应用层孔菌j21制备新型功能性酒精饮料的方法

专利名称：应用层孔菌j21制备新型功能性酒精饮料的方法
技术领域：
本发明是关于一种层孔菌(Phellinus sp.)的菌丝体突变株及使用该突变株制备酒精饮料的方法。更具体地，本发明是关于从层孔菌中制备突变菌丝体层孔菌J21(Phellinus sp.J21)(该层孔菌J21于2005年9月13日保藏在韩国典型培养物保藏中心(KCTC)，保藏编号为KCTC 10847BP)的方法、在人工液体营养培养基上培养该突变菌丝体层孔菌J21的方法、从培养的层孔菌J21中分离并纯化醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase)的方法和克隆所述醇脱氢酶基因的方法，本发明还关于使用所述突变株菌丝体制备的功能性酒精饮料和制备所述酒精饮料的方法。
背景技术：
蕈类富含纤维物质(fibrous material)、维生素、矿物等，并因此作为“健康(well-being)”食品得到更多关注。特别是层孔菌因为已经发现有抗癌功效，因而被广泛用于医药食品。近来由于使用几种蕈类种的菌丝体发酵醇类成为可能，因而关于所述蕈类的醇脱氢酶(alcoholdehydrogenase，ADH)的研究也有报道。
几千年来，酒精饮料给人类带来愉悦。然而，过度的酒精饮料引起副作用，例如脂肪肝和肝损伤。自从人类历史起源，人类就已经开始酿造酒精饮料。所述酒精饮料的应用范围逐渐扩大，例如，已经应用于君王登基典礼、结婚典礼和祖先的宗教仪式。在西方国家，很久以前酒就已经用于礼拜仪式，柏拉图曾讲，“在上帝赐予人类的众多礼物中，没有比酒更有价值的了。”韩国传统的酒精饮料广义上可分为通过发酵制备的未过滤米酒和澄清过滤米酒，以及蒸馏米酒(soju韩国烧酒)。韩国传统酒精饮料的迷人之处可以从发酵酒精饮料中发现，其典型成员未过滤米酒和澄清过滤米酒为韩国历史上著名的使用酵母酿造的酒精饮料(日本米酒(Jeongjong)为日本酒“清酒(Sake)”改用的名称，该名称可以与韩国传统的澄清过滤米酒相区别)。所述未过滤米酒为低醇饮料，通过用酵母发酵大米，用滤网粗略过滤所得发酵的醇原液，然后将过滤后得到的原液用水稀释酿制而成，并且已有各种不同的名称，包括Makkoli、Daepo、Wangdaepo、Jeoknaegisul、Moju、Takbegi和Takjubegi。同样，由于它经常在家庭中酿造，其口味和香味因技巧或家庭的制备方法各异。虽然很难定义好的酒精饮料，韩国传统粮食酒要求必须尽可能接近竹叶的颜色，清香爽口。由于1907年制定的酒税法(the Liquor Tax Law)严格限定了韩国传统酒的制造，因此传统酒的历史被中断了，之后，随1988年汉城奥运会前后国际化的趋势，它们又流行起来。然而可以得出这样的事实韩国是世界上最大的酒进口国，这种趋势现在仍然继续。
乙醇发酵是指生物体在厌氧条件下将糖类转化成酒精(乙醇)的方法。即微生物对碳水化合物的一种非酶分解，最终从糖类或多糖产生乙醇和二氧化碳，如下列反应方程式1所示。

发酵酒精饮料是指应用发酵的醇液体本身或过滤后的所述醇液体，并且具有低醇浓度但是高萃取量(extract content)。制备发酵酒精饮料的方法包括单一发酵和复合发酵。单一发酵的酒精饮料指，通过用酵母能利用的糖类原料完成的乙醇发酵而获得的酒精饮料。所述单一发酵的酒精饮料包括如葡萄酒和苹果酒的果酒和马奶酒。复合发酵的酒精饮料指通过淀粉酶的淀粉糖化过程，并使糖化后的淀粉进行乙醇发酵而获得的酒精饮料。因此，用粮食制成的发酵酒精饮料为复合发酵酒精饮料。分别进行糖化作用和发酵的方法被定义为分步糖化发酵法(separate saccharification andfermentation process)，啤酒属于此类。啤酒通过发酵由麦芽淀粉酶对原料淀粉的糖化作用得到的糖液制得。同时进行糖化作用和发酵的方法被定义为同步糖化发酵法(simultaneous saccharification and fermentationprocess)。通过同步糖化发酵法制备的酒精饮料包括澄清过滤米酒、未过滤米酒和So-Hong Ju。澄清过滤米酒通过在发酵淀粉时，用清酒曲淀粉酶糖化淀粉制备。

