粒细胞、成纤维细胞等较小细胞作为供体细胞时，判断细胞膜接触面是否与电极平行就显得非常困难，而且在操作时需要在两台显微镜之间反复操作，大大加长了重组体的体外操作时间，致使核移植胚的活力下降，从而影响了核移植总体效率。
根据申请人所进行的资料检索，国内外还没有利用针状微电极进行细胞核移植(克隆)电融合的相关报道。
发明内容
针对上述现有技术存在的缺陷或不足，本发明的目的在于，提供一种用于细胞核移植/克隆电融合的针状微电极，该微电极能够提高细胞核移植(克隆)电融合速度及效率，能用于细胞核移植(克隆)和细胞融合领域。
为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案一种用于细胞核移植/克隆电融合的针状微电极，其特征在于，该针状微电极包括与电融合仪连接的第一电极和第二电极，两个电极均由粗细不同的A、B、C段组成，A段长度为20～30mm，直径为1mm；B段长度为20mm～30mm，直径为0.4mm～1mm；C段长度为5mm～10mm，直径为100μm～180μm；所述的第一电极的C段为圆台形前端，第二电极的C段为圆锥形前端。
本发明的用于细胞核移植/克隆电融合的针状微电极，由于两个电极的前端设计不同，且电极的尖端是微米级，将两个电极安装在显微操作仪的两个固定杆上，利用显微操作仪的光学系统和操作手柄来进行操作，以调整重组体中受体膜与供体膜接触面的位置和角度，也用来调整微电极的位置，做到受体膜与供体膜接触面与两电极的连线精确垂直，提高电融合的成功率。在电融合时，把供体细胞注入卵周隙后的“供体细胞-受体卵”复合体(也称重组体)置于两微电极间，以其中的锥形电极拨动“供体细胞-受体卵”复合体使其细胞膜接触面与两电极连线垂直，用两电极卡住重组体后，通过电融合仪施加电脉冲，30分钟后观察融合情况。整个电融合操作时间能够比传统的融合槽法节约20～50倍，成功率提高20％以上。大大减少了克隆胚的体外操作时间并提高了其电融合效率，从而在电融合环节上提高了细胞核移植(克隆)的成功率，而且操作简便快捷，完全可应用于科学研究。
图1是本发明的第一电极示意图；图2是本发明的第二电极示意图；图3是第一电极C段前端放大示意图；
图4是第二电极电极C段前端放大示意图；图5是微电极与显微操作仪和电融合仪组装示意图；图6电融合时两根电极与重组体位置关系示意图。
具体实施例方式
本发明的用于细胞核移植/克隆电融合的针状微电极包括与电融合仪连接的第一电极和第二电极，它们均由粗细不同的A、B、C段组成(见图1、图2)，A段长20～30mm，直径1mm；B段长20～30mm，直径0.4～1mm；C段长5～10mm，直径100～180μm。不同的是第一电极和第二电极的C段的前端部分不同(图4)，第一电极的前端为圆台形，前细后粗，顶端直径为10～150微米(见图3)，这样设计的目的是在电融合时有较大面积的平面与重组体的受体卵一侧接触，但又不能过大，因为电极过大的话会影响显微镜下视野，给操作带来不便。第二电极的前端为圆锥状，因为锥形的电极较适合用来拨动调整细胞膜接触面的位置，而且也因为供体细胞较小，所以在重组体的供体细胞一侧采用较细的针状电极为宜。电极的各个的部分的尺寸是根据卵母细胞的大小及电融合操作的需要设计的。
在使用过程中把两根电极安装在显微操作仪的安装显微操作针的位置，在固定杆的螺旋杆上与电融合仪用电线连接，其操作类似于显微操作。简单的说，就是将待融合的重组体放入上覆矿物油的电融合液微滴中，在视野下将重组体置于电极的上方，以第一电极的前端顶住重组体，再以第二电极的尖端拨动重组体，以调整供体细胞与受体细胞的膜接触面，使其与最终两电极的连线垂直，即以第二电极的尖端顶住重组体中供体细胞的位置，然后以两电极卡住重组体，直接利用融合仪的脚踏开关进行脉冲输出进行电融合，融合结束后，将已经融合完的重组体置于电极的下方，再进行第二个电融合，电极的组装与操作示意图见图5和图6。
采用本发明的电极，能够使整个操作程序简化，不再需要专用的融合槽，直接在微滴下操作即可。
