专利名称：不结球白菜胞质雄性不育基因的分子标记方法
技术领域：
本发明不结球白菜胞质雄性不育基因的分子标记方法，属于生物技术领域，涉及不结球白菜胞质雄性不育系选育的分子育种，专用于不结球白菜胞质不育基因的筛选。
二、技术背景不结球白菜(Brassica campestris ssp.chinensis Makino)，原产中国，是我国南方普遍种植的最大众化蔬菜，在蔬菜的周年供应中起着举足轻重的作用(侯喜林，2003)。不结球白菜为典型的异花授粉作物，杂种优势明显，而利用雄性不育系是进行杂种生产的理想材料。
细胞质雄性不育是呈母性遗传的雄性不育类型，它在植物杂种优势利用方面具有重要的作用，对其深入研究具有重大的经济价值和社会价值，同时又是研究核—质互作和花粉发育的模式系统，具有重要的理论研究意义，因而引起国内外学者的普遍关注，成为分子生物学研究领域的一大热点(凌杏元，2000)。
随着分子生物学的发展，国内外都很重视开展育性基因的分子标记筛选以及用于标记辅助选择。Hanson等(1997)用BSA法(Bulked Segregant Analysis)识别了甘蓝Ogu胞质雄性不育恢复基因连锁的分子标记，利用选择的标记来选择纯合的育性恢复位点的植株。Delourme等(1998)等从138个随机引物中筛选出与油菜Ogu胞质雄性不育育性基因紧密连锁的4个RAPD标记片段。Jean等(1998)利用NILS和BSA法鉴定出与pol胞质雄性不育育性位点连锁的10个RFLP标记和1个RAPD标记。王俊霞等(2000)用BSA法从860个随机引物中筛选出与pol胞质雄性不育恢复基因连锁的2个RAPD标记AH19.690和AH6.830。王晓武等(1998)利用BSA分析获得了1个与甘蓝雄性不育基因MS连锁的ERAPD标记，在辅助2个甘蓝自交系回交一代及2个青花菜自交系回交一代的MS基因转育中预测的准确性超过90％。王永飞等(2002，2003)利用RAPD技术对大白菜细胞质雄性不育系及其保持系分析，获得了不育系的特异标记CMSOPL01670。王春国等(2005)采用同源序列的侯选基因法，设计特异引物，获得了花椰菜胞质雄性不育基因的特异PCR标记。盖树鹏等(2001，2004)利用RAPD技术，获得了大葱胞质雄性不育基因的1个标记S132800，并成功转化为SCAR标记，同时建立了大葱不育系分子标记辅助选择的技术体系。陈学军等(2003)利用合成的引物在榨菜胞质雄性不育系中获得了1173bp的特异PCR标记。但至今尚无不结球白菜胞质雄性不育基因标记筛选及其标记辅助选择的报道，分子标记辅助选择不受环境条件的限制，可实现苗期选择，减少工作量，提高选择效率，从而加快育种进程。
发明内容
技术问题本发明的目的是筛选出一个或几个与不结球白菜胞质雄性不育基因紧密连锁的分子标记，这些分子标记用于不结球白菜辅助选择育种，可大大提高不结球白菜不育系的选择效率，为杂种优势的利用提供理想材料。
技术方案 本发明的实施方案如下与不结球白菜胞质雄性不育基因连锁的分子标记方法，其特征在于用标记引物OPAX1，引物序列TGCGCTCCTC扩增不结球白菜胞质雄性不育系或育种材料DNA，如果能够扩增出800bp的片段NAU/RAPD/CMS1800，则标志着不结球白菜胞质雄性不育基因的存在。
或者用标记引物OPAF12，引物序列GGAACCCACA扩增不结球白菜胞质雄性不育系或育种材料DNA，如果能够扩增出600bp的片段NAU/RAPD/CMS2600，则标志着不结球白菜胞质雄性不育基因的存在。
或者用标记引物SCAX1，左端引物序列TGCGCTCCTCCTTGGTGGTG右端引物序列TGCGCTCCTCTCCAAAACTA扩增不结球白菜胞质雄性不育系或育种材料DNA，如果能够扩增出800bp的片段NAU/SCAR/CMS3800，则标志着不结球白菜胞质雄性不育基因的存在。
或者用标记引物SCAF12，左端引物序列GGAACCCACAATCCAGAA右端引物序列GGAACCCACACCAGAGACGCAG扩增不结球白菜胞质雄性不育系或育种材料DNA，如果能够扩增出600bp的片段NAU/SCAR/CMS4600，则标志着不结球白菜胞质雄性不育基因的存在。