发明内容
本发明的发明人已经从层孔菌制备了突变菌丝体层孔菌J21，所述层孔菌广泛用于医疗目的，并已经发现了所述突变菌丝体产生醇脱氢酶，以及发现应用所述突变菌丝体使制得的酒精饮料具有改善肝功能的功效。
因此，本发明的发明目的是提供产生醇脱氢酶的层孔菌J21，以及用该菌株制备的功能性酒精饮料和制备所述酒精饮料的方法。
为了达到上述目的，在本发明的一个具体实施方式
中提供了从层孔菌制备来的产生醇脱氢酶的突变菌丝体层孔菌J21。
在另一个具体实施方式
中，本发明提供了多种功能性酒精饮料如啤酒、果酒和澄清过滤酒，所述酒精饮料通过在人工培养基或天然培养基上接种得自富含纤维物质(fibrous material)、蛋白质和维生素的层孔菌的包含醇脱氢酶的菌丝体制备，该酒精饮料具有预防癌症的功效，以及提供应用所述发酵酒精饮料制备的蒸馏酒精饮料。


图1显示根据本发明处理的层孔菌在人工培养基上固体培养和液体培养的结果，以及培养基的显微照片；图2显示根据本发明，从层孔菌J21中分离纯化的醇脱氢酶的电泳结果；图3显示根据本发明，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增从层孔菌J21中分离的总RNA得出醇脱氢酶的cDNA克隆以及碱基序列分析结果；图4为显示了根据本发明，在使用层孔菌J21的乙醇发酵过程中乙醇浓度随发酵时间变化的图表；图5为显示根据本发明制得的乙醇已经被层孔菌J21发酵的图解图表；图6显示使用引物5’-RACE、ph-adh-R3和ph-adh-R4的结合进行的PCR扩增的结果；M标记(marker)；泳道1用5’-RACE和ph-adh-R3的结合产生的PCR产物；以及泳道2-5用泳道1的PCR产物作为模板以及5’-RACE和ph-adh-R3的结合产生的PCR产物；图7显示了根据本发明得自层孔菌J21的醇脱氢酶cDNA与得自其它已知物种的醇脱氢酶的对比的结果；P-adh得自层孔菌J21的醇脱氢酶；以及A-adh III得自伞菌的醇脱氢酶；图8显示了根据本发明得自层孔菌J21的醇脱氢酶与得自伞菌的醇脱氢酶的对比结果；P-adh得自菌丝体层孔菌的醇脱氢酶；以及A-adh III得自伞菌的醇脱氢酶；图9为示意图，显示了根据本发明，用层孔菌J21制备澄清过滤米酒(Yakju)的方法；图10显示了根据本发明利用层孔菌J21制备的发酵酒精饮料的溶解血栓活性和抑制血栓形成的功效；图11为显示了给予根据本发明用层孔菌J21制备的发酵酒精饮料的小鼠和给予其它酒精饮料的小鼠的谷草转氨酶(GOT)和谷丙转氨酶(GPT)分析结果的图表；
图12为显示了给予根据本发明用层孔菌J21制备的发酵酒精饮料的小鼠和给予其它酒精饮料(乙醇浓度14％)的小鼠的血清总胆固醇和甘油三酯水平的分析结果的图表；图13显示了给予根据本发明用层孔菌J21制备的发酵酒精饮料的小鼠和给予其它酒精饮料的小鼠的肝组织染色结果。
生物保藏本发明的层孔菌J21于2005年9月13日保藏在韩国典型培养物保藏中心(KCTC)，保藏编号为KCTC 10847BP。
具体实施例方式
现在结合附图对本发明的优选具体实施方式
做详细的说明。
