专利名称：一种重组动物丝－rgd融合蛋白及其生物合成方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种利用基因重组和发酵技术合成的具有细胞粘附活性的重组动物丝-RGD融合蛋白及其合成方法。
背景技术：
天然动物丝(包括蚕丝和蜘蛛丝等)蛋白纤维具有良好的力学性能，除了被用于传统的纺织原料外，在化妆品、食品、制药、新材料等领域正被不断地得到开发和利用。大部分的动物丝蛋白包含了丝素蛋白(Fibroin)和丝胶蛋白(Sericin)。丝胶蛋白由于具有较差的生物相容性以及容易引发过敏反应，所以本发明中所指的动物丝蛋白是丝素蛋白。动物丝蛋白由于其优越的力学性能和相对良好的生体适应性、易降解性，易降解且降解产物易被人体吸收而不产生炎症反应等优点，所以不仅作为手术缝合丝，丝蛋白作为医用生物材料在组织工程中作为细胞培养的支架材料等的应用研究也取得了许多可喜的成果。它具有人工合成材料所不可比拟的优势，但同时也存在着一些问题(1)动物丝蛋白材料的力学性能和通透性、降解速度等方面的矛盾。动物丝蛋白的平均分子量相对较大，一般多为300-400kDa，高分子量通常具有高强度，但它的通透性、降解速度就难以满足各种组织工程，尤其是细胞培养支架的要求。然而通过化学或酶降解，蛋白质的分子量又很难控制。
(2)动物丝蛋白材料与细胞之间的粘附性较差。目前是通过选择有利于细胞粘附的材料对动物丝蛋白材料进行表面修饰的方法来解决的，但其产品质量比较难控制，因此不能得到广泛的应用。
细胞与细胞外基质或细胞培养的支架材料等的粘附是细胞生存与增殖所必需的，这种粘附主要通过一种被称作为粘合素的物质来介导的。粘合素分子在与材料结合时所识别的只是材料中由数个氨基酸组成的短肽序列，其中最重要的识别序列是基质或支架材料分子中的Arg-Gly-Asp(精氨酸-乙氨酸-天门冬氨酸，简称RGD)序列，大多数粘合素都可识别它。所以如果细胞外基质或细胞培养的支架材料中含有RGD序列，它就可以参与创伤修复过程中细胞的移动，促进创面的愈合。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足之处，提供一种具有细胞粘附活性的重组动物丝-RGD融合蛋白及其合成方法。
本发明的一种重组动物丝-RGD融合蛋白，它的氨基酸序列包含了源于天然动物丝蛋白的序列以及含短肽RGD的序列。
所述重组动物丝-RGD融合蛋白含有源于动物丝蛋白的序列形成融合蛋白的结构区和短肽RGD的序列形成融合蛋白的功能区。
所述天然动物丝包括家蚕丝、野蚕丝、天蚕丝、蓖麻蚕丝、柞蚕丝和蜘蛛丝。
所述含短肽RGD的序列为包括含有氨基酸序列Arg-Gly-Asp的所有多肽。
所述含短肽RGD的序列为RGDArg-Gly-AspGRGDGly-Arg-Gly-AspRGDSArg-Gly-Asp-SerRGDSPArg-Gly-Asp-Ser-ProGRGDSGly-Arg-Gly-Asp-Ser。
该重组动物丝-RGD融合蛋白具有SEQ ID NO5中所示的氨基酸序列。
本发明的一种合成所述重组动物丝-RGD融合蛋白的方法，依次包括以下步骤(1)将合成的低聚核苷酸经退火处理成为双螺旋的目的DNA单体；(2)目的DNA单体通过在质粒中的Spe I和Nhe I限制性内切酶位点的重复聚合连接而成为高分子DNA；(3)将高分子DNA连接入表达用质粒，并转化表达用大肠杆菌宿主细胞后振荡培养，以IPTG诱导蛋白质的表达；(4)离心后收集的菌体重悬于细胞裂解缓冲液，冰浴并超声波破碎细胞，使菌体内蛋白释放；(5)所得细胞粗提物经金属螯合层析、蒸馏水中透析，再经冷冻干燥收集目的蛋白，即重组动物丝-RGD融合蛋白。
步骤(1)所述的低聚核苷酸为RGD-15’AATTCACTAGTACCGGCCGTGGTGATTCTCCGGCTGGCGTACCAGGTGTTGGCGTTCCGGGTGTG3’RGD-25’ACCCCCCACACCCGGAACGCCAACACCTGGTACGCCAGCCGGAGAGTCACCACGGCCGGTACTAGTG3’Silk-15’GGGGGTGGTGCAGGTGCTGGCTCCGGTGCCGGCGCGGGGAGCGGGGCAGGCGCAGGTTCTGCTAGCG3’Silk-25’GATCCGCTAGCAGAACCTGCGCCTGCCCCGCTCCCCGCGCCGGCACCGGAGCCAGCACCTGCACC 3’。
