专利名称：一种抑制明胶酶a活性的多肽和制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物化学多肽的制备及应用，具体地说是应用噬菌体展示技术筛选并获得明胶酶A(MMP-2)抑制性多肽M204C4编码cDNA序列的过程、该多肽具有对MMP-2酶活性有抑制作用以及体外抑制肿瘤细胞侵袭转移的作用；因此，该多肽可能应用于人类肿瘤细胞侵袭的预防和治疗。
背景技术：
肿瘤已成为继心血管疾病之后威胁人类生命的一大杀手。肿瘤的进程包括正常细胞某些基因的改变、恶性表型的形成、侵袭邻近正常组织、远距离及全身组织扩散(转移)。据临床统计，约有80％以上的肿瘤患者死于肿瘤的侵袭与转移，故对肿瘤细胞的侵袭、转移研究方面一直受到人们的关注。
肿瘤的生长、侵袭和转移依赖于肿瘤血管的生成。肿瘤细胞生长转移的主要障碍是细胞外基质。研究表明，基质金属蛋白酶类(MMPs)和其他蛋白酶与肿瘤组织周围基质的重塑有关。其中，MMP-2与肿瘤的发生、发展以及肿瘤临床恶性程度密切相关。
MMP-2，又称明胶酶A，分子量72KD，是基质金属蛋白酶家族中的一员。MMP-2主要降解明胶、IV、V、VII、X型基底膜胶原。基质金属蛋白酶组织抑制剂-2(TIMP-2)为MMP-2特异性组织抑制因子，能特异性与MMP-2催化中心的Zn2+结合，封闭其催化活性。在体内，MMPs和TIMPs的转录和活性受多因素和多水平的调节，从而维持动态平衡。该调节机制紊乱，可出现相应的病理状态，尤其在肿瘤侵袭、转移中的作用更为突出。研究表明，MMP-2在多种肿瘤中过表达，并与肿瘤恶性程度密切相关，如乳腺癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、直肠癌、胃癌等(李东、于宏、贺占国。明胶酶与疾病关系的研究。医学综述，2002，8(8)442。)。TIMP-2作用作为MMP-2的组织抑制剂，其方式复杂，它一方面可以抑制MMP-2的活性，但同时还参与MMP-2的激活(李东、于宏、贺占国。明胶酶与疾病关系的研究。医学综述，2002，8(8)442。)，有时参与细胞生长、繁殖及刺激血管生成等病理、生理学过程。MMP-2与TIMP-2相互作用的结果与肿瘤细胞侵袭、转移有相关性，MMP-2/TIMP-2比值甚至作为一些肿瘤恶性程度及预后判断的一项指标(朱峰、刘新光、梁念慈。基质金属蛋白酶及其组织抑制物与肿瘤侵袭转移。国外医学临床生物化学与检验学分册，2001，22(5)229。)。MMP-2其他抑制因子如Kazal基序逆向诱导半胱氨酸丰富蛋白(RECK)、组织因子途径抑制物-2(TFPI-2)等虽然可以作为MMP-2的抑制物，并且在体外已表达，但由于其作用机理仍未完全清楚，在抑制MMP-2活性的同时产生其他的副作用(Andrew H.Baker，Dylan R.Edwards and Gillian Murphy.Metalloproteinasein hibitorsbiological actions and therapeutic opportunities.Journalof cell science.2002，115(19)3719.)。
综上所述，寻找与MMP-2特异结合的抑制剂，对于抑制MMP-2活性，同时在体内抑制肿瘤的侵袭、转移对于肿瘤患者治疗是非常重要的。
发明内容
1.发明目的本发明的目的是提供一种抑制MMP-2活性的多肽及其制法以及该多肽抑制MMP-2作用和体外抑制肿瘤细胞侵袭转移作用。
2.技术方案本研究主要采用噬菌体展示技术筛选MMP-2特异性结合抑制性多肽来抑制MMP-2的活性。首先是将靶蛋白MMP-2包被酶标板，4℃过夜，使MMP-2能与酶标板很好的结合。然后用BSA封闭液封闭酶标板孔中未结合MMP-2的部位，减少非特异性噬菌体结合。向已封闭好的酶标板中加入噬菌体，使得噬菌体尾部表达的肽与MMP-2结合，再用TBST洗掉未结合的噬菌体，最后用甘氨酸-盐酸洗脱液洗脱结合的噬菌体，用Tris-HCl中和后即得筛选的噬菌体。将该噬菌体经过扩增以后进行随后的几轮筛选，即可得到特异性结合MMP-2的噬菌体。在噬菌体筛选的过程中，第一轮筛选洗脱时强度要小，在随后的几轮中逐渐增强洗脱强度，即可得到结合能力强的特异性结合的噬菌体。将末次筛选的噬菌体涂板，挑克隆，进行噬菌体扩增，然后用MMP-2荧光药物筛选试剂盒再次对噬菌体单克隆进行筛选，即可得到结合能力最强的噬菌体。然后将所得噬菌体提取DNA，测序，比对后就可得到抑制MMP-2酶活性的多肽编码序列M204C4。
