专利名称：谷氨酰胺合成酶及其专用表达工程菌与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及谷氨酰胺合成酶及其专用表达工程菌与应用，特别是涉及一种谷氨酰胺合成酶及其专用表达工程菌与该工程菌在生产谷氨酰胺中的应用。
背景技术：
谷氨酰胺是一种重要的食品添加剂和药物原料，具有较高的营养价值和药用价值。谷氨酰胺的市场需求日益增长，目前，谷氨酰胺市场价格约为每吨10-15万元人民币，国内谷氨酰胺的需求量约为5000吨/年，市值超过5亿元，如果加工成药剂或保健品后将可创造更大的经济效益，市场前景广阔。世界上谷氨酰胺的主要生产国是日本、韩国和中国，日本的发酵浓度高达60g/L，韩国也已达到50g/L。目前，国内在谷氨酰胺发酵方面的研究主要停留在诱变育种和发酵工艺的优化上。虽然通过诱变育种已经获得一些谷氨酰胺的生产菌株，但是最终发酵浓度和产率都比日本和韩国的低，因而难以为谷氨酰胺的大规模生产提供支持。
酶法生产谷氨酰胺具有极大的应用前景，其基本思路是用谷氨酸单钠盐和铵盐作为原料，在谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)和提供能量ATP的条件下催化合成谷氨酰胺。和微生物发酵法相比，酶法生产谷氨酰胺具有成本低、反应步骤简单、副反应少、易分离等优点。目前，已有少量用酶法成功合成谷氨酰胺的报道，杨春玉等利用谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)发酵获得GS酶(该酶氨基酸残基序列的NCBI GenBank号为Y13221)，经过细胞破碎后得到含有GS酶的粗酶液，再加入到含有谷氨酸、铵盐和ATP的磷酸盐缓冲液中，经检测谷氨酸的转化率达到了94.8％(杨春玉，马翠卿，许平等.酶法转化谷氨酰胺.过程工程学报，2002，2(6)529~533)，但是该方法采用外加ATP的方式提供能量，ATP价格昂贵，因而无法用于工业化生产；陈群英等利用基因工程的方法，实现了GS酶在大肠杆菌中的高表达，提取重组菌胞内表达的GS酶后将其加入到新鲜酿酒酵母的发酵体系中，利用酵母发酵过程中酵解葡萄糖产生的ATP为GS酶催化谷氨酸和NH4+合成谷氨酰胺提供能量，在该方法中，大肠杆菌表达的GS酶约占总菌蛋白的80％，而且利用酵母发酵产生ATP很好地解决了GS酶催化过程的能量来源问题，但是GS酶的发酵制备和酶催化过程是在两个生物体系内完成的，需要对重组大肠杆菌进行超声破壁提取GS酶，此外，为了使ATP和ADP能在酵母细胞和催化体系之间循环再生，还要用甲苯处理酵母细胞壁改变其通透性，因而操作复杂，工业化生产难度较大(陈群英，陈国安，薛彬等.基因工程酶法结合酵母能量耦联高效合成L-谷氨酰胺的研究.生物工程学报，2004，20(3)456-460)。上述研究结果表明采用酵母发酵产ATP与酶法产谷氨酰胺相耦联的大规模工业化应用难度较大。
酶法生产谷氨酰胺是用NH4+和谷氨酸作原料，经谷氨酰胺合成酶催化生产谷氨酰胺。GS酶在细菌体内存在两种形式一种是未修饰的，另一种是经腺苷共价修饰的。GS酶的腺苷酰化就是AMP以共价键方式与肽链上的酪氨酸残基结合产生GS(AMP)的过程，GS酶的腺苷酰化和去腺苷酰化都由腺苷酰基转移酶(adenylyltransferase，ATase)催化。腺苷酰化会使GS酶的活性降低或丧失。另外，GS酶的腺苷酰化修饰失活及其逆过程也受到铵盐浓度的调控，在限制铵盐的培养条件下生长到稳定期的细胞内的GS酶是未被腺苷修饰的；在过量铵盐的培养条件下，腺苷酰化程度增强，GS酶活力下降甚至失活。但是，在酶法生产谷氨酰胺的过程中，铵盐是GS酶的催化底物，欲提高谷氨酰胺产量，必须加大铵盐的供给，以实现谷氨酸和铵盐向谷氨酰胺的转化。因此，迫切需要一种解除对GS酶腺苷酰化修饰作用的方法，以保持催化生产谷氨酰胺过程中GS酶的活性。
发明内容
本发明的目的是提供一种可解除腺苷酰化修饰作用的谷氨酰胺合成酶。
本发明所提供的谷氨酰胺合成酶，是自氨基端第405位氨基酸残基突变为苯丙氨酸的谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)的谷氨酰胺合成酶。
编码上述谷氨酰胺合成酶的基因也属于本发明的保护范围。
本发明的第三个目的是提供一种谷氨酰胺合成酶的专用表达工程菌。
本发明所提供的谷氨酰胺合成酶的专用表达工程菌，是将含有所述谷氨酰胺合成酶基因的重组表达载体导入宿主菌中得到的重组菌。
用于构建所述重组表达载体的出发载体可为在大肠杆菌中表达外源基因的表达载体，如pET-3a、pET-30a、pET-28a、pET-28b或pET-28c等。
以pET-3a为出发载体，构建的含有所述谷氨酰胺合成酶基因的重组表达载体为pET-3a/GSIM。
所述宿主可为大肠杆菌、棒杆菌、酵母菌或枯草杆菌等，优选为大肠杆菌。
对大肠杆菌的具体菌株没有特殊要求，选择是非常宽泛的，比如E.coli BL21(DE3)、E.coli BL21(DE3)plys、BLR(DE3)或B834等均可。
