专利名称：抑制pqqgdh的反应位阻的方法及组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种在包含使改变了氨基酸序列的修饰的吡咯并喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶(下面，分别把吡咯并喹啉醌记载为PQQ，葡萄糖脱氢酶记载为GDH，吡咯并喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶记载为PQQGDH)反应的工序的葡萄糖测定中，抑制高浓度葡萄糖的反应位阻的方法、抑制高浓度葡萄糖的反应位阻的葡萄糖测定用组合物、葡萄糖传感器以及它们的制造方法。
背景技术：
吡咯并喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶(本申请中，也记载为PQQGDH)是以吡咯并喹啉醌(PQQ)为辅酶的葡萄糖脱氢酶(GDH)。因为催化葡萄糖氧化生成葡萄糖酸内酯的反应，所以可以用于葡萄糖的测定。血中葡萄糖的浓度，作为糖尿病的重要标志是临床诊断上非常重要的指标。现在，血中葡萄糖浓度的测定，主要是使用生物传感器的方法，可是，作为用于血中葡萄糖浓度的测定的酶，吡咯并喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶正在受到关注。作为这样的PQQGDH公开的事例，例如，发现鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)NCIMBI1517株产生吡咯并喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶，构建基因的克隆以及高表达系(例如，参照特开平11-243949号公报)等。
发明内容
吡咯并喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶，由于其催化D-葡萄糖氧化生成D-葡萄糖酸-1，5-内酯的反应、具有不受反应体系的溶解氧的影响及不一定必须添加辅酶的酶特性的特点，所以血糖的生化诊断制剂不言而喻希望广泛用于血糖传感器等。但是在进行传感器的应用研究时，存在有灵敏度下降的问题。
本发明人为了解决上述课题，在对其原因进行了专心地研究后发现，一般地在血糖传感器中，其相对用作电子介体的铁氰化物离子的反应性低。
我们对这一点进行了进一步研究，发现相对铁氰化物离子的反应性低的原因，是因为缓冲条件在中性附近受反应位阻的影响的缘故。
迄今为止，关于避免PQQGDH的反应位阻的方法的报告有特开平11-243949号公报，其中报告尽管有使用了在基因水平的PQQGDH修饰手段的研究(例如，参照WO03/106668)，但关于其反应位阻的机理，其内容也没有公开也没有启示，对于从测定反应条件的观点考虑解决反应位阻的手段，连其可能性都没有提及。
本发明人从不同于以前的方法的角度考虑，探索更简便的避免反应位阻的方法，并进行了更加专心致志地研究，结果发现，通过改良葡萄糖测定反应体系的组合物，可以避免PQQGDH的反应位阻，于是完成了本发明。亦即，本发明的内容涉及[1]一种在包含使修饰的吡咯并喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶进行反应的工序的葡萄糖测定中抑制相对高浓度葡萄糖的反应位阻的方法，在包含使改变了氨基酸序列的修饰的吡咯并喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶反应工序的葡萄糖测定方法中，包括使该修饰的吡咯并喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶，在选自琥珀酸、丙二酸、戊二酸、苹果酸、3，3-二甲基戊二酸、庚二酸和己二酸中的任意一种以上，氨基酸和/或盐类的存在下，进行反应的工序。
如[1]项记载的方法，其在含有100mM以上的葡萄糖的修饰的吡咯并喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶反应体系中，可以看出反应位阻的抑制效果。
如[1]项或[2]项记载的方法，其含有选自氨基酸为赖氨酸和/或盐类为氯化钾的至少一种化合物。
