专利名称：硅藻的硝酸盐转运蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及来源于硅藻的硝酸盐转运蛋白、硅藻硝酸盐转运蛋白的编码基因，及其在培育转基因植物中的应用。
背景技术：
氮肥是各种作物(尤其是水稻、草坪草、烟草等)生长所必需的肥料。水稻是我国重要的粮食作物，占粮食总产量的44％(凌启鸿等，论水稻生产在我国南方经济发达地区可持续发展中的不可替代作用，《中国稻米》，2004增刊)。氮肥是水稻生长所必需的第一大肥料，随着氮肥施用量的增加，水稻的产量、分蘖数、总叶片数均成明显的增加趋势(潘志高等，水稻强化栽培不同氮肥用量对产量的影响初探，《中国稻米》，2005年第2期)。因此，为提高水稻产量，人们在生产中大量施用氮肥。
草坪草的生长需要16种元素，其中氮素起到重要作用，它对草坪草的色泽、生长势、密度、抗性及恢复力度均有较大影响。如果土壤中没有施加足够的氮肥，草坪草的生长就会减缓，草色也会变浅，甚至变黄，因此培养草坪草时必须定期施加氮肥。
烟草也是我国重要的经济作物，全国烤烟种植面积达1674万亩，全国烟叶收购量保持在210万吨左右，是我国重要的税收来源。氮肥的施用量直接影响到烟叶的产量和品质。近年来，我国烟草产区氮肥的施用量显著增高。
近年来各类作物的的氮肥施用量不断增加，施用量严重超标，但是作物对土壤中氮肥的利用率却很低，对环境造成污染，河流严重富营养化。NAT(Diatom NitrateTransporter)基因，是由Mark Hildebrand从海中生长的硅藻(Cylindrothecafusiformis)中克隆得到的，该基因没有内含子。NAT基因编码的硝酸盐转运蛋白与硝酸盐具有非常高的结合力，可使硅藻从海水中富集硝酸盐。
研究表明，NAT转基因植株具有在低含量硝酸盐土壤中正常生长的能力，NAT可促进转基因植物在低氮土壤中的生长，并在不影响作物产量的前提下，减少或不施用氮肥，避免了环境污染。
目前，人们从植物中已经克隆了多个与氮转运相关的基因，例如从金藻(Isochrysis galbana)中克隆的硝酸盐转运蛋白(IgNRT)基因、氨转运蛋白(IgAMT)基因和谷氨酸盐合成酶(IgGSII)基因，其cDNA长度分别为540bp，658bp和852bp。实时荧光定量PCR检测结果表明，在存在硝酸盐的情况下，IgNRT和IgAMT转录子数量平均为27.6和28.5，氮缺乏时的转录子数量分别增加390％和178％；铵存在时，IgNRT和IgAMT基因的转录受到严重抑制，转录子数量分别降低2.4％和6.5％。比较IgGSII的表达量，在硝酸盐中生长的细胞最高，其次是生长在氮缺乏情况下的细胞(50％)，再次是生长在铵中的细胞(25％)。比较不同硅藻和绿藻中硝酸盐转运蛋白基因的表达情况发现，不同硅藻和绿藻的IgNRT，IgAMT和IgGSII基因的表达方式是相似的，均受到外加氮浓度和氮种类的调控。同源性分析结果表明，金藻IgNRT与硅藻NAT的同源性为47％，与硅藻的氨转运蛋白(CylAMT)的同源性为48％。IgGSII与来源于中肋骨条藻(Skeletonema costatum)的谷氨酸盐合成酶(SGSA)的同源性为61％。
发明内容
本发明的目的是提供一个来源于硅藻的硝酸盐转运蛋白。
本发明所提供的硝酸盐转运蛋白，名称为NAT3，来源于硅藻(Cylindrothecafusiformis)，是下述氨基酸残基序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)将序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加具有硝酸盐转运功能的蛋白质。
序列表中的SEQ ID №1由482个氨基酸残基组成。
编码上述硝酸盐转运蛋白的基因(NAT3)，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №1的DNA序列；3)与序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有硝酸盐转运功能的核苷酸序列；4)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID №2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
所述高严谨条件为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在65℃下杂交并洗膜。
序列表中的SEQ ID №2由1449个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-1449位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列的蛋白质。
含有所述硝酸盐转运蛋白基因NAT3的表达载体、转基因细胞系和宿主菌，以及扩增NAT3中任一片段的引物也属于本发明的保护范围。
本发明的另一个目的是提供一种提高植物氮吸收能力的方法。
