专利名称：一种嗜热耐高温的甘油酸激酶及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的嗜热及耐高温的甘油酸激酶及其制备方法，属于生物工程技术领域。
背景技术：
根据生物对周围生存环境温度的适应性，可将生物分为嗜冷生物(＜15℃)，嗜温生物(15-60℃)，嗜热生物(60-80℃)，极端嗜热生物(80-110℃)。大部分生物体内的蛋白质的最适活性温度一般为或者接近于该生物的最适生长温度(optimum growthtemperature，OGT)。因此，根据蛋白质对于温度的依赖性可将其分为嗜冷蛋白、嗜温蛋白、嗜热蛋白、极端嗜热蛋白。由于大部分嗜热与极端嗜热蛋白为一些酶类(如糖苷水解酶，DNA聚合酶等)，它们在高温环境中能消除底物污染等因素带来的负面效果，而且往往使反应的催化速率和效率大大提高，因此极端嗜热酶的开发及利用是当前生物技术的一个前沿领域。迄今已有75种极端酶已经投入工业应用，每年产生的经济效益达4-5亿美元，较为典型的如TagDNA聚合酶、嗜热木聚糖酶等等。
2-磷酸甘油酸(2-phospho-D-glycerate，2-PGA)是一种珍贵的有机化合物，它可以作为许多酶促化学反应如磷酸甘油酸变位酶(phosphoglycerate mutase)、烯醇化酶(enolase)等的底物。2-PGA还可以作为某些细菌的转运分子或能量来源。另外，2-PGA因具有刺激蛋白质磷酸化的功能而有望应用于胰岛素分泌过程。最后，2-PGA还可用于其他糖酵解酶类的晶体化研究中。目前，2-PGA主要由三种途径获得1.有机合成；2.经磷酸甘油酸变位酶(phosphoglycerate mutase)催化由3-磷酸甘油酸(3-PGA)转化而来；3.经烯醇化酶(enolase)催化由磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate，PEP)转化而来。但是，该化合物的有机合成过程具有费时、工序多等缺点，而由酶促转化则面临2-PGA与3-PGA的分离纯化及其他较为难以获得的酶(如磷酸甘油酸变位酶，烯醇化酶)和底物(如3-磷酸甘油酸，磷酸烯醇式丙酮酸)等问题。
掘越氏热球菌(Pyrococcus horikoshii)生存于冲绳岛附近海底约1395米火山口，发现并报道于1998年。其最适生长温度为摄氏95～105℃，分类上属广古菌。许多嗜热酶类陆续在该菌中被发现，如纤维素酶，DNA聚合酶，几丁二糖脱乙酰酶，外切氨基葡萄糖甘酶等。这些嗜热与热稳定极端酶在工业，食品，纺织及生物工程等领域已经被广泛使用或具有广泛的应用前景。
发明内容针对现有技术的不足，本发明提供一种新颖的嗜热、耐高温的甘油酸激酶(产物为2-磷酸甘油酸)(2-phosphoglycerate forming glycerate kinase)及其制备方法。
本发明还提供了嗜热、耐高温的甘油酸激酶的酶学性质与应用。
1、一种嗜热耐高温的甘油酸激酶，具有DNA序列如下(ORFPH0495，基因序列号BAA29583)gtgattgcca tggatattag ggagataggc ctgagattgg ttggagaagc aataaaagct 60gcagatccat acagggcagt cctaaatgca gttaaagtga gtgatgacaa gataattgtt120
caaggtaagg aatttgaaat caagggaaag gtgtacgtaa tagccctggg gaaagcagca 180tgtgaaatgg caagggccat agaggatata ctcgatgttg aggatggcgt tgcggtaact 240aagtacggtt atggaaaaga gttaaagagg ataaaggtga ttgaagcggg acacccaata 300cctgatgaga aatccatatt gggagctaaa gaggccctat cgatattgaa tagagctagg 360gaaaatgaca tagttttcat cctaatttca ggtggaggtt cggcactatt tgagcttcca 420gaagaaggta tttccctaga agatcttaag ctaaccacgg atctccttct aaagagcggg 480gcaaagatac atgagataaa tacggttaga aagcatatat caaaggttaa gggaggtaag 540cttgcgaaga tgatcaaggg gaccggaata gtactgataa tttcggatgt agttggcgat 600aacctagaag ccatagcctc agggcccacc gttaaggatc caactacctt cgaagatgcg 660aagaggatcc tggaactcta cgacatctgg gagaaggttc ccgaaagcgt taggttacat 720atagagagag gattaagggg ggaggtggag gaaaccctca