以E.coli BL21(DE3)为出发菌株，将pET-3a/GSIM导入E.coli BL21(DE3)获得的重组菌命名为BL21(DE3)GSIM。
上述重组表达载体和重组菌均可按照常规方法构建。
本发明的另一个目的是提供一种谷氨酰胺的制备方法。
本发明所提供的谷氨酰胺的制备方法，是发酵上述谷氨酰胺合成酶的专用表达工程菌，获得谷氨酰胺合成酶，再加入底物铵盐和谷氨酸钠，在20-37℃下继续发酵24-48小时，得到谷氨酰胺；所述发酵液中NH4+的浓度为10-100g/L，谷氨酸钠的浓度为10-150g/L。
可采用构建工程菌所用的出发菌株的常规培养条件对工程菌进行培养，当所述工程菌为重组大肠杆菌时，需加入IPTG诱导剂，所加入IPTG的浓度为0.01-1.2mmol/L，诱导温度为20-39℃，诱导时间为2-8小时。
所述铵盐的选择是多种多样的，如氯化铵、硫酸铵、硝酸铵或醋酸铵等；加入底物后的发酵温度优选为30℃。
本发明提供了一种谷氨酰胺合成酶。该酶是在原有谷氨酸棒杆菌的谷氨酰胺合成酶的基础上，将腺苷酰化位点的酪氨酸残基突变为苯丙氨酸。并将该谷氨酰胺合成酶的编码基因利用原核表达载体将转化到宿主菌中，获得了谷氨酰胺合成酶的表达工程菌。该工程菌经发酵后，即可产生酶活较高的谷氨酰胺合成酶，酶活力可达到1200U/L，显著高于用已有菌株生产的谷氨酰胺合成酶的酶活力，并且该工程菌具有表达量高，生产成本低，易于产业化的优点。本发明工程菌产的谷氨酰胺合成酶可转一性的作用于NH4+和谷氨酸，且因解除了腺苷酰化修饰作用对高浓度铵离子的耐受能力显著提高，解决了酶法生产谷氨酰胺的重要瓶颈，生成的谷氨酰胺的浓度最高达到47.6g/L。本发明具有较高的实用性和可推广性，在谷氨酰胺的工业化生产中具有广阔的应用前景。
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
图1为pET-3a/GSIM的构建流程2为发酵过程中对照菌株和重组菌株的生长情况比较结果图3为用对照菌株和重组菌株发酵产的谷氨酰胺合成酶制备谷氨酰胺的比较结果具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。所用引物序列均由赛百盛公司合成。
实施例1、谷氨酰胺合成酶定点突变基因的获得采用重叠PCR法对谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)的谷氨酰胺合成酶基因(NCBIGenBank号Y13221)进行定点突变，即将自5’端第1213-1215位腺苷酰化位点酪氨酸的密码子突变为苯丙氨酸密码子，并在序列两端分别引入限制性内切酶Nde I和Hind III的识别位点，具体方法包括以下步骤1、第一轮扩增以谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)的基因组DNA为模板，在由引物15’-ATAAGGGAGGAGTGCATATGGCGTTTGAAA-3’(带下划线碱基为限制性内切酶Nde I识别位点，序列表中SEQ ID №1)和引物35’-GGTAG GAAGAGGTCCTTGTCCACTGGAG-3’(方框内碱基为突变密码子，序列表中SEQ ID №3)组成的引物对的引导下，PCR扩增谷氨酰胺合成酶基因的上游片断并引入突变碱基，PCR反应条件为先94℃变性5分钟；然后94℃变性30秒，58℃退火45秒，72℃延伸1.5分钟，共30个循环；最后72℃延伸10分钟，降温至4℃后取出。反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果PCR扩增出了大小约1240bp的单一条带，与预期结果相符。
2、第二轮扩增以谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)的基因组DNA为模板，在由引物25’-CAAGGACCTCTTC CTACCACCAGAGGAA-3’(方框内碱基为突变密码子，序列表中SEQ ID №2)和引物45’-AATCAAGCTTACCACACGGAACCGTCTCACT-3’(带下划线碱基为限制性内切酶Hind III识别位点，序列表中SEQ ID №4)组成的引物对的引导下，PCR扩增谷氨酰胺合成酶基因的下游片断并引入突变碱基，PCR反应条件为先94℃变性5分钟；然后94℃变性30秒，54℃退火45秒，72℃延伸30秒，共30个循环；最后72℃延伸10分钟，降温至4℃后取出。反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果PCR扩增出了大小约440bp的单一条带，与预期结果相符。
3、第三轮扩增以步骤1和步骤2扩增的谷氨酰胺合成酶基因的上、下游片断为模板，在由引物1和引物4组成的引物对的引导下，进行重叠PCR扩增，PCR反应条件为先94℃变性5分钟；然后94℃变性30秒，62℃退火45秒，72℃延伸1.5分钟，共30个循环；最后72℃延伸10分钟，降温至4℃后取出。反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果PCR扩增出了大小约1660bp的单一条带，与预期结果相符。回收并纯化该目的片断，对其进行测序，测序结果表明该用重叠PCR方法扩增的谷氨酰胺合成酶突变基因具有序列表中SEQ ID №5的核苷酸序列，自5’端第1213-1215位碱基为突变位点，由酪氨酸的密码子突变为苯丙氨酸密码子，与预期结果一致。