筛选上述标记的过程如下(1)材料选用不结球白菜胞质雄性不育系98HA及其保持系98HB；(2)用CTAB法提取胞质雄性不育系98HA及其保持系98HB的单株DNA；(3)采用RAPD和SCAR标记标记进行不结球白菜胞质雄性不育标记的筛选。
RAPD标记的筛选是用随机引物OPAX1和OPAF12，在PTC-100TM扩增仪上进行PCR扩增，PCR反应体系为20μl，其中10×Buffer2.0μl，25mMMgCl22.0μl，2mMdNTP1.0μl，10μM引物2.0μl，5单位/μl Taq酶0.2μl，模板DNA20ng，5mM TM0.2μl，加ddH2O至20μl。PCR反应程序为94℃2min预变性后，接着94℃变性45s，37℃退火30s，72℃延伸50s，18个循环，72℃延伸5min，再94℃变性45s，37℃退火30s，72℃延伸50s，25个循环，再72℃5min；PCR产物于1.4％的琼脂糖凝胶上进行电泳分离分析，电泳结束后在UVP成像系统上自动成像，筛选出在不结球白菜胞质雄性不育系98HA及其保持系98HB间的多态性片段，从而获得不结球白菜胞质雄性不育基因800bp的RAPD标记片段NAU/RAPD/CMS1800和600bp的RAPD标记片段NAU/RAPD/CMS2600。
利用Takara公司的凝胶回收试剂盒回收、纯化特异DNA片段，连接pGEM-T载体，转化感受态大肠杆菌DH5α，筛选、鉴定重组克隆并由Takara公司进行两端测序。
根据RAPD扩增特异序列的测序结果，利用软件Primer Premier设计两对SCAR引物SCAX1及SCAF12，SCAR标记的筛选是在PTC-100TM扩增仪上进行PCR扩增，PCR反应体系为为20μl，其中10×Buffer2.0μl，25mMMgCl22.0μl，2mMdNTP1.0μl，10μM引物对2.0μl，5单位/μl Taq酶0.2μl，模板DNA20ng，5mM TM0.2μl，加ddH2O至20μl。
PCR反应程序为94℃2min预变性后，接着94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环。PCR产物于1.4％的琼脂糖凝胶上进行电泳分离分析，电泳结束后在UVP成像系统上自动成像，筛选出在不结球白菜胞质雄性不育系98HA及其保持系98HB间的多态性片段，从而获得不结球白菜胞质雄性不育基因800bp的SCAR标记片段NAU/SCAR/CMS3800和600bp的SCAR标记片段NAU/SCAR/CMS4600。
(4)获得两个RAPD标记片段NAU/RAPD/CMS1800和NAU/RAPD/CMS2600与不结球白菜胞质雄性不育基因连锁，并将其分别转化为更为稳定的两个SCAR标记片段NAU/SCAR/CMS3800和NAU/SCAR/CMS4600。
有益效果 本发明选用的是不结球白菜胞质雄性不育系及其保持系为材料开展不结球白菜胞质雄性不育分子标记的筛选。与目前技术相比，其优点是(1)标记稳定。本研究以不结球白菜胞质雄性不育系及其保持系这一对近等基因系为材料，鉴定出RAPD标记2个，并转化为2个更稳定的SCAR标记，在2002，2003年分别用这些标记对不结球白菜胞质雄性不育系及其保持系测交及自交后代进行检测，表明该标记表现稳定，不受年份、环境条件的影响。
(2)辅助选择方便，节约成本。不结球白菜雄性不育系的常规选育方法周期长，成本高，费时又费力。通过本发明筛选出的与不结球白菜雄性不育基因紧密连锁的分子标记用于辅助选择，可以实现苗期选择，减少工作量，大大提高不结球白菜胞质雄性不育系的选择效率，从而加快育种进程。
四
图1 NAU/RAPD/CMS1800标记的筛选左边三个泳道为引物OPAX1在不结球白菜保持系98HB扩增结果，右边三个泳道为引物OPAX1在不结球白菜胞质雄性不育系98HA扩增结果，箭头所示为标记NAU/RAPD/CMS1800。
图2 NAU/RAPD/CMS2600标记的筛选左边三个泳道为引物OPAF12在不结球白菜保持系98HB扩增结果，右边三个泳道为引物OPAF12在不结球白菜胞质雄性不育系98HA扩增结果，箭头所示为标记NAU/RAPD/CMS2600。
图3 NAU/SCAR/CMS3800和NAU/SCAR/CMS4600标记的筛选左边三个泳道为引物对SCAX1在不结球白菜胞质雄性不育系98HA扩增结果，右边三个泳道为引物对SCAF12在不结球白菜胞质雄性不育系98HA扩增结果，箭头所示为标记NAU/SCAR/CMS3800和NAU/SCAR/CMS4600。
