专利名称：乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白基因在苜蓿中的诱导性表达的制作方法
技术领域：
本发明涉及乙型肝炎病毒包膜小蛋白及中蛋白基因在转基因苜蓿中同时进行诱导性表达的方法及其应用。上述两个抗原蛋白基因被分别置于苜蓿亚硝酸还原酶基因启动子操控之下，在正常生长条件下，这两个外源蛋白基因处于沉默状态，无任何目标蛋自产生。但在硝酸盐的诱导下，亚硝酸还原酶基因启动子被激活，并随后调控乙肝病毒包膜小蛋白和中蛋白基因在苜蓿体内同时进行高效表达和积累。人或其他哺乳动物通过直接食用含有这两种重组抗原蛋白的转基因苜蓿、或通过肠道给药的方式利用自这些转基因苜蓿中部分或完全纯化出乙型肝炎病毒膜小蛋白及中蛋白作为胶囊、冲剂或其它制剂的主要活性成分从而可能引起人或其他哺乳动物对乙肝病毒包膜抗原蛋白的免疫应答反应。
乙型肝炎(HBV)是一种广泛传播、世界性分布的传染性疾病，根据世界卫生组织1996年的报告，1995年全世界死于乙型肝炎的人数约有110万，居各种传染病死亡人数的第四位，而且近年来有逐渐增加的趋势。中国也是乙型肝炎的高发区，约50-70％的人群受过HBV的感染，全国目前至少有1.2亿人为乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)携带者，其中显现临床症状的病人约有3千万人。
乙型肝炎病毒的感染，不仅可以引起急、慢性病毒性肝炎，而且还与肝硬化和肝细胞癌的发生、发展有密切关系。乙肝病毒的顽固性和多途径的易传性，使乙肝成为一个严重的公共卫生问题。迄今为止，由于仍缺乏根治乙型肝炎的特效药，因此，在日常生活中，如何保护健康人群，预防乙型肝炎的发生就成为人们要考虑的主要问题之一。
预防乙型肝炎的发生现在可以选择注射疫苗，目前广泛使用的乙肝疫苗为基因重组多肽疫苗。1986年，世界上第一个基因工程疫苗-酵母菌表达的重组乙肝疫苗(表达乙肝病毒包膜小蛋白，又称S蛋白)在美国被批准使用，中国也在上个世纪九十年代初期研制成功了具有世界先进水平的基因工程重组乙肝疫苗。但这类疫苗仍需多次接种，价格较高，且一些人群(约占15％)在接种后不能够产生免疫应答反应。
对乙型肝炎病毒粒体结构与组成的研究表明，其最外层的包膜中含有三种蛋白，依据分子量的大小，分别称之为主要蛋白(S蛋白)、中蛋白(M)和大蛋白(L)(1)，而它们在人体内均能够产生中和抗体。
主要蛋白也称为包膜小蛋白，由226个氨基酸残基组成，为S基因所编码，是病毒包膜及亚单位颗粒(HBsAg)的主要成分，因其分子量最小，因此又被称为小蛋白。小蛋白是一种疏水性蛋白，包括糖基化的GP27和非糖基化的P24两种形式，分子量分别为27kD和24kD而得名。在GP27的N末端146位的天门冬酰胺上连接着一种复杂的糖基，在122位赖氨酸残基处有胰酶切割位点。S蛋白有三个疏水区段，分别位于7-23、80-98和169-226，被二个亲水区段分开。疏水区段的氨基酸比较保守，氨基酸的变异主要发生在亲水区段。
人们常提到的乙肝表面抗原HBsAg实际上是一种构象性抗原，两个小蛋白分子通过二硫键连在一起，构成的二聚体代表着最小的HBsAg结构单位并具有完整的HBsAg活性。
中蛋白含有281个氨基酸残基，由前S2和S基因共同编码，它可以看作是在小蛋白的N端又另外增加了一个含55个氨基酸残基的S2蛋白区段，因分子量居中，故被称为中蛋白。中蛋白有一种非糖基化形式P31，两种糖基化形式GP33和GP36。GP33含有一个配糖体，GP36有两个配糖体，这两个糖基位于S蛋白的146位和前S2区段。由前S2基因编码的55个氨基酸通常是亲水性的，富含不依赖二硫键的连续抗原决定簇，具有比小蛋白更强的免疫原性，但易被胃蛋白酶消化而丧失其活性。此外，前S2蛋白还含有一个多聚人血清白蛋白受体(PHSA-R)，能特异性地与人和黑猩猩血清中的多聚白蛋白(PHSA)结合，肝细胞本身也有该受体，多聚人血清白蛋白介导HBV附着肝细胞，这就是HBV易感染肝细胞的一个重要原因，也是决定HBV嗜肝特点的重要结构基础。
大蛋白含有389-400个氨基酸残基，由前S1、前S2和S基因三部分共同编码，其分子量在三种包膜蛋白中分子量最大，故又被称为大蛋白。大蛋白也有两种不同的形式，糖基化的GP42和非糖基化的P39，分子量分别为42kD和39kD。根据亚型的不同在长度上有所变化，ay亚型和ad亚型的变化范围在389-400个氨基酸之间，在GP42有一个与N末端相连的糖基，由前S1区编码的N末端位于包膜蛋白的表面。
一个完整的病毒粒体(包括病毒核酸、蛋白和包膜，直径为42nm，又称丁氏颗粒)，含有300-400个小蛋白(S蛋白)分子，40-80个中蛋白和大蛋白分子，管状颗粒(不含有病毒核酸)的蛋白质组成与完整病毒粒体相同，而直径为22nm球形颗粒(也不含有病毒核酸)的蛋白质成份则完全不同在有病毒复制的慢性携带者血清里，S蛋白和中蛋白的含量与在HBV颗粒中的含量大约有同样的比例(10∶1)，但大蛋白少于1/20；而在病毒的非复制期，则22nm的球形颗粒所含有的几乎全是S蛋白，中蛋白少于1％，无大蛋白。
对前S2蛋白的免疫原性的研究，提供了一些制备高效乙肝疫苗的依据，目前世界上大多数血源疫苗的纯化都经胃蛋白酶处理，因而将许多前S2蛋白的免疫原性破坏掉了，因此，有必要在未来的、新的乙肝疫苗中，添加适量的包膜中蛋白或前S2蛋白的成份，以提高其免疫原性。特别是对S蛋白免疫应答差的机体，在接种前S2蛋白以后，也有希望获得中和抗体，这已在动物实验中得到了很好的证实。
现在人们已经清楚地认识到，普遍接种乙肝疫苗是控制乙型肝炎大规模发生唯一和有效的方法。在一些发达国家中，已对乙肝病毒感染高危人群进行接种。例如，在加拿大和美国，普遍接种的对象是婴幼儿和青少年，采用这种免疫方式使乙肝病毒感染的新病例减少90％以上，因此，如何使乙肝疫苗更加安全、经济、有效和更容易推广使用将是今后各国研究的主要方向。
大量的实验研究表明，人或其它哺乳类动物在受到病原感染后会产生免疫应答反应以抵御这种病原的入侵。该过程至少要涉及到以下三种免疫机制之一粘膜、体液或细胞。粘膜免疫应答产生分泌型抗体IgA，可保护呼吸道、消化道、生殖系统和腺体表面不受侵染。粘膜抗体可阻止病原在粘膜表面定居从而构成机体的第一道防御屏障。粘膜抗体的产生可通过分泌性腺体和组织的局部免疫而获得，也可通过刺激肠道和呼吸道淋巴组织产生。体液免疫主要涉及IgG和IgM，它们在血液中参与侵入病原的吞噬、病毒中和或有补体介导的细胞毒性。
研究人员已经注意到口服接种可诱导血液和粘膜抗体的产生，通常的情况是口服接种需要比较多的抗原，这是因为抗原被机体实际吸附和利用的数量比较低。因此，口服接种所需要的抗原数量远远超过注射接种(2)。然而，也有例外，人们发现一些蛋白只需口服少量就能产生体液和粘膜免疫应答，原因是这些蛋白常常能够与粘膜细胞膜表面的糖脂或糖蛋白受体进行特异性结合，因此，这些蛋白也被称为粘膜性抗原，例如病毒性血凝素。口服和肌肉注射剂量比较实验表明，粘膜类抗原也能够非常有效地引起体液免疫，与肌肉注射相比，二者之间只有轻微的差别。并不是所有的蛋白都具有这种能力，现仅发现少数病毒和细菌含有这种抗原。
乙型肝炎病毒包膜小蛋白及中蛋白可能也属于粘膜性抗原，因此，它们在经过口服接种或以肠道给药的方式进入人体和其他哺乳动物后也能够刺激机体产生相应的免疫应答反应并进而产生中和抗体。
基因工程研究领域的最新进展使植物表达外源基因成为可能。含有外源基因的植物细胞可再生成完整的植株，并将外源基因稳定地遗传给后代。迄今有些单子叶和双子叶植物都已经进行了成功的遗传转化。例如烟草、马铃薯、番茄、大豆、玉米、水稻、小麦和苜蓿等。
农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的双子叶植物转化已有众多报道。农杆菌介导的叶盘转化法可有效地进行外源基因的转移、选择和再生。
单子叶植物经农杆菌介导转化比较困难，但也可以利用其它的转化方法如PEG和电融合法。有人成功地将外源基因导入玉米、水稻和小麦的原生质体中。然后从转化的原生质体再生出完整的植株。一些新的转化方法如微管注射法和基因枪法在单子叶植物和农杆菌难以侵染的双子叶植物转化和再生中可能更加有效。
特别值得提出的是，在迄今为止所有已转化的植物中，苜蓿可能是生产药用蛋白(尤其是口服疫苗)最好的宿主之一，原因是1)苜蓿是一种多年生的豆科植物，即使在北方寒冷地区，也能够安全越冬，因此，每年不需要为留种和再次播种问题担忧，田间维护管理的成本很低；2)苜蓿地上绿色部分(营养体)的蛋白质含量很高，一般可达到植物干重的10％(每克鲜重的苜蓿地上部分约含有30mg的总蛋白)，因此，外源蛋白在转基因苜蓿中有可能得到比较高的生物产量；3)苜蓿可以通过扦插的办法大量进行繁殖，一旦获得一个高表达的转基因植株，则勿需等待外源基因纯合，可通过扦插的方法进行大规模的扩繁。当然，选择苜蓿作为宿主表达外源蛋白也有缺点，那就是苜蓿的遗传转化工作是非常困难的(豆科植物的遗传转化通常都非常困难)，因为它们的细胞分化和再生属于严重基因依赖型的。
已有人尝试在马铃薯、烟草和番茄等植物中表达乙型肝炎病毒包膜小蛋白(S)基因，发现在上述植物中所产生的HBsAg抗原蛋白与源自人血液或基因工程酵母中的HBsAg蛋白具有相似的抗原特性和物理特性，并进而提出了“食物疫苗”的概念，为此，还申请了相关专利(3)。然而，在本发明之前，还没有人利用转基因苜蓿表达过乙型肝炎病毒包膜小蛋白或中蛋白基因，更没有人尝试在苜蓿中同时表达这两种抗原蛋白基因。
本发明的目的之一是要在转基因苜蓿体内同时表达乙型肝炎病毒包膜小蛋白和中蛋白基因，以这种方式生产出的植物食用疫苗，因同时含有两种抗原蛋白，其免疫原性比仅表达其中的任何一种抗原蛋白时可能会更强。此外，如前文所述，因为中蛋白分子中含有前S2蛋白区段及多聚人血清白蛋白受体，因而有比较强的免疫原性。那些对S蛋白免疫应答差的人群，在接受含前S2蛋白的植物食用疫苗接种以后，也有希望产生专门针对乙型肝炎病毒的中和抗体，从而也能够获得乙肝疫苗有效的保护。