一种抑制明胶酶A活性的多肽M204C4，其特征是它由H W W Q W P S S L QL R G G G S所示的氨基酸序列所组成。
编码M204C4的cDNA序列为CAT TGG TGG CAG TGG CCT TCT TCGCTT CAG CTT CGG GGT GGA GGT TCG上述编码M204C4的cDNA序列，还包含所列cDNA序列的互补序列，以及类似的人工合成序列。
筛选上述多肽M204C4的方法，其步骤如下(1)噬菌体的扩增从第一、二轮筛选的噬菌体洗脱液中取10μl，加入20mL培养至吸光度A600＝0.5的ER2738菌中，室温放置、振荡、培养、离心，分离出上清液，将上清液再离心，加1/6体积的PEG8000NaCl溶液，过夜；第二天将沉淀过夜的噬菌体溶液离心，弃上清，加1mL TBS混悬沉淀，离心，转移上清液至
EP管中，离心，再次转移上清液至新的EP管中，加1/6体积的PEG8000NaCl溶液，冰浴沉淀后离心，弃上清，100μl TBS溶沉淀，再离心1min，转移上清至新EP管中，即得扩增的噬菌体；(2)亲和筛选用100ulMMP-2靶蛋白包板，过夜，加入200ulBSA封闭液封闭，用TBST洗6次，每次在加入TBST后均在摇床上轻摇2分钟，清洗完毕后，将酶标条在干净的吸水纸上敲几次，去除剩余的液体，噬菌体原库10μl加入100μl TBST即含0.1％吐温中，混匀后加入包被好的酶标板中，摇60分钟，按上述方法用TBST即含0.1％吐温洗10次，去除剩余液体后，加入100μl甘氨酸-盐酸洗脱液，摇7分钟，收集洗脱液，加15μl Tris-HCl中和，滴度测定，此即第一轮筛选；取10μl洗脱液进行噬菌体扩增，用扩增的噬菌体进行第二轮的亲和筛选；同法进行第三轮筛选；(3)将第三轮筛选的噬菌体进行滴度测定，同时挑克隆，扩增，然后用MMP-2特异性荧光分析试剂盒检测挑选的单克隆扩增产物对MMP-2酶活性的抑制作用，挑选抑制作用强的噬菌体单克隆提取DNA，进行DNA测序，由此cDNA翻译得到的多肽序列命名为M204C4。
上述筛选多肽的方法在步骤(1)中在ER2738菌中加入噬菌体洗脱液后，室温放置15min，于37℃250r/min振荡培养(4-4.5)h，4℃10000rpm离心10min，将上清液再离心5min，加1/6体积的PEG8000NaCl为20％W/V的PEG8000、2.5mol/L的Nacl，4℃过夜，将过夜的噬菌体溶液在4℃10000rpm离心15min，转移上清液至EP管中后在4℃12000rpm离心5min，冰浴沉淀(40-60)min，4℃13000rpm离心20min。
上述筛选多肽的方法在步骤(2)中所述的MMP-2靶蛋白包板是用pH8.6、0.1mol/L NaHC03溶解至浓度为10μg/ml，4℃过夜，所述的BSA封闭液为5mg/mlBAS，0.1mol/L NaHCO3，pH8.6，封闭1h；所述的TBST洗液为50mmol/L，Tris-HCl，pH7.5，150mmol/L NaCl，0.1％V/V Tween-20；所述的甘氨酸-盐酸为0.2mol/L，pH2.2，用1.0mol/L，pH9.1的Tris-HCl中和。
试验研究结果表明不同浓度的多肽M204C4，对MMP-2具有不同程度的抑制作用，且随着多肽M204C4浓度的不断增加，对MMP-2的活性抑制逐渐升高，呈现剂量依赖性；中和性多肽M204C4抑制MMP-2酶活性的IC50为78.0nmol/L；不同剂量的多肽M204C4，对体外人胰腺癌细胞系PANC-1与CFPAC-1侵袭转移作用具有不同程度的抑制作用，且随着多肽M204C4剂量的增加，其抑制肿瘤细胞侵袭转移的作用逐渐增强，呈现剂量依赖性。
