专利名称：缺氧诱导因子1反义寡核苷酸及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属生物领域，涉及一种缺氧诱导因子1(Hypoxia inducible growthfactor-1，HIF-1)的反义寡核苷酸，以及在制备抑制肝癌肿瘤血管生长的药物中应用，也可在制备抑制人肝癌HepG2细胞增殖药物中应用。
背景技术：
防治肿瘤的转移是改善肿瘤预后的关键。转移是一种高度选择的多步骤的非随机过程，有多种复杂因素相互作用和相互依赖，在其过程中，血管生成具有重要作用。新生血管形成决定了癌细胞能否发展成为临床可测及的肿瘤，能否转移和导致机体死亡。对肿瘤而言，获得并维持本身的血供，即肿瘤血管生长、转移并具有致死性的先决条件。血管生长在恶性肿瘤的生理与病理过程中起着至关重要的作用。对于恶性肿瘤，癌细胞通过新生的血管获得必要的养分，带走大量的新陈代谢产物，同时癌细胞穿过新生的毛细血管向远处转移。
肿瘤血管生长过程中包含着血管扩张、通透性增加，基底膜及血管周围基质降解，局部血管组织解离，血管内皮细胞迁移、增殖并形成管腔，新生血管的成熟等步骤。诱导肿瘤血管生成的能力不是肿瘤与生俱来的。多数肿瘤在发生后以无血管的方式在组织中存在数月甚至数年而不生长，维持在0.2-2mm大小，只有一部分肿瘤可以成功地启动血管生成，获得血管长入而进一步发展。Folkman等据此提出了肿瘤诱导血管生成“开关”的概念。
肿瘤生长过程中引起局部微环境的变化可以成为血管生成的启动因素，目前研究得最多的、获得证据最具有说服力的是缺氧在这个过程中的作用。缺氧将上调血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表达，控制这种上调的机制和一个重要的转录因子---缺氧诱导因子1(Hypoxiainducible factor-1，HIF-1)有关。HIF-1最早在1992年由Semenza发现的一种异源二聚复合物转录因子，由α亚基和β亚基组成，基因定位于14q21-q24，蛋白和核酸序列分析表明HIF-1的两个亚单位HIF-1α和HIF-1β同属于bHLH(basic-helix-loop-helix)转录因子家族。HIF-1和VEGF启动子中的缺氧反应元件(Hypoxia response element，HRE)结合而上调其表达。随后的研究发现，在许多和血管生长有关的基因的启动子中都存在HRE，包括内皮细胞受体Flt-1、Tie-2、血管生成素(Angiopoietin，Ang)和NO合成酶等。同时，有些抑癌基因如p53、PTEN和VHL的失活通过HIF-1的作用促进血管生长，说明HIF-1实际上不仅仅是受缺氧特异调控的，而是肿瘤血管生成中一个普遍而重要通路。因此，针对调节血管生长因子的转录因子HIF-1成为抗血管生成的新的靶向分子，在抑制内皮细胞活性、增殖和移行等，诱导内皮细胞凋亡，干扰基底膜和细胞外基质的生物合成及重塑，破坏毛细血管的生成等步骤中发挥作用。
反义基因治疗应用反义核酸与细胞内的核酸相互作用，在转录水平或翻译水平抑制或封闭靶标基因的表达，阻断异常信号传导，以达到治疗效果。反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides，AS-ODN)是人工合成的单链小片段核苷酸，能特异性地抑制靶标基因表达，也有文献报道，利用血管生长因子的VEGF的反义寡核苷酸抑制血管的生长和生长，提示利用AS-ODN技术抗血管生成可行。也有研究表明，HIF-1反义寡核苷酸注射于用于检验免疫治疗肿瘤疗效的荷瘤小鼠肿瘤周围，将提高免疫治疗肿瘤的疗效，提示阻断缺氧诱导途径将增加NK介导的抗肿瘤免疫治疗效果。国内也有研究报道在动物实验模型中，HIFAS-ODN能抑制肺癌细胞生长，人大肠癌移植瘤及HBx诱导的血管内皮生长。上述研究均提示利用HIF-1为靶点治疗肿瘤的可行性。
目前，现有技术中尚没有抑制肿瘤血管生长的HIF-1反义寡核苷酸制剂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种HIF-1的反义寡核苷酸，具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列ACGCAGAATATATTCCATGAA。
