专利名称：蛋白质精氨酸甲基转移酶5在白血病细胞检测和治疗中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及蛋白质精氨酸甲基转移酶5(Protein Arginine Methyltransferase 5，PRMT5)的新用途，特别是涉及PRMT5在白血病细胞检测和治疗中的应用。
背景技术：
蛋白质精氨酸甲基化转移酶，即PRMT家族，目前在哺乳动物细胞已发现有8个成员，分别为PRMT1-8。根据底物和反应产物的特异性可将这8个酶分为二类。二类酶的共同特点是都能催化蛋白质精氨酸发生单甲基化；二类酶的不同点在于一类PRMTs能催化蛋白质精氨酸发生不对称性双甲基化，而第二类PRMT能催化精氨酸发生对称性双甲基化。除PRMT5和PRMT7属于第二类催化精氨酸鸟嘌呤基团发生单甲基化和对称性的双甲基化，其它6个酶都属于一类催化精氨酸鸟嘌呤基团发生单甲基化和不对称的双甲基化(Bedford MT，Richard S.Arginine MethylationAn EmergingRegulator of Protein Function.Molecular Cell，2005，18263-272)。
PRMT5又称JBP1、Skb1Hs或Hsl7，最早是通过酵母双杂交分离获得的，在真核生物中从酵母到哺乳动物其蛋白质在进化中高度同源和保守。裂殖酵母PRMT5的同源蛋白Skb1与磷酸激酶Shk1紧密结合，是Shk1的调节子。在酵母中超表达Skb1导致细胞增长，而Skb1缺失突变体却使细胞变短，说明Skb1是细胞周期的负调控因子(Gilbreth，M.，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1998，9514781-14786)。在哺乳动物细胞中，PRMT5与Jak-Stat途径中的酪氨酸蛋白激酶结合，表明PRMT5可能在细胞激动素、生长因子和性激素等信号转导途径中起到重要作用(Pollack BP，etal.The human homologue of the yeast proteins Skb1 and Hsl7p interacts withJak kinases and contains proteinmethyltransferase activity.J Biol Chem 1999，27431531-31542)。PRMT5甲基化神经肌疾病SMA相关的蛋白质(Sm proteins)，参与调控snRNP，包括pre-mRNA的剪接和运输(Friesen，WJ，et al.The methylosome，a 20S complex containing JBP1 and pICln，produces dimethylarginine-modifiedSm proteins.Mol.Cell.Biol.2001，21，8289-8300)。Kwak等发现PRMT5与PRMT1都能催化RNA聚合酶II结合蛋白SPT5上的精氨酸甲基化，以调控基因转录的延长(Kwak，YT，et al.Methylation of SPT5 regulates its interaction with RNApolymerase II and transcriptional elongation properties.Mol.Cell，2003，11，1055-1066.)。最新的研究发现PRMT5不仅在细胞周期调控中起到重要作用，而且还能与组蛋白脱乙酰化酶(HDAC)、染色质重塑蛋白Brg1等相互作用，直接催化组蛋白H3、H4甲基化，表明该酶可能通过调控组蛋白密码子(Histone code)，在染色质重塑和基因的转录调控中发挥重要作用(Pal S，et al.，Human SWI/SNF-AssociatedPRMT5 Methylates Histone H3 Arginine 8 and Negatively Regulates Expressionof ST7 and NM23 Tumor Suppressor Genes；MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY；2004，Vol.24，No.21；9630-9645.)。但是，PRMT5是否与癌症发生和白血病直接相关，目前国内外没有任何报道。
白血病是小儿时期最常见的恶性肿瘤，据统计，我国每年新诊断的儿童白血病约11000人，白血病已经成为小儿时期主要的死亡原因之一。由于化疗方案不断改进，支持治疗的日益完善，白血病的治疗有了很大的提高，儿童急性淋巴细胞白血病(Acute Lymphoblastic Leukemia，ALL)的长期无病生存率达80％以上(BFM-orientedtreatment for children with acute lymphoblastic leukemia without cranialirradiation and treatment reduction for standard risk patientsresults ofDCLSG protocol ALL-8(1991-1996).Leukemia.2002，161099-1111；Improvedoutcome in Childhood acute lymphoblastic leukemia despite reduced use ofanthracyclines and cranial radiotherapyresults of trial ALL-BFM 90.Blood.2000，953310-3322；Long-term results of the Italian Association of PediatricHematology and Oncology(AIEOP)Acute Lymphoblastic Leukemia studies，1982-1995.Leukemia.2000，142196-2204；Children’s Cancer Group trials inchildren acute lymphoblastic leukemia1983-1995.Leukemia.2000，142196-2204)，但是白血病的发病机理仍不清楚，还有一些患儿治疗失败、复发，此外髓性白血病、混合白血病的治疗效果仍不理想。