专利名称：一种鉴别等位基因类型的方法
技术领域：
本发明涉及基因分析领域中一种鉴别等位基因类型的方法。
背景技术：
鉴于基因序列分析在生命科学研究和医学临床实践中具有重要的应用价值，人们已经建立了很多用于基因序列分析的方法。比较经典的方法有限制性酶切片段长度多态性分析(Restriction fragment length polymorphism，RFLP)、单链构象多态性分析(Single Strand Conformation Polymorphism，SSCP)、核酸测序(Sequence Based Typing，SBT)、变性高效液相色谱分析(Denaturing HighPerformance Liquid Chromatography，DHPLC)、等位基因特性PCR技术(Allele-specific PCR，ASPCR)、序列特异性探针杂交法(Sequence SpecificOligonucleotide Probe，SSOP)等。但这些技术都存在一定的缺点，如成本太高、准确性不够或操作过程复杂等，而且它们还有一个共同的不足，即不能高通量、大规模的进行基因多态性分析。为了应对后基因组时代对高通量基因序列分析技术的要求，国际上正在开发一些新的技术。如MALDI-TOF MS质谱分析法(Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight massspectrometry)、连接酶检测反应技术(Ligase detection reaction，LDR)、微测序技术即单碱基延伸(SBE，single base chain extension)、BeadArray技术、通用芯片(Universal array)技术和高密度基因芯片(High densitymicroarray)技术等。
在上述方法中，等位基因特性PCR(allele-specific PCR，ASPCR)技术是一种简便易行的基因序列分析方法，它是由Newton等于1989年建立，它是PCR技术应用的发展，也称为扩增阻碍突变系统(amplification refractory mutationsystem，ARMS)，或PCR-序列特异性引物(PCR-sequence specific primer，PCR-SSP)等。用于对基因序列中的已知突变或多态性进行检测，该法使用缺失3-5′外切活性的DNA聚合酶，当引物的3′末端与模板不匹配时，该引物不能延伸，PCR反应被阻滞。该方法简便实用，但通量较低，尤其是对多个基因位点进行同时检测时比较麻烦。为了提高检测通量，研究者们采取了多种策略，Rebecca Robert等借鉴多重PCR原理进行检测，将多个位点的野生型和突变型引物分两管多重扩增，最后凝胶电泳检测，两条泳道检测，一条为野生型产物，另一条为突变型产物，不同位点间通过扩增产物的长度进行区分。Gomez-Llorente C等采用单管多重扩增结合自动化毛细管电泳检测的方法，不同位点间通过片段长度进行区分，同一位点的两条等位基因特异性引物标记两种荧光，通过颜色区分突变型和野生型。Michele Boniotto等将单管多重扩增与溶解曲线分析结合进行多位点检测，在等位基因特异性引物5′末端连接GC尾巴从而区分两等位基因的TM值，结合SYBR Green I进行荧光定量分析。Shannon Eaker等将ARMS与芯片检测结合，首先进行多重ARMS扩增，产物标记后与等位基因特异性寡核苷酸芯片杂交分型。
通用芯片(Universal array)技术是近年来发展起来的一种用于基因序列分析的高通量技术，是由Barany等(U.S.Pat.No.6506594)首先提出的，将液相连接酶检测反应(ligase detection reaction，LDR)与微阵列技术相结合，该方法可对低丰度的基因点突变进行非常灵敏的检测。将连接酶反应(LDR)下游共用探针的3′末端连接荧光素分子，在上游等位基因特异探针的5′末端连接不同的cZip-code序列，这种cZip-code序列是人工设计，并经过严格的筛选，能够与通用芯片上的Zip-code序列完全互补，每一种cZip-code和Zip-code序列的组合对应一种靶基因分子中可能出现的突变点或SNP；当上游等位基因特异性探针与靶标互补时，连接酶将上下游探针连接起来，然后进行芯片杂交，通过不同Zip-code位置和荧光信号进行核酸序列差异检测。这种方法的灵敏度很高，可以准确检测出野生序列中混杂的1％甚至更低量的单碱基突变。如果将cZip-code连接在其它的特异探针上，就可以用设计好的同一种芯片检测其它任意的靶基因序列，从而使芯片具有了通用性。通用芯片与液相酶促反应结合检测基因多态性(或突变)大大克服了等位基因特异性寡核苷酸芯片特异性低的缺点。