通过用致死率大于95％的紫外线(UV)照射层孔菌而分离层孔菌的突变菌丝体层孔菌J21，然后每天传代培养经过照射的菌株共30天。与现有的层孔菌相比，突变菌株层孔菌J21显示出液体培养菌丝体形成周期缩短、乙醇发酵周期缩短和乙醇发酵能力增强的特点。所述突变菌株层孔菌J21于2005年9月13日保藏在布达佩斯条约下的国际保藏机构-韩国典型培养物保藏中心(KCTC)，保藏编号为KCTC-10847BP。
在本发明中，分离并培养产生醇脱氢酶的突变菌丝体层孔菌J21，然后将所得培养的菌丝体用于工业乙醇发酵。此外，从突变菌丝体层孔菌J21中分离醇脱氢酶(ADH)并克隆醇脱氢酶的cDNA。
层孔菌J21于25℃液体培养基中培养6天，通过离心从培养基中收集菌丝体，并用超声波进行破碎，然后通过分级色谱法(stepwisechromatography)从中分离和纯化ADH。纯化出的酶通过十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳测得分子量为约46千道尔顿(kDa)。
此外，收集在上述相同条件下培养的所述菌丝体(Phellinus sp.J21)，用液氮冻干，然后用研钵完全粉碎，从所得粉碎的菌丝体中提取总RNA。所提取的总RNA进行反向PCR(RT-PCR)克隆出ADH的cDNA，以测定ADH的碱基序列。层孔菌J21的克隆cDNA具有编码379个氨基酸的1137个碱基对。将所述ADH的cDNA转换成氨基酸序列，并且与先前已知的伞菌(Agaricus)ADH进行比较，结果与伞菌ADH的氨基酸序列显示出68％的同源性。并且，局部相似性基本查询工具(Basic Local Alignment SearchTool，BLAST)分析表明所述克隆出的ADH与ADH III非常相似。
在本发明中，产生醇脱氢酶的所述突变菌丝体层孔菌J21分离自富含有益健康的物质的层孔菌，分离的突变菌丝体在液体培养基中培养并用于制造酒精饮料。具体地，上述方法包括如下步骤1)从层孔菌中制备所述层孔菌J21；2)在营养培养基中培养层孔菌J21；以及3)以重量比2∶3∶5混合酒曲(Koji)(详见下文)、蒸米饭和水，并用所得混合物培养所述培养的菌丝体以产生乙醇。
上述酒曲通过用米曲霉(Aspergillus oryzae)接种蒸米饭以使蒸米饭糖化制得。通过用米曲霉接种所述蒸米饭而对蒸米饭糖化后，将层孔菌J21代替酵母作为乙醇发酵源加入其中，并将所得混合物在25℃下发酵11天以产生乙醇浓度达到最大值16.7％的酒精饮料。
在本发明的优选实施方式中，对用层孔菌J21制备的发酵酒精饮料的功能性进行检测，结果，该饮料表现出溶解血栓活性和延迟血栓形成的功效。同时，在用本发明所发明的发酵酒精饮料动物实验中，所述酒精饮料与具有同样乙醇浓度(14％)的普通酒精饮料相比，表现出低GOT和GPT水平，并且表现出低血清胆固醇和中性脂(neutral lipid)水平。此外，动物肝组织分析结果中，给予普通酒精饮料(14％)大鼠的肝表现出部分的炎性部位，而给予用层孔菌J21制备的发酵酒精饮料大鼠的肝与给予生理盐水的对照组的肝表现结果相似。
在本发明中，用具有抗癌功效的突变菌丝体层孔菌J21醇发酵成功地达到了工业生产的水平。此外，根据本发明的发酵酒精饮料具有溶解血栓的功能以及抑制肝功能损害的效果，因而有益健康。
下面将结合实施例进一步详细描述本发明。然而本领域技术人员清楚，所述实施例只具说明性的目的，本发明的范围由后附的权利要求限定，而不限于所述实施例。
实施例1 层孔菌的突变菌丝体层孔菌J21的分离、培养和富集从层孔菌分离并培养的菌丝体的形态见图1。概括讲，取具有特定大小的层孔菌孢果柄(carpophore)，在YMD平板(7.5％葡萄糖、4.5％麦芽提取物、5％酵母提取物、0.01％生物素、0.05％ MgCl2、0.01％FeSO4、2％琼脂，pH 7.0)上于25℃下静止培养6天。将层孔菌的菌丝体边缘部分从培养的YMD平板上切下大约0.5厘米×0.5厘米大小的4到5个琼脂小块，并将所切小块接种到YBM(7.5％葡萄糖、4.5％麦芽提取物、5％酵母提取物、0.01％生物素、0.05％MgCl2、0.01％FeSO4，pH 7.0)中，在250毫升三角瓶中于25℃下以100转/分钟(rpm)的转速振荡培养6天。所培养的菌丝体用于分离总RNA以分离醇脱氢酶和醇脱氢酶的cDNA克隆。从层孔菌分离并培养的菌丝体的形态见图1。