本发明所提供的提高植物氮吸收能力的方法，是将所述硝酸盐转运蛋白基因NAT3导入植物组织或细胞，得到氮吸收能力提高的植物。
所述硝酸盐转运蛋白基因NAT3可通过含有所述硝酸盐转运蛋白基因NAT3的植物表达载体导入植物组织或细胞。
用于构建所述植物表达载体的出发载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它的参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区等均具有类似功能。
使用NAT3构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、根部特异表达启动子等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
具体来讲，用于构建所述植物表达载体的出发载体可为pCAMBIA2301、pBI121、pCAMBIA1301或pCAMBIA1300等，优选为pCAMBIA2301。
以pCAMBIA2301为出发载体，构建的植物表达载体为pNAT121。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
携带有本发明NAT3的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。
上述提高植物氮吸收能力的方法对所有植物都适用，既适用于水稻、玉米、小麦等单子叶植物，也适用于烟草、草坪草、拟南芥等双子叶植物。
本发明提供了一个来源于硅藻的硝酸盐转运蛋白NAT3及其编码基因。同源性分析结果表明，该基因与在GenBank上公布的硅藻NAT1基因(GenBank号gi5733416)的核苷酸序列同源性为99.31％，编码蛋白的氨基酸序列同源性为99.76％。NAT3转基因烟草、水稻和草坪草均可在氮元素含量为正常值1/32的培养基上正常生长，表明NAT3可提高植物的氮吸收能力，使植物在低氮条件下仍可正常生长。本发明将在植物氮肥吸收领域及抗低氮植物品种的繁育工作中发挥重要作用，应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
图1为PCR扩增的硅藻硝酸盐转运蛋白基因NAT3的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果图2为阳性克隆质粒pNAT的BamH I酶切鉴定结果图3为中间载体pUC121的Sac I和EcoR I双酶切鉴定结果图4为中间载体pMV121的Hind III和BamH I双酶切鉴定结果图5为中间载体pCV121的Hind III和EcoR I双酶切鉴定结果图6为中间载体pCV121的构建流程7为NAT3植物表达载体pNAT121的构建流程8为NAT3植物表达载体pNAT121的BamH I酶切鉴定结果图9为NAT3转基因烟草的PCR鉴定结果图10为NAT3转基因水稻的PCR鉴定结果图11为NAT3转基因白三叶草的PCR鉴定结果图12为NAT1、NAT3转基因烟草及非转基因烟草在1/32N MS0培养基上的生长情况图13为NAT1、NAT3转基因水稻及非转基因水稻在1/32N营养土上的生长情况图14为NAT1、NAT3转基因白三叶草及非转基因白三叶草在1/32N营养土上的生长情况具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。所用引物均由上海生工合成，所有测序工作均由三博远志生物技术有限责任公司协助完成。
实施例1.硅藻硝酸盐转运蛋白基因NAT3的克隆用下述方法克隆硅藻的硝酸盐转运蛋白基因，具体过程包括以下步骤1.提取硅藻的总RNA使用Invitrogen公司的TRIZOLRReagent试剂盒(Cat.No.15596-026)并参照试剂盒说明书提取硅藻的总RNA，具体方法包括以下步骤1)取50-100mg硅藻，置于液氮中研磨成粉末，转入1.5mL离心管中。
2)加入1mL TRIZOL Reagent充分混匀，室温放置5min。
3)加200μl氯仿，振荡15s，室温放置2-3min，4℃、12000g离心10min。
4)取上清，加入500μl异丙醇，室温放置10min，4℃、12000g离心5min，在离心管底部可见白色片状的RNA沉淀。
5)弃上清，小心加入1mL 70％乙醇，不要破坏RNA片状沉淀，5s后用加样器将液体全部吸出。
6)室温放置5-10min使乙醇挥发(不要让其完全干，否则影响溶解性)，加入20μlDEPC水溶解沉淀，得到硅藻总RNA。
2.反转录合成cDNA以步骤1获得的硅藻总RNA为模板，用Invitrogen公司的GeneRacer试剂盒并参照试剂盒说明书反转录合成其cDNA，具体方法包括以下步骤1)取硅藻总RNA 10μl，加入1μl Gene Racer Oligo dT Primer，1μl dNTPs，1μl无菌蒸馏水。
2)65℃温浴5min以去掉RNA二级结构，冰浴5min，短暂离心。