如[1]项记载的方法，其改变了氨基酸序列的修饰的吡咯并喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶，是与对应的野生型酶相比，麦芽糖作用性下降了的吡咯并喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶。
如[1]项记载的方法，其使修饰的吡咯并喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶反应的工序包含在含有改变了氨基酸序列的修饰的吡咯并喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶的葡萄糖测定用试剂组合物中进行。
如[5]项记载的方法，其包括葡萄糖测定用组合物采取包含在葡萄糖浓度测定试剂盒中的形态。
如[1]项记载的方法，其包括使修饰的吡咯并喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶反应的工序，在包含改变了氨基酸序列的修饰的吡咯并喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶，并且含有至少由作用极和相对极构成的电极的葡萄糖传感器中进行。
如[7]项记载的方法，其葡萄糖传感器中的反应，是对含有修饰的吡咯并喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶的反应溶液施加电压，测定介体的氧化电流而形成的。
一种使用修饰的吡咯并喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶的抑制高浓度葡萄糖的反应位阻的葡萄糖测定用组合物，其包含改变了氨基酸序列的修饰的吡咯并喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶，选自琥珀酸、丙二酸、戊二酸、苹果酸、3，3-二甲基戊二酸、庚二酸和己二酸中的任意一种以上，氨基酸和/或盐类。
一种使用修饰的吡咯并喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶的抑制高浓度葡萄糖的反应位阻的葡萄糖传感器，其含有改变了氨基酸序列的修饰的吡咯并喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶，选自琥珀酸、丙二酸、戊二酸、苹果酸、3，3-二甲基戊二酸、庚二酸和己二酸中的任意一种以上，氨基酸和/或盐类。
一种使用修饰的吡咯并喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶的抑制高浓度葡萄糖的反应位阻的葡萄糖测定用组合物的制造方法，包括使其含有选自琥珀酸、丙二酸、戊二酸、苹果酸、3，3-二甲基戊二酸、庚二酸和己二酸中的任意一种以上，氨基酸和/或盐类的工序。
一种使用修饰的吡咯并喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶的抑制高浓度葡萄糖的反应位阻的葡萄糖传感器的制造方法，包括使其含有选自琥珀酸、丙二酸、戊二酸、苹果酸、3，3-二甲基戊二酸、庚二酸和己二酸中的任意一种以上，氨基酸和/或盐类的工序。
根据本发明抑制反应位阻的组合物，可以用葡萄糖测定试剂、葡萄糖浓度测定试剂盒及葡萄糖传感器进行高浓度的葡萄糖测定。
图1表示在PQQGDH的苯二甲酸-NaOH缓冲液(pH7.0)中的底物浓度和反应速度的关系。
图2表示在添加了规定浓度的琥珀酸时的PQQGDH的苯二甲酸-NaOH缓冲液(pH7.0)中的底物浓度和反应速度的关系。
图3表示在添加了规定浓度的庚二酸时的PQQGDH的苯二甲酸-NaOH缓冲液(pH7.0)中的底物浓度和反应速度的关系。
图4表示在添加了规定浓度的氯化钾时的PQQGDH的苯二甲酸-NaOH缓冲液(pH7.0)中的底物浓度和反应速度的关系。
图5表示在添加了规定浓度的丙二酸时的PQQGDH的苯二甲酸-NaOH缓冲液(pH7.0)中的底物浓度和反应速度的关系。
图6表示在添加了规定浓度的L-赖氨酸时的PQQGDH的苯二甲酸-NaOH缓冲液(pH7.0)中的底物浓度和反应速度的关系。
图7表示在PQQGDH的戊二酸-NaOH缓冲液(pH7.0)中的底物浓度和反应速度的关系。