aggaagatct acccaatgtt 780cacaacttcc tgatagccag taattcaatc tcctgcgagg ccatagccag ggaagctcag 840aggcttgggt tcaaagcata tataatgacg actactttgg agggagaagc caaggatgcc 900gggttattca taggatctat agtccaggaa atagctgaaa ggggaaggcc gttcgaacct 960ccggtagttc tagtgttcgg tggagagacc accgtaacaa tagaaggtaa agggggaaag1020ggagggccca accaagaaat agcgctgagt gctaccagga agatctcgga tctagaagcc1080ctgatcgtgg ccttcgacac cgatggaacc gatggtccca ctgatgcggc cgggggaata1140gtggatggaa caacgtacaa gaagcttagg gaaaagggaa tagatgttga gaaagtattg1200aaagagcata actcgtatga agccttaaag aaagttgggg gcttgctatt cactgggccc1260actggaacga acgtcaactc tattgttata gcgatagtca catcgaaacg aggccgtact1320taa 13232、一种嗜热耐高温的甘油酸激酶(生成2-磷酸甘油酸)，具有氨基酸序列如下MIAMD IREIG LRLVG EAIKA ADPYR AVLNA VKVSD DKIIV QGKEF EIKGK VYVIA LGKAA51015202530354045505560CEMAR AIEDI LDVED GVAVT KYGYG KELKR IKVIE AGHPI PDEKS ILGAK EALSI LNRAR65707580859095 100 105 110 115 120ENDIV FILIS GGGSA LFELP EEGIS LEDLK LTTDL LLKSG AKIHE INTVR KHISK VKGGK125 130 135 140 145 150 155 160 165 170 175 180LAKMI KGTGI VLIIS DVVGD NLEAI ASGPT VKDPT TFEDA KRILE LYDIW EKVPE SVRLH185 190 195 200 205 210 215 220 225 230 235 240IERGL RGEVE ETLKE DLPNV HNFLI ASNSI SCEAI AREAQ RLGFK AYIMT TTLEG EAKDA245 250 255 260 265 270 275 280 285 290 295 300GLFIG SIVQE IAERG RPFEP PVVLV FGGET TVTIE GKGGK GGPNQ EIALS ATRKI SDLEA305 310 315 320 325 330 335 340 345 350 355 360LIVAF DTDGT DGPTD AAGGI VDGTT YKKLR EKGID VEKVL KEHNS YEALK KVGGL LFTGP365 370 375 380 385 390 395 400 405 410 415 420TGTNV NSIVI AIVTS KRGRT425 430 435 440。
3、嗜热耐高温的甘油酸激酶的制备方法嗜热耐高温的甘油酸激酶的制备方法，包括菌株、质粒、酶与培养基，PCR扩增及重组质粒的构建，基因的诱导表达与蛋白质的纯化。具体步骤如下(1)菌株、质粒、酶与培养基大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α、限制性内切酶、Pyrobest DNA聚合酶、DNA连接kit ver.2.1购自TakaRa公司；克隆与表达质粒载体pET15b、大肠杆菌(Escherichia coli)BL21-codonPlus(DE3)-RIL购自Novagen公司；LB培养基每升含Tryptone 10g，Yeastextract 5g，NaCl 10g；氨苄青霉素浓度为100mg/L，氯霉素浓度为34mg/L。
(2)PCR扩增及重组质粒的构建设计一对引物，以Pyrococcus horikoshii(掘越氏热球菌)全基因组序列为模板进行扩增，用内切酶酶切后连接到经同样内切酶酶切的pET15b上，连接产物转化大肠杆菌E.coli DH5α，筛选重组质粒，并进行双酶切及测序验证。
上述引物优选如下上游[5′-attcgctgattcatatgattgccatggatattagggag-3′]，下游[5′-gtgaacagtcgacttaagtacggcctcgtttcgatgtgac-3′]，其中，划线部分为上游引物Nde I酶切位点及下游引物Sal I酶切位点。
酶切用内切酶选用Nde I和Sal I两种。
