专利名称：肿瘤双靶向腺病毒AdCN103及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术和基因治疗领域，具体地说，是关于一种肿瘤细胞内特异性增 殖的肿瘤双靶向病毒载体AdCN103及其构建方法和应用。
背景技术：
对于大多数种类的癌症，目前仍然采用的是传统疗法如外科手术、放疗、化疗等， 而面对很多中晚期恶性肿瘤，传统疗法显得束手无策，主要表现在治愈率低，复发率及 死亡率高、预后较差。基因治疗是通过改造基因来治疗疾病的一种生物高技术方案，人 们对肿瘤的基因治疗寄寓极高的热情，66%的基因治疗临床试验均用于肿瘤治疗。到目前 为止，肿瘤的基因治疗研究已取得了重要进展，对于恶性肿瘤，基因治疗可利用肿瘤细 胞与正常细胞间分子水平的差异，显著拓宽肿瘤的"治疗窗"，高效地、选择性地杀伤肿 瘤细胞或阻止肿瘤细胞生长以及防止肿瘤的转移。
然而经过十多年600多个临床试验方案发现，尽管基因治疗是非常安全的，但其抗 肿瘤效应也非常低，有的甚至无任何治疗作用，这主要是现阶段基因治疗载体的问题。 目前的载体系统在人体内既不能特异性转染所有的肿瘤细胞，也不能使治疗基因在肿瘤 内高效表达，而且肿瘤的发生是包含多种基因改变的多步骤过程，通过单一基因的修饰 很难彻底消灭肿瘤。这一系列问题严重阻碍着肿瘤基因治疗的临床疗效。因此研制高效、 靶向转染肿瘤细胞的载体系统对目前肿瘤的基因治疗至关重要。以病毒治疗恶性肿瘤成了科学研究的热点，且取得了新的突破。最近临床实验使用 的几种病毒，如腺病毒ONYX-015、 CV706，单纯疱疹病毒G207和G1716，治疗效果令人 鼓舞。这些病毒能够选择性的在肿瘤细胞中复制、增殖，杀死肿瘤细胞，释放出来的子 代病毒扩散到临近的肿瘤细胞，在肿瘤组织内引起一种链式反应，最终消灭全部肿瘤， 而在正常细胞中不复制。这种病毒称为"肿瘤特异性增殖病毒"，又称为"融瘤病毒"。
实施肿瘤的基因病毒治疗，首先要构建能够特异性的在肿瘤细胞中增殖，而对正常 细胞无损害的病毒。对病毒基因进行突变，构建肿瘤特异增殖型病毒主要有两种方法， 一是利用肿瘤特异性启动子控制病毒复制所必须的基因，从而控制病毒的复制。二是将 病毒复制在正常细胞中所必需，而在肿瘤细胞中不需要的基因进行缺失，使病毒只能在 肿瘤细胞中复制。本项目旨在构建一种双调控的靶向性腺病毒，把这两种方法应用于同 一腺病毒中，提高腺病毒的靶向性，使腺病毒载体能更有效安全的应用于临床。利用肿瘤特异性启动子控制病毒复制所必需的基因是构建肿瘤特异性增殖病毒的方 法之一，使这些基因只能在肿瘤细胞中表达，而在正常细胞中不表达，从而使病毒只能 在肿瘤细胞中复制、增殖。腺病毒E1A基因是腺病毒感染细胞后最早表达的基因。E1A 蛋白的功能很复杂，它可以促进细胞进入S期，即细胞周期的合成期，有利于病毒的复 制；同时，E1A蛋白可以作为反式作用因子，激活病毒的基因，以及细胞内其他基因的转 录，促进病毒的复制。总之，E1A基因是病毒复制所必需的。因此使用肿瘤特异性启动子 控制E1A基因的表达，就能达到控制病毒复制的目的。近年研究表明，端粒酶可能是迄 今发现的一个最为广泛的肿瘤新标志物，在细胞永生化和肿瘤发生发展过程中起重要作 用。在生理条件下，正常细胞大都没有端粒酶活性；而在90%左右的肿瘤细胞中端粒酶活 性高。并且其活性高低与肿瘤的恶性程度相关，提示端粒酶可以作为肿瘤治疗的很好的 耙点。端粒酶逆转录酶，艮卩hTERT(human telomerase reverse transcriptase)，是端粒 酶复合物的核心成分，其表达状态与端粒酶活性显著相关，是细胞调控端粒酶活性的关 键环节。hTERT基因的表达主要是从转录水平上调节，在90%左右的肿瘤细胞中转录上 调，而在静息期细胞中不转录。因此，hTERT启动子被用来控制外源基因的表达，提高肿 瘤基因治疗的靶向性。