五具体实施例方式
利用RAPD等分子标记技术寻找与不育基因连锁的标记，为定位及克隆这些基因提供了极其有用的工具，并为分子标记辅助育种打下良好的基础。分子标记辅助选择不受环境条件的限制，可实现苗期选择，减少工作量，加快育种进程。目前国内外在不结球白菜CMS基因分子标记研究方面尚属空白。
本发明的实施程序是(一)材料与方法 不结球白菜胞质雄性不育系98HA及其保持系98HB这一近等基因系来自南京农业大学蔬菜研究所(Hou X.L.Cao S.C and He Y.K.Creation ofa new germplasm of CMS non-heading Chinese cabbage.Acta Horticulturae，2004，175～81，南京农业大学蔬菜研究所自该专利申请之日起20年内保证对外提供)。胞质雄性不育系98HA及其保持系98HB测交及自交后代进行育性调查、分子标记的筛选及连锁分析，重组率计算公式为重组率＝重组型植株数/总株数×100％。
(二)分子标记分析 主要利用RAPD标记及SCAR标记。
用CTAB法提取胞质雄性不育系98HA及其保持系98HB的单株DNA(史公军，侯喜林.不结球白菜RAPD反应体系的优化.江西农业大学学报，2004.11～5)首先用含有标记引物OPAX1，引物序列TGCGCTCCTC；和标记引物OPAF12，引物序列GGAACCCACA的300对随机引物对不结球白菜胞质雄性不育系98HA及其保持系98HB的DNA多态性进行初步分析。在PTC-100TM扩增仪上进行PCR扩增，PCR反应体系为20μl，其中10×Buffer 2.0μl，25mMMgCl22.0μl，2mMdNTP1.0μl，10μM引物2.0μl，5单位/μl Taq酶0.2μ1，模板DNA 20ng，5mM TM0.2μl，加ddH2O至20μl。 PCR反应程序为94℃2min预变性后，接着94℃变性45s，37℃退火30s，72℃延伸50s，18个循环，72℃延伸5min，再94℃变性45s，37℃退火30s，72℃延伸50s，25个循环，再72℃5min；PCR产物于1.4％的琼脂糖凝胶上进行电泳分离分析，电泳结束后在UVP成像系统上自动成像，筛选出在不结球白菜胞质雄性不育系98HA及其保持系98HB间的多态性片段。
利用Takara公司的凝胶回收试剂盒回收、纯化特异DNA片段，连接pGEM-T载体，转化感受态大肠杆菌DH5α，筛选、鉴定重组克隆并由Takara公司进行两端测序。
根据测序结果进行SCAR标记引物的设计，利用软件Primer Premier设计18～22bpSCAR引物对SCAX1LTGCGCTCCTCCTTGGTGGTG，SCAX1RTGCGCTCCTCTCCAAAACTA；SCAF12LGGAACCCACAATCCAGAA，SCAF12RGGAACCCACACCAGAGACGCAG，在PTC-100TM扩增仪上进行PCR扩增，PCR反应体系为为20μl，其中10×Buffer2.0μl，25mMMgCl22.0μl，2mMdNTP1.0μl，10μM引物2.0μl，5单位/μl Taq酶0.2μl，模板DNA 20ng，5mM TM0.2μl，加ddH2O至20μl。。PCR反应程序为94℃2min预变性后，接着94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环。PCR产物于1.4％的琼脂糖凝胶上进行电泳分离分析，电泳结束后在UVP成像系统上自动成像，筛选出不结球白菜胞质雄性不育基因的SCAR标记。
(三)结果与分析 分子标记筛选结果表明，共发现2个RAPD标记与不结球白菜胞质雄性不育基因连锁，即用引物OPAX1扩增出的800bp的NAU/RAPD/CMS1800和用引物OPAF12扩增出的600bp的NAU/RAPD/CMS2600。通过设计的SCAR引物对将其分别转化为更为稳定的两个SCAR标记NAU/SCAR/CMS3800和NAU/SCAR/CMS4600，其中引物对SCAX1L和SCAX1R可扩增出800bp的DNA片段，而用引物对SCAF12L和SCAF12R可扩增出600bp的DNA片段。通过对不结球白菜胞质雄性不育系及其保持系后代单株进行连锁分析，发现所筛选到的标记与不结球白菜胞质雄性不育基因紧密连锁(表1)。此外，标记在不同年份，不同环境表现稳定，因此筛选到的与不结球白菜雄性不育基因紧密连锁的分子标记用于辅助选择，可有效开展不结球白菜胞质雄性不育系的选育，大大提高选择效率，从而加快育种进程。