因此，发现和深刻了解白血病的发病机理，将有助于白血病的诊治(Acute Lymphoblastic Leukemia.N Engl J Med 2004，3501535-1548；Biology and Treatment of Childhood T-Lineage AcuteLymphoblastic Leukemia.Blood，1998，91735-746；Treatment of AcuteLymphoblastic Leukemia.N Engl J Med 2006，354166-78)。
RNA干扰技术(RNA interference，简称RNAi)是通过小分子双链RNA(ds RNA)特异性互补靶向基因转录本，从而诱导转录后基因沉默的一种方式。将双链RNA降解成长度为19-25nt的小干扰RNA片段(siRNA，small interfering RNA)，这些小片段会进一步介导与其同源的单链RNA降解，其结构稳定，无须像反义核苷酸那样进行广泛的化学修饰以提高其半衰期，并能在低于反义核苷酸几个数量级的浓度下，使靶基因降低至极低水平甚至完全“敲除”，从而产生缺失突变表型。siRNA的干预效应关键取决于其靶基因序列的选择，任一nt的错误均会导致RNAi效应的丧失，这种高度序列特异性使其对点突变、序列插入和缺失的选择性基因静寂具有重要的药理作用。已证实，RNA干扰技术可单独或与其它现有的治疗手段一同用于突变所致的疾病，如病毒感染，还可以用于治疗肿瘤等。
发明内容
本发明的目的是提供蛋白质精氨酸甲基转移酶5(PRMT5)的新用途，即在白血病细胞检测(包括白血病初期诊断、药物治疗效果、预后残留等)中的应用。
本发明提供了一种PRMT5的新用途，即在白血病细胞检测中的应用。
可用常规的蛋白质免疫杂交(Western blot)、反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、细胞免疫荧光染色(Immunostaining)、免疫组化、流式细胞仪、免疫胶体金等方法检测待测样品骨髓细胞中PRMT5在基因转录及蛋白水平上的表达量，再与正常骨髓细胞中PRMT5的表达量进行比较，若表达量显著增高，则可初步鉴定为白血病细胞。
实验证明，白血病患者骨髓细胞中PRMT5的表达水平显著高于正常骨髓细胞，因此可以PRMT5作为白血病标志物，将PRMT5制成单克隆抗体或与其它抗体搭配应用于临床白血病残留细胞的检测，且具有检测方法简单、快捷、灵敏度高、成本低廉的优点。本发明为白血病细胞检测提供了一条新的途径，在医学领域具有广阔的应用前景。
本发明的另一个目的是提供抑制PRMT5基因表达的小干扰RNA。
本发明所提供的抑制PRMT5基因表达的小干扰RNA，是下述双链RNA序列之1)正义链为序列表中的SEQ ID №1，反义链为序列表中SEQ ID №2；2)正义链为序列表中的SEQ ID №3，反义链为序列表中SEQ ID №4；3)正义链为序列表中的SEQ ID №5，反义链为序列表中SEQ ID №6；4)正义链为序列表中的SEQ ID №7，反义链为序列表中SEQ ID №8。
将上述双链RNA序列命名为PRMT5 siRNA1-4。PRMT5 siRNA1的反义链与PRMT5mRNA距离PRMT5 cDNA起始密码子ATG 288-308位置序列互补，序列表中SEQ ID №1由21个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端，序列表中SEQ ID №2由21个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端；PRMT5 siRNA2的反义链与PRMT5 mRNA距离PRMT5 cDNA起始密码子ATG 626-646位置序列互补，序列表中SEQ ID№3由21个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端，序列表中SEQ ID №4由21个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端；PRMT5 siRNA3的反义链与PRMT5 mRNA距离PRMT5 cDNA起始密码子ATG 852-872位置序列互补，序列表中SEQID №5由21个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端，序列表中SEQ ID№6由21个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端；PRMT5 siRNA4的反义链与PRMT5 mRNA距离PRMT5 cDNA起始密码子ATG 1228-1248位置序列互补，序列表中SEQ ID №7由21个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端，序列表中SEQ ID №8由21个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端。