(3)基因的诱导表达与蛋白质的纯化将重组质粒转化E.coli BL21-codonPlus(DE3)-RIL。加入0.5-1mol/L IPTG于37℃继续培养3-5h，诱导表达的蛋白经过热处理，亲和层析，阴离子交换层析得到纯化的酶蛋白。
优选的，所述亲和层析为镍柱亲和层析。
4、甘油酸激酶(生成2-磷酸甘油酸)的酶学性质分析鉴定酶反应方程式为
酶反应体系为100ul反应体系中D-甘油酸(Sigma公司产)1mM；纯化的酶蛋白500ng；ATP(BBI公司产)1mM；MgCl210mM；50mM磷酸氢二钠与磷酸二氢钠缓冲液(pH 7)。反应温度为40℃，反应时间为10min。
在上述反应体系中加入3U烯醇化酶、5U乳酸脱氢酶、3.5U丙酮酸激酶(Sigma公司产品)，3mM NADH(Sigma公司产品)，于40℃反应10min。
通过对甘油酸激酶进行分析鉴定，得到该酶的主要以下酶学性质(1)得到编码甘油酸激酶的基因序列(ORFPHO495，基因序列号BAA29583)基因序列如上所述。
(2)得到编码甘油酸激酶的氨基酸序列氨基酸序列如上所述。
(3)得到的纯化的甘油酸激酶蛋白电泳图如图1所示。
(4)该酶能够催化D-甘油酸生成2-磷酸甘油酸(在2-磷酸甘油酸存在的情况下，反应体系中加入烯醇化酶、乳酸脱氢酶、丙酮酸激酶可催化NADH生成NAD+，使反应溶液在340nm的光吸收值下降)，因此鉴定为一种甘油酸激酶(生成2-磷酸甘油酸)。
(5)该酶具有较为宽的酶适应温度，在20-50℃具有很高的酶活，在100℃时的酶活能达最大酶活的50％左右，该酶的最适酶活温度为45℃(见图2)。
(6)该酶是一种嗜酸性酶，在酸性条件下具有很高的酶活，最适酶活pH为2.5(见图3)。
(7)该酶除能够利用ATP作为磷酸供体外，还能利用GTP，CTP，UTP及ADP作为磷酸供体。与ATP作为磷酸供体(100％)相比，酶活分别为GTP(64％)，CTP(73％)，UTP(29％)ADP(32％)。
(8)单价金属离子KCl，NaCl，NH4Cl and LiCl(50mM)能明显的促进该酶的酶活，与未加金属离子(100％)相比，酶活分别为KCl(795％)，NaCl(349％)，NH4Cl(783％)，LiCl(228％)。
(9)该酶具有极高的热稳定性，分别在70℃，80℃，90℃热处理12个小时后，酶活力能保持起始酶活的95％以上。
(10)该酶的在实验条件下的比活力为50-100U/mg。
5、甘油酸激酶的应用本发明的甘油酸激酶的酶可用于医药、生物工程领域2-磷酸甘油酸的制备。
(1)利用本发明的甘油酸激酶(生成2-磷酸甘油酸)，可以用D-甘油酸来生产2-磷酸甘油酸，由于该酶所具有的独特的嗜热及热稳定性，可以提高反应速率并消除反应可能带来的污染物等负面影响。
(2)可以利用ADP作为磷酸供体来生产2-磷酸甘油酸。在反应体系中加入单价金属离子可以有效的促进酶反应速率及效率。
(3)该酶的嗜酸特性与宿主菌Pyrococcus.horikoshii的生长pH(5-8)范围不一致，说明该酶可能具有独特生理学性质，这对于该菌代谢途径等理论研究也具有一定的参考价值。
本发明甘油酸激酶的技术特点如下1.本发明得到了嗜热及耐高温的甘油酸激酶的基因序列和氨基酸序列，该酶是在嗜热球古菌(Thermococcales)中发现并制备获得的第一个甘油酸激酶。
2本发明首次获得了嗜热的甘油酸激酶。
3.本发明首次获得了热稳定性良好的耐高温甘油酸激酶。
4.本发明首次获得了能利用ADP作为磷酸供体的甘油酸激酶。
5.单价金属离子能够明显的促进该酶的酶活。
图1是蛋白质表达的电泳照片，其中M.标准蛋白质分子量；1.细胞总提取物；2.可溶性细胞提取物；3.经热处理以后的粗酶提取液；4.经镍柱亲和层析纯化的酶蛋白；5.经阴离子交换层析得到纯化的酶蛋白。
图2是该酶的酶活与温度变化关系曲线。
图3是该酶的酶活与pH变化关系曲线。
具体实施方式
实施例1、一种嗜热耐高温的甘油酸激酶，具有DNA序列如下gtgattgcca tggatattag ggagataggc ctgagattgg ttggagaagc aataaaagct 60gcagatccat acagggcagt cctaaatgca gttaaagtga gtgatgacaa gataattgtt120caaggtaagg aatttgaaat caagggaaag gtgtacgtaa tagccctggg gaaagcagca180tgtgaaatgg caagggccat agaggatata ctcgatgttg aggatggcgt tgcggtaact240aagtacggtt atggaaaaga gttaaagagg ataaaggtga ttgaagcggg acacccaata300cctgatgaga aatccatatt gggagctaaa gaggccctat cgatattgaa tagagctagg360gaaaatgaca tagttttcat cctaatttca ggtggaggtt cggcactatt tgagcttcca420gaagaaggta tttccctaga agatcttaag ctaaccacgg atctccttct aaagagcggg480gcaaagatac atgagataaa tacggttaga aagcatatat caaaggttaa gggaggtaag540