表1标记在胞质雄性不育系98HA及其保持系98HB后代中的分离情况
权利要求
1.不结球白菜胞质雄性不育基因的分子标记方法，其特征在于用标记引物OPAX1，引物序列TGCGCTCCTC扩增不结球白菜胞质雄性不育系或育种材料DNA，如果能够扩增出800bp的片段，则标志着不结球白菜胞质雄性不育基因的存在；或者用标记引物OPAF12，引物序列GGAACCCACA扩增不结球白菜胞质雄性不育系或育种材料DNA，如果能够扩增出600bp的片段，则标志着不结球白菜胞质雄性不育基因的存在；或者用标记引物SCAX1，左端引物序列TGCGCTCCTCCTTGGTGGTG右端引物序列TGCGCTCCTCTCCAAAACTA扩增不结球白菜胞质雄性不育系或育种材料DNA，如果能够扩增出800bp的片段，则标志着不结球白菜胞质雄性不育基因的存在；或者用标记引物SCAF12，左端引物序列GGAACCCACAATCCAGAA右端引物序列GGAACCCACACCAGAGACGCAG扩增不结球白菜胞质雄性不育系或育种材料DNA，如果能够扩增出600bp的片段，则标志着不结球白菜胞质雄性不育基因的存在。
2.根据权利要求1所述不结球白菜胞质雄性不育基因的分子标记方法，其中分子标记引物的筛选过程如下(1)材料选用不结球白菜胞质雄性不育系98HA及其保持系98HB；(2)用CTAB法提取胞质雄性不育系98HA及其保持系98HB的单株DNA；(3)标记引物的筛选用随机引物在PTC-100TM扩增仪上进行PCR扩增，PCR反应体系为20μl，其中10×Buffer2.0μl，25mMMgCl22.0μl，2mMdNTP1.0μl，10μM引物2.0μl，5单位/μl Taq酶0.2μl，模板DNA 20ng，5mM TM0.2μl，加ddH2O至20μl，PCR反应程序为94℃2min预变性后，接着94℃变性45s，37℃退火30s，72℃延伸50s，18个循环，72℃延伸5min，再94℃变性45s，37℃退火30s，72℃延伸50s，25个循环，再72℃5min；PCR产物于1.4％的琼脂糖凝胶上进行电泳分离分析，电泳结束后在UVP成像系统上自动成像，筛选出在不结球白菜胞质雄性不育系98HA及其保持系98HB间的多态性片段，从而获得不结球白菜胞质雄性不育基因800bp的RAPD标记片段和600bp的RAPD标记片段；其用标记引物分别为OPAX1和OPAF12；根据RAPD扩增特异序列的测序结果，利用软件Primer Premier设计两对SCAR引物SCAX1及SCAF12，SCAR标记的筛选是在PTC-100TM扩增仪上进行PCR扩增，PCR反应体系为为20μl，其中10×Buffer2.0μl，25mMMgCl22.0μl，2mMdNTP1.0μl，10μM引物对2.0μl，5单位/μl Taq酶0.2μl，模板DNA20ng，5mM TM0.2μl，加ddH2O至20μl；PCR反应程序为94℃2min预变性后，接着94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环。PCR产物于1.4％的琼脂糖凝胶上进行电泳分离分析，电泳结束后在UVP成像系统上自动成像，筛选出在不结球白菜胞质雄性不育系98HA及其保持系98HB间的多态性片段，从而获得不结球白菜胞质雄性不育基因800bp的SCAR标记片段和600bp的SCAR标记片段，其标记引物分别为SCAX1和SCAF12。
全文摘要
本发明提供了不结球白菜胞质雄性不育基因的分子标记方法，属于分子遗传学领域。对不结球白菜胞质雄性不育系98HA及其保持系98HB进行RAPD及SCAR分子标记的筛选，获得不结球白菜胞质雄性不育基因的两个标记NAU/RAPD/CMS文档编号C12N15/11GK1936022SQ20061008616
公开日2007年3月28日 申请日期2006年9月6日 优先权日2006年9月6日
发明者侯喜林, 史公军 申请人:南京农业大学