上述抑制PRMT5表达的小干扰RNA的编码基因也属于本发明的保护范围。它为下述双链核苷酸序列之一1)正义链具有序列表中SEQ ID №9的核苷酸序列或在高严谨条件下与序列表中SEQ ID №9限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；反义链具有序列表中SEQ ID №10的核苷酸序列或在高严谨条件下与序列表中SEQ ID №10限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；2)正义链具有序列表中SEQ ID №11的核苷酸序列或在高严谨条件下与序列表中SEQ ID №11限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；反义链具有序列表中SEQ ID№12的核苷酸序列或在高严谨条件下与序列表中SEQ ID №12限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；3)正义链具有序列表中SEQ ID №13的核苷酸序列或在高严谨条件下与序列表中SEQ ID №13限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；反义链具有序列表中SEQ ID№14的核苷酸序列或在高严谨条件下与序列表中SEQ ID №14限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；4)正义链具有序列表中SEQ ID №15的核苷酸序列或在高严谨条件下与序列表中SEQ ID №15限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；反义链具有序列表中SEQ ID№16的核苷酸序列或在高严谨条件下与序列表中SEQ ID №16限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
序列表中SEQ ID №9由58个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端；序列表中SEQ ID №10由62个碱基组成，序列的方向从左至右为3′端→5′端；序列表中SEQ ID №11由58个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端；序列表中SEQ ID №12由62个碱基组成，序列的方向从左至右为3′端→5′端；序列表中SEQ ID №13由58个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端；序列表中SEQ ID №14由62个碱基组成，序列的方向从左至右为3′端→5′端；序列表中SEQ ID №15由58个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端；序列表中SEQ ID №16由62个碱基组成，序列的方向从左至右为3′端→5′端。
含有抑制PRMT5表达的小干扰RNA编码基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌以及扩增抑制PRMT5表达的小干扰RNA编码基因中任一片段的引物也属于本发明的保护范围。
本发明的另一个目的是提供一种抑制PRMT5基因表达的方法。
本发明所提供的抑制PRMT5基因表达的方法，是将所述PRMT5基因的小干扰RNA的编码基因导入宿主，从而抑制PRMT5基因表达。
所述抑制PRMT5基因表达的小干扰RNA的编码基因可通过含有所述抑制PRMT5基因表达的小干扰RNA的编码基因的siRNA表达载体导入宿主；用于构建所述siRNA表达载体的出发载体可为任意一种可在宿主中表达外源基因的载体，如pNeoU6+1、pSilence1.0-U6(美国Ambion公司)或pSilencerTM3.1-H1(美国Ambion公司)等。
以pNeoU6+1为出发载体，构建的PRMT5基因的siRNA表达载体为pDs288、pDs626、pDs852或pDs1228。
本发明的RNAi表达载体可按常规方法构建。
本发明提供了PRMT5的新用途，即在白血病细胞检测(包括白血病初期诊断、药物治疗效果、预后残留等)中的应用。实验证明，白血病患者骨髓细胞中PRMT5的表达水平显著高于正常骨髓细胞，因此可以PRMT5作为白血病标志物，将PRMT5制成单克隆抗体或与其它抗体搭配应用于临床白血病残留细胞的检测，且具有检测方法简单、快捷、灵敏度高、成本低廉的优点。此外，本发明还提供了抑制PRMT5基因表达的小干扰RNA。实验证明，本发明的小干扰RNA对PRMT5基因具有显著的抑制作用，此外，通过沉默PRMT5基因，可以抑制PRMT5基因缺失细胞的增殖，表明PRMT5基因可以作为治疗白血病及肿瘤的药物靶标。因此可以以抑制PRMT5基因表达的小干扰RNA的编码序列作为活性成分制备成白血病及肿瘤治疗性药物。本发明在医学和生物制药领域具有较大的实际意义和广阔的应用前景。
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
图1为白血病患儿骨髓细胞中PRMT5表达情况的Western blot检测结果图2为白血病患儿骨髓细胞中PRMT5表达情况的RT-PCR检测结果图3为白血病患儿骨髓细胞中PRMT5表达情况的流式细胞仪检测结果图4为白血病患儿骨髓细胞中PRMT5表达情况的免疫染色检测结果图5为siRNA抑制PRMT5在细胞中的表达的Western Blot检测结果及其抑制肿瘤细胞生长的克隆形成实验结果
具体实施例方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。所有序列均由北京博亚生物技术公司合成。