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实施例2、一种甘油酸激酶，其特征在于，具有氨基酸序列如下MIAMD IREIG LRLVG EAIKA ADPYR AVLNA VKVSD DKIIV QGKEF EIKGK VYVIA LGKAA51015202530354045505560CEMAR AIEDI LDVED GVAVT KYGYG KELKR IKVIE AGHPI PDEKS ILGAK EALSI LNRAR65707580859095 100 105 110 115 120ENDIV FILIS GGGSA LFELP EEGIS LEDLK LTTDL LLKSG AKIHE INTVR KHISK VKGGK125 130 135 140 145 150 155 160 165 170 175 180LAKMI KGTGI VLIIS DVVGD NLEAI ASGPT VKDPT TFEDA KRILE LYDIW EKVPE SVRLH185 190 195 200 205 210 215 220 225 230 235 240IERGL RGEVE ETLKE DLPNV HNFLI ASNSI SCEAI AREAQ RLGFK AYIMT TTLEG EAKDA245 250 255 260 265 270 275 280 285 290 295 300GLFIG SIVQE IAERG RPFEP PVVLV FGGET TVTIE GKGGK GGPNQ EIALS ATRKI SDLEA305 310 315 320 325 330 335 340 345 350 355 360LIVAF DTDGT DGPTD AAGGI VDGTT YKKLR EKGID VEKVL KEHNS YEALK KVGGL LFTGP365 370 375 380 385 390 395 400 405 410 415 420TGTNV NSIVI AIVTS KRGRT425 430 435 440。
实施例3、嗜热耐高温的甘油酸激酶的制备嗜热耐高温的甘油酸激酶的制备方法，包括菌株、质粒、酶与培养基，PCR扩增及重组质粒的构建，基因的诱导表达与蛋白质的纯化。具体步骤如下(1)菌株、质粒、酶与培养基大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α、限制性内切酶、Pyrobest DNA聚合酶、DNA连接kit ver.2.1购自TakaRa公司；克隆与表达质粒载体pET15b、大肠杆菌(Escherichia coli)BL21-codonPlus(DE3)-RIL购自Novagen公司；LB培养基每升含Tryptone 10g，Yeastextract 5g，NaCl 10g，氨苄青霉素浓度为100mg/L，氯霉素浓度为34mg/L。
(2)PCR扩增及重组质粒的构建设计一对引物上游[5′-attcgctgattcatatgattgccatggatattagggag-3′]，下游[5′-gtgaacagtcgacttaagtacggcctcgtttcgatgtgac-3′]，划线部分为上游引物Nde I酶切位点及下游引物Sal I酶切位点。以Pyrococcus horikoshii(掘越氏热球菌)全基因组序列为模板进行扩增，用Nde I和Sal I两种酶切后连接到经同样酶切的pET15b上，连接产物转化大肠杆菌E.coli DH5α，筛选重组质粒，并进行双酶切及测序验证。
(3)基因的诱导表达与蛋白质的纯化将重组质粒转化E.coli BL21-codonPlus(DE3)-RIL。加入1mol/L IPTG于37℃继续培养4h，诱导表达的蛋白经过超声破壁，85℃热处理半小时，离心，取上清液进行镍柱亲和层析(Novagen公司产品)和阴离子交换层析柱(Amersham公司产品)得到纯化的酶蛋白。电泳图如图1所示。
本实施例所得的甘油酸激酶(生成2-磷酸甘油酸)的分析鉴定如下酶反应方程式为
酶反应体系为100ul反应体系中D-甘油酸(Sigma公司产)1mM；纯化的酶蛋白500ng；ATP(BBI公司产)1mM；MgCl210mM；50mM磷酸氢二钠与磷酸二氢钠缓冲液(pH 7)。反应温度为40℃，反应时间为10min。
在上述反应体系中加入3U烯醇化酶、5U乳酸脱氢酶、3.5U丙酮酸激酶(Sigma公司产品)，3mM NADH(Sigma公司产品)，于40℃反应10min。
该酶的主要酶学性质如下(1)该酶能够催化D-甘油酸生成2-磷酸甘油酸(在2-磷酸甘油酸存在的情况下，反应体系中加入烯醇化酶、乳酸脱氢酶、丙酮酸激酶可催化NADH生成NAD+，使反应溶液在340nm的光吸收值下降)，因此鉴定为一种甘油酸激酶(生成2-磷酸甘油酸)。
