专利名称：一种具有厌氧氨氧化活性的浮霉状菌的分离、鉴定方法
技术领域：
本发明涉及一种具有厌氧氨氧化活性的浮霉状菌的分离、鉴定方法。
背景技术：
厌氧氨氧化(Anaerobic ammonia oxidation，Anammox)首次报道于1990年，它是一个以氨为电子供体，以亚硝酸盐为电子受体的生物反应，反应产物为氮气()[1]。在废水生物脱氮领域，它突破了经典的硝化-反硝化理论，人们以此为基础研创了崭新的生物脱氮工艺，如短程硝化(SHARON)-厌氧氨氧化工艺、OLAND工艺和CANON工艺等。这些生物脱氮工艺所涉及的微生物为自养细菌，无需外加有机碳源，不但可节约运行成本40％以上，而且可为高浓度含氮废水(特别是低碳氮比废水，如污泥压滤液、焦化废水等化工废水、味精废水等食品加工废水)处理这一世界性难题的解决提供一条理想的途径。在微生物领域，Anammox突破了长期以来氨氧化必须有氧参与的观念，揭示了一类前所未闻的微生物，即厌氧氨氧化菌，丰富了微生物学内容。
在自然生态系统中，由于氧供应不足或电子供体(硫化物或有机质)有限，常常发生氨氧化成亚硝酸盐或硝酸盐还原成亚硝酸盐，氨与亚硝酸盐共同存在的情况。现已证明，在海洋底泥、海洋深水缺氧区、湖泊底泥、渍水土壤以及许多污水处理装置中，都可检测到厌氧氨氧化活性[2-7]。同时含有氨和亚硝酸盐(或硝酸盐)的自然生境样品或人工生境样品是厌氧氨氧化菌的良好分离源。
迄今为止，文献报道的厌氧氨氧化菌共有五个种，分别归于浮霉状菌的三个属中[2，8，9]。这五种厌氧氨氧化菌都是采用密度梯度离心法分离获得的[10]，还没有采用经典微生物分离法成功获得厌氧氨氧化菌的报道。换句话说，到目前为止还无人获得过厌氧氨氧化菌的纯培养物。
参考文献[1]Van de Graaf AA，Mulder A，De Bruijn P，et al.Anaerobic oxidation of ammoniais a biologically mediated process.Applied and Environmental Microbiology，1995，61(4)1246-1251[2]Schmid M，Twachtmann U，Klein M，et al.Molecular evidence for genus leveldiversity of bacteria capable of catalyzing anaerobic ammonium oxidation.SystAppl microbial，2000，2393-106[3]Gable J E.Anaerobic ammonium oxidation during soil aquifer treatment(D).Arizona state university，2002. Thamdrup B and Dalsgaard T.Production of N2through anaerobic ammoniaoxidation coupled to nitrate reduction in marine sediments.Applied andEnvironmental Microbiology，2002，68(3)1312-1318[5]Toh SK and Ashbolt NJ.Adaptation of anaerobic ammonium-oxidizingconsortium to synthetic coke-ovens wastewater.Appl Microbiol Biotechnol，2002，59344-352[6]Trimmer M，Nicholls JC，Deflandre B.Anaerobic ammonium oxidation measuredin sediments along the Thames Estuary，United Kingdom.Appl.Environ.Microbiol.2003，696447-6454. Devol A H.Solution to a marine mystery [J].Nature，2003，422(6932)575～576. Strous M，Fuerst JA，Kramer EHM，et al.Missing lithotroph identified as newplanctomycete.Nature 1999，400446-449[9]Schmid，M.