所述的低聚核苷酸的长度为200个碱基对或以下。
本发明的有益之处在于(1)提供了一种利用基因重组和发酵技术来合成模拟天然动物丝蛋白，并使其具有细胞粘附活性的方法。通过调节DNA的聚合度，可以达到有效控制蛋白质分子量的目的。
(2)该重组动物丝-RGD融合蛋白既具有天然动物丝蛋白的结构和功能，又具有细胞粘附活性，从而解决了天然动物丝蛋白材料细胞粘附活性差的缺点。
(3)该重组动物丝-RGD融合蛋白既可用于其它医用材料的表面修饰，又可以经过适当的加工成为如手术缝合丝、人工皮肤以及骨组织等具有可降解性的医用生物材料，在组织工程中加于应用。
图1为本发明的重组动物丝-RGD融合蛋白的二级结构示意图；图1中结构区由源于动物丝蛋白的氨基酸序列组成，功能区由含短肽RGD的序列组成。
图2为本发明的实施例的具有不同分子量的重组动物丝-RGD融合蛋白的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)图；图2中M-蛋白分子量标准；1-重组动物丝-RGD融合蛋白SilkRGD(2)，分子量16kDa；2泳道-重组动物丝-RGD融合蛋白SilkRGD(6)，分子量30kDa；3泳道-重组动物丝-RGD融合蛋白SilkRGD(10)，分子量42kDa。
图3为小鼠成纤维细胞BALB/3T3在本发明的实施例的重组动物丝-RGD融合蛋白上经2小时培养后的细胞接着数量；图3中以天然胶原蛋白及天然蚕丝蛋白的评价作对照。2小时培养反映的是细胞在载体上的粘附性能。
图4为小鼠成纤维细胞BALB/3T3在本发明的实施例的重组动物丝-RGD融合蛋白上经36小时培养后的细胞接着数量；图4中以天然胶原蛋白及天然蚕丝蛋白的评价作对照。36小时培养反映的是细胞在载体上的生长性能。
具体实施例方式
下面结合实施例来说明本发明的技术方案本实施例中所使用的氨基酸序列Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ser来源于天然家蚕丝蛋白的结晶区域。其特殊之处在于以(Gly-Ala)n-Gly-Xaa为基本的组成单元(Gly为甘氨酸，Ala为丙氨酸)，Xaa为具有较小氨基酸侧链的残基，如Ala(丙氨酸)，Ser(丝氨酸)等。该氨基酸序列的结构特征是形成稳定的β-折叠。
另外，本发明中采用了另外一个氨基酸序列Thr-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Ala-Gly-Val-Pro-Gly-Val-Gly-Val-Pro-Gly-Val。其特殊之处在于序列中包含了Arg-Gly-Asp，即RGD序列。
该重组动物丝-RGD融合蛋白材料具有如图1所示的结构特征。其特殊之处在于，源于天然家蚕丝蛋白的序列形成材料的结构区，提供材料的力学性能；含短肽RGD的序列形成材料的功能区，提供材料的细胞粘附性能。
实施例1、重组动物丝-RGD融合蛋白质粒的构建一种设计的重组动物丝-RGD融合蛋白的氨基酸序列如下[Thr-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Ala-Gly-Val-Pro-Gly-Val-Gly-Val-Pro-Gly-Val-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ser-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ser-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ser-Ala-Ser]n(1)设计和合成了四个低聚核苷酸RGD-1，RGD-2，Silk-1和Silk-2，然后运用退火的方法分别得到两段双螺旋DNA，其