将所述分离的菌丝体以致死率高于95％的(250纳米，30分钟)紫外线照射，然后每天传代培养30天以分离层孔菌J21。所得突变菌株在YMD培养基中于25℃下以100转/分钟的转速振荡培养6天，并用于分离总RNA以分离醇脱氢酶和醇脱氢酶的cDNA克隆。
用层孔菌J21产生醇的人工培养基最佳培养条件见下表1。
表1

醇脱氢酶的分离和纯化分离的菌丝体层孔菌J21用纱布过滤，以体积比2∶1的比例与20mM的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)(pH 8.0)混合，并用超声波仪(Branson Sonifier 250，美国)破碎。所得破碎液体在4℃下以13000转/分钟离心20分钟，并且所得上清液通过透析膜用20mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)透析，并用作辅酶溶液(coenzyme solution)。所述辅酶溶液通过二乙胺基乙基纤维交联葡聚糖A-50离子交换柱(DEAE Sephadex A-50ion-exchange column)、交联葡聚糖G-200柱(Sephadex G-200 column)和交联葡聚糖G-75柱(Sephadex G-75 column)分级分离纯化。最终得到48.6单位/毫克(U/mg)分离纯化的酶，产率3.5％(见表2)。
表2

酶分子量的测定所述纯化的酶在90伏特进行2小时的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE electrophoresis)并通过银染色确认蛋白带。酶的分子量以比移值(Rf value)通过对数图表计算。测定的纯化ADH酶的分子量为约46000道尔顿。所述电泳和得自层孔菌J21的醇脱氢酶的分子量见图2。
分离总RNA所述菌丝体层孔菌J21在液体介质中培养6天，富集所培养的菌丝体，并用液氮冻干，用研钵彻底破碎。根据RNeasy Plant Mini试剂盒(QIAGEN)的测试步骤处理100毫克破碎菌丝体以分离总RNA。所得分离的RNA用紫外分光光度计定量，通过RT-PCR用以醇脱氢酶的cDNA克隆。
实施例2 醇脱氢酶的cDNA克隆和碱基序列分析用反转录酶III(Invitogen)和CapFishingTM全长cDNA预混合试剂盒(Cap Fishing TM Full-length cDNA Premix kit(Seegene))提供的寡聚脱氧胸腺嘧啶连接体(oligo dT-adaptor)从3微克菌丝体层孔菌J21的总RNA合成第一链cDNA。所述合成的第一链cDNA的5’末端区域与Cap Fishing TMFull-length cDNA Premix kit(Seegene)提供的5’-RACE相连，然后进行PCR。所述PCR扩增用本发明的发明人设计的引物(正向ph-adh-1和反向ph-adh-2)和由Seegene提供的3’-RACE引物完成，因此合成了第二链cDNA。使用BLAST数据库的相关高度保守碱基序列区域设计所述引物。所得PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳(图3)。