，Walsh，K.，Webb，R.，et al.andidatus ″Scalindua brodae″，sp.nov.，Candidatus ″Scalindua wagnei″，sp.nov.，two new species of anaerobicammonium oxidizing bacteria.Systematic and Applied Microbiology 2003，26，529-538[10]Strous M，Kuenen JG，Fuerst JA，et al.The anammox--a new experimentalmanifesto for microbiological eco-physiology.Antonie van Leeuvenoek，2002，81693-702. 东秀珠，蔡妙英，等.常见细菌系统鉴定手册.科学出版社，2001. Holt JG.，Krieg NR.，Sneath PHA.et al.Bergey′s manual of determinativebacteriology(9th edition )Williams & Wilkins，1994427-455. Staley JT，Bryant MP，Pfennig N and Holt JG.Bergey’s manual of systematicbacteriology(Vol.3).Williams & Wilkins，1989，p.1807-1835发明内容本发明提供一种具有厌氧氨氧化活性的浮霉状菌的分离、鉴定方法。
具有厌氧氨氧化活性的浮霉状菌的分离步骤如下1)选取同时具有氨和硝酸盐或亚硝酸盐的自然生境和人工生境样品作为具有厌氧氨氧化活性的浮霉状菌的分离源，自然生境样品主要是渍水土壤、沼泽地污泥、湖泊底泥、海洋沉积物，人工生境样品主要是城市污水处理厂曝气池污泥、城市污水处理厂厌氧消化池污泥、各种废水生物脱氮处理系统中的活性污泥；2)以含有0.1mg/L～1mg/L的酵母膏或葡萄糖的基本无机盐液体培养基作为富集基质，采用连续培养或分批培养的方式，培育厌氧氨氧化生物膜、絮体或颗粒污泥；3)取厌氧氨氧化生物膜、絮体或颗粒污泥，用超声波破碎，制成初级菌悬液，再逐级稀释制成系列菌悬液；4)将系列菌悬液混合于融化的固体培养基中，在28-30℃下进行厌氧滚管法培养，用毛细管将厌氧滚管上长出的单菌落挑入液体培养基中，在28-30℃下厌氧培养，培养后，再采用厌氧滚管法分离单菌落，如此重复数次，当在显微镜下观察到的细菌细胞形态一致时，即认为目标菌株已被纯化。
所述的液体培养基配方为KHCO3500mg/L，KH2PO427.2mg/L，MgSO47H2O 300mg/L，CaCl2136mg/L，NaNO2140mg/L，NH4)2SO4140mg/L，微量元素I 1mL/L，微量元素II 1mL/L，酵母膏或葡萄糖贮备液1mL/L；其中微量元素I配方为EDTA 5000mg/L，FeSO45000mg/L；微量元素II配方为EDTA15000mg/L，ZnSO47H2O 430mg/L，CoCl26H2O 240mg/L，MnCl24H2O 990mg/L，CuSO45H2O 250mg/L，Na2MoO42H2O 220mg/L，NiCl26H2O 190mg/L，Na2SeO410H2O 210mg/L，H3BO414mg/L；酵母膏或葡萄糖贮备液配方为酵母膏或葡萄糖100mg/L。
固体培养基为在上述液体培养基中添加琼脂20g/L。