hTERT启动子是一个广泛的肿瘤特异性启动子，能够使外源基因的表达限制在肿瘤 细胞中，因此我们认为，hTERT启动子是构建肿瘤特异性增殖病毒的优秀候选启动子。本 项目用基因克隆的方法改造野生型腺病毒，用hTERT启动子取代ElA基因自身的启动子， 构建了一个新的肿瘤特异性增殖腺病毒，能够使E1A基因在肿瘤细胞中特异性表达，而 在正常细胞中不表达，从而在肿瘤细胞中复制、增殖，从而杀死肿瘤细胞，而在正常细 胞中不复制。在此基础上，我们同时用基因克隆方法使E1A基因CR2区缺失24bp， EIA CR2耙 向Rb蛋白，其作用是在腺病毒感染细胞后，与Rb蛋白结合，释放E2F蛋白，促进细胞 进入S期，为病毒复制提供各种相关蛋白和适宜环境。在80X的肿瘤细胞中Rb蛋白突 变，E1ACR2蛋白无需与之结合就能进行复制，而在正常细胞中若缺失这一序列，病毒 将无法复制。这两种靶向兼具广谱性和选择性，研究证明对子宫颈癌，肺癌，肝癌，结 肠癌等均有一定的疗效。但是这两种方法也各有缺陷hTERT在干细胞中也存在高表达 现象;某些病毒感染会引起正常细胞Rb途径突变(如乙肝病毒HBV感染会引起正常肝细 胞Rb途径突变)。因此，单靶向的溶瘤腺病毒的安全性存在一定隐患，在此研究基础上， 为了确保溶瘤腺病毒载体在临床上能够安全使用，我们构建了新一代的双耙向的溶瘤腺病毒载体。用改进后的hTERT启动子调控含基因组序列922—947bp缺失的E1A蛋白， 在基因转录水平以及蛋白翻译水平同时控制病毒的复制，经研究证实，这种方法能很大 程度提高腺病毒的选择性，从而提高腺病毒载体的安全性。 发明内容本发明的目的在于将肿瘤特异性启动子和缺失腺病毒E1ACR2区域两种肿瘤靶向优 势结合在起来，共同调控腺病毒E1A蛋白的表达，从而提供一种更安全的肿瘤双靶腺 病毒载体。本发明的另一个目的在于构建一种新型的hTERT启动子hTEl,该启动子的肿瘤靶 向性特异性提高。本发明的另一个目的在于提供一种新型的hTERT启动子hTEl的构建方法。 本发明的另一个目的在于提供一种肿瘤双靶向腺病毒载体AdCN103的构建方法。 本发明的另一个目的在于提供一种肿瘤双靶向腺病毒载体AdCN103用于治疗肿瘤 的用途。为达到上述目的，本发明提供了一种肿瘤双靶向腺病毒载体AdCN103，该载体具有 双重肿瘤耙向性，能作为一种更好的基因一病毒治疗载体平台。本发明提供了一种hTERT启动子hTEl的构建方法，其步骤包括A用PCR方法，以人胚肾细胞HEK293的DNA为模板，使用hTERT特异性引物， 得到PCR产物为hTERT启动子核心一255 +40nt序列B设计引物，在下游引物中引入三个E—box序列本发明并提供了抗癌肿瘤双靶向病毒载体AdCN103的构建方法，其步骤包括-A、 用PCR方法，在hTERT的核心区域一255 — +40nt后插入三个E-BOX和polyA 序列，构建成一种高效的肿瘤特异性启动子hTEl;B、 用PCR方法，得到含病毒947—1354bp的质粒载体，通过EcoRV/Xba I双酶切， 得到一端为平末端， 一段为粘末端的片段，同样用ClaI (Khiow)以及Xbal酶切含ElA 全序列的质粒载体，得到到一端为平末端， 一段为粘末端的大片段，将两者用连接酶连 接，构成了 ElA区的24bp缺失。C、 将得到的质粒pCN103与含有全序列腺病毒骨架DNA的质粒pTG3602在大肠杆 菌BJ5183中重组，产生E1A区由hTERT启动子控制的以及缺失24bp的完整的腺病毒 骨架DNA的质粒载体。本发明的构建双靶向腺病毒的方法，可以用于开发有效治疗肿瘤的抗癌新药。