(2)该酶具有较为宽的酶适应温度，在20-50℃具有很高的酶活，在100℃时的酶活能达最大酶活的50％左右，该酶的最适酶活温度为45℃(见图2)。
(3)该酶是一种嗜酸性酶，在酸性条件下具有很高的酶活，最适酶活pH为2.5(见图3)。
(4)该酶除能够利用ATP作为磷酸供体外，还能利用GTP，CTP，UTP及ADP作为磷酸供体。与ATP作为磷酸供体(100％)相比，酶活分别为GTP(64％)，CTP(73％)，UTP(29％)ADP(32％)。
(5)单价金属离子KCl，NaCl，NH4Cl and LiCl(50mM)能明显的促进该酶的酶活，与未加金属离子(100％)相比，酶活分别为KCl(795％)，NaCl(349％)，NH4Cl(783％)，LiCl(228％)。
(6)该酶具有极高的热稳定性，分别在70℃，80℃，90℃热处理12个小时后，酶活力能保持起始酶活的95％以上。
(7)该酶的在实验条件下的比活力为50-100U/mg。
序列表<110>山东大学<120>一种嗜热耐高温的甘油酸激酶及其制备方法与应用<140>
<141>
<160>1<170>Patent In3.1<210>1<211>1323<212>DNA<213>掘越氏热球菌(Pyrococcus horikoshii)<400>1gtgattgcca tggatattag ggagataggc ctgagattgg ttggagaagc aataaaagct 60gcagatccat acagggcagt cctaaatgca gttaaagtga gtgatgacaa gataattgtt 120caaggtaagg aatttgaaat caagggaaag gtgtacgtaa tagccctggg gaaagcagca 180tgtgaaatgg caagggccat agaggatata ctcgatgttg aggatggcgt tgcggtaact 240aagtacggtt atggaaaaga gttaaagagg ataaaggtga ttgaagcggg acacccaata 300cctgatgaga aatccatatt gggagctaaa gaggccctat cgatattgaa tagagctagg 360gaaaatgaca tagttttcat cctaatttca ggtggaggtt cggcactatt tgagcttcca 420gaagaaggta tttccctaga agatcttaag ctaaccacgg atctccttct aaagagcggg 480gcaaagatac atgagataaa tacggttaga aagcatatat caaaggttaa gggaggtaag 540cttgcgaaga tgatcaaggg gaccggaata gtactgataa tttcggatgt agttggcgat 600aacctagaag ccatagcctc agggcccacc gttaaggatc caactacctt cgaagatgcg 660aagaggatcc tggaactcta cgacatctgg gagaaggttc ccgaaagcgt taggttacat 720atagagagag gattaagggg ggaggtggag gaaaccctca aggaagatct acccaatgtt 780cacaacttcc tgatagccag taattcaatc tcctgcgagg ccatagccag ggaagctcag 840aggcttgggt tcaaagcata tataatgacg actactttgg agggagaagc caaggatgcc 900gggttattca taggatctat agtccaggaa atagctgaaa ggggaaggcc gttcgaacct 960ccggtagttc tagtgttcgg tggagagacc accgtaacaa tagaaggtaa agggggaaag 1020ggagggccca accaagaaat agcgctgagt gctaccagga agatctcgga tctagaagcc 1080ctgatcgtgg ccttcgacac cgatggaacc gatggtccca ctgatgcggc cgggggaata 1140gtggatggaa caacgtacaa gaagcttagg gaaaagggaa tagatgttga gaaagtattg 1200aaagagcata actcgtatga agccttaaag aaagttgggg gcttgctatt cactgggccc 1260actggaacga acgtcaactc tattgttata gcgatagtca catcgaaacg aggccgtact 1320taa 1323<210>2<211>440<212>PRT<213>掘越氏热球菌(Pyrococcus horikoshii)<400>2MIAMD IREIG LRLVG EAIKA ADPYR AVLNA VKVSD DKIIV QGKEF EIKGK VYVIA LGKAA51015202530354045505560CEMAR AIEDI LDVED GVAVT KYGYG KELKR IKVIE AGHPI PDEKS ILGAK EALSI LNRAR