本发明的目的之二是采用诱导型的启动子，以便在转基因苜蓿体内对乙型肝炎病毒包膜小蛋白和中蛋白基因同时进行诱导性表达。进行诱导表达的必要性在于1)上述两种抗原蛋白基因对苜蓿而言，属于外源性的，它们的高效表达及累积将会对苜蓿的生长产生不利的影响；2)如采用组成型的启动子，如花椰菜花叶病毒35S启动子，上述两种抗原蛋白将在苜蓿的各个发育时期及各个器官和组织内都会大量积累，当该转基因苜蓿在田间进行大规模种植时，一旦散播出去，将会对生态环境及人类带来潜在的危险，尽管目前我们已经知道人类和其他哺乳类动物食用上述两种抗原蛋白是安全的。而采用诱导性表达就可以避免上述现象的产生，因为在正常的生长条件下，诱导性启动子处于沉默状态，它并不会操控外源基因的表达，也就是说在诱导因子缺乏的情况下，在转基因苜蓿体内是检测不到乙肝病毒包膜小蛋白和中蛋白重组抗原的。
在本发明之前，尽管已有人提出“食物疫苗”的概念，但在具体操作中存在着很大的困难，原因在于植物中表达的抗原蛋白含量不确定，且植物不同个体或同一植物个体的不同器官之间存在很大差异，若人或动物直接食用这种转基因植物就会产生很大风险，例如，长时间食用含少量抗原蛋白的植物材料会引起免疫耐受性，而短时间食用过多的抗原又会引起超敏反应。本发明首次提出将含有乙型肝炎病毒包膜小蛋白及中蛋白抗原的转基因苜蓿加工成胶囊、冲剂或其它制剂的方法，由于可对各种制剂中所含的抗原蛋白进行严格的定量，从而使人或其他哺乳动物的食用间隔和食用量有了可以参考的依据，由此克服了直接食用转基因植物所潜在的一些缺点。
本发明提供乙型肝炎病毒包膜小蛋白及中蛋白基因如何在转基因苜蓿中同时进行诱导性表达的方法以及如何应用含上述两种重组抗原蛋白转基因苜蓿的方法。本项发明特别适用于中国或其它发展中国家。
本发明利用可以食用的转基因苜蓿生产乙型肝炎病毒包膜小蛋白及中蛋白抗原，这两个重组抗原蛋白在免疫原性方面与天然蛋白类似。按照一个优先的实施方案，就是本发明提供了乙型肝炎病毒包膜小蛋白及中蛋白基因在转基因苜蓿中同时进行诱导性表达的方法以及如何具体应用这种含乙肝抗原蛋白转基因苜蓿的方法。
本发明克服了以前其他一些转基因植物组成型表达乙型肝炎病毒抗原蛋白所存在的一些缺点，转基因苜蓿在经过诱导后才能够表达目标外源蛋白基因，这样就可以最大限度地减少乙肝病毒抗原蛋白转基因苜蓿对人和生态环境所带来的潜在的危险。
本发明利用转基因苜蓿诱导性生产乙型肝炎病毒包膜小蛋白及中蛋白重组抗原，如果将其加工成口服胶囊、冲剂或其它制剂，则具有廉价、安全和使用方便的特点，会使更多的人或其他哺乳动物得到保护。按照一个优先的实施方案，人或其他哺乳动物只需食用这种转基因苜蓿的叶、根和茎，或以肠道给药的方式利用该转基因苜蓿、或者是转基因苜蓿粗提取物或完全纯化物所制备的胶囊、冲剂或其它制剂便可获得对乙型肝炎病毒的免疫能力。
按照一个实施方案，本发明涉及利用转基因苜蓿生产含乙肝病毒包膜重组抗原蛋白胶囊、冲剂或其它制剂的方法。生产这种胶囊、冲剂或其它制剂的转基因苜蓿材料可以有多种方式，可以是完整的植株，或者是苜蓿的一部分如叶子、茎和根，或者是苜蓿某一部分的粗提物、或者是虽源自转基因苜蓿但已经过部分纯化或完全纯化的乙肝病毒包膜重组抗原蛋白。总之，采用何种方式主要取决于产生粘膜免疫应答反应所需这两种源自转基因苜蓿的乙肝病毒抗原蛋白的剂量以及在制剂中所含的干扰免疫应答反应的物质的多少，如糖类、热原和毒素等，并尽量降低免疫耐受性的产生。
本发明所指的乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白抗原是指在转基因苜蓿中经过诱导表达后才生产的，首先是编码上述两种抗原蛋白的基因被分离出来，然后同时插入到一个含有选择标记的质粒载体上，在每个基因的上游分别插入一个诱导型的启动子，它操纵该基因在苜蓿中的表达。在经过诱导后，上述两种抗原蛋白基因在苜蓿的各器官中表达，人或其他哺乳动物可食用这部分组织。诱导物可以是温度、光照、金属离子、化合物及其他物理和化学因子，按照一个优先的实施方案，所使用的诱导型启动子是亚硝酸盐还原酶基因启动子(NIR)，该启动子可在硝酸盐的诱导下被激活，从而开始调控乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白基因在苜蓿中的表达。
本发明提供了在苜蓿细胞中诱导表达和生产乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白重组抗原的方法，而这两种蛋白已知在天然状态下可引起人或哺乳动物产生免疫应答反应。或者说，本发明所指的乙肝病毒重组包膜小蛋白及中蛋白可作为抗原，具有与源自哺乳动物血液和其它常规表达系统如酵母和细菌产生的该抗原蛋白一样的免疫原性。或者更确切说，本发明的重组抗原蛋白与源自哺乳动物血液和其它常规表达系统产生的该抗原蛋白一样，均能够通过口服和肠道给药的方式引起免疫应答反应。按照一个优先的实施方案，乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白属于粘膜性抗原，它可以在苜蓿中经诱导表达而产生，且具有与源自哺乳动物或其它常规表达系统所产生的该类抗原蛋白相似的免疫原性。
本发明的乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白抗原可以是乙肝病毒天然抗原蛋白的全部。然而，在某些具体实施方案中，抗原也可能只是该天然蛋白分子的一部分。有时，上述抗原蛋白可与另外一个多肽或蛋白分子如细菌病原蛋白多肽结合在一起形成融合蛋白。蛋白的融合可以通过蛋白翻译后加工、共价结合的方式，或者通过DNA重组技术使基因在翻译前就连接在一起。这两种技术是本领域专家早已熟知的技术。
按照一个优先的实施方案，本发明涉及到了一种食物的组成问题，该食物中至少含有转基因苜蓿的某些食用部分，如叶、茎和根部等，这里所指的转基因苜蓿应能够诱导表达和生产乙型肝炎病毒包膜小蛋白及中蛋白重组抗原，已知这些抗原蛋白能够引起人和其他哺乳类动物免疫应答反应，特别是粘膜免疫应答反应，就如同天然蛋白或其它表达系统产生的该类抗原蛋白一样。
按照一个优先的实施方案，本发明涉及到了一种胶囊、冲剂或其它制剂的组成成份问题，胶囊、冲剂或其它制剂中至少含有转基因苜蓿的某些食用部分，如叶、茎和根部等，这里所指的转基因苜蓿应能够诱导表达和生产乙型肝炎病毒包膜小蛋白及中蛋白重组抗原。就本发明而言，胶囊、冲剂或其它制剂中含有的乙型肝炎病毒包膜小蛋白及中蛋白抗原应该能够精确定量，以避免人或其他哺乳类动物食用后产生免疫耐受性。
对本发明所使用的方法和其它相关事项极为重要的是一些质粒载体的构建，它们在获得本发明所指的转基因苜蓿以及转基因苜蓿的加工应用中起重要作用。用于转化苜蓿的质粒载体由编码乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白基因或其衍生物的DNA序列和分别操纵这些DNA序列在苜蓿中进行诱导性表达的植物诱导型启动子组成。在某些具体实施方案中，质粒载体还包括一个选择或标记基因，主要用于转基因苜蓿的检测。在某些具体实施方案中，本发明的植物诱导型启动子是苜蓿亚硝酸盐还原酶基因启动子。正如上面所述，按照某些具体的实施方案，本发明的质粒载体将用于转化苜蓿，它编码的抗原是乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白，更进一步说，质粒载体所编码的抗原能够诱导人和其他哺乳类动物产生免疫应答反应，特别是粘膜性免疫应答反应，就象天然蛋白和源自其它表达系统所产生的该抗原蛋白一样，而植物诱导型启动子主要是操纵这两种抗原蛋白基因在苜蓿中进行诱导表达和生产。在一个类似的实施方案中，本发明提供的DNA片段可通过其他的遗传转化方法例如基因枪法转化苜蓿。
本发明也提供了获得转基因苜蓿细胞的方法，它包括以下步骤1)构建一个质粒载体或者一段DNA序列，其中都含有编码乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白重组抗原的基因，而且这些基因被分别置于一个植物诱导型启动子的操纵之下；2)用质粒载体或上述DNA片段转化苜蓿细胞。按照一个优先的实施方案，还包括从转化的苜蓿细胞再生出完整的转基因苜蓿植株的方法。
本发明提供了各种苜蓿细胞或苜蓿植株的转化方法。尽管在下面描述的某些优先实施方案中仅利用了特定的转化方法，但显而易见的是，本领域专家所早已熟知的其它植物转化方法也应包括在本发明的权利要求范围之内，这些方法包括微管注射、PEG融合和电融合等。按照某些优先实施方案，使用的是农杆菌介导的转化方法，特别指Ti质粒参与的农杆菌转化系统。在其它一些优先实施方案中，还可以使用基因枪法转化苜蓿细胞或苜蓿植株。
就象下面实例中所要详细描述的那样，本发明苜蓿细胞或苜蓿转化方法中所用的质粒载体是一个双元载体系统。按照一个实施方案，本发明使用的质粒是一个整合性载体。按照一个更加优先的实施方案，本发明所使用的质粒是pBI121。
本发明提供了诱导表达乙型肝炎病毒包膜小蛋白及中蛋白或其衍生物转基因苜蓿的构建方法，这种转基因苜蓿作为食物或加工成胶囊、冲剂或其它制剂后被人们食用有可能引起人或其他哺乳动物的免疫应答。这种免疫应答的结果使人或其他哺乳动物对乙肝病毒的感染具有抵抗能力。这种免疫应答是由于在转基因苜蓿中表达乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白重组抗原后而产生的结果，而乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白抗原的产生则是由于这些抗原蛋白基因整合入苜蓿的基因组中并在诱导型启动子调控下能够进行诱导性表达及生产的结果。
有许多种方法可以将外源基因导入苜蓿。将外源基因稳定整合入苜蓿染色体基因组DNA的主要方法包括1)农杆菌介导法；2)DNA直接摄入法，包括PEG介导的原生质融合法、电激法、微管注射法以及使用基因枪将DNA直接送入植物细胞和组织等。
农杆菌介导法是利用质粒载体将特定的DNA片段整合入苜蓿染色体基因组DNA。苜蓿的转化方法因苜蓿外植体的不同及所使用的农杆菌系统而异。最常用的方法是叶盘法，它适用于任何易于再生成完整植株的苜蓿外植体。