本发明具有如下有益效果1、 本发明有机的结合了两种耙向肿瘤的方法，进一步提高了腺病毒载体的耙向 性和安全性，可以用于治疗多种肿瘤；2、 本发明提供了一种新型肿瘤特异性启动子hTEl的构建方法，该启动子的肿 瘤特异性显著提高。3、 本发明提供了双靶向AdCN103腺病毒构建方法，该方法易于掌握；4、 本发明构建的双靶向腺病毒AdCN103能和其他非复制型带有基因的腺病毒 载体协同作用，为今后的基因一病毒联合治疗打下坚实的基础。5、 本发明构建的双靶向腺病毒AdCN103经动物试验证明能选择性的杀死肿瘤 细胞，而不影响正常细胞；这种新型双靶向腺病毒治疗，能有效地抑制肿瘤 生长，为治疗癌症提供了一个优良的新型技术平台。
图l四种不同hTERT启动子的构造简2为hTEl启动子和其他三种hTERT启动子在肿瘤细胞和正常细胞中的转录活性比较图3显示hTEl启动子在正常小鼠肝脏中没有转录活性图4A为本发明的双耙向腺病毒AdCN103的构建示意图。图4B为本发明的双靶向腺病毒AdCN103的鉴定示意图。图5为双靶向腺病毒AdCN103在正常细胞或肿瘤细胞中的复制能力示意图。图6为MTT法检测肿瘤细胞和正常细胞经10 MOI (multiplicity of infection)的不同病毒处理后4天的存活率。图7为双耙向腺病毒AdCN103和携带绿色荧光蛋白的非复制性腺病毒协同作用，有利 于非复制性腺病毒在肿瘤细胞中特异性增值。图8为双耙向腺病毒AdCN103在裸鼠体内治疗肿瘤细胞移植瘤的结果示意图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，应理解，以下实施例仅用于说明本发 明而不用于限定本发明的范围。实施例1、携带新型hTERT启动子hTEl的复制型溶瘤腺病毒的构建A相关质粒构建先设计如下引物 255-P1: 5，255-P2: 5，255-4DEB-P2: 5'408-Pl: 5，408-P2: 5，1125—Pl: 5，-CTGCGCTGTCGGGGCCAGGC-3 ， -ATCGGCCAGGGCTTCCCACG-3'-CCCACGTGCGCCCACGTGCGCCCACGTGCGATCGGCCAGGGCTTCCCACG-3， -CCACATCATGGCCCCTCCCT-3 ， -GCTGCCTGAAACTCGCGCCG-3' —CTGTCCTGCGGTTGTGCCGG—3 ，用PCR方法，以人胚肾细胞HEK293的DNA为模板，引物255-Pl， 255-P2,得到PCR 产物hTERTl，为hTERT启动子核心一255 +40nt序列，引物408-P1， 408-P2得到PCR 产物hTERT3，为hTERT启动子核心—408 ■卜40nt序列，引物1125-P1, 408-P2,得到PCR 产物hTERT3，为hTERT启动子核心-1125 + 40nt序列用PCR方法，引物255-P1， 255-4DEB-P2，以hTERTl为模板，在核心一255 +40nt 序列后加上三个E-box序列，得到PCR产物hTERT2分别将hTERTl， hTERT2， hTERT3， hTERT4克隆到T载体上，分别命名为pBT-255， pBT-2554DEB， pBT-418， pBT-SEB设计以下两组引物 Adl9 5， -GAGTGCCAGCAGTAGAGTT-3' Ad20 5' -GAAAATCCAGCAGGTACCCC-3' Ad21 5， -GGGGTACCTGCTGGATTTTC-3' Ad22 5， -GAATTCTCAATCTGTATCTTCATC-3，用二步PCR方法，以pXCl ( Microbix， Toronto, Canada)质粒为模板，首先分别以Adl9/ Ad20, Ad21/Ad22两组引物,得到两组PCR产物,然后将两组PCR产物混合为模板，以Adl9/ Ad22为引物,得到腺病毒基因组504-3510bp片断,对应为腺病毒El区域全序列. 将PCR产物克隆到pGEM-T-EASY质粒中，命名为pGEM-T-E1,测序证实序列正确，构建质粒 成功.随后，从pGEM-T-El酶切得到El区片断，克隆到pcDNA3的Not I位点，构建为 pCMV-ElA,然后进一步将El区片断克隆到在BamHI位点有两个BGH polyA序列的 pBluescript KS质粒的EcoRV位点，其中BGH polyA序列能阻隔残留的E1A启动子的作 用.将先前构建的四个hTERT启动子片断分别插入该质粒的EcoRV位点，构建为 pBT-255-ElA， pBT-2554DEB-ElA， pBT-418-E1A, pBT-SE-E1A.质粒pBT-2554DEB-E1A即