实施例2、谷氨酰胺合成酶专用表达工程菌的构建一、谷氨酰胺合成酶基因重组大肠杆菌表达载体的构建将实施例1扩增的谷氨酰胺合成酶突变基因用限制性内切酶Nde I和HindIII进行酶切后，与经相同酶双酶切的含氨苄青霉素(Amp)抗性标记的质粒pET-3a(Novagen)进行连接，将连接产物转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，筛选具有Amp抗性的转化子，得到含谷氨酰胺合成酶突变基因重组表达载体，命名为pET-3a/GSIM，其构建流程图见图1。
二、将重组表达载体pET-3a/GSIM转化大肠杆菌将步骤一构建的重组表达载体pET-3a/GSIM用CaCl2法转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，将转化细胞涂布于含100μg/mL Amp的LB抗性平板上，在37℃下培养12-16h。长出单菌落后，挑取单菌落作为模板，在引物1和引物4的引导下进行菌落PCR鉴定，经PCR扩增可获得1660bp片段的为阳性克隆，提质粒，先分别用限制性内切酶Nde I和Hind III进行单酶切鉴定，经Nde I酶切获得5780bp片段的为阳性质粒，经Hind III酶切获得5780bp片段的为阳性质粒，再用Nde I和Hind III进行双酶切鉴定，经酶切获得4120bp和1660bp片段的为阳性质粒，鉴定结果表明获得了正确转化有目的基因的阳性重组子，可作为表达谷氨酰胺合成酶的工程菌，将该工程菌命名为BL21(DE3)GSIM。
实施例2、谷氨酰胺的制备将实施例1构建的重组菌BL21(DE3)GSIM接种于50mL LB液体培养基中，以E.coli BL21(DE3)为对照，在37℃、170rpm摇床中培养2-3小时至菌液的OD600值为0.6-1.0，对照菌株和重组菌株的生长情况基本相同(见图2)，然后加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG，继续培养23小时使GS酶表达，经检测重组菌株中的GS酶活可达到122.84U/L，比对照菌E.coli BL21(DE3)提高了6倍，然后加入底物NH4Cl(10-100g/L发酵液)和谷氨酸钠(10-150g/L发酵液)，调整摇床温度至30℃，继续发酵24-48h，使发酵表达的GS酶催化谷氨酸和铵合成谷氨酰胺。发酵结束后，检测发酵液中的谷氨酰胺浓度，结果用重组菌发酵产GS酶制备的谷氨酰胺的浓度最高达到47.6g/L，是对照菌E.coliBL21(DE3)产谷氨酰胺浓度的51.8倍(见图3)，表明谷氨酰胺合成酶腺苷酰化位点的突变显著提高了谷氨酰胺合成酶耐受高浓度铵离子的能力，解决了酶法生产谷氨酰胺的重要瓶颈，本发明的工程菌株可为大规模工业化生产谷氨酰胺提供支持。
序列表<160>5<210>1<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1ataagggagg agtgcatatg gcgtttgaaa 30<210>2<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2caaggacctc ttcgaactac caccagagga a31<210>3<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3ggtagttcga agaggtcctt gtccactgga g31<210>4<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>4aatcaagctt accacacgga accgtctcac t31<210>5<211>1434<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>5atggcgtttg aaaccccgga agaaattgtc aagttcatca aggatgaaaa cgtcgagttc 60gttgacgttc gattcaccga ccttcccggc accgagcagc acttcagcat cccagctgcc 120agcttcgatg cagatacaat cgaagaaggt ctcgcattcg acggatcctc gatccgtggc 180ttcaccacga tcgacgaatc tgacatgaat ctcctgccag acctcggaac ggccaccctt 240gatccattcc gcaaggcaaa gaccctgaac gttaagttct tcgttcacga tcctttcacc 300cgcgaggcat tctcccgcga cccacgcaac gtggcacgca aggcagagca gtacctggca 360tccaccggca ttgcagacac ctgcaacttc ggcgccgagg ctgagttcta cctcttcgac 420