3.有益效果本发明所得M204C4多肽，经过抑制MMP-2酶活性试验测定IC50，以及体外对经过PGE2处理后获得高侵袭性的胰腺癌细胞系PANC-1、CFPAC-1的侵袭转移抑制性试验研究结果表明(1).M204C4在较低浓度下即可抑制MMP-2酶活性(表1)，其IC50为78.0nmol/L。
(2).M204C4体外可以抑制PANC-1、CFPAC-1的侵袭转移作用，并具有一定的剂量——效应关系(图3、图4)。
四
图1.编码M204C4的cDNA序列。
图2.M204C4氨基酸序列。
图3.胰腺癌细胞系PANC-1经PGE2处理后，MMP-2生成增加，侵袭转移能力显著增强，当加入M204C4后，侵袭转移能力下降，并具有一定的剂量效应关系。
图4.胰腺癌细胞系CFPAC-1经PGE2处理后，MMP-2生成增加，侵袭转移能力显著增强，当加入M204C4后，侵袭转移能力下降，并具有一定的剂量效应关系。
五具体实施例方式
实施例1.多肽M204C4的筛选方法试验材料(1)噬菌体12肽库、受体菌ER2738均购自NEW ENGLAND Biolabs公司。
(2)重组人MMP-2，购自美国R&D公司。
(3)MMP-2荧光分析药物筛选试剂盒，购自美国Biomol公司。
试验方法(1)噬菌体的扩增从第一、二轮筛选的噬菌体洗脱液中取10μl，加入20mL培养至吸光度A600＝0.5的ER2738菌中，室温放置15min，于37℃250r/min振荡培养4.5h，4℃10000rpm离心10min，分离出上清液，将上清液再离心5min，加1/6体积的PEG8000NaCl(20％W/V PEG8000、2.5mol/L NaCl)溶液，4℃过夜；第二天将沉淀过夜的噬菌体溶液在4℃10000rpm离心15min，弃上清，加1mL TBS混悬沉淀，离心，转移上清液至EP管中，4℃12000rpm离心5min，重新转移上清液至新EP管中，加1/6体积的PEG8000NaCl溶液，冰浴沉淀40分钟，4℃13000rpm离心20min，弃上清，100μl TBS溶沉淀，再离心1min，转移上清至新EP管中，即得扩增的噬菌体；(2)亲和筛选用100ul MMP-2靶蛋白(用pH 8.6，0.1mol/L NaHCO3溶解至浓度为10μg/ml)包板，4℃过夜，弃去包被液，加入200ulBSA封闭液(5mg/mLBSA，0.1mol/L NaHCO3pH 8.6)封闭1h，用TBST(50mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，150mmol/L NaCl，0.1％V/V Tween-20)洗6次，每次在加入TBST后均在摇床上轻摇2分钟，清洗完毕后，将酶标条在干净的吸水纸上敲几次，去除剩余的液体，噬菌体原库10μl加入100μl TBST(0.1％吐温)中，混匀后加入包被好的酶标板中，摇60分钟，按上述方法用TBST(0.1％吐温)洗10次，去除剩余液体后，加入100μl甘氨酸-盐酸(0.2mol/L pH2.2)洗脱液，摇7分钟，收集洗脱液，加15μl Tris-HCl(1.0mol/L pH9.1)中和，滴度测定，此即第一轮筛选；取10μl噬菌体洗脱液进行噬菌体扩增，并进行第二轮的亲和筛选，同法进行第三轮筛选；(3)将第三轮筛选的噬菌体进行滴度测定，同时挑克隆，扩增，然后用MMP-2特异性荧光分析试剂盒检测挑选的单克隆扩增产物对MMP-2酶活性的抑制作用，挑选抑制作用强的噬菌体单克隆提取DNA，进行DNA测序(结果见图1)，并经过翻译后得到的多肽序列命名为M204C4(见图2)。
实施例2.多肽M204C4对MMP-2的抑制作用与IC50的计算试验方法按照MMP-2荧光检测试剂盒方法，向96孔检测板中加入中和性多肽M204C4(由西安华辰有限公司合成)和MMP-2，使得M204C4终浓度分别为0、10、20、50、100、200nmol/L，37℃温育45min，加入底物，立即在波长为328/393nm处测定荧光值，并计算酶活性抑制百分率。应用SPSS10.0软件计算IC50。