3)依次加入4μl 5×第一链缓冲液，1μl 0.1M DTT，1μl RNaseOutTM，1μlSuperScriptTMIII RT缓冲液至总体积为20μl，用移液器混匀。
4)短暂离心后，50℃温浴50min。
5)70℃温浴15min，冰上放置2min停止反应，最大转速短暂离心。
6)加入1μl RnaseH，37℃温浴20min。
7)短暂离心，得到cDNA，可立即用于PCR扩增或-20℃保存。
3.目的基因的PCR扩增以步骤2获得的cDNA为模板，在引物P1(上游引物)5’-ATGAGTGGAACTGATGTTGCA-3’和P2(下游引物)5’-TCTTCTCGGTATCAGGTTGGG-3’(引物P1和P2根据NAT1设计)的引导下进行PCR扩增，PCR反应条件为95℃5min；94℃30s，67℃1min，72℃2min，30个循环后，72℃延伸10min。反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1所示(泳道1为λDNA/EcoR I+Hind III分子量Marker，泳道2为PCR扩增产物)，在1449bp处有一明显的扩增条带。
4.冻融法回收PCR扩增产物用冻融法回收步骤3中PCR扩增的长度为1449bp的DNA片段，具体方法包括以下步骤1)将长度约1449bp的目的片段从琼脂糖凝胶上切下，置于一新的离心管中。
2)加入TE缓冲液200μl，在振荡器上振荡5min，再放入液氮中冷冻5min。
3)取出，在65℃下水浴5min。
4)按步骤2)-3)的方法重复冷冻、融化两次。
5)依次用苯酚、苯酚/氯仿(混合比例1∶1)、氯仿抽提，用无水乙醇沉淀DNA，然后加入4ul无菌水溶解沉淀，沉淀即为回收的目的片段。
5.目的片段的克隆及测序用载体pMD18-T(TaKaRa，Cat.No.D504A)试剂盒进行目的片段的克隆，具体方法为取回收的PCR扩增产物4ul，依次加入1ul pMD18-T载体、5ul Ligase SolutionI，然后16℃连接4h。连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，经筛选得到阳性重组克隆，提质粒进行酶切鉴定，鉴定结果如图2所示(泳道1为MarkerλDNA/EcoRI+Hind III，泳道2为酶切产物)，经酶切获得了1449bp的酶切片段，与预期结果一致，将此重组质粒命名为pNAT，再对其进行测序，测序结果表明插入片段具有序列表中SEQ ID №2的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID №2由1449个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-1449位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №2氨基酸残基序列的蛋白质。对该基因序列及其编码的氨基酸残基序列进行比对分析，结果该基因与在GenBank上公布的硅藻NAT1基因(GenBank号gi5733416)的核苷酸序列同源性为99.31％，编码蛋白的氨基酸序列同源性为99.76％，表明获得了硅藻的硝酸盐转运蛋白基因，命名为NAT3，将其编码蛋白命名为NAT3。
实施例2.构建NAT3及硅藻NAT1基因的植物表达载体一、中间载体pCV121的构建参见图6构建中间载体pCV121，具体过程包括以下步骤1.中间载体pUC121的构建用限制性内切酶Sac I和EcoR I对载体pBI121(北京拜尔迪生物技术有限公司)进行双酶切，回收260bp的T-NOS终止子片段，将其与经相同酶双酶切的载体pUC19(购自大连宝生物公司)连接，得到中间载体pUC121。对其用限制性内切酶SacI和EcoRI进行双酶切鉴定，酶切鉴定结果如图3所示(泳道1为MarkerλDNA/EcoR I+Hind III，泳道2和3为酶切产物)，经酶切获得了大小约为260bp的DNA片段，与预期结果相符。
2.中间载体pMV121的构建用限制性内切酶Hind III和BamH I对载体pBI121进行双酶切，回收800bp的P35S启动子片段，将其与经相同酶双酶切的步骤1构建的载体pUC121连接，获得中间载体pMV121。对其用限制性内切酶Hind III和BamH I进行双酶切鉴定，酶切鉴定结果如图4所示(泳道1为酶切产物，泳道2为MarkerλDNA/EcoR I+Hind III)，经酶切获得了大小约为800bp的DNA片段，与预期结果相符。
3.中间载体pCV121的获得用限制性内切酶Hind III和EcoR I对载体pCAMBIA 2301(北京拜尔迪生物技术有限公司)进行双酶切，回收1.0kb的目的片段，将其与经相同酶双酶切的步骤2构建的载体pMV121连接，获得一中间载体，命名为pCV121。对其用限制性内切酶Hind III和EcoR I进行酶切鉴定，酶切鉴定结果如图5所示(泳道1为酶切产物，泳道2为MarkerλDNA/EcoR I+Hind III)，酶切产物片段大小约为1.0kb，与预期结果相符。