具有厌氧氨氧化活性的浮霉状菌的鉴定方法的步骤如下1)在液体培养基中扩增浮霉状菌纯培养物，5000rpm离心收获菌体细胞，用基本无机盐培养基制成菌体悬液，添加氨和亚硝酸盐，以厌氧条件下同时转化氨和亚硝酸盐的能力，判断该菌株是否为厌氧氨氧化菌；2)以菌体形态和16S rDNA序列确定菌株的分类地位，菌体形态包括培养菌落的观察和培养菌体的观察以及菌体细胞结构的观察，16S rDNA序列的测定步聚包括提取菌株基因组DNA，PCR扩增16S rDNA，纯化16S rDNA，测定16SrDNA序列，将测得的16S rDNA序列与GenBank(www.ncbi.com)中已有的16SrDNA序列比对，确定菌株的分类地位。
本发明的优点1)可以获得厌氧氨氧化菌的纯培养物，为微生物学研究和工业化应用提供菌种；2)了解被分离菌株的生理生化特性，便于菌种保藏和大量扩增；3)鉴定程序简单，结果可信。
具体实施例方式
本发明根据已分离的五种厌氧氨氧化菌均为浮霉状菌的现状，采用自主研制的适合浮霉状菌生长的培养基成功地获得浮霉状菌的纯培养物，并确认了纯培养菌株的厌氧氨氧化活性。
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1厌氧氨氧化菌分离鉴定的步骤如下1、本例选取城市污水处理厂曝气池活性污泥作为具有厌氧氨氧化活性的浮霉状菌的分离源。
2、采用连续培养方式，以添加微量酵母膏的基本无机盐液体培养基作为富集基质，培养厌氧氨氧化絮体。
3、取厌氧氨氧化絮体，用超声波破碎，制成菌悬液，再逐级系列稀释制成菌悬液。
4、将系列菌悬液混合于融化的固体培养基中，厌氧滚管，在28-30℃下厌氧培养。培养7-14天后，用毛细管将厌氧滚管上长出的单菌落挑入液体培养基中，在28-30℃下继续厌氧培养7-14天。培养后，再采用厌氧滚管法分离单菌落。如此重复数次。当在显微镜下观察到的细菌细胞形态一致时，即认为目标菌株已被纯化。
5、以液体培养基扩增纯培养物，离心收获菌体细胞，用基本无机盐培养基制成菌体悬液，添加氨和亚硝酸盐，以厌氧条件下同时转化氨和亚硝酸盐的能力，判断该菌株是否具有厌氧氨氧化活性。
6、根据纯培物的形态特征和分子生物学特征，确定菌株的分类地位，具体参照文献[12，13]进行。
1)形态特征包括培养菌落的观察和培养菌体的观察以及菌体细胞结构的观察。细菌细胞形态观察，按文献[11]介绍的方法染色，采用德国Leica研究显微镜(DMLB+QCOLite)观察。细菌细胞形态电镜观察，离心收集培养液中的细菌细胞，用生理盐水悬浮，然后用2％磷钨酸负染，制成悬滴样品，采用JEM-1200EX透射电镜下观察。细菌细胞结构电镜观察，超薄切片后，采用JEM-1200EX透射电镜(TEM)观察。
2)分子生物学特征主要是16S rDNA序列，其测定步聚为
a)采用细菌DNA抽提试剂盒提取并纯化被分离菌的基因组DNA。
b)采用一对PCR通用引物扩增16S rDNA[11]。正向引物BSF8/205′-AGAGTTTGAT CCTGG CTCAG-3′(Escherichia coli对应位置为8-27)；反向引物BSR1495/205′-ACGGC TACCT TGTTA CGACT-3′(Escherichia coli对应位置为1495-1514)。PCR反应在100μL反应体系中进行DNA模板(1.0μmol/L)5μL，dNTP混合物(终浓度100μmol)2μL，Taq DNA聚合酶(2.5U)1μL，正向引物Pf(50pmol)2μL，反向引物Pf(50pmol)2μL，缓冲液10μL，水78μL。PCR反应条件94℃，1min；52℃，1min，72℃，3min，30个循环。
c)纯化16S rDNA，委托生物科技有限公司测定16S rDNA序列。
d)将测得的16S rDNA序列与GenBank(www.ncbi.com)中已有序列的比对，确定分离菌株的分类地位。