正如上面已提到的各种DNA直接摄入转化方法，电激法是先将苜蓿原生质体置于放在一个强电场中，在电流作用下将外源DNA送入原生质体内。微管注射法是用微管将DNA直接注射入细胞中。基因枪法是将DNA先吸附在硫酸镁或钨粒上，这些颗粒被加速射入苜蓿细胞或组织中。
按照本发明的一个优先实施方案，农杆菌Ti质粒系统被选用。农杆菌的Ti质粒中含有一段叫做转移DNA(T-DNA)的，它可以进入苜蓿细胞中并整合入苜蓿的染色体中。转移载体的构建分为两步，首先是构建一个可以在大肠杆菌中复制的质粒，这个质粒含有乙型肝炎病毒包膜小蛋白及中蛋白抗原基因或其衍生物；抗原基因的两端含有T-DNA边界序列，它负责目的基因在苜蓿基因组中的插入位点。通常另外一个选择标志基因(如抗卡那霉素抗性基因)也被包含在T-DNA的左右边界序列中，该基因在苜蓿细胞中表达后可提供一个选择标记证实苜蓿或苜蓿细胞是否含有整合的T-DNA序列。载体构建的第二步是将质粒从大肠杆菌转移到农杆菌中。这可以通过三亲交配的方式或DNA直接导入方式完成。为了T-DNA的转移，所用的农杆菌菌株中还要含有一套诱导基因，它们在T-DNA转移到苜蓿细胞中起重要作用。
熟悉植物遗传转化的人应该知道转化用的农杆菌菌株可以有多种选择，质粒构建也有多种方式，其目的都是为了更有利于苜蓿的遗传转化。同样，人们也应该知道除了根癌农杆菌外，在有些情况下，还有其它农杆菌如发根型农杆菌可供使用。
苜蓿的转化方法因苜蓿的外植体不同和农杆菌介导系统而异。最常用的是植物叶盘转化法，它适于多种易于再生的苜蓿外植体。在某些情况下，还需要加入一些辅助细胞。其他的转化方法包括原生质体转化，继而由原生质体再生出完整苜蓿细胞及完整植株。
本发明不仅仅限于使用农杆菌Ti质粒转化系统，还应包括使用其它物理性的手段将目标外源蛋白基因直接导入苜蓿细胞或原生质体的方法。
在苜蓿外植体和转化方法确定之后，一个诱导型表达的植物启动子被选择以便乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白基因能够在苜蓿中进行诱导性表达。
所有已知能操纵外源基因在苜蓿细胞中进行诱导性转录的启动子都可以在应用在本发明中。这些启动子可从植物或病毒中获得，如苜蓿亚硝酸还原酶基因的启动子(包括经过拼接、加倍和突变改造后的NIR启动子)；光诱导基因启动子如核糖二磷酸羧化酶小亚基(rbcS)启动子或逆境诱导基因启动子如乙醇脱氢酶(Adh1)启动子等，但不仅限于此。
用于苜蓿转化的质粒通常含有一个选择标志基因。许多有此功能的基因已被开发出来。
本发明提供了一种转基因食物的生产方法。它包括以下步骤1)构建一个质粒载体或者一段DNA序列，其中都含有编码乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白重组抗原的基因或其衍生物，而且这些基因被分别置于一个植物诱导型启动子操纵之下；2)用质粒载体或上述DNA片段转化苜蓿细胞；3)从转基因苜蓿细胞中再生出完整的转基因苜蓿植株；4)收获转基因苜蓿的可食用部分；5)食用一定量的这种转基因苜蓿，尽量避免产生免疫耐受性，以达到预防疾病的效果。
本发明也提供了含确定剂量乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白重组抗原蛋白胶囊、冲剂或其它制剂的生产方法，它包括以下步骤1)构建一个质粒载体或者一段DNA序列，其中都含有编码乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白抗原的基因或其衍生物，而且这些基因被分别置于一个植物诱导型启动子操纵之下；2)用质粒载体或上述DNA片段转化苜蓿细胞；3)从转基因苜蓿细胞中再生出完整的转基因苜蓿植株；4)自转基因苜蓿细胞或完整植株中部分纯化或完全纯化出乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白重组抗原，然后加工成胶囊、冲剂或其它制剂。按照一个优先的实施方案，含有乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白重组抗原的完整转基因苜蓿食用部分可直接进行冷冻干燥和粉碎，然后加工成胶囊、冲剂或其它制剂，并确定其中含有的乙肝病毒重组抗原蛋白剂量。
为了详细描述本发明的某些优先实施方案，并以相应的绘图作参考
图1A乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白基因的克隆。
图1B乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白的结构和组成。
图2质粒pSML的构建过程，它含有乙型肝炎病毒包膜小蛋白和中蛋白抗原基因及苜蓿亚硝酸还原酶基因启动子。其中GUS＝代表β-Glucuronidase(葡糖醛酸酶)基因；S代表乙肝病毒包膜小蛋白基因；M代表乙肝病毒包膜中蛋白基因；NIR代表苜蓿亚硝酸还原酶基因启动子。
图3质粒pSML所含的3个结构基因及其调控表达序列。其中Nos-Pro代表胭脂碱合成酶启动子；NPT-II＝新霉素磷酸转移酶基因；Nos-Ter代表胭脂碱合成酶终止子；NIR代表苜蓿亚硝酸盐还原酶基因启动子；RB代表T-DNA右边界序列；LB代表T-DNA左边界序列。
图4PCR检测乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白基因在不同苜蓿中的整合情况。其中1为标准分子量1kb DNA Ladder；2为包膜中蛋白阳性对照扩增产物；3为包膜小蛋白阳性对照扩增产物；4-5为阴性对照植物扩增结果；6-8为部分转基因苜蓿中蛋白基因扩增产物；9-11相同转基因苜蓿小蛋白基因扩增产物。
图5转基因苜蓿在诱导前后的乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白重组抗原酶联检测结果。1为非转基因苜蓿；2-3为转基因苜蓿。
图6乙肝病毒重组抗原蛋白(S&M)在苜蓿植物汁液中的稳定性测定。其中含抗原蛋白的苜蓿茎叶(0.1g)在400ul磷酸缓冲液中磨碎后，室温下(15-20℃)放置1-7天后，取100ul上清液酶联反应后测定OD405nm光吸收值。
图7乙肝病毒重组抗原蛋白在高温下的稳定性测定。其中含抗原蛋白的苜蓿茎叶(0.1g)在400ul磷酸缓冲液中磨碎后，不同温度下放置2小时后，取100ul上清液酶联反应后测定OD405nm光吸收值。
图8经亲和层析纯化出的苜蓿乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白的PAGE分析。
其中1为标准蛋白分子量(Pharmacia)；2为源自人血浆的乙肝病毒表面抗原(S蛋白，Chemicon公司)；3为非转基因苜蓿茎叶的总蛋白提取物；4为转基因苜蓿茎叶的总蛋白提取物；5为从转基因苜蓿茎叶中纯化出的乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白重组抗原。
本发明包括以下几个组成部分1)乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白基因的克隆。根据已公布的编码乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白的DNA核苷酸序列，合成了两对引物。乙肝患者的血清(adr亚型)经酚和氯仿处理可抽提出含乙型肝炎病毒核酸的总DNA，以此为模板，利用上述的两对引物，经多聚酶链式反应(PCR)扩增可分别获得大小与期望值相符的两个DNA片段，这两个PCR扩增产物被分别定向插入到pGEM-T质粒中的T位点内(见Promega公司产品说明书)，经蓝白系统选择，可获得含有外源插入片段的细菌克隆(重组子)，序列分析所获基因的正确性和完整性；2)苜蓿亚硝酸还原酶基因启动子的克隆。根据已知的核苷酸序列，合成一对引物。利用CTAB法自苜蓿茎叶中提取出其总DNA，并以此为模板，经PCR扩增可获得大小与期望值相符的一个DNA片段，该PCR产物被定向插入到pGEM-T质粒中的T位点内(见Promega公司产品说明书)，经蓝白系统选择，可获得含有外源插入片段的细菌克隆(重组子)，序列分析所获基因的正确性和完整性；3)利用DNA重组技木构建质粒表达载体，它同时含有乙型肝炎病毒包膜小蛋白及中蛋白基因或其衍生物，这些抗原蛋白基因在诱导型启动子的操纵下能够分别在苜蓿体内进行诱导性表达；4)在农杆菌的介导下、或采用其他适宜的转化方法，选择适宜的苜蓿外植体进行遗传转化，使编码上述乙肝病毒抗原蛋白的双基因都能稳定地整合入苜蓿染色体中并可稳定地遗传给后代；5)从转化的苜蓿细胞中再生出完整的转基因植株，而且该工程植株在诱导物的作用下，能够稳定和高效地表达及生产乙型肝炎病毒包膜小蛋白中蛋白重组抗原；6)人或其他哺乳动物直接食用这种转基因苜蓿或以肠道给药的方式口服以该转基因为主要活性成份加工而成的胶囊、冲剂或其它制剂后，有可能预防乙型肝炎病毒的侵染。
下面以苜蓿亚硝酸还原酶基因启动子调控乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白在转基因苜蓿中的诱导性表达为例，描述一个优先的实施方案，但本发明的应用不仅限于此。
实施例11.乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白基因的克隆根据已公布的乙肝病毒基因组DNA核苷酸序列(4)，合成了一对特定的引物以便用于扩增乙肝病毒包膜小蛋白基因，其中上游引物(5’端引物)为5’-AACCCGGGAACAATGGAGAACACAGCATCAGGATTCC-3’，下游引物(3’端引物)为5’-AAGAGCTCTCAAATGTATACCCAAAGACAAAAG-3’。乙肝患者的血清(adr亚型)购自北京大学医学部微生物教研室，经用等体积酚和氯仿处理以后，可从中抽提出含乙型肝炎病毒核酸的总DNA，以此作为模版，利用上述引物并经多聚酶链式反应(PCR)扩增，可获得一个大小约为700bp的DNA片段。该DNA片段被直接插入到pGEM-T质粒中的T位点内(见Promega公司产品说明书)，按照该公司提供的方法，通过蓝白系统筛选，得到含有乙肝病毒包膜小蛋白基因的细菌克隆pGEMS(见图1)，然后，通过核苷酸序列分析，确定乙肝病毒包膜小蛋白编码序列是正确和完整的(测序工作由上海生工生物工程公司完成)(见序列表中的1)。