tccgttcgct actccaccga gatgaactcc ggcttctacg aagtagatac cgaagaaggc 480tggtggaacc gtggcaagga aaccaacctc gacggcaccc caaacctggg cgcaaagaac 540cgcgtcaagg gtggctactt cccagtagca ccatacgacc aaaccgttga cgtgcgcgat 600gacatggttc gcaacctcgc agcttccggc ttcgctcttg agcgtttcca ccacgaagtc 660ggtggcggac agcaggaaat caactaccgc ttcaacacca tgctccacgc ggcagatgat 720atccagacct tcaagtacat catcaagaac accgctcgcc tccacggcaa ggctgcaacc 780ttcatgccta agccactggc tggcgacaac ggttccggca tgcacgctca ccagtccctc 840tggaaggacg gcaagccact cttccacgat gagtccggct acgcaggcct gtccgacatc 900gcccgctact acatcggcgg catcctgcac cacgcaggcg ctgttctggc gttcaccaac 960gcaaccctga actcctacca ccgtctggtt ccaggcttcg aggctccaat caacctggtg 1020tactcacagc gcaaccgttc cgctgctgtc cgtatcccaa tcaccggatc caacccgaag 1080gcaaagcgca tcgaattccg cgctccagac ccatcaggca acccatacct gggctttgca 1140gcgatgatga tggccggcct cgacggcatc aagaaccgca tcgagccaca cgctccagtg 1200gacaaggacc tcttcgaact accaccagag gaagctgcat ccattccaca ggcaccaacc 1260tccctggaag catccctgaa ggcactgcag gaagacaccg acttcctcac cgagtctgac 1320gtcttcaccg aggatctcat cgaggcgtac atccagtaca agtacgacaa cgagatctcc 1380ccagttcgcc tgcgcccaac cccgcaggaa ttcgaattgt acttcgactg ctaa 143权利要求
1.谷氨酰胺合成酶，是自氨基端第405位氨基酸残基突变为苯丙氨酸的谷氨酸棒杆菌的谷氨酰胺合成酶。
2.编码权利要求1所述谷氨酰胺合成酶的基因。
3.表达谷氨酰胺合成酶的工程菌，是将含有权利要求2所述谷氨酰胺合成酶基因的重组表达载体导入宿主菌中得到的重组菌。
4.根据权利要求3所述的工程菌，其特征在于用于构建所述重组表达载体的出发载体为大肠杆菌表达载体。
5.根据权利要求4所述的工程菌，其特征在于所述重组表达载体为pET-3a/GSIM。
6.根据权利要求3或4或5所述的工程菌，其特征在于所述宿主为大肠杆菌。
7.一种谷氨酰胺的制备方法，是发酵权利要求3所述的表达谷氨酰胺合成酶的工程菌，获得谷氨酰胺合成酶，再加入底物铵盐和谷氨酸钠，在20-37℃下继续发酵24-48小时，得到谷氨酰胺；所述发酵液中NH4+的浓度为10-100g/L，谷氨酸钠的浓度为10-150g/L。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述工程菌为重组大肠杆菌时，添加IPTG诱导剂，所加入IPTG的浓度为0.01-1.2mmol/L，诱导温度为20-39℃，诱导时间为2-8小时。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于所述铵盐为氯化铵、硫酸铵、硝酸铵或醋酸铵；加入底物后的发酵温度为30℃。
全文摘要
本发明公开了谷氨酰胺合成酶及其专用表达工程菌与应用，其目的是提供一种谷氨酰胺合成酶及其专用表达工程菌与该工程菌在生产谷氨酰胺中的应用。该谷氨酰胺合成酶是自氨基端第405位氨基酸残基突变为苯丙氨酸的谷氨酸棒杆菌的谷氨酰胺合成酶。该工程菌是将含有所述谷氨酰胺合成酶基因的重组表达载体导入宿主菌中得到的重组菌。本发明工程菌产的谷氨酰胺合成酶可专一性的作用于NH
文档编号C12P13/02GK1884501SQ20061008948
公开日2006年12月27日 申请日期2006年6月29日 优先权日2006年6月29日
发明者曹竹安, 黄星, 刘铭 申请人:清华大学