实施例2厌氧氨氧化菌分离鉴定的步骤如下1、本例选取城市污水处理厂曝气池活性污泥作为具有厌氧氨氧化活性的浮霉状菌的分离源。
2、采用连续培养方式，以添加微量葡萄糖的基本无机盐液体培养基作为富集基质，培养厌氧氨氧化絮体。
3、取厌氧氨氧化絮体，用超声波破碎，制成菌悬液，再逐级系列稀释制成菌悬液。
4、将系列菌悬液混合于融化的固体培养基中，厌氧滚管，在28-30℃下厌氧培养。培养7-14天后，用毛细管将厌氧滚管上长出的单菌落挑入液体培养基中，在28-30℃下继续厌氧培养7-14天。培养后，再采用厌氧滚管法分离单菌落。如此重复数次。当在显微镜下观察到的细菌细胞形态一致时，即认为目标菌株已被纯化。
5、以液体培养基扩增纯培养物，离心收获菌体细胞，用基本无机盐培养基制成菌体悬液，添加氨和亚硝酸盐，以厌氧条件下同时转化氨和亚硝酸盐的能力，判断该菌株是否具有厌氧氨氧化活性。
6、根据纯培物的形态特征和分子生物学特征，确定菌株的分类地位，具体参照文献[12，13]进行。
1)形态特征包括培养菌落的观察和培养菌体的观察以及菌体细胞结构的观察。细菌细胞形态观察，按文献[11]介绍的方法染色，采用德国Leica研究显微镜(DMLB+QCOLite)观察。细菌细胞形态电镜观察，离心收集培养液中的细菌细胞，用生理盐水悬浮，然后用2％磷钨酸负染，制成悬滴样品，采用JEM-1200EX透射电镜下观察。细菌细胞结构电镜观察，超薄切片后，采用JEM-1200EX透射电镜(TEM)观察。
2)分子生物学特征主要是16S rDNA序列，其测定步聚为a)采用细菌DNA抽提试剂盒提取并纯化被分离菌的基因组DNA。
b)采用一对PCR通用引物扩增16S rDNA[11]。正向引物BSF8/205′-AGAGTTTGAT CCTGG CTCAG-3′(Escherichia coli对应位置为8-27)；反向引物BSR1495/205′-ACGGC TACCT TGTTA CGACT-3′(Escherichia coli对应位置为1495-1514)。PCR反应在100μL反应体系中进行DNA模板(1.0μmol/L)5μL，dNTP混合物(终浓度100μmol)2μL，Taq DNA聚合酶(2.5U)1μL，正向引物Pf(50pmol)2μL，反向引物Pf(50pmol)2μL，缓冲液10μL，水78μL。PCR反应条件94℃，1min；52℃，1min，72℃，3min，30个循环。
c)纯化16S rDNA，委托生物科技有限公司测定16S rDNA序列。
d)将测得的16S rDNA序列与GenBank(www.ncbi.com)中已有序列的比对，确定分离菌株的分类地位。
本实施例与实施例1相比将酵母膏换成葡萄糖，同样可分离到具有厌氧氨氧化活性的浮霉状菌。
实施例3厌氧氨氧化菌分离鉴定的步骤如下1、本例选取渍水土壤作为具有厌氧氨氧化活性的浮霉状菌的分离源。
2、采用连续培养方式，以添加微量酵母膏的基本无机盐液体培养基作为富集基质，培养厌氧氨氧化絮体。
3、取厌氧氨氧化絮体，用玻璃匀浆器破碎，制成菌悬液，再逐级系列稀释制成菌悬液。
4、将系列菌悬液混合于融化的固体培养基中，厌氧滚管，在28-30℃下厌氧培养。培养7-14天后，用毛细管将厌氧滚管上长出的单菌落挑入液体培养基中，在28-30℃下继续厌氧培养7-14天。培养后，再采用厌氧滚管法分离单菌落。如此重复数次。当在显微镜下观察到的细菌细胞形态一致时，即认为目标菌株已被纯化。
5、以液体培养基扩增纯培养物，离心收获菌体细胞，用基本无机盐培养基制成菌体悬液，添加氨和亚硝酸盐，以厌氧条件下同时转化氨和亚硝酸盐的能力，判断该菌株是否具有厌氧氨氧化活性。
6、根据纯培物的形态特征和分子生物学特征，确定菌株的分类地位，具体参照文献[12，13]进行。
1)形态特征包括培养菌落的观察和培养菌体的观察以及菌体细胞结构的观察。细菌细胞形态观察，按文献[11]介绍的方法染色，采用德国Leica研究显微镜(DMLB+QCOLite)观察。细菌细胞形态电镜观察，离心收集培养液中的细菌细胞，用生理盐水悬浮，然后用2％磷钨酸负染，制成悬滴样品，采用JEM-1200EX透射电镜下观察。细菌细胞结构电镜观察，超薄切片后，采用JEM-1200EX透射电镜(TEM)观察。