临床标本收集从2003年9月至2006年3月期间住院治疗的149名初诊白血病患儿、23名缓解(Complete Remission，CR)患儿、25名停药儿童、13名特发性减少性血小板紫癜(Idiopathic Thrombocytopenic Purpura，ITP)患儿的骨髓，以及24名外科矫形儿童(正常对照组)的骨髓，所有患儿均经临床、形态学、细胞化学染色及免疫学确诊，诊断与分型标准按全国统一标准(参见小儿急性白血病诊疗建议”中华儿科杂志，1999，Vol137(5)305-307)。患儿及对照儿童的具体资料如下(1)初诊白血病患儿共选初诊白血病患儿149名，男88名，女61名，男女比例1.44∶1。年龄0.3-16岁，均数6.87岁。其中，急性淋巴细胞白血病(Acute Lymphoblastic Leukemia，ALL)患儿129名，包括T-ALL患儿27名、前前B-ALL患儿9名、前B-ALL患儿5名、普通B-ALL患儿86名、成熟B-ALL患儿2名；非淋巴细胞白血病患儿17名，包括急性髓性细胞白血病(Acute Myeloid Leukemia，AML)10名、慢性粒细胞白血病(ChronicMyelogenous Leukemia，CML)患儿7名；双表型急性白血病(Biphenotypic AcuteLeukemia，BAL)3名。
采用多重巢式RT-PCR方法可以检测出29种染色体结构畸变形成的基因，所有白血病患儿中，检测结果呈阴性的白血病患儿74名，检测结果呈阳性的白血病患儿75名，其中BCR-ABL融合基因阳性白血病患儿13名，TEL-AML1融合基因阳性白血病患儿23名，HOX11活化的白血病患儿27名，E2A-PBX1融合基因阳性白血病患儿6名、AML1-ETO融合基因阳性白血病患儿3名、PML-RARα融合基因阳性白血病患儿1名，del(1)(p34；p34)阳性的白血病患儿2名。
(2)缓解(CR)患儿由两部分组成，初诊白血病患儿中经过治疗已经缓解3个月的患儿15人，初诊白血病患儿中经过治疗已经缓解约12个月的患儿18人(其中10人与缓解3个月的患儿为同一人群)。
(3)停药儿童停药儿童25名，男15名，女10名。年龄6-17岁，均数10.94岁。
(4)对照组儿童由两部分组成，一部分为外科矫形儿童24人，均无血液系统疾病、近期无感染、及其它疾病(除本身畸形外)，其中男14名，女10名，年龄3-14岁，均数7.87岁；另一部分为ITP儿童13人，男8名，女5名，年龄2.6-10岁，均数4.62岁。
实施例1、检测白血病患儿骨髓细胞中PRMT5的表达情况一、白血病患儿骨髓细胞中PRMT5表达情况的Western blot检测1、采集骨髓采集上述149名初诊白血病患儿、23名缓解患儿、25名停药儿童、13名特发性减少性血小板紫癜患儿的骨髓，以及北京儿童医院外科矫形24名儿童(正常对照组)的骨髓，具体方法如下从初诊白血病患儿、缓解患儿、停药儿童和对照组儿童的不同部位(如胸骨、髂骨、胸椎或胫骨)，在无菌条件下抽取骨髓2mL，加乙二胺四乙酸盐(EDTA)抗凝。骨髓标本的采集要求EDTA抗凝，骨髓量大于2mL，无血凝块，标本存放时间小于24小时。
2、提取单个核细胞从采集的骨髓中提取单个核细胞，包括以下步骤A、裂解红细胞取2mL骨髓标本，放入提取管中，往提取管中加入10mL红细胞裂解液(EDTA钠盐20mg、氯化铵4.2g、碳酸氢钾0.5g，加蒸馏水定容至500mL)，与骨髓充分混合，室温放置3分钟，1000rpm常温离心3分钟。离心结束，弃去上层液体。
B、观察提取管底层提取的单个核细胞，如其中混有较多红细胞，可重复步骤A1-2次，去除多余红细胞。
C、洗涤裂解液取10mL生理盐水放入提取管中，用吸管吹打底层细胞，使其与生理盐水充分混合，1000rpm常温离心3分钟，离心结束，弃去上层液体。
D、向提取管中加入少量生理盐水，用吸管吹打，使其与底层细胞混合，转移至1.5mL EP储存管中，4000rpm常温离心5秒钟，弃去上层生理盐水，提取的单个核细胞数应在107个数量级。
E、将提取好的单个核细胞标本存放于-76℃冰箱，备用。
3、超声裂解细胞提取蛋白质A、从-76℃冰箱取出保存的单个核细胞，对每个EP试管编号，然后根据细胞量的多少加入150-400ul的RIPB裂解液(2×贮存液2mL Triton X-100、6mL 5M NaCl、8mL 0.5M Na2HPO4调节溶液的pH值至7.4，加蒸馏水定容至100mL。使用液10mL 2×贮存液加10mL PBS液再加2片罗氏Complete药片。)。
B、在冰上进行超声细胞，将超声仪器的振幅设置为40％，根据细胞量多少调节超声时间，一般设置为15秒。
C、每超声一个标本后，用蒸馏水冲洗探头，并在冰水中冷却5分钟后，再超声下一个标本。
D、将超声后的标本用4℃高速离心机，12000rpm离心10分钟。
E、取上清液转移至另一个相应的EP试管中，编号。
4、测定待测蛋白样品的浓度用BCA试剂盒(购自美国PIETCE公司)并参照试剂盒说明书测定样品的浓度。
5、SDS-PAGE电泳及转膜对待测蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，先在电压80V下电泳10-30分钟，待染料前沿进入分离胶后，将电压提高到160V继续电泳约1小时，直至溴酚蓝到达分离胶的底部。电泳结束后，用电转移法将分离的蛋白样品转移至硝酸纤维素膜(NC膜)，400mA(100V)，1小时(或350mA(95V)，1.5小时)。
6、Western blot检测用常规方法进行Western blot检测，其中PRMT5多克隆抗体购自美国Upstate公司，Tubulin单克隆抗体(内参)购自Sigma公司，ECL显色试剂盒(购自瑞典Amersham公司)，检测结果如图1所示(泳道1为作为阳性对照的直肠癌细胞，泳道2为正常骨髓细胞，泳道3-7为初诊白血病患儿样本，泳道8-13为缓解患儿样本)，93.95％的初诊白血病患儿的骨髓细胞中PRMT5蛋白表达量显著增高，而缓解患儿、停药患儿、正常矫形儿童和ITP患儿中均未发现PRMT5蛋白表达量增高。