二、NAT3植物表达载体pNAT121的获得参见图7构建NAT3的植物表达载体，具体方法为用限制性内切酶BamH I对实施例1构建的携带有NAT3的质粒载体pNAT进行酶切，回收1449bp的NAT3目的片段，将其与经相同酶酶切的步骤一构建的中间载体pCV121进行连接，对连接产物用限制性内切酶BamH I进行酶切鉴定，酶切鉴定结果如图8所示(泳道1为MarkerλDNA/EcoR I+Hind III，泳道2为酶切产物)，酶切产物片段大小为1449bp，与预期结果相符，得到了NAT3的植物表达载体，命名为pNAT121。
用相同方法将硅藻NAT1基因(GenBank号gi5733416)连入中间载体pCV121的BamH I酶切位点，得到硅藻NAT1基因的植物表达载体，命名为pNAT1121。
实施例3.NAT3转基因烟草的氮降低敏感性实验将实施例2构建的植物表达载体pNAT121、pNAT1121分别用冻融法转化根癌农杆菌LBA4404，再用叶盘法将整合有pNAT121的根癌农杆菌LBA4404转化子转化烟草NC89，筛选阳性转基因植株，其中用引物P1(上游引物)5’-ATGAGTGGAACTGATGTTGCA-3’和P2(下游引物)5’-TCTTCTCGGTATCAGGTTGGG-3’对NAT3转基因烟草进行PCR鉴定的结果如图9所示(泳道1为MarkerλDNA/EcoR I+Hind III，泳道2为PCR产物)，阳性转基因植株经PCR扩增可获得1449bp条带，结果获得NAT3、NAT1转基因烟草各10株。将NAT3、NAT1转基因烟草和NC89非转基因烟草(对照，CK)的种子经严格消毒灭菌后，分别播种在MS0[(按常规浓度配制)含大量元素(母液INH4NO3，KNO3，CaCl2·2H2O，MgSO4·7H2O，KH2PO4)，微量元素(母液IIKI，H3BO3，MnSO4·4H2O，ZnSO4·7H2O，Na2MoO4·2H2O，CuSO4·5H2O，CoCl2·6H2O)，铁盐(母液III，FeSO4·7H2O，Na2-EDTA·2H2O)，有机成分(母液肌醇，盐酸吡哆醇(维生素B6)，烟酸，硫胺素(维生素B1)，甘氨酸)，pH 5.8，氢离子浓度为1.585微摩/升]、1/8N(N含量为MS0的1/8，包括氨态氮和硝态氮)、1/16N、1/32N、1/8NO3-(硝态氮含量为MS0的1/8)MS0培养基中，观察NAT3、NAT1转基因烟草和非转基因烟草在不同氮浓度MS0培养基中的生长情况，叶片大小，以及干重、湿重情况，以确定NAT3基因在转基因烟草中的作用。
播种后26d，在MS0，氨态氮、硝态氮含量同时降低及仅硝态氮含量降低的MS0培养基中的NAT3转基因烟草、NAT1转基因烟草和NC89非转基因烟草的生长情况(叶片大小)如表1所示(实验重复3次，每次重复均设2个处理)，在MS0培养基中的NAT3、NAT1转基因烟草、非转基因烟草的生长状况没有明显差别，在1/8N、1/16N培养基中的NAT3转基因烟草与播种在相同培养基中的NAT1转基因烟草、非转基因烟草相比，叶片略大。在1/32N培养基中的NAT3转基因烟草、NAT1转基因烟草、非转基因烟草均严重黄化、生长缓慢，但与NAT1转基因烟草、非转基因烟草相比，NAT3转基因烟草的叶片较大，颜色也绿些，烟草在1/32N MS0培养基上的生长情况如图12所示(左侧瓶非转基因烟草，中间瓶NAT1转基因烟草，右侧瓶NAT3转基因烟草)。在1/8NO3-培养基中的NAT3转基因、NAT1转基因烟草、非转基因烟草均比在MS0培养基中的烟草生长缓慢、叶片发黄，但转基因烟草比非转基因烟草叶片略大，叶色稍深，而且NAT3转基因烟草比NAT1转基因烟草长势更好一些。总体来讲，在MS0氮缺乏培养基中的NAT3转基因烟草、NAT1转基因烟草和非转基因烟草的生长状况差异明显，NAT1转基因烟草比非转基因烟草的叶片大2-3倍，NAT3转基因烟草比NAT1转基因烟草的叶片大1.5-2倍，表明本发明的NAT3较NAT1更能提高植物的氮利用率，使植物在低氮情况下仍能正常生长状况。
播种后61d，称取在MS0，氨态氮、硝态氮含量同时降低及仅硝态氮含量降低的MS0培养基中的NAT3转基因烟草、NAT1转基因烟草和NC89非转基因烟草的湿重，再将各植株放入80℃烘箱烘烤1小时，称取各植株的干重，统计结果如表2所示，在不同氮含量培养基上生长的NAT3转基因烟草的干、湿重均显著高于NAT1转基因烟草及对照植株，进一步证明本发明的NAT3较NAT1更能提高植物的氮利用率，使植物在低氮情况下仍能正常生长。
表1 氨态氮、硝态氮含量同时降低及仅硝态氮含量降低对NAT3、NAT1转基因烟草及非转基因烟草NC89生长情况(叶片大小)的影响
表2 播种后61d在MS0，氨态氮、硝态氮含量同时降低及仅硝态氮含量降低的MS0培养基中的NAT3、NAT1转基因烟草及非转基因烟草NC89的干、湿重统计结果
实施例3 NAT3转基因水稻的抗低氮性检测一、NAT3转基因水稻的获得1.将植物表达载体pNAT121转化水稻(1)水稻成熟胚愈伤组织的诱导a)水稻种子去壳，70％酒精处理1min，然后用20％次氯酸钠溶液表面消毒两次，每次各20min，再用无菌水漂洗3遍。