核苷酸序列分别为RGD-15’AATTCACTAGTACCGGCCGTGGTGATTCTCCGGCTGGCGTACCAGGTGTTGGCGTTCCGGGTGTG3’RGD-25’ACCCCCCACACCCGGAACGCCAACACCTGGTACGCCAGCCGGAGAGTCACCACGGCCGGTACTAGTG3’Silk-15’GGGGGTGGTGCAGGTGCTGGCTCCGGTGCCGGCGCGGGGAGCGGGGCAGGCGCAGGTTCTGCTAGCG3’Silk-25’GATCCGCTAGCAGAACCTGCGCCTGCCCCGCTCCCCGCGCCGGCACCGGAGCCAGCACCTGCACC3’。
RGD-1和RGD-2经退火处理所得双螺旋RGD基因对应于氨基酸序列Thr-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Ala-Gly-Val-Pro-Gly-Val-Gly-Val-Pro-Gly-Val-Gly。
Silk-1和Silk-2经退火处理所得双螺旋Silk基因对应于氨基酸序列Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ser-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ser-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ser-Ala-Ser。
在两段DNA片断的两端，分别设计了Spe I和Nhe I限制性内切酶位点。
(2)设计两个低聚核苷酸(Adapter-1和Adapter-2)，然后运用退火的方法得到一段双螺旋Adapter DNA，序列为Adapter-15’CTAGAATGACTAGTGGGCCCGCTAGCATGT 3’Adapter-25’CTAGACATGCTAGCGGGCCCACTAGTCATT 3’把设计有Spe I和Nhe I限制性内切酶位点的Adapter DNA连接到质粒pUC118(购自Takara)的Xba I位点中，制作成一个新的质粒pUC118-linker。
其特殊之处在于在原先没有限制性内切酶位点Spe I和Nhe I的pUC118中，通过重组技术导入了该位点而创建了一个新的质粒。
(3)用限制性内切酶Spe I和Nhe I对pUC118-linker进行切割，CIAP处理后，用1.2％琼脂糖凝胶电泳分离，切取目的片段，利用DNA凝胶回收试剂盒(Gel Extraction Kit)(购自碧云天公司)纯化后与Silk和RGD基因连接，得到重组质粒，命名为pUC118-linker-SilkRGD(1)，后转入大肠杆菌DH5α(购自Novagen)中，用氨苄青霉素进行克隆选择。将克隆株在1.5ml LB培养基中重新培养。以碱裂解法提取质粒，以Spe I-Nhe I双酶切法筛选接入正确外源基因的转化子。以Rapid Plasmid DNA Daily Mini-prep Kit小量制备质粒，并经DNA测序确认其序列，得质粒pUC118-linker-SilkRGD(1)。
用Spe I和Nhe I对pUC118-linker-SilkRGD(1)进行切割，用1.2％琼脂糖凝胶电泳分离，切取目的片段，利用DNA凝胶回收试剂盒(Gel ExtractionKit)纯化后得到单体SilkRGD(1)；另一方面，用Spe I或Nhe I对pUC118-linker-SilkRGD(1)进行切割，CIAP处理后，用1.2％琼脂糖凝胶电泳分离，切取目的片段，利用DNA凝胶回收试剂盒(Gel Extraction Kit)纯化后得到线性的pUC118-linker-SilkRGD(1)。将单体SilkRGD(1)与线性pUC118-linker-SilkRGD(1)连接，得到重组质粒，命名为pUC118-linker-SilkRGD(2)，后转入大肠杆菌DH5α中，用氨苄青霉素进行克隆选择。将克隆株在1.5ml LB培养基中重新培养，用碱裂解法提取与纯化带有两个重复(两倍体)目的DNA的质粒pUC118-linker-SilkRGD(2)。