图8表示在添加了规定浓度的琥珀酸时的PQQGDH的戊二酸-NaOH缓冲液(pH7.0)中的底物浓度和反应速度的关系。
图9表示在添加了规定浓度的庚二酸时的PQQGDH的戊二酸-NaOH缓冲液(pH7.0)中的底物浓度和反应速度的关系。
图10表示在添加了规定浓度的戊二酸时的PQQGDH的戊二酸-NaOH缓冲液(pH7.0)中的底物浓度和反应速度的关系。
图11表示在添加了规定浓度的DL-苹果酸时的PQQGDH的戊二酸-NaOH缓冲液(pH7.0)中的底物浓度和反应速度的关系。
图12表示在添加了规定浓度的己二酸时的PQQGDH的戊二酸-NaOH缓冲液(pH7.0)中的底物浓度和反应速度的关系。
图13表示在PQQGDH的磷酸钾缓冲液(pH7.0)中的底物浓度和反应速度的关系。
图14表示在添加了规定浓度的琥珀酸时的PQQGDH的磷酸钾缓冲液(pH7.0)中的底物浓度和反应速度的关系。
图15表示在添加了规定浓度的庚二酸时的PQQGDH的磷酸钾缓冲液(pH7.0)中的底物浓度和反应速度的关系。
图16表示在添加了规定浓度的3，3-二甲基戊二酸时的PQQGDH的磷酸钾缓冲液(pH7.0)中的底物浓度和反应速度的关系。
图17表示以缓冲液A～D为反应液使用时的葡萄糖电极中的葡萄糖浓度和应答值的关系。
具体实施例方式
下面，对本发明进行详细说明。
本发明中所谓的反应位阻，是指提高作为测定对象的样品的葡萄糖(底物)浓度的情况下，在达到一定浓度时反应速度下降的现象。测定各种葡萄糖浓度的样品时，将反应速度降低之前的葡萄糖浓度当作“不发生反应位阻的最高浓度”。
另外，所谓“抑制反应位阻”是指提高“不发生反应位阻的最高浓度”。实际上，从正常血糖值(葡萄糖浓度)为5mM(90mg/dl)左右、高血糖值为10mM(180mg/dl)左右判断，如果与之相比达到有显著差别的较高的值到30mM(540mg/dl)，看不出反应位阻(亦即，如果「不发生反应位阻的最高浓度」为30mM以上)，则实用上是充分的。更优选其到100mM看不出反应位阻。
本发明中所谓的“抑制相对高浓度葡萄糖的反应位阻”，是指在葡萄糖浓度到5mM以下的浓度范围中不发生上述反应位阻。优选葡萄糖浓度到10mM以下、更优选葡萄糖浓度到30mM以下、最优选到100mM以下的浓度范围中，不发生上述反应位阻。
能够适用于本发明方法的PQQGDH，是以吡咯并喹啉醌为辅酶进行配位，催化D-葡萄糖氧化生成D-葡萄糖酸-1，5-内酯反应的酶(EC1.1.5.2(旧EC1.1.99.17))，对其由来和结构没有特别限定。
优选适用于野生型PQQGDH的氨基酸序列改变了的修饰的吡咯并喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶。在此，所谓的氨基酸序列的改变，是指利用基因学的方法，对原来的氨基酸序列中的至少1个以上的氨基酸残基进行置换、插入、缺失。其中，优选使用通过进行这样的氨基酸序列的改变，和对应的野生型酶相比对麦芽糖的作用性降低了的修饰的PQQGDH。
用于本发明修饰型PQQGDH通过如下方法可以制作，例如，取得标记有野生型PQQGDH的基因，然后，将其改变构建标记有修饰的PQQGDH的多核苷酸，然后，使该多肽在适当的表达系中表达。
成为用于本发明修饰型PQQGDH的修饰基础的野生型PQQGDH，其来源不特别限定。例如，微生物中的鲍氏不动杆菌(例如，参照特开平11-243949号公报)、醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)(例如，参照A.M.Claton-Jansen等，J.Bacteriol.，170.2121(1988)及Mol.Gen.Genet.，217，430(1989))、铜氯假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、Cluconobacter oxydans(例如，参照Mol.Gen.Genet.，229.206(1991))等氧化细菌和放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)、大肠杆菌(Escherichia coil)(例如，参照A.M.Cleton-Jansen等，J.Bacteriol.，172.6308(1990))、产气克雷白氏杆菌(Klebsiclla aerogenes)等肠内细菌、Burkhorderia cepacia等。