2)分子生物学特征主要是16S rDNA序列，其测定步聚为a)采用细菌DNA抽提试剂盒提取并纯化被分离菌的基因组DNA。
b)采用一对PCR通用引物扩增16S rDNA[11]。正向引物BSF8/205′-AGAGTTTGAT CCTGG CTCAG-3′(Escherichia coli对应位置为8-27)；反向引物BSR1495/205′-ACGGC TACCT TGTTA CGACT-3′(Escherichia coli对应位置为1495-1514)。PCR反应在100μL反应体系中进行DNA模板(1.0μmol/L)5μL，dNTP混合物(终浓度100μmol)2μL，Taq DNA聚合酶(2.5U)1μL，正向引物Pf(50pmol)2μL，反向引物Pf(50pmol)2μL，缓冲液10μL，水78μL。PCR反应条件94℃，1min；52℃，1min，72℃，3min，30个循环。
c)纯化16S rDNA，委托生物科技有限公司测定16S rDNA序列。
d)将测得的16S rDNA序列与GenBank(www.ncbi.com)中已有序列的比对，确定分离菌株的分类地位。
与实施例1相比，本实施例采用不同的分离源及不同的厌氧氨氧化絮体破碎方式同样可以分离到具有厌氧氨氧化活性的浮霉状菌。
实施例4厌氧氨氧化菌分离鉴定的步骤如下1、本例选取城市污水处理厂曝气池活性污泥作为具有厌氧氨氧化活性的浮霉状菌的分离源。
2、采用连续培养方式，以基本无机盐液体培养基作为富集基质，培养厌氧氨氧化絮体。
3、取厌氧氨氧化絮体，用玻璃匀浆器破碎，制成菌悬液，再逐级系列稀释制成菌悬液。
4、将系列菌悬液混合于融化的固体培养基中，厌氧滚管，在28-30℃下厌氧培养。培养7-14天后，用毛细管将厌氧滚管上长出的单菌落挑入液体培养基中，在28-30℃下继续厌氧培养7-14天。培养后，再采用厌氧滚管法分离单菌落。如此重复数次。当在显微镜下观察到的细菌细胞形态一致时，即认为目标菌株已被纯化。
5、以液体培养基扩增纯培养物，离心收获菌体细胞，用基本无机盐培养基制成菌体悬液，添加氨和亚硝酸盐，以厌氧条件下同时转化氨和亚硝酸盐的能力，判断该菌株是否具有厌氧氨氧化活性。
6、根据纯培物的形态特征和分子生物学特征，确定菌株的分类地位，具体参照文献[12，13]进行。
与实施例1相比，本实施例采用不同的富集和分离培养基，即在基本培养基中不添加酵母膏或葡萄糖。在本实施例中可以富集到厌氧氨氧化菌的混培物，但不能分离到具有厌氧氨氧化活性的浮霉状菌的纯培养物。
实施例5，对比实验[10]厌氧氨氧化菌密度梯度离心分离法的步骤如下1、选取生物脱氮流化床反应器中的活性污泥作为厌氧氨氧化菌的分离源。
2、以基本无机盐培养基作为富集基质，采用分批培养的方式，培育厌氧氨氧化絮体。
3、取厌氧氨氧化絮体，用超声波破碎，离心去除细胞碎片，制成细胞悬液。
4、将细胞悬液与Percoll液混合，进行密度梯度离心。离心后，出现红色细胞带并处于离心管的特定位置。该红色细胞带即为厌氧氨氧化菌。
5、用无菌吸管小心吸出离心管内的红色细胞带，所分离的菌株纯度可达每200-800个细胞中只含一个污染细胞。
6、将分离菌株制成高细胞密度(高于1010个/mL)的悬液，并添加含氨和亚硝酸盐的液体无机盐培养基，检测氨和亚硝酸盐的消失情况，如果氨和亚硝酸同时消失，即认为该菌株为厌氧氨氧化菌。
7、提取并测定分离菌株的16S rDNA序列，通过与GenBank比对，确定该菌株的分类地位。
比较上述几种实施例，采用不同的分离源及破碎方式不影响具有厌氨氧化菌的富集和分离，但如果培养基中不添加酵母膏或葡萄糖，却只能富集厌氧氨氧化菌的混培物，不能获得具厌氧氨氧化活性的浮霉状菌的纯培物。