在我国，耳聋人群是最大的残疾人群体，约有2千万患者。其中，50％与遗传有关。由于导致耳聋的基因突变点位于多个基因上，目前临床主要用基因测序的方法进行基因序列分析，不但操作繁琐、通量低，而且价格较高。
发明内容
本发明的目的是提供一种鉴别等位基因类型的方法。
本发明所提供的鉴别等位基因类型的方法，是以待测样品的基因组DNA为模板，用待检测目的基因的一个或一个以上突变位点对应的等位基因的引物组和不具有5′→3′外切核酸酶活性的DNA聚合酶，进行多重PCR扩增包括突变位点在内的待测目的基因的等位基因片段，将得到的多重PCR扩增产物与通用芯片杂交，根据杂交结果确定是哪种等位基因；所述引物组包括一种通用引物，和用于扩增每种目的基因的每个突变位点对应的两种等位基因特异性引物和一种共用引物；每种等位基因特异性引物的5′端均连接有不同的Tag序列；所述Tag序列可以和所述多重PCR产物具有的互补Tag序列杂交，所有的Tag序列的Tm值之差小于等于5℃(有相似的Tm值)，相互之间以及与所有的引物之间没有交叉杂交，并且无发夹结构，与含有所述目的基因的物种的基因组同源性较低(连续匹配或相同的碱基数小于10个)；所述通用芯片包括若干种Tag探针，所述Tag探针与所述Tag序列一一对应，一种Tag探针含有只与其相对应的Tag序列相同的寡核苷酸序列；其中，每一种Tag探针可以与多重PCR反应产生的互补的序列杂交。
其中，所述Tag序列具体可以通过生物信息学的方法人工设计20-24bp序列，或者取自不同于含有所述目的基因的物种的基因组DNA序列，如目的基因来源于人，可取自细菌等其它物种的基因组DNA序列，如结核分支杆菌等。
所述待检测目的基因至少有一种。
其中，所述共用引物和通用引物5′末端带有荧光分子或可通过化学发光或固体微粒进行标记检测的分子，如生物素。
所述多重PCR扩增在一管中进行，或分为多管进行多管多重PCR反应。
所述目的基因的两个等位基因是由于单核苷酸的置换、插入或缺失产生，或多个碱基的插入或缺失产生；所述用于扩增目的基因的两个等位基因的两种等位基因特异性引物中的一种的3′末端碱基与目的基因突变位点的野生型碱基相同或互补，另一种的3′末端碱基与目的基因突变位点的突变型碱基相同或互补。
为提高检测的特异性，所述用于扩增目的基因的两个等位基因的两种等位基因特异性引物中引入人工错配碱基；所述人工错配碱基是天然的A、T、C、G四种碱基或其类似物。当这种新引入的人工突变遇到引物中原有的天然的碱基突变时将产生协同作用，使得引物和目的基因序列的结合更加不稳定，而当引物中仅有人工突变时则可以和目的基因序列结合，这样使得匹配引物(仅有人工突变的引物)的扩增产量与不匹配引物(既有人工突变，又有天然突变的引物)的扩增产量差异变大，从而特异的区分靶分子中的单碱基差异。
使用多重不对称PCR扩增获得用于杂交的靶标，每个位点的荧光标记的共用引物与等位基因特异性引物的量比例为10～25∶1，为了提高单链PCR产物的量，共用引物的5′末端还连接有通用引物序列，多重扩增时，另外加入一种荧光标记的通用引物，浓度高于等位基因特异性引物，从而通过引物浓度的差异获得大量的单链产物，用于杂交。所述通用引物序列与所述等位基因特异性引物的Tm值之差小于等于5℃，无发夹结构和二聚体形成；与含有所述目的基因的物种的基因组同源性较低(连续匹配或相同的碱基数小于10个)；与所有的Tag序列无交叉杂交。
所述Tag序列可为单链寡核苷酸序列或肽核酸序列。
上述方法中，所述等位基因是由基因突变产生的。
基因突变是指由于DNA碱基的置换、插入或缺失而引起的基因结构碱基序列差异。
所述基因突变具体可为遗传性耳聋基因突变；其中，所述待检测目的基因为GenBank Accession Number为NC_000013的GJB2(cox26)，GenBank AccessionNumber为NC_000001的GJB3(cox31)，GenBank Accession Number为NC_000007的SLC26A4(PDS)和GenBank Accession Number为NC_001807的12S rRNA基因；所述引物组包括用于扩增GenBank Accession Number为NC_000013的GJB2(cox26)基因的35delG、167delT、176del16、235delC和299delAT突变位点分别对应的两种等位基因特异性引物和一种共用引物，用于扩增GenBank AccessionNumber为NC_000001的GJB3(cox31)基因的538C＞T和547G＞A突变位点分别对应的两种等位基因特异性引物和一种共用引物，用于扩增GenBank