为扩增乙肝病毒包膜中蛋白基因，又合成了另外一个上游引物(5’端引物)，其序列为5’-AACCCGGGAACAATGGCGTGGAACTCCACAACATTCCACC-3’，而下游引物(3’端引物)与扩增乙肝病毒包膜小蛋白所使用的引物完全相同。同样以乙肝病毒基因组DNA为模板，利用上述引物并经多聚酶链式反应(PCR)扩增，可获得一个大小约为850bp的DNA片段。该DNA片段被直接插入到pGEM-T质粒中的T位点内(见Promega公司产品说明书)，按照该公司提供的方法，通过蓝白系统筛选，得到含有乙肝病毒包膜中蛋白基因的细菌克隆pGEMM(见图1)，然后，通过核苷酸序列分析，确定乙肝病毒包膜中蛋白编码序列是正确和完整的(测序工作由上海生工生物工程公司完成)(见序列表中的3)。
2.苜蓿亚硝酸还原酶基因启动子(NIR)的克隆根据已公布的苜蓿亚硝酸还原酶基因启动子DNA核苷酸序列(5)，合成了一对特定的引物以便用于扩增该启动子，其中上游引物(5’端引物)为5’-AAAGCTTCCGGGCTGGTCTGTACATTCATCTTGCCGCC-3’，下游引物(3’端引物)为5’-ACCCGGGTTTTGGAGAAGAGAGTGTGTTTGGAATGAG-3’。苜蓿基因组DNA的提取方法基本依据Chee的方法(6)。取0.3g苜蓿(苜蓿品种为保定苜蓿，购自中国农业科学院畜牧研究所)新鲜叶片，放入研钵中用液氮研磨，磨碎后的粉末移置10ml离心管中，然后加入0.9ml CTAB提取液(100mM Tris-HCl，pH7.5含5M NaCl，10mM EDTA，10ml/L β-巯基乙醇，10g/L CTAB)，剧烈振荡1分钟，使之充分混匀。在60℃水浴中温浴90分钟，期间每30分钟振荡一次。从水浴中取出离心管，室温下放置4-5分钟，使之冷却，然后加入0.45ml氯仿，轻轻摇动，使之充分混匀。室温下5000g离心10分钟。收集上清液于另一10ml离心管中，加入0.45ml氯仿，重复上述步骤。收集上清液，加入1ml冰冷的异丙醇，轻摇10-15分钟，5000g离心5分钟，收集沉淀，用1ml 76％乙醇含0.2MNaOAc和1ml 76％乙醇含10mM NH4OAc各洗沉淀一次，最后加入TE(pH8.0)缓冲液溶解DNA，将DNA浓度调至1ug/ul。取上述苜蓿基因组DNA作为模版，利用上述合成的特异性引物经多聚酶链式反应(PCR)扩增，可获得一个大小约为3kb的DNA片段。该DNA片段被直接插入到pGEM-T质粒中的T位点内(见Promega公司产品说明书)，按照该公司提供的方法，通过蓝白系统筛选，得到含有苜蓿亚硝酸还原酶基因启动子核苷酸序列的细菌克隆pGEMNIR，通过核苷酸序列分析，确定苜蓿亚硝酸还原酶基因启动子核苷酸序列是正确和完整的(测序工作由上海生工生物工程公司完成)(见序列表中的5)。
3.植物表达载体pSML质粒的构建质粒pGEMS中含有乙肝病毒包膜小蛋白基因，在合成引物时，因为在5’端和3’端引物中分别引入了SmaI和SacI位点，所以用限制性内切酶SmaI和SacI双酶切质粒pGEMS便可将包膜小蛋白基因切下来，通过琼脂糖凝胶电泳可分离获得该DNA片段，随后将其定向插入到质粒pBI121中的原GUS基因位点上(SmaI和SacI双酶切)便构建成中间质粒载体pS(见图2)。
质粒pGEMM中含有乙肝病毒包膜中蛋白基因，在合成引物时，因为在5’端和3’端引物中分别引入了SmaI和SacI位点，所以用限制性内切酶SmaI和SacI双酶切质粒pGEMM同样可将包膜中蛋白基因切下来，通过琼脂糖凝胶电泳可分离获得该DNA片段。随后将其定向插入到质粒pBI121中的原GUS基因位点上(SmaI和SacI双酶切)便构建成中间质粒载体pM(见图2)。
质粒pGEMNIR中含有苜蓿亚硝酸还原酶基因启动子核苷酸序列，在合成引物时，因为在5’端和3’端引物中分别引入了HindIII和SmaI位点，用限制性内切酶HindIII和SmaI双酶切质粒pGEMNIR便可将该启动子序列切下来，通过琼脂糖凝胶电泳可分离获得该DNA片段，随后将其分别定向插入到中间质粒载体pS和pM中的原35S启动子位点上(HindIII和SmaI双酶切)便又构建成两个新的中间质粒载体pSN和pMN(见图2)。
质粒pSN DNA先用限制性内切酶EcoRI酶切，然后用Klenow酶将粘性末端补平，在T4 DNA连接酶的作用下，再与磷酸化的HindIII接头(购自大连宝生物工程有限公司，货号为D4860P)相连，最后，用限制性内切酶HindIII单酶切并通过琼脂糖凝胶电泳可分离获得携带苜蓿亚硝酸还原酶基因启动子-乙肝病毒包膜小蛋白基因-Nos终止子序列的DNA片段，随后将其插入到质粒pMN的HindIII位点内，便构建成植物表达载体pSML(见图2)。
质粒pBI121购自美国Clonetech公司，它的SmaI限制性酶切位点位于花椰菜花叶病毒35S启动子和GUS基因起始密码之间，SacI限制性酶切位点位于GUS基因终止序列和NOS终止子之间。选用质粒pBI121是因为用SmaI和SacI双酶切可将GUS基因删除，而随后可插入另外一个蛋白基因。用HindIII和SmaI双酶切可将原35S启动子删除，而随后可插入一个新的植物诱导型启动子。新基因将能够在植物细胞内进行诱导性表达。质粒pBI121还含有新霉素磷酸转移酶II基因(NPT II)，它编码的酶可为植物细胞提供卡那霉素抗性，从而可将含有T-DNA的细胞和组织筛选出来。NPT II基因有自己的启动子和多聚腺酸信号序列，它们源自胭脂碱(Nopaline)合成酶(NOS)基因。
植物表达载体pSML含有1)新霉素合成酶基因II(NPT II)，它提供给植物细胞卡那霉素抗性；2)乙肝病毒包膜小蛋白抗原基因及操纵该基因在苜蓿中进行诱导性表达的苜蓿亚硝酸还原酶启动子；3)乙肝病毒包膜中蛋白抗原基因及操纵该基因在苜蓿中进行诱导性表达的苜蓿亚硝酸还原酶启动子；4)T-DNA左右边界序列，它可将NPT II基因、乙肝病毒包膜小蛋白和中蛋白抗原基因转移到苜蓿体内并整合到苜蓿的染色体中。pSML的结构如图3所示。
4.将表达载体pSML导入农杆菌(A.tumefaciens)含有乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白抗原基因的质粒pSML被通过三亲交配的方式转移到农杆菌LBA4404菌株中，该菌株购自美国Clonetech公司(见产品说明书)。菌株LBA4404现已被广泛应用是因为它是一改造后的农杆菌，它含有完整Vir基因，但其野生型的T-DNA已经被删除。Vir基因可反式调节T-DNA自质粒载体pSML向苜蓿细胞内的转移。
农杆菌在含有25mg/L链霉素50ml YEP(蛋白胨10克，酵母提取物10克，NaCl 5克，加蒸馏水至1升，pH7.0)培养基中振荡培养，在OD600nm值达到0.4-0.7时，4000g离心收集细菌细胞，将农杆菌细胞重新悬浮在1ml不含任何抗生素的YEP培养基中待用。含有表达载体pSML的DH5α(购自美国GIBCO公司)和含有辅助质粒pRK2013(购自美国Clonetech公司)的HB101(购自美国Clonetech公司)分别接种在含有50mg/L卡那霉素50ml LB培养基中振荡培养，在OD600nm值达到0.4-0.7时，4000g离心收集细菌细胞，然后将细胞分别悬浮在1ml不含任何抗生素的LB培养基(10g蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，加蒸馏水至1升，pH7.0)中待用。取上述三种细胞悬浮液各200ul，置于同一1.5ml离心管中(三亲交配)，28℃静置培养过夜，取该培养物5-10ul，均匀涂抹在YEP固体培养基平板上，该培养基中同时含有25mg/L链霉素和50mg/L卡那霉素，28℃培养2天后，含有pSML质粒的农杆菌菌落开始产生。
用碱裂解法从农杆菌中提取质粒DNA，并用限制性内切酶酶切可检测pSML质粒DNA是否存在。
实施例21.苜蓿的遗传转化苜蓿的遗传转化主要依据Horsch等人的叶盘转化方法(7)。苜蓿种子(品种为保定苜蓿，购自中国农业科学院畜牧研究所)被浸入10％次氯酸钠溶液中，室温下消毒处理10分钟，然后用无菌蒸馏水漂洗三次。漂洗后的苜蓿种子被置于无菌水浸湿的滤纸上进行萌发，辅之以中等光照强度下，7日后切取子叶(带子叶柄)作为外植体进行遗传转化。
含有表达载体pSML的农杆菌LBA4404接种在50ml YEP培养基(含50mg/ml卡那霉素和25mg/ml链霉素)中28℃培养2天，4000g离心5分钟收集菌体，用25ml MS培养液(不含抗抗生素)洗涤一次，再用MS培养液重新悬浮至OD600nm＝0.2-0.4。将有伤口的子片浸入稀释后的农杆菌菌液中5-8分钟，用无菌滤纸吸干子叶上多余的菌液，然后将子叶移置不含任何激素和抗生素的TM-1固体平板培养基(8)上23-25℃避光共培养5天；将叶片移置新鲜的再生固体平板培养基(TM-1中含有11mg/L 2，4-D、0.5mg/L 6-BA、0.1mg/L NAA；25mg/L卡那霉素、250mg/L羧苄青霉素，7g/L琼脂)上培养，温度26℃，16小时光照，中等光照强度(GXZ智能型光照培养箱，宁波江南仪器厂)，以后每两周更换一次培养基。当叶片伤口处愈伤有幼芽形成并长至足够大时，将幼芽切下(通常在转化后3个月)转移到生根培养基上(TM-1中含有25mg/L卡那霉素、250mg/L羧苄青霉素，不含任何激素)生长。当根出现后(约需20天)，待植株长至一定高度，然后转移到灭菌土壤或蛭石中，给予适宜的条件培养生长。