本发明(实施例1，2，3)与对比实验(实施例5)相比，优点是1)可以获得厌氧氨氧化菌的纯培养物(不含污染细胞)，为微生物学研究和工业化应用提供纯种；2)易探明被分离菌株的生理生化特性，便于菌种保藏和大量扩增；3)分离、鉴定程序简单，结果可信。
权利要求
1.一种具有厌氧氨氧化活性的浮霉状菌的分离方法，其特征在于，方法的步骤如下1)选取同时具有氨和硝酸盐或氨和亚硝酸盐的自然生境和人工生境样品作为具有厌氧氨氧化活性的浮霉状菌的分离源，自然生境样品主要是渍水土壤、沼泽地污泥、湖泊底泥、海洋沉积物，人工生境样品主要是城市污水处理厂曝气池污泥、城市污水处理厂厌氧消化池污泥、各种废水生物脱氮处理系统中的活性污泥；2)以含有0.1mg/L～1mg/L酵母膏或葡萄糖的基本无机盐液体培养基作为富集基质，采用连续培养或分批培养的方式，培育厌氧氨氧化生物膜、絮体或颗粒污泥；3)取厌氧氨氧化生物膜、絮体或颗粒污泥，用超声波破碎，制成初级菌悬液，再逐级稀释制成系列菌悬液；4)将系列菌悬液混合于融化的固体培养基中，在28-30℃下进行厌氧滚管法培养，用毛细管将厌氧滚管上长出的单菌落挑入液体培养基中，在28-30℃下厌氧培养，培养后，再采用厌氧滚管法分离单菌落，如此重复数次，当在显微镜下观察到的细菌细胞形态一致时，即认为目标菌株已被纯化。
2.根据权利要求1所述的一种具有厌氧氨氧化活性的浮霉状菌的分离方法，其特征在于，所述的液体培养基配方为KHCO3500mg/L，KH2PO427.2mg/L，MgSO47H2O 300mg/L，CaCl2136mg/L，NaNO2140mg/L，(NH4)2SO4140mg/L，微量元素I 1mL/L，微量元素II 1mL/L，酵母膏或葡萄糖贮备液1mL/L；其中微量元素I配方为EDTA 5000mg/L，FeSO45000mg/L；微量元素II配方为EDTA 15000mg/L，ZnSO47H2O 430mg/L，CoCl26H2O 240mg/L，MnCl24H2O990mg/L，CuSO45H2O 250mg/L，Na2MoO42H2O 220mg/L，NiCl26H2O 190mg/L，Na2SeO410H2O 210mg/L，H3BO414mg/L；酵母膏或葡萄糖贮备液配方为酵母膏或葡萄糖100mg/L。
3.根据权利要求1或2所述的一种具有厌氧氨氧化活性的浮霉状菌的分离方法，其特征在于，所述的固体培养基为在上述液体培养基中添加琼脂20g/L。
4.一种具有厌氧氨氧化活性的浮霉状菌的鉴定方法，其特征在于，方法的步骤如下1)在液体培养基中扩增浮霉状菌纯培养物，5000rpm离心收获菌体细胞，用基本无机盐培养基制成菌体悬液，添加氨和亚硝酸盐，以厌氧条件下同时转化氨和亚硝酸盐的能力，判断该菌株是否为厌氧氨氧化菌；2)以菌体形态和16S rDNA序列确定菌株的分类地位，菌体形态包括培养菌落的观察和培养菌体的观察以及菌体细胞结构的观察，16S rDNA序列的测定步聚包括提取菌株基因组DNA，PCR扩增16S rDNA，纯化16S rDNA，测定16SrDNA序列，将测得的16S rDNA序列与GenBank(www.ncbi.com)中已有的16SrDNA序列比对，确定菌株的分类地位。
全文摘要
本发明公开了一种具有厌氧氨氧化活性的浮霉状菌的分离、鉴定方法，即先分离浮霉状菌，再以厌氧条件下同时转化氨和亚硝酸盐的能力作为判据，确认该菌为厌氧氨氧化菌，最后鉴定该菌的分类地位。它采用了一种适合浮霉状菌生长的培养基，在基本无机盐培养基中添加微量酵母膏或葡萄糖。同时采用一种新的厌氧氨氧化菌鉴定程序。即先纯化菌株，确认厌氧氨氧化活性，再鉴定菌种。本发明的优点是1)可以获得厌氧氨氧化菌的纯培养物，为微生物学研究和工业化应用提供菌种；2)易探明被分离菌株的生理生化特性，便于菌种保藏和大量扩增；3)分离、鉴定程序简单，结果可信。
文档编号C12Q1/04GK1807593SQ200610049499
公开日2006年7月26日 申请日期2006年2月14日 优先权日2006年2月14日
发明者胡宝兰, 郑平 申请人:浙江大学