使用微电极时，输出电压的粗略计算方法1.在进细胞核移植(克隆)电融合时输出电压的粗略计算方法 2.在进行细胞电融合时输出电压的粗略计算方法 上述公式只能在一定的范围内粗略估算输出电压的大小，在具体实验中还应在估算出的输出电压值附近进行条件的优化，方能达到理想的效果。
实施例1两个电极的A段长度为25mm，直径为1mm；B段长度为25mm，直径为0.6mm；C段长度为7mm，直径为150μm；所述的第一电极的C段为圆台形前端，顶端直径为100微米，第二电极的C段为圆锥形前端。
实施例2两个电极的A段长度为20mm，直径为1mm；B段长度为20mm，直径为0.9mm；C段长度为5mm，直径为100μm；所述的第一电极的C段为圆台形前端，顶端直径为50微米，第二电极的C段为圆锥形前端。
当然，两个电极的大小可以针对不同研究的需要来进行调整，例如，在进行牛、羊等大动物的克隆时应选择直径粗一些的电极，而在小鼠克隆时应该选择细一些的比较合适，如果不进行克隆，而只是两种体细胞间的融合，只要选择两根细一些的电极即可。
实验实施例1运用本发明的微电极进行电融合时，输出电压的粗略估算及条件的优化
(1)输出电压的粗略估算以山羊去核卵母细胞为受体，以山羊胎儿成纤维细胞为核供体进行核移植，将构建好重组体随机分组。本实验在使用电融合槽时的融合电压为2.4kv/cm，山羊的卵细胞的直径为140～160μm，把这两个数值带入上述的公式中
(2)输出电压的优化从(1)中算得输出电压约在0.34～0.38kv左右，设计以下实验来优化输出电压，详见表1。
表1输出电压的优化
从表1中可见，当输出电压为0.36kv时，电融合的成功率显著高于其它各实验组，所以在本实验的条件下，摸索出的优化输出电压为0.36kv，用于后继的实验研究。
实验实施例2微电极法与传统的电融合槽法的对比以山羊去核卵母细胞为受体，以山羊胎儿成纤维细胞为核供体进行核移植，将构建好的428枚重组体随机分为两组。第一组以传统的电融合槽法进行电融合，融合参数为2.4kv/cm，20μs，两次脉冲；第二组以微电极法进行电融合，融合参数为0.36kv(经过优化后的输出电压)，20μs，两次脉冲。分别记录融合时间和融合率。其结果见表1。
表2微电极法与传统的电融合槽法的对比
由表2可见，以微电极进行电融合比传统的电融合槽法融合成功率提高了20％以上，而在融合效率(时间)上也提高了20几倍。
权利要求
1.一种用于细胞核移植/克隆电融合的针状微电极，其特征在于，该针状微电极包括与电融合仪连接的第一电极和第二电极，两个电极均由粗细不同的A、B、C段组成，A段长度为20～30mm，直径为1mm；B段长度为20mm～30mm，直径为0.4mm～1mm；C段长度为5mm～10mm，直径为100μm～180μm；所述的第一电极的C段为圆台形前端，第二电极的C段为圆锥形前端。
2.如权利要求1所述的用于细胞核移植/克隆电融合的针状微电极，其特征在于，所述的第一电极圆台形前端的直径为10μm～150μm。
全文摘要
本发明公开了一种用于细胞核移植/克隆电融合的针状微电极，该针状微电极包括两个电极，它们均由粗细不同的A、B、C段组成，A段长度为20～30mm，直径为1mm；B段长度为20mm～30mm，直径为0.4mm～1mm；C段长度为5mm～10mm，直径为100μm～180μm；其中一个电极的C段为圆台形前端，另一个电极的C段为圆锥形前端。将上述电极其安装在显微操作仪的两个显微操作针的位置，借助于显微操作仪的操作手柄进行操作，操作简便、精确度高、使用速度快、实用性强。在电融合时，把供体细胞注入卵周隙后的重组体置于两微电极间，以其中一电极拨动重组体使其细胞膜接触面与两电极连线垂直，整个电融合操作时间能够比传统的融合槽法节约20～50倍，成功率提高20％以上。
文档编号C12N15/87GK1834256SQ20061004261
公开日2006年9月20日 申请日期2006年4月3日 优先权日2006年4月3日
发明者刘凤军, 张涌, 郑月茂, 张玉玲, 安志兴, 赵晓娥 申请人:西北农林科技大学