AccessionNumber为NC_000007的SLC26A4(PDS)基因的707 T＞C和2168 A＞G和IVS7-2 A＞G突变位点分别对应的两种等位基因特异性引物和一种共用引物，GenBankAccession Number为NC_001807的12S rRNA基因1555A＞G突变位点对应的两种等位基因特异性引物和一种共用引物；用于扩增GenBank Accession Number为NC_000013的GJB2基因的35delG突变位点的两个等位基因特异性引物的5′端分别连接有具有序列表中序列1和序列2的核苷酸序列的Tag1和Tag2；用于扩增GenBank Accession Number为NC_000013的GJB2基因的167delT突变位点的两个等位基因特异性引物的5′端分别连接有具有序列表中序列3和序列4的核苷酸序列的Tag3和Tag4；用于扩增GenBank Accession Number为NC_000013的GJB2基因的176del16突变位点的两个等位基因特异性引物的5′端分别连接有具有序列表中序列5和序列6的核苷酸序列的Tag5和Tag6；用于扩增GenBank Accession Number为NC_000013的GJB2基因的235delC突变位点的两个等位基因特异性引物的5′端分别连接有具有序列表中序列7和序列8的核苷酸序列的Tag7和Tag8；用于扩增GenBank Accession Number为NC_000013的GJB2基因的299delAT突变位点的两个等位基因特异性引物的5′端分别连接有具有序列表中序列9和序列10的核苷酸序列的Tag9和Tag10；用于扩增GenBank Accession Number为NC_000001的GJB3基因的538 C＞T突变位点的两个等位基因特异性引物的5′端分别连接有具有序列表中序列11和序列12的核苷酸序列的Tag11和Tag12；用于扩增GenBank Accession Number为NC_000001的GJB3基因的547 G＞A突变位点的两个等位基因特异性引物的5′端分别连接有具有序列表中序列13和序列14的核苷酸序列的Tag13和Tag14；用于扩增GenBank Accession Number为NC_000007的SLC26A4基因的707 T＞C突变位点的两个等位基因特异性引物的5′端分别连接有具有序列表中序列15和序列16的核苷酸序列的Tag15和Tag16；用于扩增GenBank Accession Number为NC_000007的SLC26A4基因的2168 A＞G突变位点的两个等位基因特异性引物的5′端分别连接有具有序列表中序列19和序列20的核苷酸序列的Tag19和Tag20；用于扩增GenBank Accession Number为NC_000007的SLC26A4基因的IVS7-2A＞G突变位点的两个等位基因特异性引物的5′端分别连接有具有序列表中序列21和序列22的核苷酸序列的Tag21和Tag22；用于扩增GenBank Accession Number为NC_001807的12S rRNA基因1555A＞G突变位点的两个等位基因特异性引物的5′端分别连接有具有序列表中序列17和序列18的核苷酸序列的Tag17和Tag18。
所述通用芯片包括分别含有序列表中序列1至序列22的22种Tag序列的22种Tag探针。
所述22种Tag探针的5′端进行了氨基化，所述Tag序列的5′端连接有15个T。
上述方法可以结合微型全分析系统制成自动化检测装置。
本发明还提供了一种鉴别遗传性耳聋等位基因类型的芯片。
本发明所提供的鉴别遗传性耳聋等位基因类型的芯片，分别含有序列表中序列1至序列22的核苷酸序列的22种Tag探针。
所述22种Tag探针的5′端进行了氨基化，所述Tag序列的5′端连接有15个T。
包括该鉴别遗传性耳聋等位基因类型的芯片的试剂盒也属于本发明的保护范围。
本发明将多重等位基因特异性PCR技术与通用芯片技术相结合，建立了一种高通量、低成本、易于操作的基因序列分析方法，其反应原理见图1所示首先，在一只反应管中用基因位点特异性引物(包括等位基因特异性引物和共用引物)进行多重等位基因特异性PCR反应，然后把PCR产物与通用芯片进行杂交反应，最后通过芯片扫描进行结果检测。本发明的方法在每个位点的共用引物5′末端荧光标记，并且连接通用引物以提高多重PCR的单链产量，两种等位基因特异性引物5′末端连接不同的标签(Tag)序列，扩增产物与通用芯片上对应的标签(Tag)序列杂交，最后通过芯片上Tag序列的位置和杂交信号值进行基因序列分析。