本发明的另一个目的是提供HIF-1的反义寡核苷酸在制备抑制肿瘤血管生长药物中的应用。
本发明的又一个目的是提供HIF-1的反义寡核苷酸在制备抑制肝癌HepG2细胞增殖药物中应用。
本发明的HIF-1反义寡核苷酸可以与HIF-1mRNA形成mRNA-DNA杂交双链，有效地抑制缺氧条件下HIF-1mRNA的表达，且可以抑制人肝癌细胞HepG2细胞的增殖，可在制备抑制人肝癌HepG2细胞增殖药物中的应用。应用本发明的反义寡核苷酸以HIF-1为靶点，可以抑制肝癌和肿瘤血管生长，从而防治肿瘤的转移。本发明设计合理，为肿瘤治疗提供新的途径。
图1为HIF1-AS对HepG2细胞中HIF1mRNA的琼脂糖电泳分析。
图2为HIF1-AS对HepG2细胞增殖的特异性抑制作用。
具体实施例方式
本发明结合实施例作进一步的说明。根据HIF-1mRNA序列的二级结构，设计和合成若干条HIF-1硫代AS-ODN，以脂质体介导进行转染进入HepG2细胞后，用Northern-blot和Wwstern-blot方法观察于缺氧环境下HIF-1在HepG2中mRNA和蛋白的表达，筛选出有效的HIF-1mRNA AS-ODN序列。该反义序列是由20个核苷酸所构成的短链寡聚脱氧核糖核酸。
实施例1 HIF-1mRNA反义寡核苷酸的制备采用AKTA Oligo Pilot II合成仪以DMT-ON形式自动合成，合成过程中仪器自动对每步合成的硫代率和偶联率进行检测。合成完毕，每克合成产物加入30ml 25％浓氨水，60℃脱保护15h即得粗品溶液。粗品溶液使用阴离子交换HPLC一步纯化法使脱DMT、分离及纯化在同一柱上一次完成。纯化产品经反相柱脱盐并用真空旋转蒸发仪将乙腈蒸除后，由冰冻干燥机冻干。
硫代寡核苷酸呈白色粉末状，纯度98.68％，易溶于水。
实施例2 HIF-1-AS对人肝癌细胞HepG2细胞中靶向mRNA的抑制作用实验程序将人肝癌细胞HepG2在含10％小牛血清的DMEM细胞培养液(含青、链霉素各100KU/L)，于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养。观察细胞状态良好，培养至对数生长期后，将HepG2细胞接种到6孔板(1×105细胞/孔/2ml)。培养至细胞贴壁且丰度达到40～60％时，进行寡核酸的转染，HIF-AS取二个浓度0.4、0.8umol/L，同时设置0.4umol/L正义链对照组。
六孔板转染后维持缺氧状态48h，按照TrizolRNA提取试剂盒说明书提取细胞总的RNA，紫外分光光度计定量，OD260/280在1.8～2.0之间，RNA甲醛变性电泳显示无降解，-70℃保存。
再通过RT-PCR反转录获得cDNA2ug RNA，0.5ug/mL oligodT 1ul，补水至9ul，70℃10min，立即冰上放置5min；然后加入逆转录体系(5×RT buffer4ul，25mM MgCl24ul，10mM dNTP 1ul，RNase 0.5ul，AMV 1.5U)补水至20ul，42℃1h，72℃5min灭活逆转录酶。
PCR反应体系PCR mix 15ul，20umol/L，上、下游引物各0.5ul(见SEQID NO.2核苷酸序列(F)CATTACCCACCGCTGAAACGCC，SEQ ID NO.2核苷酸序列(R)CTGGGACTATTAGGCTCAGGTG)，cDNA 1ul，Taq酶0.5ul，去离子水补充至20ul。PCR扩增条件94℃4分钟，94℃30秒、56℃30秒、72℃30秒30个循环，最后72℃延伸5分钟。进行双重PCR，以β-actin为内参，产物经2％琼脂糖电泳。
分析HIF-1AS转染HepG2细胞，同时设正义链对照组和突变链对照组。缺氧状态维持48h后提取总的RNA反转录，并且以看家基因β-actin为内标进行双重PCR，扩增产物进行琼脂糖电泳分析。参见图1，正义链对HepG2细胞中HIF-1mRNA的表达没有显著影响，与反义链HIF-1AS相比具有显著性差异；HIF-1AS可以显著抑制相应mRNA的表达，当浓度达到0.4umol/L时对靶基因mRNA的抑制已经趋于饱和，增加浓度到0.8umol/L时，mRNA的抑制没有太大变化。图1中，1和2是指HIF1-AS浓度分别为0.8umol/L和0.4umol/L，3是指正义链浓度为0.4umol/L，4是指人肝癌细胞HepG2，5为标记，3-actin317bp，HIF1 195bp。