上述物质中，优选不动杆菌(Acinetobacter)属由来的PQQGDH。这些作为可溶性酶在水类中是易溶的。进一步优选来自醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)或鲍氏不动杆菌的任一个的PQQGDH。进一步更优选鲍氏不动杆菌NCIMB11517株由来(例如，参照特开平11-243949号公报)、醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)LMD79.41株由来(例如，参照A.M.Cleton-Jansen等，J.Bacteriol.，170.2121(1988)及Mol.Gen.Genet.，217，430(1989))或醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)IFO 12552株(例如，参照特开2004-173538号公报)由来的PQQGDH。最优选鲍氏不动杆菌NCIMB11517株由来的PQQGDH。需要说明的是，鲍氏不动杆菌NCIMB11517株以前是归类至醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)的。
这些都是公知的氨基酸序列、基因序列，或者酶的纯化法确立其理化性质也是明确的物质，基于这种见解，本领域技术人员可以容易地制造修饰的PQQGDH。
这样的修饰本领域技术人员可以使用该技术领域中的公知技术很容易地进行。例如，为了在蛋白质上引入部位特异的变异，用于置换或插入标记该蛋白质的基因的碱基序列的种种方法，记载于Sambrook等著Molecular CloningA Laboratory Manual第2版(1989)Cold SpringHarbor Laboratory Press，New York。
能够适用于本发明的方法的PQQGDH，只要具有葡萄糖脱氢酶活性，上述示例过的物质中也可以缺失或取代其他氨基酸的一部分残基，另外，也可以附加其他的氨基酸残基。
例如，将生产上述PQQGDH的天然微生物或标记天然PQQGDH基因直接或使其变异后，插入表达用载体(多数是本技术领域中已知的，例如质粒)，培养使适当的宿主(多数是该技术领域中已知的，例如大肠菌)进行过形质转化的转化子，用离心分离等方法从培养液中回收菌体后，用机械的方法或溶菌酶等的酶的方法破坏菌体，另外，根据需要添加EDTA等螯合剂和表面活性剂等，使其进行可溶化，可以得到含有PQQGDH的水溶性组分。或者，通过使用适当的宿主载体，可以直接已表达的PQQGDH分泌在培养液中。
将进行如上述操作得到的含PQQGDH溶液，可以通过例如减压浓缩，薄膜浓缩，进一步进行的硫酸铵、硫酸钠等的盐析处理，或者利用亲水性有机溶剂例如甲醇、乙醇、丙酮等的分别沉淀法进行沉淀。另外，加热处理和等电位处理也是有效的纯化手段。另外，通过实施利用吸附剂或凝胶过滤剂等进行过滤、吸附色谱法、离子交换色谱法、亲和性色谱法，可以得到纯化了的PQQGDH。该纯化酶样品优选进行电泳(SDS-PAGE)表示单一光谱带程度的纯化。
与上述工序前后进行，为了提高相对全GDH酶蛋白质的全酶型PQQGDH的比例，可以进行优选25～50℃、更优选30～45℃的加热处理。
本发明中的PQQGDH的浓度没有特别限制。
PQQGDH的酶活性，可以通过以下方法测定。
PQQGDH酶活性的测定方法(1)测定原理通过利用在570nm的分光光度计测定由N-甲基吩嗪甲基硫酸盐(PMS)(red)形成的氯化硝基四氮唑蓝(NTB)还原形成的二甲 的存在。
(2)单位的定义1单位是指在以下记载的条件下，使每1分钟二甲 形成0.5毫摩尔PQQGDH的酶量。