65707580859095 100 105 110 115 120ENDIV FILIS GGGSA LFELP EEGIS LEDLK LTTDL LLKSG AKIHE INTVR KHISK VKGGK125 130 135 140 145 150 155 160 165 170 175 180LAKMI KGTGI VLIIS DVVGD NLEAI ASGPT VKDPT TFEDA KRILE LYDIW EKVPE SVRLH185 190 195 200 205 210 215 220 225 230 235 240IERGL RGEVE ETLKE DLPNV HNFLI ASNSI SCEAI AREAQ RLGFK AYIMT TTLEG EAKDA245 250 255 260 265 270 275 280 285 290 295 300GLFIG SIVQE IAERG RPFEP PVVLV FGGET TVTIE GKGGK GGPNQ EIALS ATRKI SDLEA305 310 315 320 325 330 335 340 345 350 355 360LIVAF DTDGT DGPTD AAGGI VDGTT YKKLR EKGID VEKVL KEHNS YEALK KVGGL LFTGP365 370 375 380 385 390 395 400 405 410 415 420TGTNV NSIVI AIVTS KRGRT425 430 435 440
权利要求
1.一种甘油酸激酶，其特征在于，具有DNA序列如下gtgattgcca tggatattag ggagataggc ctgagattgg ttggagaagc aataaaagctgcagatccat acagggcagt cctaaatgca gttaaagtga gtgatgacaa gataattgttcaaggtaagg aatttgaaat caagggaaag gtgtacgtaa tagccctggg gaaagcagcatgtgaaatgg caagggccat agaggatata ctcgatgttg aggatggcgt tgcggtaactaagtacggtt atggaaaaga gttaaagagg ataaaggtga ttgaagcggg acacccaatacctgatgaga aatccatatt gggagctaaa gaggccctat cgatattgaa tagagctagggaaaatgaca tagttttcat cctaatttca ggtggaggtt cggcactatt tgagcttccagaagaaggta tttccctaga agatcttaag ctaaccacgg atctccttct aaagagcggggcaaagatac atgagataaa tacggttaga aagcatatat caaaggttaa gggaggtaagcttgcgaaga tgatcaaggg gaccggaata gtactgataa tttcggatgt agttggcgataacctagaag ccatagcctc agggcccacc gttaaggatc caactacctt cgaagatgcgaagaggatcc tggaactcta cgacatctgg gagaaggttc ccgaaagcgt taggttacatatagagagag gattaagggg ggaggtggag gaaaccctca aggaagatct acccaatgttcacaacttcc tgatagccag taattcaatc tcctgcgagg ccatagccag ggaagctcagaggcttgggt tcaaagcata tataatgacg actactttgg agggagaagc caaggatgccgggttattca taggatctat agtccaggaa atagctgaaa ggggaaggcc gttcgaacctccggtagttc tagtgttcgg tggagagacc accgtaacaa tagaaggtaa agggggaaagggagggccca accaagaaat agcgctgagt gctaccagga agatctcgga tctagaagccctgatcgtgg ccttcgacac cgatggaacc gatggtccca ctgatgcggc cgggggaatagtggatggaa caacgtacaa gaagcttagg gaaaagggaa tagatgttga gaaagtattgaaagagcata actcgtatga agccttaaag aaagttgggg gcttgctatt cactgggcccactggaacga acgtcaactc tattgttata gcgatagtca catcgaaacg aggccgtacttaa。