b)在超净工作台上将上述消毒过的种子接种到愈伤组织诱导培养基上，在22-25℃下暗培养约15d长出愈伤组织，用继代4d的新鲜愈伤组织进行农杆菌侵染。
(2)农杆菌的准备a)挑取含目的质粒的农杆菌单菌落，将其接种于2mL含50mg/L链霉素和50mg/L氨苄青霉素的YEB培养基(Yeast extract 1g/L，Tryptonc 5g/L，蔗糖5g/L，硫酸镁0.98g/L)b)吸取2mL培养物转入50mL含50mg/L链霉素和50mg/L氨苄青霉素的YEB培养基(Yeast extract 1g/L，Tryptonc 5g/L，蔗糖5g/L，硫酸镁0.98g/L)中，28℃、200rpm继续暗培养至OD600值约为1.0。
c)将菌液转至无菌离心管中，5000rpm离心2min。
d)将菌体沉淀用AAM液体培养基(AA盐(20×，250mg/L MgSO4·7H2O+150mg/LCaCl2·2H2O+150mg/L NaH2PO4·H2O+2.95g/L KCl)，氨基酸(谷氨酰胺(Glutamine)876mg/L+天冬氨酸(Aspartic acid)266mg/L+精氨酸(Arginine)174mg/L+甘氨酸(Glycine)7.5mg/L)，MS Vitamins，水解酪蛋白(Casamino acid)1g/L，葡萄糖(Glucose)36g/L，蔗糖(Sucrose)68.5g/L，100μM乙酰丁香酮，pH 5.2。)重悬至OD600值约为1.0，供侵染水稻愈伤组织用。
(3)农杆菌转化水稻a)选步骤(1)获得的直径0.2-0.4cm的愈伤组织颗粒，放入AAM农杆菌悬液中浸泡15-20min。
b)将愈伤组织放在一叠无菌滤纸上吸干，转移到铺有两层无菌滤纸的共培养培养基(N6培养基+100-200μM乙酰丁香酮+10g/L葡萄糖+1mg/L 2，4-D+1.0-1.2％琼脂，pH 5.2)上，在25℃下暗培养2-3d。
c)先用无菌水漂洗愈伤组织5-10次，室温干燥。
d)用无菌滤纸吸干愈伤组织，置培养皿中在室温下干燥0.5-1h。
e)挑选色泽黄亮的愈伤组织，转移到选择培养基上，在25℃下暗培养，两周继代一次。
f)经2-3次继代培养后，将新长出的抗性愈伤组织转移到预分化培养基(MS培养基+2g/L水解酪蛋白+20g/L蔗糖+1mg/L 2，4-D+300-500mg/L噻孢霉素+30mg/L Basta或3-5mg/L Bialaphos+1.0-1.2％琼脂，pH 5.8)上，在25℃下暗培养10d。
g)将抗性愈伤组织转到芽分化培养基(MS培养基+2-3mg/L 6BA(6-Benzyladenin)+2-3mg/L KT(Kinetin)+0.2-0.4mg/L Zeitin+1.0-1.2％琼脂，pH 5.8)上，在25℃下每天10-14h光照培养，10-15d后新鲜愈伤组织上开始有绿点出现，每2-3周继代一次，待长出完整小苗，转入壮苗培养基(1/2MS培养基+2-4mg/L多效唑+1.0-1.2％琼脂，pH 5.8)。
h)从壮苗培养基上剥离幼苗，在清水中浸根炼苗，每天换水一次，约4-5d长出新根后移栽。
2.NAT3转基因水稻的PCR鉴定提取NAT3转基因水稻叶片的基因组DNA并以此为模板，在引物P35’-CCTTCTTCATCTGGTTCGCCA-3’和引物P45’-AGCGGCGGTGTTGTTCAT-3’的引导下进行PCR鉴定，反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图10所示(泳道1为MarkerλDNA/EcoR I+Hind III，泳道2为PCR扩增产物)，NAT3阳性转基因植株可扩增出约700bp的特异性条带，表明NAT3已导入到水稻基因组中并获得表达，得到了NAT3转基因水稻。同时，用上述相同方法获得了转化有pNAT1121的NAT1转基因水稻。
二、转基因水稻的抗低氮性检测将NAT3转基因水稻、NAT1转基因水稻和NC89非转基因水稻幼苗分别播种在正常营养土(全N含量在0.2％左右，速效氮含量在60-200mg/千克)、1/8N(氮含量为正常营养土含量的1/8)、1/16N、1/32N营养土中，观察各植株的生长情况。播种后30d观察发现，移植在正常营养土中的NAT3转基因、NAT1转基因、非转基因水稻的生长状况没有明显差别，1/8N、1/16N营养土中的NAT3转基因水稻与播种在相同营养土中的NAT1转基因水稻、非转基因水稻相比，叶片略大。1/32N营养土中的NAT3转基因水稻、NAT1转基因水稻、非转基因水稻植株逐渐变小，生长缓慢，但与NAT1转基因水稻和非转基因水稻相比，NAT3转基因烟草叶片较大，颜色也绿些，而且NAT3转基因水稻比NAT1转基因水稻长势更好一些，如图13所示(左侧NAT3转基因水稻，中间NAT1转基因水稻，右侧非转基因水稻)，证明本发明的NAT3较NAT1更能提高植物的氮利用率，使植物的抗低氮性得到提高。