2.PCR检测乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白基因在苜蓿中的整合情况苜蓿基因组DNA的提取方法见实施例1。取3g苜蓿叶片，放入研钵中用液氮研磨，磨碎后的粉末移置20ml离心管中，然后加入9ml CTAB提取液(100mMTris-HCl，pH7.5含5M NaCl，10mM EDTA，10ml/L β-巯基乙醇，10g/L CTAB)，剧烈振荡1分钟，使之充分混匀。在60℃水浴中温浴90分钟，期间每30分钟振荡一次。从水浴中取出离心管，室温下放置4-5分钟，使之冷却，然后加入4.5ml氯仿，轻轻摇动，使之充分混匀。室温下5000g离心10分钟。收集上清液于另一20ml离心管中，加入4.5ml氯仿，重复上述步骤。收集上清液，加入10ml冰冷的异丙醇，轻摇10-15分钟，5000g离心5分钟，收集沉淀，用3ml 76％乙醇含0.2M NaOAc和2ml 76％乙醇含10mM NH4OAc各洗沉淀一次，最后加入TE(pH8.0)缓冲液溶解DNA，将DNA浓度调至1ug/ul。
取上述苜蓿基因组DNA 1ug约1ul作为模版，加入乙肝病毒包膜小蛋白或中蛋白基因特异性引物各1ul，10XPCR缓冲液3ul，dNTP(各2.5mM)3ul，Taq酶0.5ul约1.5U，加水至总体积30ul。94℃30秒，50℃45秒，72℃1.5分钟，共进行35个循环。反应结束后，取5ul扩增样品进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。如图4所示，阴性对照苜蓿中(泳道4-5)没有发现特异性的条带，而在转基因苜蓿植株中则可扩增出1个约700bp或850bp的特异性条带(泳道6-11)，该结果表明乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白基因已整合进入苜蓿基因组DNA中。
3.乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白抗原在转基因苜蓿中的诱导性表达及检测乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白在转基因苜蓿中的诱导性表达基本上参照Vezina等人的方法(5)。转基因苜蓿以盆栽的方式、单株定植在蛭石中，在定植后前4周，每隔5天浇灌一次Hoagland营养液(2mM KH2PO4，2mM MgSO4·7H2O，0.55mMK2SO4，15mM KCl，10mM NH4Cl，2.8mM CaCl2·2H2O，0.05mM NaFe EDTA)，每升Hoagland营养液中还添加有1毫升微量元素(1g/L H3BO3，1g/L MnCl2·4H2O，0.58g/LZnSO4·7H2O，0.13g/L CuSO4·5H2O，0.1g/L Na2MoO4·2H2O)。在第4周后，开始浇灌新的营养液，新营养液的营养成分与上述营养液大致相同，只是以40mM KNO3替换掉原来的10mM NH4Cl，因为KNO3是苜蓿亚硝酸还原酶启动子的诱导物，它可以激活该启动子并操纵乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白基因在苜蓿中开始表达。在更换浇灌营养液两周后，取苜蓿顶端已完全伸展开的叶片进行乙肝病毒抗原蛋白的检测。
取不同转基因苜蓿顶端伸展开叶片各0.1g，分别加入1.5ml去离子水，在4℃下用玻璃匀浆器磨碎。匀浆液10000g 4℃离心5分钟，利用Lowry法(蛋白测定试剂盒购自Sigma公司，货号为P5656)，取部分上清液测定可溶性蛋白含量。依据Hepanostika HBsAg Uni-Form II Microelisa System试剂盒(购自荷兰Organon Teknika公司)中提供的方法，通过酶联免疫吸附试验测定上清液中乙肝病毒包膜小蛋白和中蛋白的含量(该试剂盒无法区分包膜小蛋白和中蛋白各自的含量)。以CHO细胞提取的标准含量的重组HBsAg蛋白(中国卫生部生物制品鉴定所提供，因为无法获得标准含量的乙肝病毒包膜中蛋白，以下所测定的苜蓿乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白表达量为近似值)为阳性对照。阳性对照被稀释成不同蛋白水平(0.2-32ng)，在颜色反应后，读取405nm光吸收值，制备一条标准吸收曲线。如图5中所示，通过比较发现，阴性对照苜蓿诱导前后(1)及转基因苜蓿(诱导前)其OD405nm吸光值均处于较低的水平，意味着体内乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白基因处于沉默状态，没有表达；或者说是在这种条件下，因乙肝病毒重组抗原蛋白含量非常低，该酶联试剂盒无法检测到这些重组抗原蛋白(2和3)。但在诱导后，苜蓿亚硝酸还原酶基因启动子被激活，它开始操控乙肝病毒包膜小蛋白和中蛋白基因在转基因苜蓿中同时进行高效表达。通过与阳性对照相比，可知在转基因苜蓿中，乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白重组抗原的表达量约占到植物可溶性蛋白的0.01-0.02％，即每克鲜重茎叶约含有1-2ug克乙肝病毒重组抗原蛋白。不同转基因苜蓿之间有一定的差异，这可能是由于基因插入的拷贝数和插入位点不同引起的。
4.表达乙型肝炎病毒包膜中蛋白转基因苜蓿的繁殖和培育在筛选出高效和稳定表达乙型肝炎病毒包膜小蛋白及中蛋白重组抗原的转基因苜蓿后，为商品化生产上述抗原蛋白必须大量繁殖该转基因植株。苜蓿既可以通过种子繁殖，也可以通过营养繁殖(扦插)。通过种子繁殖，转基因苜蓿必须要经过连续几代的筛选，在得到纯系后，外源基因才有可能稳定地遗传给后代，这就需要比较长的时间。因此，可通过扦插的方法，在短时间内便可获得大量苜蓿幼苗，且不必担心由于有性生殖而引起后代的遗传重组问题。
实施例31.重组乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白重组抗原在苜蓿茎叶中的稳定性测定重组乙肝病毒包膜蛋白重组抗原[包括小蛋白(S)及中蛋白(M)]在完整的苜蓿细胞中，可长时间保存。例如，苜蓿地上绿色部分在收割后可迅速脱水干燥并在4℃下低温保存，保存期长达一年，抗原蛋白也不会有任何损失。但当苜蓿细胞结构完全破坏以后，细胞器中的各种蛋白酶就会被释放出来，它们能降解苜蓿植物汁液中所含的乙肝病毒重组抗原蛋白。因此，检测乙肝病毒重组抗原蛋白在苜蓿植物汁液中的稳定性，对于今后在加工过程中尽可能保证抗原蛋白不受损失至关重要。从图6中可以看出，重组的乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白抗原在苜蓿植物汁液中放置的时间越长，蛋白的损失就会越大。在室温下放置1天后与新研磨的汁液中相比，抗原蛋白含量差别不大，但从第2天起，抗原蛋白的量会急剧减少，到第七天后，基本上就检测不到乙肝重组抗原蛋白了。该结果表明，在转基因苜蓿茎叶加工过程中，应尽快使其脱水干燥并保存在低温条件下，才可以有效防止乙肝病毒重组抗原蛋白不会被细胞中释放出的蛋白酶降解破坏。
尽管高温可加速转基因苜蓿茎叶脱水干燥，但重组乙肝病毒包膜中蛋白抗原对高温的忍受能力是有限的。从图7可以看出，当温度超过50℃时，处理时间达长2小时，则苜蓿植物汁液中能够检测到的乙肝病毒重组抗原蛋白的数量就会急剧下降，这表明乙肝病毒抗原蛋白在苜蓿植物汁液中可忍受的极限高温是50℃，超过此温度，抗原蛋白会被蛋白酶所降解，或者是由于乙肝病毒抗原蛋白变性，从而失去了与特异性抗体的反应能力。
综合上述，可以得出如下结论，苜蓿地上部分的干燥应以低温、快速最为适宜，在此条件下可有效保护乙肝病毒重组抗原蛋白不受损失。
2.含乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白重组抗原胶囊的制备苜蓿地上绿色部分不便于人类食用，可考虑加工成胶囊。1000g鲜重苜蓿茎叶在低温条件下彻底干燥后可获得干物质约230g，该干物质进而在低温下被磨成150-200目的干粉，经测定，每100mg这种转基因苜蓿茎叶制成的干粉中约含有0.4ug乙型肝炎病毒包膜小蛋白及中蛋白抗原。该干粉可直接灌入肠溶性或胃溶性的胶囊外壳内。根据具体情况，每个胶囊可灌入100-500mg由转基因苜蓿茎叶制成的干粉，例如，一个300mg的胶囊约含有1.2ug乙肝病毒抗原蛋白。成人一次需服用至少10粒这样的胶囊，才有可能获得足够的免疫剂量。
为了提高每个胶囊内乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白抗原的含量，可预先进行一个粗提纯过程。新鲜的苜蓿茎叶在加入等重量PBS缓冲液(0.2g KH2PO4，2.9gNa2HPO4·12H2O，8.0gNaCl，0.2g KCl，加水至1升，pH7.4)后，在4℃低温条件下被彻底粉碎，以便将乙肝病毒抗原蛋白自苜蓿细胞中完全释放出来，低速离心后收集上清液，经迅速冷冻干燥后，每100mg这种粗提取物中约含有30-50ug乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白抗原，而成年人每次只需服用1粒100mg的胶囊，就有可能达到足够的免疫剂量。
3.含乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白重组抗原冲剂的制备胶囊的容积比较小，如果直接灌入转基因苜蓿茎叶制成的干粉，则每粒胶囊所含有的乙肝病毒重组抗原蛋白较少，成人每次需服用多粒胶囊才能够达到足够的免疫剂量。而若经过一个粗提纯过程，虽然可提高每粒胶囊中所含的有效成分，但这必然会增加生产成本。为此，为增加一次性服用的剂量，可采用冲剂包装形式，每袋内装入10-20g由转基因苜蓿茎叶制成的干粉。以10g包装为例，含有乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白重组抗原约40ug。成人每次只需服用1袋，便可获得足够的免疫剂量。在服用时，为避免高温导致蛋白变性，可伴以温开水稀释后服下。
4.含乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白重组抗原的其它制剂苜蓿茎叶也可以加工成饮料的方式便于服用，其前提是必须保证在液体情况下其中的乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白重组抗原不会被蛋白酶所降解，并能在室温条件下长期储存。