二、白血病患儿骨髓细胞中PRMT5表达情况的RT-PCR检测现对29名初诊白血病患儿、23名缓解患儿、25名停药儿童、13名特发性减少性血小板紫癜患儿的骨髓，以及北京儿童医院外科矫形24名儿童骨髓细胞中PRMT5的表达情况进行RT-PCR检测，具体方法包括以下步骤1、设计引物根据GeneBank中PRMT5基因的cDNA序列(BC025979)设计PCR扩增产物长度为210bp的引物，引物序列如下P1(上游引物)5’-AGCCAGAACCGTCCTCCACC-3’P2(下游引物)5’-CAGCACCATCAGTACCTGGAC-3’；同时以长度为310bp的ABL基因的PCR扩增产物为内对照，引物序列如下P3(上游引物)5’-CCTTCAGCGGCCAGTAGC-3’P4(下游引物)5’-GGACACAGGCCCATGGTAC-3’2、骨髓采集及单个核细胞的提取方法与步骤一相同。
3、Trizol法提取单个核细胞的总RNA用Trizol试剂并参照产品说明书提取单个核细胞的总RNA，包括以下步骤a、将单个核细胞从-70℃冰箱取出，立即加TRIzol试剂1mL，反复吹打混匀，置室温5分钟使细胞溶解。
b、每1mL TRIzol加氯仿0.2mL，剧烈振摇15秒钟，置室温3分钟。4℃、12000rpm离心15分钟。
c、仔细吸取上层水相，转移至另一EP管(无RNase)中，加0.5mL异丙醇，颠倒混匀3-4次，置室温10分钟。4℃、12000rpm离心10分钟。
d、弃上清，加75％乙醇1mL，摇振，充分洗涤沉淀，4℃、7500rpm离心5分钟。彻底吸去上清，37℃干燥，将沉淀重悬于约20μl DEPC水中。
f、按1∶1000比例稀释RNA(1μl RNA+1000μl DEPC水)，通过分光光度法测定样品OD260及OD280，OD260/OD280比值应大于或等于1.8，否则重新提取样品。
RNA浓度(μg/μl)＝OD260×40×稀释倍数/1000＝OD260×404、cDNA的合成以步骤3提取的单个核细胞的总RNA为模板，用RNA反转录试剂盒(购自Promega公司)并参照产品说明书逆转录合成其cDNA。
5、PCR反应以步骤4反转录合成的cDNA为模板，在引物P1和P2的引导下PCR扩增PRMT5基因的cDNA片段，12.5μl PCR反应体系为5×ABI缓冲液II(购自美国应用生物系统公司)2.5μl，1.5mmol/L MgCl2，0.2mmol/L dNTPs，引物P1、P2各800nM，cDNA 1μl，TaqDNA聚合酶1.25U。PCR反应条件为先95℃预变性5分钟；然后94℃变性40秒，60℃退火30秒，72℃延伸60秒，共30个循环；最后72℃继续反应15分钟。反应结束后，4℃保存。
同时以广泛表达的ABL基因片段为作为内对照，12.5μl PCR反应体系为5×ABI缓冲液II2.5μl，2.5mmol/L MgCl2，0.2mmol/L dNTPs，引物P3、P4各400nM，cDNA 1μl，TaqDNA聚合酶1.25U。PCR反应条件先95℃预变性5分钟；然后94℃变性30秒，65℃退火60秒，72℃延伸60秒，共35个循环；最后72℃继续反应15分钟。反应结束后，4℃保存。
6、聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染色对步骤5的PCR扩增产物进行6％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，然后进行银染色，染色方法为A、将聚丙烯酰胺凝胶在固定液(10％乙醇，1％硝酸)中固定5分钟。回收固定液，用去离子水漂洗2遍。将凝胶在染色液(0.5mL 20％AgNO3蒸馏水稀释液至50mL，加入30μL甲醛(37％)，混匀)中作用10分钟。倾去染色液，去离子水漂洗2遍。
B、将凝胶在显色液中作用至显出清晰条带为止。倾去显色液(3％Na2CO350mL加入30μL甲醛(37％)和30μL Na2S2O3(10mg/mL)，混匀)，用去离子水漂洗2遍。
C、将凝胶在10％乙酸终止液中作用10-15分钟以终止显色反应。回收终止液，将凝胶用去离子水漂洗1遍。
D、以玻璃纸封胶，至于4℃冰箱中干燥。
结果如图2所示(泳道1-2为正常骨髓细胞对照，泳道3-4为初诊白血病患儿样本，泳道5为Marker)，29名初诊白血病患儿中的27人检测到强弱不等的PRMT5 mRNA表达，2人未检测到PRMT5 mRNA表达，并且步骤一的Western blot检测结果表明这2人也未检测到PRMT5蛋白表达量增高，检测结果相符；同时比较初诊白血病患儿与CR患儿的PRMT5 mRNA表达情况，发现初诊患儿PRMT5的mRNA表达水平明显高于CR患儿，说明白血病细胞的PRMT5在mRNA和蛋白水平的表达量均增高。
三、白血病患儿骨髓细胞中PRMT5表达情况的流式细胞仪检测采集上述部分初诊白血病患儿及缓解患儿的骨髓，骨髓采集方法见步骤一，然后对骨髓细胞中PRMT5的表达情况进行流式细胞仪检测，具体方法包括以下步骤1)差异梯度离心法提取单个核细胞A、用1×PBS或生理盐水稀释骨髓2∶1(2∶1，PBS∶骨髓)。
B、将稀释后的骨髓沿试管壁徐徐加入4mL淋巴细胞分液Ficoll的液面上，勿用力过大，以免造成骨髓液与分离液混合，保持清晰的分层状态。
C、在室温(18-20℃)下2000rpm离心30分钟后可见试管内的骨髓清楚地分为4层上层为血浆层，中层为分离液层(单个核细胞所处于血浆层和分离液层中间)，底层为红细胞层，红细胞上层为粒细胞层。