正如所期望的，用正向ph-adh-1和反向ph-adh-2引物组的PCR产物的长度为约960个碱基对，用ph-adh-1和3’-RACE引物组的PCR产物的长度为1160个碱基对。对所期望的每一PCR产物都进行扩增和电泳，然后将所需的DNA带从凝胶中切离。将分离的PCR产物(960个碱基对)克隆到T-载体(T-vector)并分析其DNA碱基序列。为了在960碱基对片段DNA碱基序列的基础上构建测序引物(sequencing primer)，以及获得3’区域碱基序列信息，对所述1160碱基对的片段进行了直接的局部碱基序列分析，没有将PCR产物克隆到载体中。为了获得层孔菌ADH 的cDNA的5’区域序列信息，所述被分析的碱基序列(960碱基对)用于设计ph-adh-R3和ph-adh-R4引物，并用分别用ph-adh-R3和5’-RACE的引物组以及ph-adh-R4和5’-RACE的引物组进行PCR扩增。在此情况下，所述PCR扩增反应完成35个循环在94℃变性30秒，在55℃退火30秒以及72℃延伸1分钟。用所述ph-adh-R4和5’-RACE引物组使1微升用所述ph-adh-R3和5’-RACE引物组得到的PCR产物完成嵌套式聚合酶链式反应(nest-PCR)，以最终获得约460碱基对的片段(图6)，然后测定层孔菌J21 ADH的5’区域碱基序列。克隆的层孔菌J21ADH全长cDNA SEQ IDNO9为编码SEQ ID NO10的379个氨基酸的1137个碱基对。本实施例应用的引物见于下表3。
表3

层孔菌J21 ADH的cDNA的碱基序列分析将层孔菌J21 ADH的cDNA与BLAST数据库中的其他种类的ADH基因比较，结果它与ADH III具有高度相似性。同时所述cDNA与芽殖酵母(budding yeast)、裂殖酵母(fission yeast)、线虫(C.elegans)、斑马鱼(zebra fish)以及人类的DNA比较，结果显示出与所述基因分别达57.6％、55.0％、51.8％、57.2％和49.7％的同源性。
这些基因的进化系统树(phylogenetic tree)见图7。同时，将所述层孔菌J21ADH的cDNA与现有技术报道的伞菌ADH III比较，结果所述cDNA与伞菌ADH III表现出68％的同源性。
实施例3 利用菌丝体层孔菌J21的乙醇发酵和酒精饮料产品用实施例1制备的菌丝体层孔菌J21制造新型酒精饮料的具体方法见图9。如图9所示，原料米蒸煮后，用酒曲米曲霉接种，在25-30℃下培养3天以产生酵母(yeast)。在此期间，淀粉糖化作用发生。在本发明中，淀粉发酵通过用菌丝体层孔菌J21代替澄清过滤米酒常用的清酒酵母(Saccharomyces sake)，接种所述糖化了的淀粉，然后在25℃下发酵淀粉14天完成(见图9)。通过向酒曲中加入包含得自层孔菌J21的醇脱氢酶的菌丝体制备的酒精饮料的乙醇浓度在发酵后第11天为16.7％。
实验实施例1野生型层孔菌与实施例1制备的突变菌丝体层孔菌J21相关特征互相对比，结果见下表4。
表4

从上述表4可以看出，突变菌丝体层孔菌J21的醇脱氢酶活性比野生型层孔菌的醇脱氢酶活性高，并且因此表现高乙醇产量。
实验实施例2 用层孔菌J21制备的发酵酒精饮料的溶解血栓活性和抑制血栓形成的功效为了测量溶解血栓活性，根据Haverkata-Trass的纤维蛋白平板法(fibrin plate method)，将在0.2M的硼酸缓冲液(pH 7.8)中的20单位的凝血酶逐滴加入到10毫升2％凝胶溶液中的0.2％纤维蛋白原并充分混合，将所得混合物倾倒在有盖培养皿(petri-dish)上，形成纤维蛋白膜。100微升用菌丝体层孔菌J21制备的发酵酒精饮料被纸片吸收，并于37℃在所述培养皿上放置18个小时。随所述纤维蛋白被酶溶解，测量所述溶解面积以测定相对活性。为了测定抑制血栓形成功效，将200微升用菌丝体层孔菌J21制备的发酵酒精饮料与200微升凝血酶(12.5单位/毫升)混合，在37℃放置5分钟，向其中加入800微升0.33％的血纤维蛋白，并且彻底地混合。观察混合物的凝结时间，结果见图10。测试结果中，观察到所述用菌丝体层孔菌J21制备的发酵酒精饮料具有溶解血栓活性和抑制血栓形成功效。