(3)方法试剂A.D-葡萄糖溶液0.5M(0.9g D-葡萄糖(分子量180.16)/10mlH2O)B.PIPES-NaOH缓冲液pH6.550mM(在60mL的水中悬浊的1.51g PIPES(分子量302.36)溶解在5N NaOH中，加入2.2ml的10％Triton X-100。在25℃，用5N NaOH调整pH值为6.5±0.05，加水至100ml)C.PMC溶液3.0mM(9.19mg的N-甲基吩嗪甲基硫酸盐(分子量817.65)/10ml H2O)D.NTB溶液6.6mM(53.96mg的氯化硝基四氮唑蓝(分子量817.65)/10ml H2O)E.酶稀释液含有1mM CaCl2、0.1％Triton X-100、0.1％BSA的50mM PIPES-NaOH缓冲液(pH6.5)步骤在遮光瓶中调制以下反应混合物，在冰上贮藏(用时调制)1.8ml D-葡萄糖溶液 (A)24.6ml PIPES-NaOH缓冲液(pH6.5) (B)2.0ml PMS溶液(C)1.0ml NTB溶液(D)上述化验混合物中的浓度如下PIPES缓冲液42mMD-葡萄糖 30mMPMS0.20mMNTB0.22mM将3.0ml的反应混合液加入试管(塑料制)中，在37℃预热5分钟。
加入0.1ml的酶溶液，平稳地进行反转混合。
一边维持37℃温度，一边用分光光度计记录4～5分钟在570nm的相对水的吸光度的增加，计算从曲线开始的直线部分的每1分的ΔOD(OD测试)。
同时，除了加入酶稀释液(E)代替酶溶液以外，重复相同的方法，测定空白样品(ΔOD空白)。
将酶粉末溶解于在化验之前进行过冰冷的酶稀释液(E)中，用同一种缓冲液稀释成0.1～0.8U/ml(由于该酶的附着性，优选使用塑料管)。
计算用下面的式子计算活性U/ml＝{ΔOD/min(ΔOD测试-ΔOD空白)×Vt×df}/(20.1×1.0×Vs)U/mg＝(U/ml)×1/CVt总体积(3.1ml)Vs样品体积(1.0ml)20.1二甲_的1/2毫摩尔分子吸光系数1.0光程(cm)df稀释系数C溶液中的酶浓度(c mg/ml)在含有使本发明修饰型PQQGDH反应的工序的葡萄糖测定时抑制相对高浓度葡萄糖的反应位阻的方法中，和PQQGDH共存的物质是选自琥珀酸、戊二酸、丙二酸、苹果酸、苯二甲酸、2-酮戊二酸、3，3-二甲基戊二酸、庚二酸、辛二酸、己二酸及柠檬酸中的至少一种。它们的共同特征是称为二羧酸。
在含有使本发明的修饰的吡咯并喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶反应的工序的葡萄糖测定时抑制相对高浓度葡萄糖的反应位阻的方法中，可以进一步含有缓冲成分、表面活性剂、用于最大限度地发挥PQQGDH的活性和稳定性的金属盐、亲水性聚合物以及各种稳定剂等。缓冲成分没有特别的限定，例如有磷酸钾盐、磷酸钠盐、PIPES和MES等GOOD的缓冲剂、醋酸、甘氨酸、硼酸等。另外，表面活性剂没有特别限定，例如各种Triton、Tween、胆汁酸、SDS等。另外，作为金属盐已知与活性中心键合的含有钙的化合物更适合。稳定剂例如有牛血清白蛋白、蛋白白蛋白等蛋白质，以谷氨酰胺、赖氨酸及谷氨酸为代表的氨基酸等。
在含有使本发明修饰型吡咯并喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶反应的工序的葡萄糖测定时抑制相对高浓度葡萄糖的反应位阻的方法中含有的二羧酸或氨基酸或者盐类的含量，只要在有效提高底物特异性的范围，就没有特别限定，但优选在0.001％以上，更优选0.002％以上。
在本发明的方法中，测定时的pH为中性。所谓pH中性，是指7.0±1.0，没有特别的限定，在本发明中优选范围是pH6.5～7.5。
另外，本发明包含在上述葡萄糖定量用组合物中进一步添加各种介体进行测定的葡萄糖定量方法。可以使用的介体例子如上所述。
本发明的定量方法中，也可以采用葡萄糖的定量以起因于介体或显色试剂的显色、褪色的特定波长的吸光度的增减为指标的所谓比色法，或者也可以对反应溶液施加电压，以介体的氧化电流值为基础进行定量。
在本发明中的葡萄糖定量方法中，可以在使检体中的全部葡萄糖和PQQGDH反应后，将积蓄了的还原型介体定量，进行所谓的终点测定。另外，也可以进行测定作为底物的葡萄糖浓度依赖的PQQGDH酶活性的，所谓的比率测定。
本发明的葡萄糖定量用组合物及葡萄糖定量方法，更具体地来讲可以采用下面的形态。
在本发明的方法中测定时，可以使用各种缓冲液。这样的缓冲液，只要是具有能使pH保持在中性的缓冲能力，就没有特别限定。通常可以使用的缓冲液例如有Tris-盐酸、硼酸、磷酸、醋酸、柠檬酸、琥珀酸、苯二甲酸、马来酸、甘氨酸以及它们的盐等和称为MES、Bis-Tris、ADA、PIPES、ACES、MOPSO、BES、MOPS、TES、HEPES等良好缓冲液等。
优选和钙不形成不溶性盐的缓冲液。
这些物质中，可以只使用一种，也可以使用二种以上。进一步可以是含有上述以外的一种以上的复合组成。