实施例5.NAT3转基因草坪草-白三叶草的抗低氮性检测一、NAT3转基因草坪草-白三叶草的获得及PCR鉴定1.将植物表达载体pNAT121转化草坪草采用与实施例4相同的方法将植物表达载体pNAT121转化草坪草-白三叶草。
2.转基因白三叶草的分子生物学检测提取NAT3转基因白三叶草叶片的基因组DNA并以此为模板，在引物P55’TGGAACTGATGTTGCAACTGG 3’和引物P65’TGACAAGACAGAAGACGCACA 3’的引导下进行PCR鉴定，反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图11所示(泳道1为MarkerλDNA/EcoRI+HindIII，泳道2为PCR扩增产物)，NAT3阳性转基因植株可扩增出约1350bp的特异性条带，表明NAT3已导入到白三叶草的基因组中并获得表达，得到了NAT3转基因白三叶草。同时，用上述相同方法获得了NAT1转基因白三叶草。
二、转基因白三叶草的抗低氮性检测将NAT3转基因白三叶草、NAT1转基因白三叶草和NC89非转基因白三叶草的种子经严格灭菌后分别播种在MS0、1/8N、1/16N、1/32N、1/8NO3-MS0培养基中，观察各植株的生长情况。播种后30d观察发现，在MS0培养基中的NAT3转基因白三叶草、NAT1转基因白三叶草、非转基因白三叶草的生长状况没有明显差别，1/8N、1/16N MS0培养基中的NAT3转基因白三叶草与播种在相同培养基中的NAT1转基因白三叶草、非转基因白三叶草相比，叶片略大，植株略高。1/32N MS0培养基中NAT3转基因白三叶草、NAT1转基因白三叶草、非转基因白三叶草均严重黄化、生长迟滞，但与NAT1转基因白三叶草、非转基因白三叶草比较，NAT3转基因白三叶草叶片较大，颜色也绿些。1/8NO3-MS0培养基中的NAT3转基因白三叶草、NAT1转基因白三叶草、非转基因白三叶草均比MS0培养基中的白三叶草生长缓慢、叶片发黄，但转基因白三叶草比非转基因白三叶草的叶片略大，叶色也稍深，而且NAT3转基因草坪草比NAT1转基因白三叶草的长势更好一些，见图14(左侧NAT1转基因白三叶草，右侧NAT3转基因白三叶草)，进一步证明本发明的NAT3较NAT1更能提高植物的氮利用率，使植物的抗低氮性得到提高。
序列表<160>2<210>1<211>482<212>PRT<213>硅藻(Cylindrotheca fusiformis)<400>1Met Ser Gly Thr Asp Val Ala Thr Gly Ala Pro Ala Glu Trp Lys Lys1 5 10 15Tyr Gln Glu Tyr Ser Leu Asp Val Asp Pro Asp Gln Asp Asp Arg Ala20 25 30Thr Glu Ile Lys Leu Cys Asn Phe Ser Arg Pro His Met Arg Ala Phe35 40 45His Phe Ser Trp Ile Gly Phe Phe Ile Ala Phe Phe Ile Trp Phe Ala50 55 60Ile Ala Pro Leu Leu Ser Glu Ile Gln Asp Thr Leu Asp Leu Asp Lys65 70 75 80Lys Glu Val Trp Thr Ser Ser Ile Val Gly Val Gly Gly Thr Ile Phe85 90 95Met Arg Phe Leu Leu Gly Pro Phe Cys Asp Lys Ile Gly Pro Arg Val100 105 110Leu Phe Thr Phe Val Leu Cys Phe Ala Ser Ile Pro Thr Ala Cys Thr115 120 125Gly Phe Val Asn Ser Ala Thr Ser Leu Ala Val Leu Arg Leu Phe Ile130 135 140Gly Thr Ala Gly Gly Thr Phe Val Met Cys Gln Tyr Trp Thr Ser Arg145 150 155 160Met Phe Thr Lys Gln Val Val Gly Thr Ala Asn Ala Leu Val Gly Gly165 170 175
Trp Gly Asn Leu Gly Gly Gly Val Thr Gln Leu Val Met Gly Ser Ala180 185 190Leu Phe Pro Leu Phe Lys Glu Ile Phe Lys Asn Glu Pro Asp Pro Ala195 200 205Glu Thr Ala Trp Arg Trp Val Ser Ile Val Pro Ala Val Val Ala Phe210 215 220Ala Ile Gly Leu Leu Ile Phe Phe Tyr Ser Asp Asp Ala Pro Lys Gly225 230 235 240Asn Tyr Asn Glu Met Lys Lys Asn Gly Ala Met Ala