D、用吸管将上层与中层之间的单个核细胞吸出收集到另一个试管中，用PBS洗2遍，每次均以1500rpm离心10分钟，弃去上清后，得到高纯度的单个核细胞悬液。
2)取两支试管，每个试管中加入1×106单个核细胞悬液进行免疫染色。细胞固定和免疫染色过程参照文献(Bao S，et al.Oncogene，2004，23(33)5586-93).其中PRMT5多克隆抗体购自Upstate，Cy3标记的羊抗兔二抗购自美国JacksonImmunoResearch Laboratories Inc。3)免疫染色的细胞，用流式细胞仪检测。
结果如图3所示，正常骨髓细胞中98.03％细胞微弱表达PRMT5，仅有1.96％细胞PRMT5表达增高；而白血病细胞中0.93％的细胞微弱表达PRMT5，99.07％的细胞表达PRMT5增强。这证明初诊白血病患儿骨髓细胞中PRMT5的表达水平较对照组儿童显著增高，从而进一步证明PRMT5在白血病细胞中的表达量增高。
四、免疫组织化学染色法对PRMT5在白血病细胞中的表达进行检测对部分初诊白血病患儿、缓解患儿、正常对照儿童的骨髓细胞进行免疫组织化学染色，具体方法包括以下步骤1)采集骨髓细胞及差异梯度离心法提取单个核细胞方法与实施例1相同。
2)用含4％多聚甲醛的PBS固定细胞，石蜡包埋，切片，厚为4um。
3)对切片进行常规梯度脱蜡将切片置于二甲苯甲20分钟，再到二甲苯乙20分钟，后放入无水酒精5分钟，然后依次倒95％酒精、80％酒精、蒸馏水各1分钟。
4)PBS冲洗切片3次，每次3分钟，加入3％过氧化氢，在孵育盒37℃孵育10分钟，以消除内源性过氧化酶活性。
5)对切片用蒸馏水冲洗，PBS冲洗3次，每次3分钟，用高压锅121℃加热90秒，滴加正常山羊血清(封闭)，室温孵育15分钟。
6)弃去正常山羊血清，勿洗，滴加按1∶200比例稀释的PRMT5(一抗)，4℃12-24小时(阴性对照以PBS代替一抗)。
7)PBS冲洗，3分钟×3次，滴加SP-9001生物素标记羊抗兔抗体(二抗，购自福州迈新生物技术开发有限公司)，在37℃孵育15分钟，PBS冲洗3次，每次3分钟。
8)滴加辣根酶标记链酶卵白素工作液(购自福州迈新生物技术开发有限公司，三抗)，在37℃孵育15分钟，然后PBS冲洗3次，每次3分钟。
9)加DAB显色剂(购自北京中杉金桥生物技术有限公司)显色，显色后用自来水冲洗5分钟，苏木素复染，封片。
结果如图4所示(1为正常对照组，2为初诊白血病患儿组)，与正常对照组相比，缓解患儿骨髓细胞中有微量的PRMT5表达，初诊白血病患儿骨髓细胞中的PRMT5大量表达，与上述检测结果一致，进一步证明PRMT5在白血病细胞中的表达量增高。
实施例2、检测PRMT5的siRNA对肿瘤细胞的抑制作用一、PRMT5 siRNA的设计及其编码DNA的合成1、PRMT5 siRNA的设计根据PRMT 5mRNA的其中四个区段(288-308(ggagaagattcgcaggaactc)，626-646(gggctgacctcccatctaatc)，852-872(ggaatacttaagccagaaccg)，1228-1248(ggaagccaagtgaccgtagtc))设计出四对siRNA，序列如下siRNA1
正义链5’-ggagaagauucgcaggaacuc-3’(序列表中序列1)反义链5’-gaguuccugcgaaucuucucc-3’(序列表中序列2)；siRNA2正义链5’-gggcugaccucccaucuaauc-3’(序列表中序列3)反义链5’-gauuagaugggaggucagccc-3’(序列表中序列4)；siRNA3正义链5’-ggaauacuuaagccagaaccg-3’(序列表中序列5)反义链5’-cgguucuggcuuaaguauucc-3’(序列表中序列6)；siRNA4正义链5’-ggaagccaagugaccguaguc-3’(序列表中序列7)反义链5’-gacuacggucacuuggcuucc-3’(序列表中序列8)。
2、述PRMT5 siRNA编码基因的合成再根据上述四对PRMT5 siRNA序列合成构建抑制PRMT5表达的siRNA表达载体所需的互补DNA序列，序列如下第一对PRMT5-dsRNA288-15’-gagaagattcgcaggaactcTTCAAGAGAgagttcctgcgaatcttctccTTTTTTTA-3’(序列表中的序列9)，PRMT5-dsRNA288-23’-AGCTTAAAAAAAggagaagattcgcaggaactcTCTCTTGAAgagttcctgcgaatcttctc-5’(序列表中的序列10)；第二对PRMT5-dsRNA626-15’-ggctgacctcccatctaatcTTCAAGAGAgattagatgggaggtcagcccTTTTTTTA-3’(序列表中的序列11)，PRMT5-dsRNA626-23’-AGCTTAAAAAAAgggctgacctcccatctaatcTCTCTTGAAgattagatgggaggtcagcc-5’(序列表中的序列12)；第三对PRMT5-dsRNA852-15’-gaatacttaagccagaaccgTTCAAGAGAcggttctggcttaagtattccTTTTTTTA-3’(序列表中的序列13)，
PRMT5-dsRNA852-23’-AGCTTAAAAAAAggaatacttaagccagaaccgTCTCTTGAAcggttctggcttaagtattc-5’(序列表中的序列14)；第四对PRMT5-dsRNA1228-15’-gaagccaagtgaccgtagtcTTCAAGAGAgactacggtcacttggcttccTTTTTTTA-3’(序列表中的序列15)，PRMT5-dsRNA1228-23’-AGCTTAAAAAAAggaagccaagtgaccgtagtcTCTCTTGAAgactacggtcacttggcttc-5’(序列表中的序列16)。