重复该步骤，就可以得到三倍体，四倍体，五倍体，六倍体等具有不同聚合度的目的DNA大分子的质粒。
(3)将以上多倍体，如十倍体pUC118-linker-SilkRGD(10)用BamHI和HindIII进行切割，同样用BamHI和HindIII对质粒pET30a(+)(购自Novagen)进行切割，用1.2％琼脂糖凝胶电泳分离，切取目的片段，利用DNA凝胶回收试剂盒(Gel Extraction Kit)纯化后得到SilkRGD(10)和线性pET30a(+)DNA；线性pET30a(+)DNA经CIAP处理后与SilkRGD(10)连接，并转入大肠杆菌DH5α中，用卡纳霉素进行克隆选择。将克隆株在1.5ml LB培养基中重新培养，带有目的DNA的表达质粒pET30a(+)-SilkRGD(10)用碱裂解法提取与纯化。
本发明的特殊之处在于用同样的方法可以构筑pET30a(+)-SilkRGD(n)，n为任何整数，但一般小于20的具有目的DNA大分子的重组质粒。
实施例2、重组动物丝-RGD融合蛋白的表达(1)将测序验证的pET30a(+)-SilkRGD(n)，如pET30a(+)-SilkRGD(10)质粒转化感受态细胞BL21(DE3)pLysS(购自Novagen)细菌，挑取单菌落接种于LB液体培养基，37℃振荡培养过夜，然后以1∶100接种于含10-50μg/ml卡纳霉素和25-170μg/ml氯霉素的TB液体培养基，当OD600达到0.5-1.0左右时，加入诱导剂IPTG诱导蛋白质的表达，IPTG的浓度为0.1-2mM。继续培养2-5小时后经离心收集菌体(5000×g，4℃离心10分钟)。
本发明的特殊之处在于诱导表达的时间和温度可根据实际情况，如目的蛋白的可溶性，稳定性和表达量进行调整，可调整为采用30℃诱导4小时以上，或者20-25℃或12-15℃诱导过夜。
实施例3、重组动物丝-RGD融合蛋白的纯化用3-7倍于细胞湿重的冰冷的细胞裂解缓冲液(Cell Lysis Buffer)将上述收集的菌体重悬，冰浴，超声波破碎细胞，使蛋白SilkRGD(10)释放。细胞破碎后液体粘度升高，若混合液的粘度过高，可适当稀释细胞裂解液，或加入含有MgCl2(终浓度为5mM)的10μg/ml无蛋白酶污染的DNA酶，以降低粘稠度。20,000×g，4℃离心30分钟，上清即为澄清的细胞粗提物。该粗提物经金属螯合层析、蒸馏水中透析，再经冷冻干燥收集蛋白。
蛋白质的表达和纯化结果通过SDS-PAGE凝胶电泳(图2)实验进行确认。图2中M为蛋白分子量标准；1泳道为重组动物丝-RGD融合蛋白SilkRGD(2)，分子量16kDa；2泳道为重组动物丝-RGD融合蛋白SilkRGD(6)，分子量30kDa；3泳道为重组动物丝-RGD融合蛋白SilkRGD(10)，分子量42kDa。
实施例4、重组动物丝-RGD融和蛋白的实验研究(1)将重组动物丝-RGD融合蛋白SilkRGD(10)溶解于PBS(磷酸缓冲盐溶液，pH7.4)中，浓度为0.5％。以同样的方法溶解天然胶原蛋白及天然家蚕丝蛋白于PBS中。
(2)蛋白涂层将上述三种0.5％蛋白溶液分别注入三个48口孔细胞培养板(Microplate)中，每个口孔注入蛋白溶液500μl于底部，经过30分钟后使其成层。
(3)细胞接种与培养将小鼠成纤维细胞BALB/3T3(购自中国科学院上海生科院细胞资源中心)混悬于新鲜的液体培养基Eagle’s MEM(FBS)中，以每孔1×105细胞的密度接种于上述培养板中，于37℃、5％CO2、95％空气高湿度的培养箱中培养2小时和36小时。
(4)细胞接着数的评价细胞培养结束后，使培养基从培养板上脱离，用500μl PBS冲洗三次并去除PBS，每孔注入200μl 0.5％Triton-X100/PBS保存一个晚上，使细胞悬浮。在细胞悬浮液中，加入LDH(乳酸脱氢酶)液，并直接在plate reader分析仪上测定340nm处的吸光度。