为pBT-hTEl-E1A. B病毒重组构建用Sal I和Spe I分别从pBT-255-E1A， pBT-2554DEB-ElA， pBT-418-E1A， pBT-SE-E1A. 切下hTERT-ElA片断，克隆到含腺病毒同源臂的质粒 pTGC1960(Microbix， Ontario, Canada)中，将这些穿梭质粒分别和腺病毒骨架包装质粒 pBGHIO (Microbix, Ontario, Canada)共转染N52. E6细胞，经空斑纯化后得到病毒 AdBT-255-ElA， AdBT-2554DEB-E1A， AdBT-418-E1A, AdBT-SE-E1A.实施例2、新型hTERT启动子hTEl在细胞内的活性评估报告基因质粒pCMV 0 -gal购自Clontech公司，CMV启动子控制下表达P -半乳糖苷 酶；萤火虫荧光素酶报告基因分析用质粒pGL3-Basic(不含启动子及增强子)、 pGL3-Control (含SV40启动子/增强子)购自Promega公司。将四种hTERT启动子用KpnI+Bglll酶切，克隆入pGL3-Basic质粒，命名为pGL3_ BT-255, pGL3- BT-2554DEB, pGL3- BT-418, pGL3_ SE。在该质粒中，hTERT启动子启动 萤火虫荧光素酶(Luciferase)基因的表达。细胞按1.0乂105接种于6孔培养板，24h 后，用LipofectAMINE (GIBC0 BRL)将含萤火虫荧光素酶报告基因质粒l化，内标 半乳糖苷酶报告基因pCMV-eGal 0. lPg转染细胞。48h后，收集细胞，PBS洗两次，裂 解于R印orter Lysis Buffer (Promega公司)。 一部分与萤火虫荧光素酶底物auciferase Assay试剂盒，Promega公司)反应(10sec)，另一部分与e -半乳糖苷酶化学发光底物 (Clontech公司)反应(37°C 30min)，分别在荧光计(BG-P公司)上测定10sec发光 光子计数(RLU)。计算荧光素酶RLU/半乳糖苷酶RLU即得相对荧光素酶活性。如图二 A、 B所示，在肿瘤细胞中，虽然pGL3- BT-255的活性最高，PGL3- BT-2554DEB 的活性略低，但在各种正常细胞中，pGL3- BT-2554DEB的活性明显低于其他三种启动子 的活性。数据表明带有三个额外E-box序列的hTEl启动子具有很好的肿瘤细胞特异性。实施例3、新型hTEl启动子在裸鼠体内的活性评估每四至六只Balb/c裸鼠为一组，共六组。将20ug质粒DNA分别溶解在1. 6 ml生理盐 水中，静脉注射裸鼠。24小时后处死裸鼠，将肝脏收集后，用1.5ml含Ultra-Turrax
T25的PLB (Promega)溶液将肝脏制成匀浆。收集经14, 000 rpm 4° C离心10分钟离 心后或者过滤后的上清溶液，测量各组样品的荧光活性。如图三所示，只有pGL3- BT-2554DEB在裸鼠肝脏中完全无法检测到荧光表达，表明其hTEl 启动子肿瘤靶向性十分显著，对正常肝组织基本无毒副作用。实施例4、双耙向病毒AdCN103的构建A、 在E1A区缺失CR2 24 bp先设计如下引物 Ad49: 5， -CACCCAGTGACGACGAGGATGAA-3' Ad50:5' -TATTGCATTCTCTAGACACAGGTG-3pTG3602是含5型腺病毒全序列的质粒载体。