实验实施例3 给予得自层孔菌J21发酵的酒精饮料以及其他酒精饮料的小鼠的GOT和GPT水平分析自由饮食(free diet)2周使适应实验室环境后，应用8周龄健康雄性Sprague-Dawley白鼠。为了说明功能性，每只鼠口服给予或者3毫升的层孔菌J21发酵酒精饮料或3毫升另一种酒精饮料，每天两次给予10天，然后从每个动物的血液中分离分析GOT和GPT水平用的血清，结果见图11。从图11可以看出，与给予另一种酒精饮料的鼠相比，给予层孔菌J21发酵酒精饮料的鼠具有较低的GOT和GPT水平。
实验实施例4 给予层孔菌J21发酵酒精饮料的鼠的血清胆固醇和中性脂(甘油三酯)水平的测量分析给予层孔菌J21发酵酒精饮料或另一酒精饮料(14％乙醇)的鼠的血清总胆固醇和中性脂(甘油三酯)水平，结果见图12。从图12可以看出，与给予另一种酒精饮料(14％乙醇)的鼠相比，给予层孔菌J21发酵酒精饮料的鼠具有较低的血清总胆固醇和甘油三酯水平。
实验实施例5 层孔菌J21发酵酒精饮料在鼠肝组织方面的功效层孔菌J21发酵酒精饮料在鼠肝组织方面的功效见图13。从口服给予或者所述层孔菌J21发酵酒精饮料(14％乙醇)或者另一种酒精饮料(14％乙醇)的每只白鼠分离肝组织，然后染色。结果所述给予其他酒精饮料(14％乙醇)的鼠的肝组织中观察到部分的炎症，但是给予层孔菌J21发酵酒精饮料的鼠的肝组织中无炎症位点，并与那些给予生理盐水的鼠显示相似的图案。
如上所述，根据本发明，具有溶解血栓活性并减少乙醇引起的肝功能损伤的功能酒精饮料得以制备。因此本发明能对国民健康(nationalhealth)做出贡献。
虽然为了解释说明目的对本发明的优选实施方式进行了描述，但是本领域技术人员清楚，在不背离本发明权利要求所述的范围和精华的前提下，可以对本发明作出各种修饰、添加或减少。
序列表<110>株式会社千年约束<120>应用层孔菌J21制备新型功能性酒精饮料的方法<130>16189YOL<150>KR10-2005-0102524<151>2005-10-28<160>10<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚脱氧胸腺嘧啶连接体<400>1ctgtgaatgc tgcgactacg attttttttt tttttttttt40<210>2<211>22<212>DNA<213>5′-RACE引物<400>2gtctaccagg cattcgcttc at 22<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>Ph-adh-1正向引物<400>4tgtcacactg atgactacac 20
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<223>Ph-adh-4正向引物<400>5tcccttccaa ctggtcactg 20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>Ph-adh-R3反向引物<400>7accttgacga cggagacatc 20<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Ph-adh-R4反向引物<400>8gcggccttga gtagctctga 20<210>9<211>1137<212>DNA<213>层孔菌J21<400>9atgtctaccg ctggtcaagt tatcaaatgt cgtgctgctg tcgcttggga agctggcaag 60cctttgagca ttgaggaagt cgaagtcgct gctcccaagg ctcacgaagt ccgtatcaag 120