Asp Val Ser Ala245 250 255Ala Ala Ser Phe Arg Thr Gly Ala Leu Asn Leu Asn Thr Trp Phe Leu260 265 270Phe Ile Gln Tyr Ala Cys Cys Phe Gly Val Glu Leu Thr Met Asn Asn275 280 285Ala Ala Ala Leu Tyr Phe Lys Glu Lys Phe Ser Leu Thr Thr Glu Glu290 295 300Ala Ala Ala Ile Ala Ser Ile Phe Gly Trp Met Asn Leu Phe Ala Arg305 310 315 320Gly Ala Gly Gly Phe Leu Ser Asp Lys Ala Asn Ala Arg Met Gly Met325 330 335Arg Gly Arg Leu Trp Thr Gln Thr Ile Leu Leu Ala Cys Glu Gly Ala340 345 350Leu Val Leu Val Phe Ala Asn Thr Gly Ser Leu Thr Gly Ala Ile Val355 360 365Val Met Val Phe Phe Ser Leu Phe Val Gln Ala Ala Glu Gly Ser Ser370 375 380Tyr Gly Ile Val Pro Tyr Val Asp Pro Pro Ala Thr Gly Ala Ile Ala385 390 395 400Gly Ile Ile Gly Ala Gly Gly Asn Thr Gly Ala Val Ala Phe Gly Met405 410 415Gly Phe Arg Gln Leu Asp Tyr Lys Asp Ala Phe Ile Ile Met Gly Ala420 425 430
Val Ile Cys Ala Ser Ser Val Leu Ser Val Phe Ile Cys Ile Pro Gly435 440 445Ser Ser Arg Met Ile Gly Gly Glu Ala Asp Asp Val Gly Ala Lys Asp450 455 460Pro Thr Leu Ser Val Pro Gln Pro Asp Thr Glu Lys Thr Gln Asp Val465 470 475 480Asn Ala<210>2<211>1449<212>DNA<213>硅藻(Cylindrotheca fusiformis)<400>2atgagtggaa ctgatgttgc aactggtgct cctgccgaat ggaagaagta ccaagagtac 60tcccttgacg tcgatcccga tcaagacgac cgggccactg agatcaagct atgtaacttc120tctcggcccc atatgagagc tttccatttc tcatggattg gattcttcat tgccttcttc180atctggttcg ccatcgctcc ccttctcagt gagatccaag atactcttga cttggacaag240aaggaagtct ggacttcatc tattgtcggt gtcggaggta caattttcat gcgtttcctt300ctaggaccgt tctgcgacaa gatcgggccc cgagtcctct tcacctttgt cctttgcttc360gcttctattc ccactgcctg taccggattt gtcaactctg ccacttccct tgccgtcctc420cgattgttca ttggaactgc tggaggtact ttcgtcatgt gccaatattg gaccagccga480atgttcacaa agcaagtggt cggaactgcc aatgctcttg tcggtggatg gggaaatctt540ggaggaggtg tcacgcagct tgtcatggga tcagcgttgt ttccactgtt caaggaaatc600ttcaagaacg agcctgaccc cgctgagact gcgtggcgat gggtttctat cgttcccgcc660gtcgttgcat tcgcaattgg tctcctaatt ttcttctatt ccgacgatgc gcccaaggga720aactacaacg agatgaagaa gaatggggcc atggccgatg tttccgccgc cgcttccttc780cgcaccggag cactcaacct caatacttgg tttttgttca ttcaatacgc atgctgcttc840ggtgtggaac tgaccatgaa caacgccgcc gctctgtact tcaaggagaa gttctcgctg900accactgaag aagcggccgc cattgcctcc atcttcggat ggatgaatct tttcgcccgt960ggcgctggtg gattccttag tgacaaggcc aacgccagga tgggaatgcg tggacgcctt 1020tggactcaga ccatcttgct ggcttgtgag ggtgctcttg tcttggtttt tgccaacaca 1080