首先用Bgl II酶切质粒pTG3602，酶切后得 到一段含E1A区的6k左右的片段，自连转化大肠杆菌Gm2163，命名为pCNOOl。以pTG3602 为摸板，用引物Ad49/Ad50得到腺病毒基因组片段947-1354bp，克隆到进T载体后，将 质粒命名为pTE/Ad947-1354，用E(:oRV+Xba I双酶切后，其中400bp酶切片段和经Cla I (Klenow) + Xba I双酶切pCNOOl得到的6kb片段连接，得到在E1A区922-947bp缺失 的质粒pCN101。得到的质粒pCN101经测定其中922-947bp缺失，结果与理论数据一致，表明质粒构 建成功。B、 hTEl启动子的构建 1缺失野生型E1A区启动子Ad55: 5， -GGATCCGAATTCTTAATTAA-3'Ad56: 5， -GCGGCCGCAAATATTACGCGCTATGAGT-3，Ad52: 5' -GCGGCCGCCTCGAGGATATCGAATTCGTCGAC GCCGCTCCGACACCGGGACT-3，Ad51: 5， -ATCGATCACCTCCGGTACAA-3'以pTG3602质粒为PCR反应的模板，引物Ad55、 Ad56和Ad52、 Ad51分别进行PCR反应(详见Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed. ， Joseph Sambrook andDavid W. Russell),跑电泳回收片段，得到PCR产物。将两种PCR产物分别用Not I酶切，连接成缺失E1A启动子的E1A1—922 (A)片段，将此片段任意克隆到T载体上，以BamH I / Cla I酶切，得779bp片段与相同的酶切的质粒pCNIOl得到的大片段相连，构
建成新质粒pCN002。pBlueScript KS质粒(购自Stratagene)在BamH I位点含有2个BGH poly A加尾 信号，用Not I / Xhol切下115bp的poly A，插入pCN002野生型E1A启动子缺失断处， 作为绝缘子进一步阻断野生型E1A启动子的作用，构建为pCN003. 2插入hTEl启动子以质粒pBT-2554DEB为模板，引物上游5' -GTGCAGGTGCCAGAACATTTCT-3，，下游 5， -CAGTACCGGATATCCAAGCTCCCA-3，(包含EcoRV酶切位点)，PCR产物经Hind111/EcoRV 酶切后插入pBlueScript polyA前的多克隆位点，构建成pBlueScript—TEl，进一步用 Xhol/. EcoRV酶切后，与pCN003的酶切产物相连接，构建成完整的双靶向载体 phTEl-delat24经测序鉴定与预期结果一致，表明载体构建成功。C、双耙向病毒AdCN103的构建的构建phTEl-delat24与pTG3602经Clal酶切线型化后，在大肠杆菌BJ5183中重组后，得 到完整的双靶向腺病毒载体pCN103，转化人胚肾细胞HEK293，包装病毒。(参阅He, T. C., Zhou, S. ， da Costa， L. T. ， Yu， J. ， Kinzler， K. W., and Vogelstein， B. A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 9<5V 2509 - 2514， 1998)病毒的扩增、鉴定293细胞铺于24孔板中小量扩增病毒。病毒DNA 用Qiagen Blood Kit获得，利用PCR技术，鉴定基因病毒hTERT启动子和24bp缺失。 鉴定所用引物由上海生工合成。