专利名称：一种反刍动物葡萄球菌分离、增菌及荚膜多糖表达培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种细菌培养基，具体涉及一种反刍动物葡萄球菌分离、增菌及荚膜多糖表达培养基。
背景技术：
葡萄球菌广泛分布于自然界，致病性葡萄球菌常引起人和动物各种化脓性疾患、败血症或脓毒败血症。其中金黄色葡萄球菌、模仿葡萄球菌等致病菌是常见病原。应用活的或灭活的菌体苗、分离的肽糖、类毒素、粘附素等制备的传统疫苗，对防治葡萄球菌感染的效果并不显著。造成传统疫苗效果不佳的原因是大部分致病菌株具有荚膜(粘液层/微荚膜)。荚膜多糖具有抗吞噬活性且阻止中性粒细胞识别葡萄球菌细胞壁成份的抗体，是主要毒力因子和免疫原。葡萄球菌易于分离、增菌，例如，现在常用营养肉汤/琼脂(NutrientBroth/Agar)、高盐甘露醇琼脂(Manitol Salt Agar)、血琼脂(Blood Agar)或切浦曼培养基(Chapman Stone Medium)作葡萄球菌的分离、增菌培养基。这些培养基的缺陷是，葡萄球菌分离后，作为主要免疫原和毒力因子的荚膜多糖低浓度表达甚至不表达，连续传代2-4代后消失，导致致病菌毒力迅速下降，即使通过本动物回归也不能恢复毒力。但是，生产科研过程中需要葡萄球菌分离、增菌及连续传代后仍然能够保持其毒力的培养基，能够为菌种保存、传代、疫苗保护力检验、荚膜多糖提取提供支持，因此，目前的培养基达不到技术要求。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术之不足，提供一种菌种保存、连续传代后毒力维持能力强的反刍动物葡萄球菌分离、增菌及荚膜多糖表达培养基。
本发明反刍动物葡萄球菌分离、增菌及荚膜多糖表达培养基是由下述重量配比的原料制成(按制取1000毫升计算)水解乳蛋白1-7.5g、 蛋白胨1-7.5g、胰蛋白胨1-7.5g、大豆蛋白胨1-7.5g、乳糖5-25g、氯化钠20-50g、磷酸氢二钾3-7g、硫酸镁0.05-0.2g、硫酸亚铁0.01-0.03g、L-半胱氨酸盐酸盐0.05-0.15g、兔脑心浸液500ml，其余为双蒸水。其中，所述的兔脑心浸液500ml是这样制得称取新鲜兔脑100g、兔心50g，剪碎、研磨、匀浆，然后用温度为4℃的双蒸水250ml浸该组织48小时，煮沸15分钟，滤纸过滤，补充水分至500ml。
本发明反刍动物葡萄球菌分离、增菌及荚膜多糖表达培养基的制备方法是首先依次将水解乳蛋白、 蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、乳糖、氯化钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸亚铁和L-半胱氨酸盐酸盐加入双蒸水中，充分搅拌，加热融化，然后再加入所述的兔脑心浸液混合，最后补足水至1000ml，分装，115℃×15分钟灭菌，4℃保存。
本发明在选取材料中，用多种蛋白胨组合提供菌体荚膜多糖表达所需氮源；用乳糖提供能量源；用磷酸氢二钾提供缓冲体系；用L-半胱氨酸盐酸盐提供适宜的氧化-还原电势；用硫酸亚铁和硫酸镁提供荚膜多糖合成酶类的配位激活剂；考虑到牛脑潜藏疯牛病原的因素，特别添加兔脑心浸液提供荚膜多糖合成所需的不饱和脂肪酸，有利于金黄色葡萄球菌在兼性厌氧条件下毒力因子的表达。根据反刍动物葡萄球菌的营养需求与荚膜多糖高浓度表达之间的相互关系，通过对培养基中碳源、氮源、无机盐、氨基酸和特殊营养因子的合理组合，简化制备工艺，省略其他大部分营养要求丰富的培养基中需添加0.22μm滤膜超滤除菌的动物血清，既避免细菌或病毒的污染，又达到既能分离葡萄球菌，分离增菌后又能保持毒力。同时，该培养基所有成份均符合生物化学试剂和卫生标准要求，对人畜无致癌、致病、致畸作用。
本发明培养基实验情况如下2002年至2005年，对新疆昌吉市、呼图壁县、玛纳斯县、五家渠市共12家奶牛场采取集奶牛临床型乳腺炎奶样进行分离、增菌后，采用TH-16S系统鉴定。全部159份奶样共分离172株菌，其中金黄色葡萄球菌34株(34/172)，表皮葡萄球菌35株(35/172)，腐生葡萄球菌43株(43/172)，溶血葡萄球菌12株(12/172)，模仿葡萄球菌21株(21/172)，溶血性芽胞杆菌5株(5/172)，其它葡萄球菌20株(20/172)，霉菌2株(2/172)。尽管溶血性芽胞杆菌可以在此培养基上生长，但菌落大而扁，表面皱褶，边缘不整齐呈锯齿状，很容易根据菌落形态与葡萄球菌区分。霉菌呈疏松絮状，菌丝明显容易区别。葡萄球菌在该固体培养基上呈金黄色/橙黄色/乳白色，圆形、隆起、闪光、边缘整齐，直径0.5-2.0mm，但少数和也呈乳白色及其它色泽。涂片革兰氏染液染色显微镜检查，呈革兰氏阳性、葡萄串状、无芽孢的球菌。久储碱性美蓝染液染色呈有或无荚膜的球菌。