ggatcgttga cgggagccat tgtcgttatg gtcttctttt ctctattcgt ccaagccgcc1140gaagggtcct cttatggaat cgtcccctac gttgacccac ccgccactgg ggccattgcc1200ggtatcattg gagctggagg aaacactgga gccgtcgctt ttggaatggg attccgtcag1260ttggactaca aagatgcttt catcatcatg ggagccgtca tctgtgcgtc ttctgtcttg1320tcagtcttca tctgcatccc cggatcgtct agaatgattg gaggagaagc ggatgatgtc1380ggtgccaagg accccacttt gtcggttccc caacctgata ccgagaagac tcaagatgtc1440aatgcctaa1449
权利要求
1.硅藻的硝酸盐转运蛋白，是下述氨基酸残基序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)将序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加具有硝酸盐转运功能的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的硝酸盐转运蛋白，其特征在于所述蛋白具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列。
3.编码权利要求1或2所述硝酸盐转运蛋白的基因。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于所述基因是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №1的DNA序列；3)与序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有硝酸盐转运功能的核苷酸序列；4)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID №2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
5.根据权利要求4所述的基因，其特征在于所述基因具有序列表中SEQ ID №2的DNA序列。
6.含有权利要求3所述基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌。
7.一种提高植物氮吸收能力的方法，是将权利要求3所述的硝酸盐转运蛋白基因导入植物组织或细胞，得到氮吸收能力提高的植物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述硝酸盐转运蛋白基因通过含有所述硝酸盐转运蛋白基因的植物表达载体导入植物组织或细胞；用于构建所述植物表达载体的出发载体为pBI121、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301或pCAMBIA1300。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述植物表达载体为pNAT121。
10.根据权利要求7或8或9所述的方法，其特征在于所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。
全文摘要
本发明公开了一个来源于硅藻的硝酸盐转运蛋白及其编码基因与应用，其目的是提供一个硅藻的硝酸盐转运蛋白及其编码基因与其在转基因植物中的应用。该蛋白是下述氨基酸残基序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)将序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加具有硝酸盐转运功能的蛋白质。转有本发明基因NAT3的烟草、水稻和草坪草均可在氮元素含量为正常值1/32的培养基上正常生长，表明NAT3可提高植物的氮吸收能力，使植物在低氮条件下仍可正常生长。本发明将在植物氮肥吸收领域及抗低氮植物品种的繁育工作中发挥重要作用，应用前景广阔。
文档编号C12N15/82GK1887903SQ20061008882
公开日2007年1月3日 申请日期2006年7月19日 优先权日2006年7月19日
发明者刘昱辉, 贾士荣, 伍祥贵, 包骏 申请人:北京优利康生物农业技术有限公司