hTERT上游 5' -AGTAGTAGTGTGGCGGAAGT-3'hTERT下游 5， -ACGAATTCGATATCCAAGCTCCCA-3，24bp缺失上游 5， - TTACCTGCCACGAGGCTGGCTTTC-3，24bp缺失下游 5， - T CTGCTGTGCGTAACTTG-3，24bp阳性对照上游5， - CCGTCTTTTGGACCAGC-3，24bp阳性对照下游 5， -TCTGCTGTGCGTAACTTG-3'以Qiagen Blood Kit抽提所得的病毒DNA作为模板，同时以野生型病毒DNA作为对照，以上述三组引物进行PCR反应。PCR条件94°C X lmin， 55°C X lmin， 72°C X2minl5s。对PCR产物进行检测，如PCR产物含hTEl，不含24bp野生型腺病毒DNA,病毒包装成功。重复此过程一次，得到重组正确的腺病毒。双靶向腺病毒AdCN103在293细胞中大量繁殖，应用氯化铯梯度离心纯化病毒。具
体操作方法见Microbix Biosystem Inc.的操作说明。实施例5、双靶向病毒AdCN103在正常细胞或肿瘤细胞中复制能力分析将3Xl(f的正常细胞或肿瘤细胞铺于6孔板，24 h后，加入5M01的AdCNlOl (单靶 向病毒)、AdCN102v(单耙向病毒)、AdCN103(双耙向病毒)，WtAd5分别感染肝癌细胞株 BEL7404、 S丽C7721、 H印3B细胞(购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库)、 MHCC-97(购自上海中山医院细胞库)及正常人胚肺细胞株NHLF、 WI-38 (购自ATCC)正常 人肺MRC-5细胞株(购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库)，正常人肝细胞株 L02(购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库)。48 h后，收集细胞上清与细胞，在 -2(TC与37'C反复冻融3次以释放病毒。将病毒稀释，检测病毒滴度。293细胞铺于60mm dish， 24h后细胞接近长满，加入含不同稀释度(10—'-10—8)的病毒，37'C感染2小时后， 铺8ml低熔点胶(5%FBS， 1. 25% Agarose)。 9天左右记数。计算每PFU病毒产生的病毒 数目。结果如图五所示。由图五的结果可见，在肿瘤细胞中，AdCN101(单耙向病毒)、AdCN102(单耙向病毒)、 AdCN103(双靶向病毒)，WtAd5的复制能力大致相同。而在正常细胞中，AdCN103 (双耙向 病毒)的复制能力显著降低，WtAd5在肿瘤细胞和正常细胞的复制能力差别不明显，没有 选择性；而AdCN101(单耙向病毒)、AdCN102(单耙向病毒)、AdCN103(双耙向病毒)能选择 性地在肿瘤细胞中复制，并且AdCN103(双靶向病毒)的选择性最好。实施例6、双靶向病毒AdCN103在体外对肿瘤细胞的杀伤能力检测细胞经病毒处理后的存活率由MTT法检测 (Cancer Research, 1989， 49(17): 4785-90)。步骤如下将肝癌癌细胞株BEL7404，S醒CC7721及正常人胚肺细胞NHLF和正 常人肺细胞MRC-5以5000每孔的量铺入96孔板，培养24小时后分别加入10 MOI的病 毒，作用l天，然后每天一次，连续四天将含病毒的培养液移去，换成含5mg/ml MTT的 正常培养液，培养4小时后将含MTT的培养液移去，以DMSO裂解，摇匀，然后以655nm 处吸光度为参比测定595mn处吸光度。细胞存活率(％) =A595 (样品)/A595 (对照)X100%。结果如图六所示，双靶向病毒AdCN103对肿瘤细胞有一定的杀伤作用，而对正常细 胞毒性很小，具有肿瘤选择性。