另外，这些物质的添加浓度，只要是在具有缓冲能力的范围，就没有特别限定，但优选上限为100mM以下，更优选为50mM以下。优选下限为5mM以上。
冻结干燥物中缓冲剂的含量，没有特别限制，但优选为0.1％(重量比)以上，特别优选在0.1～30％(重量比)的范围使用。
这些可以使用各种市售试剂。
这些缓冲液可以在测定时添加，也可以在制作后述的葡萄糖测定用试剂、葡萄糖浓度测定试剂盒或葡萄糖传感器时，使其预先含有。需要说明的是，这时，与液体状态、干燥状态等形态无关，只要使其测定时能发挥作用就可以。
本发明的效果在包含介体的体系中更加显著。可以适用本发明方法的介体没有特别限制，例如N-甲基吩嗪甲基硫酸盐(PMS)和2，6-二氯苯酚靛酚(DCPIP)的组合、PMS和氯化硝基四氮唑蓝(NBT)的组合、单独的DCPIP、单独的铁氰化物离子(铁氰化钾等作为化合物)、单独的二茂铁等。其中优选铁氰化物离子(铁氰化钾等作为化合物)。
由于这些各介体在灵敏度上存在很大差异，因此，添加浓度不必进行统一规定，但通常希望添加1mM以上。
这些介体可以在测定时添加，也可以在制作后述的葡萄糖测定用试剂、葡萄糖浓度测定试剂盒或葡萄糖传感器时，使其预先含有。需要说明的是，这时，与液体状态、干燥状态等形态无关，只要使其在测定时反应时离解成离子状态就可以。
本发明中，可以进一步根据需要使各种成分共存。例如，可以添加表面活性剂、稳定剂、赋形剂等。
例如，通过含有钙离子或钙盐，可以使PQQGDH稳定化。钙盐例如有氯化钙、醋酸钙、柠檬酸钙等无机酸或有机酸的钙盐等。另外，在水性组合物中，钙离子的含量优选为1×10-4～1×10-2M。
利用含有钙离子或钙盐的稳定化效果，与含有选自谷氨酸、谷氨酰胺及赖氨酸的氨基酸相比，进一步提高。选自谷氨酸、谷氨酰胺及赖氨酸中的氨基酸，可以是一种或两种以上。在此，也可以进一步含有牛血清白蛋白(BSA)、蛋白白蛋白(OVA)。
或者，通过使(1)选自天冬氨酸、谷氨酸、α-酮戊二酸、苹果酸、α-酮葡萄糖酸、α-环糊精及这些的盐的一种或两种以上的化合物及(2)白蛋白共存，可以使PQQGDH稳定化。
本发明中，可以利用以下各种方法测定葡萄糖。
本发明的葡萄糖测定用试剂、葡萄糖浓度测定试剂盒、葡萄糖传感器，可以是液态(水溶液、悬浊液等)、利用真空干燥和喷雾干燥等粉末化过的、采用冻结干燥等各种形态。冻结干燥法没有特别限制，可以依照常法进行。包含本发明的酶的组合物不限于冻结干燥物，也可以是将干燥物再溶解后的溶液状态。
下面，基于实施例对本发明进行更详细地说明，但本发明并不限于实施例。
实施例1使用葡萄糖测定体系的底物特异性的确认测定原理PQQGDH
将D-葡萄糖的一部分变更成其它糖类，测定相对各种底物的特异性。由铁氰化物离子的还原生成的亚铁氰化物离子的存在，通过采用分光光度法测定在波长420nm的吸光度的减少进行确认。
(2)方法试剂A.各种缓冲液苯二甲酸-NaOH缓冲液pH7.050mM(在60mL水中溶解1.02g的苯二甲酸氢钾(分子量204.22)，加入2.2ml 10％TritonX-100。进一步在25℃、用5N NaOH调整pH至7.0±0.05，加水至100ml。戊二酸-NaOH缓冲液pH7.0也用和制作苯二甲酸-NaOH缓冲液同样的方法制作。在磷酸钾缓冲液pH7.0中，也可添加使其成为相同浓度的Triton X-100)B.铁氰化钾溶液50mM(将0.165g铁氰化钾(分子量329.25)溶解于10ml蒸馏水中)C.PQQGDH溶液1000U/ml(将约10mg PQQGDH(东洋纺织社制GLD-331)溶解于10ml蒸馏水中)样品D-葡萄糖溶液分别为150、300、600、900、1200及1500mM的浓度(以用270g D-葡萄糖(分子量180.16)/1000ml H2O调制而成的1500mM葡萄糖溶液为基准，水稀释1/10、2/10、4/10、6/10、8/10水稀释液而制成)。
步骤1.在遮光瓶中调制以下的反应混合物，在冰上贮藏(用时调制)49.6ml 各种缓冲液(pH7.0) (A)4.0ml 铁氰化钾溶液(B)5.6ml (C)2.将3.0ml的反应混合物装入试管(塑料制)，在37℃预热5分钟。
3.加入0.1ml的葡萄糖溶液，平稳地进行混合。