挑选金黄色葡萄球菌生化优势株733330株1株，接种本发明培养基，摇床37℃24h培养后，粗提荚膜多糖，按照二硝基苯法测定多糖含量为275μg/ml。将上述菌株37℃24h培养物接种18-22g小白鼠10只，0.2ml/只，24h内全部致死，本发明培养基对照健活。上述菌株连续在本发明培养基上传代10次，荚膜多糖含量为223μg/ml。该菌株37℃24h在本发明培养基上10代培养物腹腔接种18-22g小白鼠10只，0.2ml/只。24h内死亡7只，48h内致死9只，96h内全部致死，本发明培养基对照健活。上述10代菌株接种本发明培养基半固体培养基37℃12h后封口，4℃保存6个月，移至本发明培养基37℃24h培养后，腹腔接种18-22g小白鼠10只，0.2/ml/只。24h内致死6只，96内全部致死，本发明培养基对照健活。本发明培养基培养物灭活后粗提荚膜多糖含量为223μg/ml，免疫18-22g小白鼠0.2ml/只×4只，21天后攻同株菌37℃24h本发明培养基培养物0.2ml/只，保护力达50％，未免疫阳性对照全部于48h内死亡。
相比较来看，上述同株733330株金黄色葡萄球菌传代1次营养肉汤37℃24h培养物，灭活后粗提荚膜多糖含量为33μg/ml，腹腔接种18-22g小白鼠0.2ml/只×10只，96h内仅致死2只，营养肉汤对照健活。连续传代10代后荚膜多糖消失，腹腔接种营养肉汤37℃24h培养物给18-22g小白鼠0.2ml/只×10只，96h内无死亡，对照鼠健活。接种营养肉汤半固体37℃24h后封口，4℃保存6个月，移至营养肉汤37℃24h培养后，腹腔接种18-22g小白鼠0.2ml/只×10只，96h内无死亡，对照健活(见表1)。
表1金黄色葡萄球菌733330株在本发明培养基和营养肉汤培养下致病力的比较 上述结果显示，金黄色葡萄球菌在本发明培养基培养传代条件下能够显著表达荚膜多糖，而且至少在10代以内连续传代能够维持毒力。并且证明，荚膜多糖不但是主要毒力因子，而且也是主要免疫相关成份。
本发明的优点是菌种保存、传代毒力维持能力强。
具体实施例方式
A称取新鲜兔脑100g、兔心50g，剪碎、研磨、匀浆，用双蒸水250ml 4℃浸该组织48小时后，煮沸15分钟，滤纸过滤，补充水分至500ml。
B依次称取水解乳蛋白5g、 蛋白胨5g、胰蛋白胨5g、大豆蛋白胨5g、乳糖10g、氯化钠30g、磷酸氢二钾5g、硫酸镁0.1g、硫酸亚铁0.01g、L-半胱氨酸盐酸盐0.1g、按顺序加入400ml双蒸水中，充分搅拌，加热融化。
C将上述A、B两项混合，补足水至1000ml，分装，115℃×15分钟灭菌，4℃保存。
权利要求
1.一种反刍动物葡萄球菌分离、增菌及荚膜多糖表达培养基，其特征在于每1000ml培养基是由下述重量配比的原料制成的水解乳蛋白1-7.5g、蛋白胨1-7.5g、胰蛋白胨1-7.5g、大豆蛋白胨1-7.5g、乳糖5-25g、氯化钠20-50g、磷酸氢二钾3-7g、硫酸镁0.05-0.2g、硫酸亚铁0.01-0.03g、L-半胱氨酸盐酸盐0.05-0.15g、兔脑心浸液500ml，其余为双蒸水，其中，所述的兔脑心浸液500ml是这样制得称取新鲜兔脑100g、兔心50g，剪碎，研磨，匀浆，然后用温度为4℃的双蒸水250ml浸该组织48小时，煮沸15分钟，滤纸过滤，补充水分至500ml。
2.根据权利要求1所述的反刍动物葡萄球菌分离、增菌及荚膜多糖表达培养基的制备方法，其特征在于首先依次将水解乳蛋白、蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、乳糖、氯化钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸亚铁、L-半胱氨酸盐酸盐加入双蒸水中，充分搅拌，加热融化，然后再加入所述的兔脑心浸液混合，最后补足水至1000ml，分装，115℃×15分钟灭菌，4℃保存。
全文摘要
本发明公开了一种反刍动物葡萄球菌分离、增菌及荚膜多糖表达培养基，它由水解乳蛋白、蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、乳糖、氯化钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸亚铁、L－半胱氨酸盐酸盐、兔脑心浸液和双蒸水制成，其中，所述的兔脑心浸液是由新鲜兔脑、兔心经剪碎、研磨、匀浆，然后用温度为4℃的双蒸水浸该组织，煮沸15分钟，滤纸过滤，补充水分制得。本发明菌种保存、传代毒力维持能力强，适用于科学研究、疫苗生产检验过程中葡萄球菌分离、增菌及连续传代或保存条件下毒力维持。
文档编号C12R1/44GK101063092SQ20061008006
公开日2007年10月31日 申请日期2006年4月25日 优先权日2006年4月25日
发明者马文戈, 黄炯, 薛英, 王延 申请人:新疆维吾尔自治区畜牧科学院兽医研究所