然后将合成的四对单链DNA序列分别在沸水中变性10分钟，然后慢慢冷却至室温，使四对单链DNA退火形成四条双链DNA片段。
二、PRMT5 siRNA表达载体的构建将步骤一合成的四条双链DNA片段分别插入到载体pNeoU6+1(pNeoU6+1载体和克隆方法参照文献Bao S，et al.Oncogene，2004，23(33)5586-93)中，得到四种PRMT5 siRNA的表达质粒，分别命名为pDs288、pDs626、pDs852和pDs1228。用Qiangen质粒提取试剂盒大量制备质粒DNA，测定质粒浓度，用于真核细胞转染。
三、检测PRMT5 siRNA对肿瘤细胞中PRMT5表达的抑制情况1、GFP-PRMT5融合蛋白表达载体的构建以人PRMT5的全长cDNA(NCBIBC025979，购自美国OpenBiosystem公司)为模板，在引物P1(5’-cgggatccatggcggcgatggcggtcg-3’)和P2(5’-ccgctcgaggaggccaatggtatatgagc-3’)的引导下PCR扩增PRMT5全长cDNA序列，再将该序列克隆到载体pEGFP-C1(购自Clonetech)多克隆位点的Bgl II和Xho I限制性内切酶酶切位点之间，得到GFP-PRMT5融合蛋白表达载体，命名为pGFP-PRMT5。
2、转染细胞1)转染用细胞的培养转染前24h，在60mm培养皿中培养直肠癌细胞系HCT116(购自美国ATCC，Bao S，et al.Oncogene，2004，23(33)5586-93)，密度达到70％时进行转染。
2)转染细胞对照组pGFP-PRMT5(0.3ug)+pDslucif(2.7ug，沉默Luciferase基因的对照siRNA表达质粒，构建方法参照文献Bao S，et al.Oncogene，2004，23(33)5586-93)。
实验组pGFP-PRMT5(0.3ug)+步骤二构建的siRNA表达质粒(pDs288、pDs626、pDs852或pDs1228)2.7ug。
用Invitrogen公司的Lipofectamine2000(Cat11668-027)试剂盒并参照试剂盒说明书将上述质粒组合瞬时转染HCT116细胞。
3、转染细胞中PRMT5表达情况的Western Blot检测转染36h后，用Western Blot法检测上述5种转染细胞中PRMT5的表达情况，蛋白提取方法为吸去培养基，将细胞用冷PBS洗两遍，加300ul RIPA缓冲液(50mMTris pH7.5，150mM NaCl，10mM EDTA，1％NP-40，0.1％SDS，1mM PMSF，10μg/mLAprotinin)，4℃裂解30min，收集细胞；8V电压超声15秒，冰浴10min；4℃，12000rpm离心10min。吸取上清，利用Brandford法进行蛋白定量，然后各取50ug总蛋白进行检测，以GFP为参照，检测结果见图5中的a图，针对PRMT5设计的四对siRNA都能有效地降低或抑制肿瘤细胞中PRMT5的表达水平，其中以siRNA1(288-308(ggagaagattcgcaggaactc))的抑制效果最为显著(见图5中的图b，以Tubulin为参照)。
四、检测PRMT5 siRNA对肿瘤细胞生长的抑制情况以能有效沉默PRMT5的siRNA表达载体pDs288为例，通过细胞克隆存活实验检测其对癌细胞生长的影响，具体方法为将pDs288和pDslucif分别转染HCT116细胞，24小时后计数，20000个细胞/100mm培养皿，每个样本平行三份，加入终浓度为400ug/mL的新霉素(G418，购自Gibco公司)，培养14-20天至细胞形成直径大小为2mm左右的克隆，见图5中的图c，转染pDs288的癌细胞的生长得到显著抑制，并最终被杀死，证明本发明针对PRMT5设计的siRNA能有效地抑制或杀死肿瘤细胞。
序列表<160>16<210>1<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1ggagaagauu cgcaggaacu c21<210>2<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2gaguuccugc gaaucuucuc c21<210>3<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3gggcugaccu cccaucuaau c21<210>4<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>4gauuagaugg gaggucagcc c21<210>5<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>5ggaauacuua agccagaacc g21<210>6<211>21<212>RNA<213>人工序列
<220>
<223>
<400>6cgguucuggc uuaaguauuc c21<210>7<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>7ggaagccaag ugaccguagu c21<210>8<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>8gacuacgguc acuuggcuuc c21<210>9<211>58<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>