4.一边维持在37℃，一边用分光光度计记录4～5分钟在420nm的相对水的吸光度的减少，计算从曲线的初期直线部分的每1分钟的ΔOD(OD测试)。同时，除加入蒸馏水替代葡萄糖溶液以外，用同样的方法，测定空白样品(ΔOD空白)。
用各150mM～1500mM的各浓度的葡萄糖溶液进行上述操作。
计算通过算出ΔOD/min(ΔOD测试-ΔOD空白)，求出每单位时间的吸光度变化。
图表中的横轴表示反应液中的葡萄糖浓度，纵轴表示对应各葡萄糖浓度的ΔOD/min。
用苯二甲酸-NaOH缓冲液测定的结果如图1所示，用戊二酸-NaOH缓冲液测定的结果如图7所示，用磷酸钾缓冲液测定的结果如图13所示。
实施例2利用各种化合物的PQQGDH反应位阻的抑制效果的研究在实施例1的PQQGDH反应体系中，添加各种图表的标题中记载的化合物，以使其最终浓度成为各种图表的列出的数字(％)，同样研究葡萄糖浓度和活性值(ΔOD/min)的关系。以苯二甲酸-NaOH缓冲液为基础的测定结果如图2～6所示，以戊二酸-NaOH缓冲液为基础的测定结果如图8～12所示，以磷酸钾缓冲液为基础的测定结果如图14～16所示。
实施例3用葡萄糖电极的测定用研棒将研钵中的石墨0.5g和流动石蜡0.3ml充分搅拌，作成碳膏。将该碳膏涂敷在铂电极上，在其上装载PQQGDH溶液(东洋纺织制GLD-331，2000U/ml)10μL，在室温风干30分钟。在该电极上覆盖截留分子量8000的纤维素制半透明膜，用O型环固定半透明膜，作成葡萄糖电极。该葡萄糖电极在用于测定的缓冲液中浸泡30分钟以上后使用。使用的缓冲液配制成4种50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0的包含0.1％Triton X-100和1mM CaCl2。缓冲液A)；在该缓冲液A中进一步溶解有庚二酸的(缓冲液B)；50mM戊二酸(pH7.0，包含0.1％TritonX-100和1mM CaCl2。缓冲液C)；在该缓冲液C中进一步溶解有1％琥珀酸的(缓冲液D)。在这4种溶液中溶解作为介体的铁氰化钾，以使其最终浓度分别成为0.1M，作成反应液。首先，将反应液20ml在25℃孵化，在其中浸泡上述葡萄糖电极和相对极、参照极，施加+0.35V的电压。约5分钟后，确认应答电流值稳定了，在其中添加D-葡萄糖溶液，监控应答电流值的上升。以添加D-葡萄糖后电流值上升，稳定至恒定值的上升度设定为应答值。在每一使用缓冲液中，将D-葡萄糖浓度为40mM、30mM、20mM、10mM、5mM中的测定值作图，其结果如图17所示。在此，所谓理论值是指使在5mM中的测定值，以原来D-葡萄糖量和测定值的比例算出的各浓度下的应答值，图中用直线表示。与分别单独使用磷酸、戊二酸的溶剂相比，添加庚二酸、琥珀酸时的应答值的直线性优良，特别是在30mM以上的葡萄糖浓度中的实测应答值比较接近理论值。这可以认为是，利用本发明避免底物位阻，结果其在葡萄糖高浓度领域的直线性更好。
工业实用性通过使用本发明的包含使改变了氨基酸序列的修饰的吡咯并喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶反应的工序的，葡萄糖测定方法中抑制高浓度葡萄糖的反应位阻的方法，可以提高葡萄糖测定试剂、葡萄糖浓度测定试剂盒及葡萄糖传感器的测定精度。
权利要求
1.一种在包含使修饰的吡咯并喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶反应的工序的葡萄糖测定中抑制相对高浓度葡萄糖的反应位阻的方法，在包含使改变了氨基酸序列的修饰的吡咯并喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶反应的工序的葡萄糖测定方法中，包括使该修饰的吡咯并喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶在选自琥珀酸、丙二酸、戊二酸、苹果酸、3，3-二甲基戊二酸、庚二酸及己二酸中的任意一种以上，氨基酸和/或盐类的存在下反应的工序。
2.如权利要求1记载的方法，其在含有100mM以上的葡萄糖的修饰的吡咯并喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶反应体系中，可以看出反应位阻的抑制效果。
3.如权利要求1或2记载的方法，其含有选自氨基酸为赖氨酸和/或盐类为氯化钾的至少一种化合物。