2.如权利要求1所述的甘油酸激酶，其特征在于，具有氨基酸序列如下MIAMD IREIG LRLVG EAIKA ADPYR AVLNA VKVSD DKIIV QGKEF EIKGK VYVIA LGKAA51015202530354045505560CEMAR AIEDI LDVED GVAVT KYGYG KELKR IKVIE AGHPI PDEKS ILGAK EALSI LNRAR65707580859095 100 105 110 115 120ENDIV FILIS GGGSA LFELP EEGIS LEDLK LTTDL LLKSG AKIHE INTVR KHISK VKGGK125 130 135 140 145 150 155 160 165 170 175 180LAKMI KGTGI VLIIS DVVGD NLEAI ASGPT VKDPT TFEDA KRILE LYDIW EKVPE SVRLH185 190 195 200 205 210 215 220 225 230 235 240IERGL RGEVE ETLKE DLPNV HNFLI ASNSI SCEAI AREAQ RLGFK AYIMT TTLEG EAKDA245 250 255 260 265 270 275 280 285 290 295 300GLFIG SIVQE IAERG RPFEP PVVLV FGGET TVTIE GKGGK GGPNQ EIALS ATRKI SDLEA305 310 315 320 325 330 335 340 345 350 355 360LIVAF DTDGT DGPTD AAGGI VDGTT YKKLR EKGID VEKVL KEHNS YEALK KVGGL LFTGP365 370 375 380 385 390 395 400 405 410 415 420TGTNV NSIVI AIVTS KRGRT425 430 435 440。
3.如权利要求1所述的甘油酸激酶，其特征在于，最适酶活温度为45℃，最适酶活pH为2.5。
4.一种权利要求1所述的甘油酸激酶的制备方法，具体步骤如下(1)质粒、菌株、酶与培养基克隆与表达质粒载体pET15b；大肠杆菌E.coli DH5α、BL21-codonPlus(DE3)-RIL；限制性内切酶、Pyrobest DNA聚合酶、DNA连接kitver.2.1；LB培养基每升含Tryptone 10g，Yeast extract 5g，NaCl 10g，氨苄青霉素浓度为100mg/L，氯霉素浓度为34mg/L；(2)PCR扩增及重组质粒的构建设计一对引物，以Pyrococcus horikoshii全基因组序列为模板进行扩增，用内切酶酶切并连接到经同样内切酶酶切的表达质粒载体pET15b上，将表达质粒载体pET15b转化大肠杆菌E.coli DH5α，筛选重组质粒；(3)基因的诱导表达与蛋白质的纯化将重组质粒转化E.coli BL21-codonPlus(DE3)-RIL，加入0.5-1mol/LIPTG于37℃继续培养3-5h，诱导表达的蛋白经过热处理，亲和层析，阴离子交换层析得到纯化的酶蛋白。
5.如权利要求4所述的甘油酸激酶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述引物是上游5′-attcgctgattcatatgattgccatggatattagggag-3’，下游5′-gtgaacagtcgacttaagtacggcctcgtttcgatgtgac-3’。
6.如权利要求4所述的甘油酸激酶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述内切酶为Nde I和Sal I。
7.如权利要求4所述的甘油酸激酶的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述亲和层析为镍柱亲和层析。
8.权利要求1所述的甘油酸激酶的应用，用于生产2-磷酸甘油酸。
全文摘要
一种嗜热耐高温的甘油酸激酶及其制备方法与应用，属于生物工程技术领域。该酶的最适酶活温度为45℃，具有较为宽的酶适应温度，在20－50℃具有很高的酶活；该酶的最适酶活pH为2.5，在酸性条件下具有很高的酶活。该酶能够利用ATP，GTP，CTP，UTP及ADP作为磷酸供体。该酶的制备方法，包括质粒、菌株与培养基的选择，PCR扩增及重组质粒的构建，基因的诱导表达与蛋白质的纯化。该酶具有极高的热稳定性，可用于医药、生物工程领域2－磷酸甘油酸的制备。
文档编号C12N9/12GK1928092SQ20061006896
公开日2007年3月14日 申请日期2006年9月28日 优先权日2006年9月28日
发明者申玉龙, 刘波 申请人:山东大学