<400>9gagaagattc gcaggaactc ttcaagagag agttcctgcg aatcttctcc ttttttta58<210>10<211>62<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>10agcttaaaaa aaggagaaga ttcgcaggaa ctctctcttg aagagttcct gcgaatcttc 60tc 62<210>11<211>58<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>11ggctgacctc ccatctaatc ttcaagagag attagatggg aggtcagccc ttttttta58<210>12<211>62
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>12agcttaaaaa aagggctgac ctcccatcta atctctcttg aagattagat gggaggtcag 60cc 62<210>13<211>58<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>13gaatacttaa gccagaaccg ttcaagagac ggttctggct taagtattcc ttttttta58<210>14<211>62<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>14agcttaaaaa aaggaatact taagccagaa ccgtctcttg aacggttctg gcttaagtat 60tc 62
<210>15<211>58<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>15gaagccaagt gaccgtagtc ttcaagagag actacggtca cttggcttcc ttttttta58<210>16<211>62<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>16agcttaaaaa aaggaagcca agtgaccgta gtctctcttg aagactacgg tcacttggct 60tc 6权利要求
1.蛋白质精氨酸甲基转移酶5在白血病检测中的应用。
2.抑制蛋白质精氨酸甲基转移酶5基因表达的小干扰RNA，是下述双链RNA序列之一1)正义链为序列表中的SEQ ID №1，反义链为序列表中SEQ ID №2；2)正义链为序列表中的SEQ ID №3，反义链为序列表中SEQ ID №4；3)正义链为序列表中的SEQ ID №5，反义链为序列表中SEQ ID №6；4)正义链为序列表中的SEQ ID №7，反义链为序列表中SEQ ID №8。
3.权利要求2所述的抑制蛋白质精氨酸甲基转移酶5基因表达的小干扰RNA的编码序列。
4.根据权利要求3所述的编码序列，其特征在于所述抑制蛋白质精氨酸甲基转移酶5基因表达的小干扰RNA的编码序列是下述双链核苷酸序列之一1)正义链具有序列表中SEQ ID №9的核苷酸序列；反义链具有序列表中SEQ ID№10的核苷酸序列；2)正义链具有序列表中SEQ ID №11的核苷酸序列；反义链具有序列表中SEQID №12的核苷酸序列；3)正义链具有序列表中SEQ ID №13的核苷酸序列；反义链具有序列表中SEQID №14的核苷酸序列；4)正义链具有序列表中SEQ ID №15的核苷酸序列；反义链具有序列表中SEQID №16的核苷酸序列。
5.含有权利要求3或4所述编码序列的表达载体。
6.含有权利要求5所述表达载体的转基因细胞系。
7.含有权利要求5所述表达载体的宿主菌。
8.一种抑制蛋白质精氨酸甲基转移酶5基因表达的方法，是将权利要求3或4所述的抑制蛋白质精氨酸甲基转移酶5基因表达的小干扰RNA的编码序列导入宿主中，蛋白质精氨酸甲基转移酶5基因得到抑制。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述抑制蛋白质精氨酸甲基转移酶5基因表达的小干扰RNA的编码序列通过含有所述抑制蛋白质精氨酸甲基转移酶5基因表达的小干扰RNA编码序列的siRNA表达载体导入宿主；所述含有抑制蛋白质精氨酸甲基转移酶5基因表达的小干扰RNA编码基因的siRNA表达载体为pDs288、pDs626、pDs852或pDs1228。
10.权利要求2所述的抑制蛋白质精氨酸甲基转移酶5基因表达的小干扰RNA在制备白血病治疗性药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了PRMT5在白血病细胞检测和治疗中的应用。本发明还提供了抑制PRMT5基因表达的小干扰RNA。实验证明，本发明的小干扰RNA对PRMT5基因具有显著的抑制作用，此外，通过沉默PRMT5基因，可以抑制PRMT5基因缺失细胞的增殖，表明PRMT5基因可以作为治疗白血病及肿瘤的药物靶标。因此可以以抑制PRMT5基因表达的小干扰RNA的编码序列作为活性成分制备成白血病及肿瘤治疗性药物。本发明在医学和生物制药领域具有较大的实际意义和广阔的应用前景。
文档编号C12N15/54GK1908187SQ20061008882
公开日2007年2月7日 申请日期2006年7月19日 优先权日2006年7月19日
发明者鲍时来, 郑胡镛, 周忠卫, 张瑞东 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所