苜蓿来源的乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白重组抗原还可以有其它应用方式，例如，抗原蛋白在经过完全纯化或部分纯化后，可作为食品添加剂，掺入奶粉、豆粉、果汁和酸奶等食物以及饮料中制备成各种特殊功能性食品。
实施例4
1.利用亲和层析法从转基因苜蓿中提纯乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白重组抗原乙肝病毒表面抗原山羊多克隆抗体(产品货号MAB8161)购自美国Chemicon公司，该抗体的免疫抗原蛋白(HBsAg)来自人血浆，它与乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白均能发生特异性血清学反应(因为乙肝病毒包膜中蛋白分子中同样含有完整的包膜小蛋白多肽)。首先通过酶联免疫吸附试验证实转基因苜蓿茎叶提取物中含有能够与该抗体产生特异性反应的物质，然后通过SDS-PAGE电泳和Western blot检测苜蓿茎叶中重组蛋白的大小和糖基化情况。
按照产品说明书中提供的方法，上述的山羊抗体被固定在经CNBr活化的Sepharose 4B上(Pharmacia Biotech公司产品)。取100克经硝酸钾诱导表达后的转基因苜蓿幼嫩茎叶，加入等量PBS缓冲液(含有0.1％Triton X-100；0.5mMPMSF)，在4℃下匀浆。匀浆液经40,000g离心后收集上清液。上清液经冷冻干燥后，重新溶解在2ml TSA缓冲液(20mM Tris-HCl，pH8.0，140mM NaCl，0.025％NaN3)中，然后与上述活化的抗体-凝胶复合物在4℃下充分混合16小时。反应物上柱后，用5倍柱体积pH8.0和pH9.0的Tris缓冲液(50mM Tris-HCl，0.1％Triton X-100，500mM NaCl)分别洗柱，接着用5ml三乙醇胺缓冲液(50mM三乙醇胺，pH11.5，0.1％Triton X-100，150mM NaCl)进行洗脱，洗脱液分别收集在10个1.5ml(每管0.5ml)离心管中。通过酶联吸附反应检测每个离心管中抗原蛋白的有无。将有免疫反应的洗脱液汇集在一起，装入透析袋中，4℃透析过夜，透析缓冲液为2升PBS。透析完成后从透析袋中吸出透析物，经冷冻干燥后，重新溶解在1ml PBS缓冲液中，然后从中取出20ul进行SDS-PAGE电泳。SDS-PAGE电泳检测发现植物重组包膜小蛋白及中蛋白的分子量分别约为27KD和33KD，与人血浆中的乙肝病毒包膜小蛋白GP27(分子量27KD)及中蛋白GP33(分子量33KD)相类似(1)，即各蛋白至少含有一个糖基化位点(见图8)。
2.小鼠的注射免疫接种试验供试小白鼠(BALB/c)购自北京大学医学部，两种性别，但每批实验各处理组的小鼠均为雄性或雌性，体重在15-20克左右。乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg源自人血浆)购自美国Chemicon公司，酵母基因工程重组乙肝疫苗(S蛋白)购自卫生部北京生物制品研究所。不同来源乙肝病毒抗原各取100ng，分别加入PBS缓冲液至终体积200ul，不加入任何佐剂，以腹腔注射方式免疫每只小鼠，每组接种5只小鼠。每隔10天注射接种1次，在第5次接种后10天通过眼部取血方式收集小鼠抗血清。
抗血清的效价通过酶联吸附反应进行测定，乙肝病毒表面抗原(Chemicon公司产品)经包被缓冲液稀释(1.59g Na2CO3，2.93g NaHCO3，加蒸馏水至1升)后，每个小孔内加入100ul(含抗原100ng)，4℃下包被过夜。次日，用PBST缓冲液(8.0gNaCl，0.2g KH2PO4，2.9g Na2HPO4·12H2O，0.2g kCl，0.5ml Tween20，加蒸馏水至1升，pH7.4)洗四次，每次2分钟，甩干后，加入经PBST(含0.2％BSA)稀释成不同浓度的小鼠抗血清100ul，37℃反应2小时。用PBST洗4次，甩干后加入经PBST(含0.2％BSA)1/5000倍稀释的碱性磷酸酶标记的兔抗鼠酶标抗体(Sigma公司产品)100ul，37℃反应2小时，用PBST洗5次，甩干后加入100ul底物缓冲液[9.7ml二乙醇胺，60mg p-nitrophenyl(Sigma公司)，加蒸馏水至100毫升，pH9.8]，室温下反应30分钟，然后加入50ul 3M NaOH终止反应，读取各小孔405nm光吸收值。
如表1所示，在注射接种同样剂量抗原蛋白的情况下，植物来源的乙肝病毒重组抗原蛋白的免疫原性是最强的，在稀释倍数达1/10,000时，检测100ng乙肝病毒表面抗原时，OD405nm的吸光值比阴性对照的高4倍之多，同时，在相同稀释度的情况下，其吸光值也比另外两种抗原抗血清的吸光值要高，如在1/5000倍稀释时，其OD405nm的吸光值比酵母重组乙肝疫苗(S蛋白)高约3倍，比血源乙肝表面抗原(HBsAg)高约1.1倍。
表1不同免疫原小鼠抗血清效价的比较
(1)表中数字为3次实验的平均值(OD405nm吸光值)3.小鼠的口服免疫接种实验供试的小鼠与上面注射接种实验相同。因自然取食无法规范确定每个小鼠的免疫剂量(各小鼠吃的量不一致)，故口服免疫接种采取一次性口腔注入的方法。取0.5g或1g转基因苜蓿新鲜茎叶与等量PBS缓冲液混合后，利用玻璃匀浆器充分研磨，然后利用针尖为圆球形的注射器(购自北京化学试剂商店)将苜蓿粗匀浆液通过小鼠口腔小心注入小鼠食道内(在操作过程中避免对小鼠消化道造成任何伤害)。小鼠在口服接种前先饥饿2 4小时，接种后2小时之内不予进水。
每隔10天口服接种1次，共接种8次。在每次口服接种后的第7天，从小鼠尾静脉取血3滴，将每组(5只小鼠)小鼠的血汇集在一起，然后与100ul PBS缓冲液混合后，室温下放置1小时，离心收集上部血清，-20℃下保存待测。小鼠抗体的产生情况通过乙肝抗抗体酶联免疫诊断试剂盒(Hepanostika anti-HBs试剂盒购自荷兰Organon Teknika公司)进行检测，操作方法完全按照试剂盒中提供的方法进行。
检测结果如表2所示，用含有乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白的转基因苜蓿茎叶口服接种小鼠是可以诱导特异性抗体产生的，而且口服接种1g转基因苜蓿茎叶的效果要好于口服接种0,5g的。尽管口服接种抗体滴度比注射接种要弱很多，而且首次免疫应答反应出现的时间也比较晚，但与试剂盒中提供的人弱阳性抗体血清(＞10mIU/ml)相比，第8次口服接种后的小鼠抗血清其OD405nm吸光值要高于后者，而这一滴度在人体上足以起到抵御乙肝病毒侵染的作用。
表2口服接种后小鼠体内抗体产生情况
(1)表中数字为3次实验的平均值(OD405nm吸光值)参考文献1.成军和杨守纯主编，现代肝炎病毒分子生物学，人民军医出版社，1997年2.de Aizpurua and Russell-Jones，J. Exp. Med.，1988，167440-4513.Man-kit，L. D.，Arntzen，C.J.and Mason，H.S.，WO94/200135，19944.琦组和等，中国科学B辑，1988，121300-13045.Vezina，L.P.and D’Aoust M.A.，patent application，WO02/36786A2，20026.Chee，P.P.，Drong，R.F.and Slightom，J.L.，Plant Molecular Biology Manual，1991，C31-287.Horsch，R.B.，et al.，Science，1985，2271229-12318.Shahin，E.A.，Theor.Appl.Genet.，1985，69235-240本发明的进一步描述只是一些特别的优先实施方案，是按照专利申请要求和为了解释和说明本专利的内容。很显然，在不背离本发明的精神和范围之内，可在此基础上，做进一步的改进和变化。
序列表<110>中国农业科学院生物技术研究所<120>乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白基因在苜蓿中的诱导性表达<160>5<210>1<211>681<212>DNA<213>乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)<220>
<221>CDS<222>(1)...