实施例7、双耙向增殖型腺病毒病毒AdCN103与非复制型病毒Ad—EGFP在肿瘤细胞中的 协同作用准备两个含1X106BEL7404的10cm的细胞培养皿，分别用非增殖型腺病毒Ad—EGFP与 双靶向增殖型腺病毒病毒AdCN103共同感染肿瘤细胞，病毒吸附两个小时后，换干净的 DMEM培养液，孵育三天。然后细胞经过三次37'(7-20'(:反复冻融释放病毒，分别收集两 种细胞上清液，再次分别感染已准备好的两个含lX106BEL7404的10cm的细胞培养皿， 两天后用荧光显微镜观察病毒复制情况。实验结果表明，在双靶向增殖型腺病毒病毒 AdCN103协同作用下，非复制型病毒Ad—EGFP能在肿瘤细胞中复制增殖。实施例8、双靶向病毒AdCN103在裸鼠体内治疗肿瘤细胞移植瘤将4-5周龄的裸鼠皮下接种肝癌细胞株BEL7404， 12天后进行动物分组。治疗组给 予1X109 pfu的AdCN103(双靶向病毒)进行治疗，对照组分五组，第1组是磷酸缓冲液 (PBS)处理组，第2， 3， 4组分别用相同剂量的AdCN101(单靶向病毒)、AdC隱(单耙 向病毒)、WtAd5病毒进行治疗，试验结果如图八所示。由图八的结果可见，AdCN103疗效接近于WtAd5和两种单靶向病毒，能抑制肿瘤的生 长，延长荷瘤裸鼠生命周期。
权利要求
1、一种肿瘤双靶向复制型溶瘤腺病毒，其特征在于，用任意一种肿瘤特异性启动子(如hTERT启动子，AFP启动子等)控制缺失CR2区域的E1A蛋白的表达，该复制型溶瘤腺病毒具有双重靶向性。
2、 一种新型的经修饰的肿瘤特异性启动子hTEl，其特征在于在hTERT启动子 -255-+40核心序列下游添加三个E-box,提高hTERT启动子对肿瘤细胞的选择性
3.—种如权利要求l所述的肿瘤双靶向复制型溶瘤腺病毒AdCN103，其特征在于，用 如权利2所要求得肿瘤特异性启动子hTEl控制缺失CR2区域的E1A蛋白的表达，该复 制型溶瘤腺病毒具有双重靶向性。
4、 一种如权利要求1所述的肿瘤双靶向复制型溶瘤腺病毒AdCN103的构建方法，其 特征在于所述方法依次包括下列步骤A、 用PCR方法，在hTERT的核心区域一255 — ~h40nt后插入三个E-BOX和polyA 序列，构建成一种高效的肿瘤特异性启动子hTEl;B、 用PCR方法，得到含病毒947—1354bp的质粒载体，通过EcoRV/Xba I双酶切， 得到一端为平末端， 一段为粘末端的片段，同样用ClaI (Klnow)以及XbaI酶切含ElA 全序列的质粒载体，得到到一端为平末端， 一段为粘末端的大片段，将两者用连接酶连接， 构成了 ElA区的24bp缺失。C、 用hTEl启动子代替野生型腺病毒E1A区启动子控制24bp缺失的E1A区，得到 双靶向质粒pCN103与含有全序列腺病毒骨架DNA的质粒pTG3602在大肠杆菌BJ5183 中重组，产生E1A区由hTERT启动子控制的以及缺失24bp的完整的腺病毒骨架DNA的 质粒载体。
全文摘要
本发明属于生物技术和基因治疗领域。本发明公开了一种肿瘤双靶向复制型溶瘤腺病毒，这种复制型溶瘤腺病毒具用双重靶向性，将肿瘤特异性启动子和缺失靶向Rb蛋白的CR2区域两种方法协同作用控制病毒早期蛋白E1A的表达以及病毒的复制。本发明同时公开了一种新型的肿瘤特异性启动子hTERT-4DEB及其构建方法，这种启动子在hTERT启动子-255-+40nt核心区后加入三个E-box，特异性提高了该启动子的肿瘤靶向性。本发明以AdCN103为例证，该溶瘤腺病毒用改进后的hTERT-4DEB启动子控制缺失CR2区域的E1A蛋白的表达，这种复制型溶瘤腺病毒具有双重靶向性。本发明同时公开了所述肿瘤双靶向复制型溶瘤腺病毒AdCN103的构建方法及其用于制备治疗肿瘤的药物的用途。本发明构建的肿瘤双靶向复制型溶瘤腺病毒AdCN103可用于治疗多种肿瘤，可以开发出有效的治疗肿瘤的病毒-基因抗癌新药。
文档编号C12N15/861GK101126100SQ200610052970
公开日2008年2月20日 申请日期2006年8月16日 优先权日2006年8月16日
发明者唯 张, 荣 蔡, 程 钱 申请人:钱 程;蔡 荣;张 唯