实验结果如表1所示，向反应体系中加入不同浓度的M204C4，对MMP-2具有不同程度的抑制作用，且随着M204C4浓度的不断增加，对MMP-2的活性抑制作用逐渐增强，呈现剂量依赖性。中和性多肽M204C4抑制MMP-2酶活性的IC50为78.0nmol/L。
表1 M204C4对MMP-2活性抑制作用
实施例3.多肽M204C4体外抑制胰腺癌细胞系侵袭试验试验材料
(1)M204C4多肽由西安华辰有限公司合成，用pH7.2PBS缓冲液溶解。
(2)人胰腺癌细胞系PANC-1与CFPAC-1，购至中科院上海细胞所。细胞培养于含10％FBS、100ug/ml青霉素和100ug/ml链霉素的DMEM培养液中，于5％CO2、37℃培养。细胞密度达80％-90％时用0.25％胰酶消化传代。
试验方法将PANC-1、CFPAC-1接种于培养瓶中，过夜。用终浓度为10μmol/L的PGE2处理细胞8h，胰酶消化，用含0.5％BSA的无血清DMEM中和，离心，收集细胞。用无血清DMEM重悬细胞，调整细胞密度(PANC-11.0×105/mL，CFPAC-12.0×105/mL)。将250μL细胞悬液加入已用无血清DMEM培养液润湿好的侵袭小室上室中，同时加入PGE2(终浓度10μmol/L)和中和性多肽M204C4(终浓度分别为200、60、20nmol/L)。在下室中加入含5.0％FBS的DMEM，于5％CO2、37℃培养24h。取出上室，用棉签去除未侵袭转移的细胞和基质胶，结晶紫染色，显微镜下观察。每样随机各取3个视野进行细胞计数。本试验重复三次。
数据处理用相对值表示，即以单独用PGE2处理的侵袭转移细胞数为基准，其余各组与其相比即得。应用SPSS10.0软件进行统计学分析处理，P＜0.05具有统计学意义。
试验结果(1)胰腺癌细胞系PANC-1经PGE2处理后，侵袭转移能力明显增强，与对照组相比具有显著的统计学差异(P＜0.01)。PANC-1细胞经PGE2预处理后加入中和性多肽M204C4后，其侵袭转移能力明显下降。高剂量200nmol/L M204C4能显著抑制PANC-1细胞侵袭转移，与单独用PGE2处理组相比，具有显著的统计学差异(P＜0.001)；中剂量60nmol/L M204C4也具有相似的作用效果(P＜0.001)，但其抑制PANC-1的侵袭转移作用小于高剂量组；低剂量20nmol/L M204C4虽然也可以抑制PANC-1的侵袭转移，但其作用弱于高、中剂量组，与单独用PGE2处理组相比亦有统计学差异(P＜0.01)。
(2)胰腺癌细胞系CFPAC-1未经PGE2处理时，几乎无侵袭转移能力(未附图)，经PGE2处理后，侵袭转移能力明显增强，在镜下观察可见大量的细胞。CFPAC-1经PGE2预处理后加入中和性多肽M204C4后，其侵袭转移能力明显下降。高剂量200nmol/L M204C4能显著抑制MMP-2的活性，使得CFPAC-1细胞侵袭转移能力减弱，与对照PGE2处理组相比，具有非常显著的统计学差异(P＜0.001)；中剂量60nmol/L M204C4也具有相似的作用效果(P＜0.01)，但其抑制作用小于高剂量组；低剂量20nmol/L M204C4虽然可以抑制CFPAC-1的侵袭转移，但与PGE2处理组相比无统计学差异(P＞0.05)。
权利要求
1.一种抑制明胶酶A活性的多肽M204C4，其特征是它由H W W Q W P S S LQ L R G G G S所示的氨基酸序列所组成。
2.一种抑制明胶酶A活性的多肽M204C4，其特征是它具有如下cDNA序列CAT TGG TGG CAG TGG CCT TCT TCGCTT CAG CTT CGG GGT GGA GGT TCG