(678)<400>1atg gag aac aca gca tca gga ttc cta gga ccc ctg ctc gtg tta cag gcg ggg ttt 57Met Glu His Thr Ala Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe1 5 10 15ttc ttg ttg aca aga atc ctc aca ata cca cag agt cta gac tcg tgg tgg act tct 114Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser20 25 30 35ctc aat ttt cta ggg gga gca ccc acg tgt cct ggc caa aat tcg cag tcc cca acc 171Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Cys Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr40 45 50 55tcc aat cac tca cca acc ttc tgt cct cca att tgt cct ggc tat cgc tgg atg tgt 228Ser Asn His Ser Pro Thr Phe Cys Pro Pro Ile Cys Pro Arg Tyr Arg Trp Met Cys60 65 70 75ctg cgg cgt ttt atc ata ttc ctc ttc atc ctg ctg cta tgc ctc atc ttc ttg ttg 285Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu80 85 90 95gtt ctt ctg gac tac caa ggt atg ttg ccc gtt tgt cct cta ctt cca gga aca tca 342Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly Thr Ser100 105 110act acc agc acg gga cca tgc aag acc tgc acg att cct gct caa gga acc tct atg 399Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys lys Thr Cys Cys Ile Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met115 120 125 130ttt ccc tct tgt tgc tgt aca aaa cct tcg gac gga aac tgc act tgt att ccc atc 456Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile135 140 145 150cca tca tca tgg gct ttc gca aga ttc cta tgg gag tgg gcc tca gtc cgt ttc tcc 513Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser155 160 165 170
tgg ctc agt tta cta gtg cca ttt gtt cag tgg ttc gta ggg ctt tcc ccc act gtt 570Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val175 180 185 190tgg ctt tca gtt gta tgg atg atg tgg tat tgg ggg cca agt ctg tac aac atc ttg 627Trp Leu Ser Val Val Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Asn Ile Leu195 200 205agt ccc ttt tta cct cta tta cca att ttc ttt tgt ctt tgg gta tac att tga 681Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile *210 215 220 225<210>2<211>226<212>PRT<213>乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)<400>2Met Glu His Thr Ala Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln1 5 10 15Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu20 25 30Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Cys35 40 45Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Phe50 55 60Cys Pro Pro Ile Cys Pro Arg Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe65 70 75 80Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val85 90 95Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly100 105 110Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys lys Thr Cys Cys Ile Pro Ala115 120 125Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp130 135 140Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg145 150 155 160Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu165 170 175Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu180 185 190
Ser Val Val Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Asn Ile195 200 205Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val210 215 220Tyr Ile225<210>3<211>846<212>DNA<213>乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)<220>
<221>CDS<222>(1)...(843)<400>3atg gcg tgg aac tcc aca aca ttc cac caa gct ctg cta gat ccc aga gtg agg ggc 57Met Ala Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln Ala Leu Leu Asp Pro Arg Val Arg Gly1 5 10 15cta tat ttt cct gct ggt ggc tcc agt tcc gga aca gta aac cct gtt ccg act act 114Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Val Pro Thr Thr20 25 30 35gtc tca ccc ata tcg tca atc ttc tcg agg act ggg gac cct gca ccg aac atg gag 171Val Ser Pro Ile Ser Ser Ile Phe Ser Arg Thr Gly Asp Pro Ala Pro Asn Met Glu40 45 50 55aac aca gca tca gga ttc cta gga ccc ctg ctc gtg tta cag gcg ggg ttt ttc ttg 228His Thr Ala Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu60 65 70 75ttg aca aga atc ctc aca ata cca cag agt cta gac tcg tgg tgg act tct ctc aat 285Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn80 85 90 95ttt cta ggg gga gca ccc acg tgt cct ggc caa aat tcg cag tcc cca acc tcc aat 342Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Cys Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn100 105 110cac tca cca acc ttc tgt cct cca att tgt cct ggc tat cgc tgg atg tgt ctg cgg 399His Ser Pro Thr Phe Cys Pro Pro Ile Cys Pro Arg Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg115 120 125 130cgt ttt atc ata ttc ctc ttc atc ctg ctg cta tgc ctc atc ttc ttg ttg gtt ctt 456Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu135 140 145 150ctg gac tac caa ggt atg ttg ccc gtt tgt cct cta ctt cca gga aca tca act acc 513Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr Thr