实施例3 HIF-1AS对人肝癌细胞HepG2细胞增殖的抑制作用实验程序人肝癌HepG2细胞株用含10％小牛血清的DMEM细胞培养液(含青、链霉素各100KU/L)培养，培养皿置于37℃含5％CO2的细胞培养箱中，每三天换液一次，0.25％胰蛋白酶液消化，传代和收集细胞。
取对数生长期细胞，用含10％小牛血清的DMEM细胞培养液配制成2～2.5×104/ml浓度的细胞悬液，按每孔3000个细胞(100ul)加入到96孔细胞培养板中，培养待细胞贴壁。
培养至细胞丰度达到40％～60％时，吸弃各孔中的培养液。在无血清无双抗状态下，按脂质体(Lipofectin)说明书进行HIF-1AS的转染。HIF-1AS设置0.2、0.4、0.8、1.0umol/L四个浓度，同时设置正义链寡核苷酸0.4umol/L对照组、脂质体对照组和细胞对照组。每个浓度设3个平行孔。转染6小时后，吸弃各孔培养液，加入100ul含血清的正常培养液。置于37℃、5％CO2孵箱继续培养。
继续培养72小时后，每孔加入20ulMTS，置于37℃、5％CO2孵箱90分钟后，用多功能酶标仪(Wallac美国)在490nm测定吸光度，并计算细胞增殖抑制率。
分析参见图2，HIF-1AS可以显著抑制HepG2细胞的增殖，且呈现剂量依赖关系，当浓度达到1.0umol/L时，细胞增殖抑制率达89.66％；与正义链相比，相同浓度的HIF-1AS可以特异性的抑制HepG2细胞的增殖，具有显著性差异；根据实验脂质体对照组对细胞增殖基本没有抑制左右。图2中1、2、3、和4分别指HIF1-AS浓度为0.2umol/L，0.4umol/L，0.8umol/L和1.0umol/L，5是指正义链浓度为0.4umol/L，6是指脂质体组。
以上对本发明较佳实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明做出各种改变和变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明的范围。
本发明涉及的序列<110>浙江大学<120>缺氧诱导因子1反义寡核苷酸及其用途<130>1<160>3<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>1acgcagaata tattccatga 20<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>2cattacccac cgctgaaacg cc22<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>3ctgggactat taggctcagg tg2权利要求
1.一种缺氧诱导因子1的反义寡核苷酸，具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列ACGCAGAATATATTCCATGAA。
2.根据权利要求1所述的缺氧诱导因子1的反义寡核苷酸在制备抑制肝癌肿瘤血管生长药物中的应用。
3.根据权利要求1所述的缺氧诱导因子1的反义寡核苷酸在制备抑制人肝癌HepG2细胞增殖药物中的应用。
4.根据权利要求2或3所述的缺氧诱导因子1的反义寡核苷酸的应用，其特征是所述的缺氧诱导因子1的反义寡核苷酸是与药用敷料组合制成药物制剂。
全文摘要
本发明提供一种HIF－1的反义寡核苷酸，具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列ACGCAGAATATATTCCA TGAA。本发明的HIF－1反义寡核苷酸可以与HIF－1mRNA形成mRNA－DNA杂交双链，有效地抑制缺氧条件下HIF－1mRNA的表达，且可以抑制人肝癌细胞HepG2细胞的增殖。应用本发明的反义寡核苷酸以HIF－1为靶点，可以抑制肝癌肿瘤血管生长，从而防治肿瘤的转移。也可在制备抑制人肝癌HepG2细胞增殖药物中的应用。
文档编号C12N15/11GK1884295SQ200610052290
公开日2006年12月27日 申请日期2006年7月4日 优先权日2006年7月4日
发明者陈卫星 申请人:浙江大学