4.如权利要求1记载的方法，其改变了氨基酸序列的修饰的吡咯并喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶，是与对应的野生型酶相比，麦芽糖作用性降低了的吡咯并喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶。
5.如权利要求1记载的方法，其包括使修饰的吡咯并喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶反应的工序，在包含改变了氨基酸序列的修饰的吡咯并喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶的葡萄糖测定用组合物中进行。
6.如权利要求5记载的方法，其包括葡萄糖测定用组合物采取葡萄糖浓度测定试剂盒中含有的形态。
7.如权利要求1记载的方法，其包括使修饰的吡咯并喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶反应的工序，在包含改变了氨基酸序列的修饰的吡咯并喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶，并且至少包含由作用极和相对极构成的电极的葡萄糖传感器中进行。
8.如权利要求7记载的方法，其葡萄糖传感器中的反应，是对含有修饰的吡咯并喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶的反应溶液施加电压，测定介体的氧化电流而形成的。
9.一种使用修饰的吡咯并喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶的抑制相对高浓度葡萄糖的反应位阻的葡萄糖测定用组合物，含有改变了氨基酸序列的修饰的吡咯并喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶、选自琥珀酸、丙二酸、戊二酸、苹果酸、3，3-二甲基戊二酸、庚二酸及己二酸中的任意一种以上，氨基酸和/或盐类。
10.一种使用修饰的吡咯并喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶的抑制相对高浓度葡萄糖的反应位阻的葡萄糖传感器，含有改变了氨基酸序列的修饰的吡咯并喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶、选自琥珀酸、丙二酸、戊二酸、苹果酸、3，3-二甲基戊二酸、庚二酸及己二酸中的任意一种以上，氨基酸和/或盐类。
11.一种使用修饰的吡咯并喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶的抑制高浓度葡萄糖的反应位阻的葡萄糖测定用组合物的制造方法，包括使其含有选自琥珀酸、丙二酸、戊二酸、苹果酸、3，3-二甲基戊二酸、庚二酸及己二酸中的任意一种以上，氨基酸和/或盐类的工序。
12.一种使用修饰的吡咯并喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶的抑制高浓度葡萄糖的反应位阻的葡萄糖传感器的制造方法，包括使其含有选自琥珀酸、丙二酸、戊二酸、苹果酸、3，3-二甲基戊二酸、庚二酸及己二酸中的任意一种以上，氨基酸和/或盐类的工序。
全文摘要
本发明涉及一种在包含使修饰的吡咯并喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶反应的工序的葡萄糖测定中抑制相对高浓度葡萄糖的反应位阻的方法，在包含使改变了氨基酸序列的修饰的吡咯并喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶反应的工序的葡萄糖测定方法中，包括使该修饰的吡咯并喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶在选自琥珀酸、丙二酸、戊二酸、苹果酸、3，3－二甲基戊二酸、庚二酸及己二酸中的任意一种以上，氨基酸和/或盐类的存在下反应的工序。
文档编号C12Q1/54GK1912134SQ200610067828
公开日2007年2月14日 申请日期2006年3月13日 优先权日2005年8月11日
发明者北林雅夫, 相场洋志 申请人:东洋纺织株式会社