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Cys Ile Arg Ala Val Val Thr Val Gln Lys Asp370 375Val Glu Ile Thr Asp Gly Gly Leu Glu Tyr Thr Phe Asp Cys Thr Gly260 265 270Asn Val Asp Val Met Arg Ala Ala Leu Glu Ala Cys His Lys Gly Trp275 280 285Gly Glu Ser Val Ile Ile Gly Val Ala Ala Ala Gly Lys Glu Ile Ser290 295 300Thr Arg Pro Phe Gln Leu Val Thr Gly Arg Val Trp Arg Gly Ser Ala305 310 315 320Phe Gly Gly Val Lys Gly Arg Ser Glu Met Gly Gly Leu Val Gln Lys325 330 335Tyr Leu Asp Gly Gln Leu Lys Val Asp Glu Phe Ile Thr His Thr Phe340 345 350Asp Phe Glu Gln Ile Asn Asp Ala Leu Asp Ala Met His Ser Gly Ser355 360 365Cys Ile Arg Ala Val Val Thr Val Gln Lys Asp370 37权利要求
1.一种突变菌丝体层孔菌J21(Phellinus sp.J21)，其中，该层孔菌J21得自层孔菌，该层孔菌J21的保藏编号为KCTC 10847BP。
2.一种制备酒精饮料的方法，该方法包括如下步骤1)用254纳米的紫外线照射层孔菌30分钟，并每日传代培养所述被照射的菌株30天，以制备层孔菌J21，该层孔菌J21的保藏编号为KCTC10847BP；2)在营养培养基中培养所述层孔菌J21；并且3)以重量比2∶3∶5混合酒曲、蒸米饭和水，并用所得混合物培养上述培养的菌丝体。
3.一种酒精饮料，该酒精饮料根据权利要求2所述的方法用菌丝体层孔菌J21制得。
4.根据权利要求3所述的酒精饮料，该酒精饮料具有减轻肝功能损伤的功效，与一般酒精饮料相比，该饮料显示出溶解血栓活性和抑制血栓形成活性，并具有较低的谷草转氨酶和谷丙转氨酶水平、血清胆固醇以及中性脂水平。
5.根据权利要求3所述的酒精饮料，该饮料选自由啤酒、果酒和澄清过滤米酒所组成的组中。
全文摘要
本发明是关于一种突变菌丝体层孔菌以及用所述变菌丝层孔菌突体制备酒精饮料的方法。更具体地，本发明是关于从层孔菌中制备突变菌丝体层孔菌J21(Phellinus sp.J21)的方法、在人工液体营养培养基上培养该突变菌丝体层孔菌J21的方法、从培养的层孔菌J21中分离并纯化醇脱氢酶的方法和克隆所述醇脱氢酶基因的方法，本发明还关于使用所述突变株菌丝体制备的功能酒精饮料和制备所述酒精饮料的方法。
文档编号C12P7/06GK1955277SQ200610072148
公开日2007年5月2日 申请日期2006年4月14日 优先权日2005年10月28日
发明者郑永基, 金星烈, 林学燮, 李康宁, 郑恩赪 申请人:株式会社千年约束