3.一种筛选权利要求1所述多肽M204C4的方法，其步骤如下(1)噬菌体的扩增从第一、二轮筛选的噬菌体洗脱液中取10μl，加入20mL培养至吸光度A600＝0.5的ER2738菌中，室温放置、振荡、培养、离心，分离出上清液，将上清液再离心，加1/6体积的PEG8000NaCl溶液，过夜；第二天将沉淀过夜的噬菌体溶液离心，弃上清，加1mL TBS混悬沉淀，离心，转移上清液至EP管中，离心，再次转移上清液至新EP管中，加1/6体积的PEG8000NaCl溶液，冰浴沉淀后离心，弃上清，100μl TBS溶沉淀，再离心1min，转移上清至新EP管中，即得扩增的噬菌体；(2)亲和筛选用100ulMMP-2靶蛋白包板，过夜，加入200ulBSA封闭液封闭，用TBST洗6次，每次在加入TBST后均在摇床上轻摇2分钟，清洗完毕后，将酶标条在干净的吸水纸上敲几次，去除剩余的液体，噬菌体原库10μl加入100μl TBST即含0.1％吐温中，混匀后加入包被好的酶标板中，摇60分钟，按上述方法用TBST即含0.1％吐温洗10次，去除剩余液体后，加入100μl甘氨酸-盐酸洗脱液，摇7分钟，收集洗脱液，加15μl Tris-HCl中和，滴度测定，此即第一轮筛选；取10μl噬菌体洗脱液进行扩增，并进行第二轮的亲和筛选，同法进行第三轮筛选；(3)将第三轮筛选的噬菌体进行滴度测定，同时挑克隆，扩增，然后用MMP-2特异性荧光分析试剂盒检测挑选的单克隆扩增产物对MMP-2酶活性的抑制作用，挑选抑制作用强的噬菌体单克隆提取DNA，进行DNA测序，得到的多肽序列命名为M204C4。
4.根据权利要求4所述筛选多肽的方法，其特征在于在步骤(1)中在ER2738菌中加入噬菌体洗脱液后室温放置15min，于37℃250r/min振荡培养4.5h，4℃10000rpm离心10min，将上清液再离心5min，加1/6体积的PEG8000NaCl为20％W/V的PEG8000、2.5mol/L的NaCl，4℃过夜，将过夜的噬菌体溶液在4℃10000rpm离心15min，转移上清液至EP管中后在4℃12000rpm离心5min，冰浴沉淀40min，4℃13000rpm离心20min。
5.根据权利要求4所述筛选多肽M204C4的方法，其特征在于在步骤(2)中所述的MMP-2靶蛋白是用pH8.6，0.1mol/L NaHCO3溶解至浓度为10ug/ml包板，4℃过夜，所述的BSA封闭液为5mg/ml BAS，0.1mol/L NaHCO3，pH8.6，封闭1h；所述的TBST洗液为50mmol/L，Tris-HCl，pH7.5，150mmol/L NaCl，0.1％V/VTween-20；所述的甘氨酸-盐酸为0.2mol/L，pH2.2，用1.0mol/L，pH9.1的Tris-HCl中和。
6.权利要求1所述的多肽M204C4，其特征在于不同浓度的多肽M204C4，对MMP-2酶活性具有不同程度的抑制作用，且随着多肽M204C4浓度的不断增加，对MMP-2的活性抑制逐渐增强，呈现剂量依赖性；中和性多肽M204C4抑制MMP-2酶活性的IC50为78.0nmol/L。
7.权利要求1所述的多肽M204C4，其特征在于不同剂量的多肽M204C4，对体外人胰腺癌细胞系PANC-1与CFPAC-1的侵袭转移作用具有不同程度的抑制作用，且随着多肽M204C4剂量的增加，其抑制作用逐渐增强，呈现剂量依赖性。
全文摘要
一种抑制明胶酶A活性的多肽M204C4，由H WW Q W P S S L Q L R G G G S所示的氨基酸序列所组成。采用噬菌体展示技术筛选MMP－2特异性结合抑制性多肽来抑制MMP－2的活性，筛选多肽的方法首先是噬菌体亲和筛选，其次是噬菌体的扩增，经几轮筛选得到特异性结合MMP－2的噬菌体，并涂板，挑克隆，进行噬菌体扩增，然后用MMP－2荧光药物筛选试剂盒再次对噬菌体单克隆筛选，即可得到抑制MMP－2酶活性的多肽M204C4，经试验研究表明该多肽M204C4具有抑制MMP－2酶活性的作用，有抑制体外胰腺癌细胞系PANC－1和CFPAC－1侵袭转移的作用。
文档编号C12N7/00GK1869063SQ200610085780
公开日2006年11月29日 申请日期2006年6月30日 优先权日2006年6月30日
发明者韩晓, 郑马庆, 孙玉洁 申请人:南京医科大学