实验结果上述三种蛋白质材料经2小时(图3)和36小时(图4)培养后的细胞接着数量。2小时培养反映的是细胞在载体上的粘附性能，而36小时培养反映的是细胞在载体上的生长性能。两图均以天然家蚕丝蛋白的活性为基准，即100来比较的。实验结果显示无论是细胞在重组动物丝-RGD融合蛋白SilkRGD(10)上的粘附性能还是生长性能都远远优于天然家蚕丝蛋白，甚至优于天然胶原蛋白。因此，该重组动物丝-RGD融合蛋白经适当加工后，具有很好的应用前景，尤其适用于生物医用材料、组织工程等领域的应用。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
1.一种重组动物丝-RGD融合蛋白，其特征在于它的氨基酸序列包含了源于天然动物丝蛋白的序列以及含短肽RGD的序列。
2.根据权利要求1所述的重组动物丝-RGD融合蛋白，其特征在于所述重组动物丝-RGD融合蛋白含有源于动物丝蛋白的序列形成融合蛋白的结构区和短肽RGD的序列形成融合蛋白的功能区。
3.根据权利要求1所述的重组动物丝-RGD融合蛋白，其特征在于所述天然动物丝包括家蚕丝、野蚕丝、天蚕丝、蓖麻蚕丝、柞蚕丝和蜘蛛丝。
4.根据权利要求1所述的重组动物丝-RGD融合蛋白，其特征在于所述含短肽RGD的序列为包括含有氨基酸序列Arg-Gly-Asp的所有多肽。
5.根据权利要求4所述的重组动物丝-RGD融合蛋白，其特征在于所述含短肽RGD的序列为RGDArg-Gly-AspGRGDGly-Arg-Gly-AspRGDSArg-Gly-Asp-SerRGDSPArg-Gly-Asp-Ser-ProGRGDSGly-Arg-Gly-Asp-Ser。
6.根据权利要求1所述的重组动物丝-RGD融合蛋白，其特征在于该重组动物丝-RGD融合蛋白具有SEQ ID NO5中所示的氨基酸序列。
7.一种合成如权利要求1所述的重组动物丝-RGD融合蛋白的方法，其特征在于依次包括以下步骤(1)将合成的低聚核苷酸经退火处理成为双螺旋的目的DNA单体；(2)目的DNA单体通过在质粒中的Spe I和Nhe I限制性内切酶位点的重复聚合连接而成为高分子DNA；(3)将高分子DNA连接入表达用质粒，并转化表达用大肠杆菌宿主细胞后振荡培养，以IPTG诱导蛋白质的表达；(4)离心后收集的菌体重悬于细胞裂解缓冲液，冰浴并超声波破碎细胞，使菌体内蛋白释放；(5)所得细胞粗提物经金属螯合层析、蒸馏水中透析，再经冷冻干燥收集目的蛋白，即重组动物丝-RGD融合蛋白。
8.根据权利要求7所述的重组动物丝-RGD融合蛋白的合成方法，其特征在于步骤(1)所述的低聚核苷酸为RGD-15’AATTCACTAGTACCGGCCGTGGTGATTCTCCGGCTGGCGTACCAGGTGTTGGCGTTCCGGGTGTG 3’RGD-25’ACCCCCCACACCCGGAACGCCAACACCTGGTACGCCAGCCGGAGAGTCACCACGGCCGGTACTAGTG 3’Silk-15’GGGGGTGGTGCAGGTGCTGGCTCCGGTGCCGGCGCGGGGAGCGGGGCAGGCGCAGGTTCTGCTAGCG 3’Silk-25’GATCCGCTAGCAGAACCTGCGCCTGCCCCGCTCCCCGCGCCGGCACCGGAGCCAGCACCTGCACC 3’。
9.根据权利要求7所述的重组动物丝-RGD融合蛋白的合成方法，其特征在于所述的低聚核苷酸的长度为200个碱基对或以下。
全文摘要
本发明公开了一种重组动物丝－RGD融合蛋白及其生物合成方法，该重组动物丝－RGD融合蛋白的氨基酸序列包含了源于天然动物丝蛋白的序列以及含短肽RGD的序列，以及该融合蛋白的生物合成方法。本发明的重组动物丝－RGD融合蛋白既具有天然动物丝蛋白的结构和功能，又具有细胞粘附活性，并提供了一种利用基因重组和发酵技术来合成模拟天然动物丝蛋白的方法，该融合蛋白可用于医用材料的表面修饰，经加工成为可降解性的医用生物材料，在组织工程中加于应用。
文档编号C12N15/09GK1807460SQ20061004941
公开日2006年7月26日 申请日期2006年2月13日 优先权日2006年2月13日
发明者姚菊明 申请人:浙江理工大学