155 160 165 170agc acg gga cca tgc aag acc tgc acg att cct gct caa gga acc tct atg ttt ccc 570Ser Thr Gly Pro Cys lys Thr Cys Cys Ile Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro175 180 185 190tct tgt tgc tgt aca aaa cct tcg gac gga aac tgc act tgt att ccc atc cca tca 627Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser195 200 205tca tgg gct ttc gca aga ttc cta tgg gag tgg gcc tca gtc cgt ttc tcc tgg ctc 684Ser Trp Ala Phe Ala Arg Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu210 215 220 225agt tta cta gtg cca ttt gtt cag tgg ttc gta ggg ctt tcc ccc act gtt tgg ctt 741Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu230 235 240 245tca gtt gta tgg atg atg tgg tat tgg ggg cca agt ctg tac aac atc ttg agt ccc 798Ser Val Val Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Asn Ile Leu Ser Pro250 255 260 265ttt tta cct cta tta cca att ttc ttt tgt ctt tgg gta tac att tga 846Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile *270 275 280<210>4<211>281<212>PRT<213>乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)<400>4Met Ala Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln Ala Leu Leu Asp Pro Arg1 5 10 15Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val20 25 30Asn Pro Val Pro Thr Thr Val Ser Pro Ile Ser Ser Ile Phe Ser Arg35 40 45Thr Gly Asp Pro Ala Pro Asn Met Glu His Thr Ala Ser Gly Phe Leu50 55 60Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile65 70 75 80Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe85 90 95Leu Gly Gly Ala Pro Thr Cys Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr100 105 110Ser Asn His Ser Pro Thr Phe Cys Pro Pro Ile Cys Pro Arg Tyr Arg
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<212>DNA<213>苜蓿(Medicago sativa)<400>5ccgggctggt ctgtacattc atcttgccgc ctttgcattc acttggccac aaagagtaga 60gagaaggaag agaagagccc agacttcaag aagcgacctt gcaagtgcac tcgagggtca 120gaaactgtat atcatatcta tgtgagagaa aggggaacat ttgagatgga gtccatttac 180ttgaggtata cttattattt tgatcaataa atttgtatac ttcttattta gatcaataaa 240tttgtcatta agctataatc caaaataaat tacgatcaaa tatgcaaatg ttagccagta 300cttgtgttaa acttgatggc atctcttggt ttctttggca atcacatgcc taagaaataa 360atagtatcat atgattgtgt ttggtcagac ttcagagtca gatgactctg tttggataaa 420cagcttaatt aagcgcttat agaatatcat atgattgtgt ttggtcagac ttcagagcat 480ctcttggttt ctctggcaat catatgccta agaaataaat agtatcatat gattgtgttt 540ggtcagactt cagagtcaga tgaccctgtt tgggtaaaca gcttaattaa gtgcttatag 600aataagcgct tatcatataa gtgcttttgt acagttattt ctatgaaagt agaagaaata 660gtcatattgt tttaatataa gctatcctgg agagcttgtg gaaataacca gaaaagaact 720tatggacacg tcatgagctg tttacataag atctccctaa cagtctcaaa agtgtttatg 780
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1.一种通过转基因苜蓿同时诱导表达和生产乙型肝炎病毒包膜小蛋白及中蛋白重组抗原或者是它们的衍生物的方法。
2.一种引起人或其他哺乳动物对乙型肝炎病毒包膜小蛋白及中蛋白重组抗原产生免疫应答的方法，该方法包括使用有效和确定免疫剂量的、来源于能产生这些重组抗原蛋白或其衍生物的转基因苜蓿可食用部分如根、茎和叶或其加工提取物对人或其他哺乳动物进行口服或肠道给药。
3.一种食物至少是由转基因苜蓿的某一部分所组成，它被食用是因为它具有一定的营养价值，其中所说的转基因苜蓿是一种能够诱导表达乙型肝炎病毒包膜小蛋白及中蛋白重组抗原的苜蓿，而这些抗原蛋白已知在天然状态下具有免疫原性，且可以作为一种药物的主要或有效组成部分。
4.如权利要求3中的任何食物，其中所说的苜蓿食用部分包括叶子、茎、根或所说的苜蓿种子。
5.一个用于转化苜蓿的质粒载体包括一段编码乙型肝炎病毒包膜小蛋白及中蛋白重组抗原或者是它们的衍生物的DNA序列，这些蛋白在已知天然状态下具有免疫原性。另外还包括与所说的基因分别连接的植物诱导型启动子，例如苜蓿亚硝酸还原酶基因启动子，该启动子在诱导物的作用下，可操纵所说的基因能够在苜蓿中同时进行诱导性表达。
6.如权利要求5中的质粒载体，它含有一个选择或标记基因。
7.一段用于基因枪法转化苜蓿的DNA序列包括一段编码乙型肝炎病毒包膜小蛋白及中蛋白重组抗原或者是它们的衍生物的DNA序列，这些蛋白已知在天然状态下具有免疫原性。另外还包括与所说的基因分别连接的植物诱导型启动子，例如苜蓿亚硝酸还原酶基因启动子，该启动子在诱导物的作用下，可操纵所说的基因能够在苜蓿中同时进行诱导性表达。
8.如权利要求7中的DNA序列，它含有一个选择或标记基因。
9.一种构建转基因苜蓿细胞的方法包括构建一个质粒载体或一段DNA序列，其中都含有编码乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白的基因或者是它们的衍生物，另外还包括与所说的基因分别连接的植物诱导型启动子，例如苜蓿亚硝酸还原酶基因启动子，该启动子在诱导物的作用下，可操纵所说的基因能够在苜蓿中同时进行诱导性表达。用该质粒载体或该DNA序列转化苜蓿细胞。
10.如权利要求9中的方法，它包括从所说的转基因苜蓿细胞中再生出完整的转基因植株。
11.生产一种胶囊、冲剂或其它制剂的方法包括构建一个质粒载体或一段DNA序列，其中都含有编码乙型肝炎病毒包膜小蛋白及中蛋白的基因或者是它们的衍生物，另外还包括与所说的基因分别连接的植物诱导型启动子，例如苜蓿亚硝酸还原酶基因启动子，该启动子在诱导物的作用下，可操纵所说的基因能够在苜蓿中同时进行诱导性表达，已知这些蛋白已知在天然状态下具有免疫原性。用该质粒载体或该DNA序列转化苜蓿细胞。将转基因苜蓿的食用部分冷冻、干燥和磨碎后制作成胶囊、冲剂或其它制剂。
12.如权利要求11的方法，其中还包括在利用转基因苜蓿作为食物以及加工成胶囊、冲剂或其它制剂之前，应从所说的转基因苜蓿细胞中再生出完整的转基因植株。
13.如权利要求11中的方法，其中还包括从所说的苜蓿细胞中部分纯化或完全纯化出所说的乙肝病毒包膜小蛋白及中蛋白重组抗原作为胶囊、冲剂或其它制剂的活性组成部分。
14.如权利要求11中的方法，其中所说的苜蓿细胞是通过农杆菌系统转化的。
15.如权利要求14中的方法，其中所说的农杆菌系统是农杆菌Ti质粒系统。
16.如权利要求11中的方法，其中所说的苜蓿细胞是通过除农杆菌转化系统以外的其它转化方法如基因枪法、微管注射法、PEG吸收法以及电融合法等方法转化的。
全文摘要
本发明涉及乙型肝炎病毒包膜小蛋白及中蛋白基因在转基因苜蓿中同时进行诱导性表达的方法及其应用。上述两个抗原蛋白基因被分别置于苜蓿亚硝酸还原酶基因启动子操控之下，在正常生长条件下，这两个外源蛋白基因处于沉默状态，无任何目标蛋白产生。但在硝酸盐的诱导下，亚硝酸还原酶基因启动子被激活，并随后调控乙肝病毒包膜小蛋白和中蛋白基因在苜蓿体内同时进行高效表达和积累。人或其他哺乳动物通过直接食用含有这两种重组抗原蛋白的转基因苜蓿、或通过肠道给药的方式利用自这些转基因苜蓿中部分或完全纯化出乙型肝炎病毒膜小蛋白及中蛋白作为胶囊、冲剂或其它制剂的主要活性成分从而可能引起人或其他哺乳动物对乙肝病毒包膜抗原蛋白的免疫应答反应。
文档编号A23L1/212GK101070536SQ20061007876
公开日2007年11月14日 申请日期2006年5月11日 优先权日2006年5月11日
发明者刘德虎, 李刚强, 徐妙云, 魏昭荣, 王跃驹 申请人:中国农业科学院生物技术研究所