本发明中的多重等位基因特异性PCR不同于一般意义上的简单多重PCR。首先，其等位基因特异性引物的3′末端碱基有两种形式，一种是末端碱基和待检测的基因位点野生型(SNP或突变)匹配，一种是末端碱基和待检测的基因位点突变型(SNP或突变)匹配，二者相互对照，这增加了反应的特异性和准确性；其次，在引物的末端或者连接Tag标签序列用于对待检测的基因位点进行编码，或者连接有标记分子用于最终的检测；另外，为了增强反应的特异性可以在引物序列中引入人工突变点，为了提高检测敏感性可以在共用引物序列末端引入通用引物，在PCR体系中加入荧光标记的通用引物(与共用引物末端的通用引物序列相同)，待前两轮PCR反应结束后，产生通用引物的互补序列，荧光标记的通用引物与之结合继续扩增，增加了PCR产物中单链DNA产量，从而增强杂交信号。
本发明中的通用芯片也不同于一般意义上的固定有序列特异性探针的基因芯片，在普通芯片上固定的探针是针对基因的特定位点进行检测的基因片段，检测不同的目标基因需要设计不同的探针，制备不同的芯片。而本发明中所指的通用芯片是一种用来对预先筛选出的一套序列特异性基因片段(Tag序列)进行识别的基因芯片，芯片上固定的探针不是针对特定的基因序列，而是针对特定的Tag序列。Tag序列可以用来对不同的基因位点、对不同基因的不同位点、对不同物种的不同基因位点进行编码(相当于一个条码)，对于不同的检测目的可以用相同的一套Tag序列，这样对于不同检测目的，只要在芯片上固定一套可以识别这套Tag序列的基因片段就可完成检测任务。因此该通用芯片是一种真正意义上的“通用”芯片，尽管检测目的不同，但都可以用同样的一张芯片来进行检测，检测过程是一个对编码在不同基因位点上的Tag序列进行解码的过程。这种芯片是与普通意义上的核酸序列特异性基因芯片完全不同的一种方便实用的生物芯片。
本发明的方法快速、简便、更具可操作性、易于实现自动化操作。可用于基因突变检测、基因多态性分析等方面，适用于临床疾病突变检测、药物基因组学分析、法医学鉴定等基因分析领域。
图1为本发明方法的反应原理示意2为通用芯片验证实验结果图3为通用芯片点阵排布示意4为用图3所示的通用芯片对耳聋病人的临床样品进行实际检测的结果图5为分别用磁珠和荧光标记的通用芯片检测结果具体实施方式
下述实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1、用本发明的通用芯片和方法检测已知遗传性耳聋基因突变分型的病例样品1.临床样品来源及其DNA提取已知遗传性耳聋基因突变分型的病例样品由中国人民解放军总医院耳鼻喉科提供。使用WizardGenomic DNA Purification Kit(Promega，Madison，USA)提取全血中的基因组DNA。
2.制备多重PCR引物及通用芯片的探针检测如表1所示的四个目的基因共11个突变位点的多重PCR引物及探针如下(1)引物多重PCR引物序列见表1。
突变形式中的“del”表示突变位点为缺失突变，如35delG表示GenBankAccession Number为NC_000013的GJB2基因的35位碱基G缺失；突变形式中的“＞”表示突变位点为置换突变，如538C＞T表示GenBank Accession Number为NC_000001的GJB3的538位碱基由C突变为T。
引物名称中后缀为WT的引物代表扩增包括突变位点在内的野生型等位基因特异性引物，引物名称中后缀为MU的引物代表扩增包括突变位点在内的突变型等位基因特异性引物，引物名称中后缀为C的引物代表扩增包括该突变位点在内的野生型和突变型等位基因片段的共用引物，每个突变位点的两种等位基因特异性引物分别与该突变位点的共用引物配对，如35delG-WT和35delG-C配对，35delG-MU和35delG-C配对。
引物序列中的Tag1至Tag22分别具有序列表中序列1至序列22的核苷酸序列；共用引物序列中的UP表示序列为GCACGCTATCACGTTAGAC的通用引物序列。共用引物的5′端修饰有荧光标记TAMRA。
为提高检测特异性，部分等位基因特异性引物中引入人工错配碱基(下划线示)。
等位基因特异性引物538C＞T-WT、547G＞A-WT、707T＞C-WT和2168A＞G-WT的3′末端碱基(粗体示)与目的基因突变位点的野生型碱基相同，等位基因特异性引物538C＞T-MU、547G＞A-MU、707T＞C-MU和2168A＞G-MU的3′末端碱基(粗体示)与目的基因突变位点的突变型碱基相同，等位基因特异性引物IVS7-2A＞G-WT和1555A＞G-WT的3′末端碱基(粗体示)与目的基因突变位点的野生型碱基互补，等位基因特异性引物1555A＞G-MU和IVS7-2A＞G-MU的3′末端碱基(粗体示)与目的基因突变位点的突变型碱基互补。
(2)探针通用芯片是由与多重PCR产物杂交的22种Tag探针、QC(点样的阳性质控)、BC(点样的阴性质控)、NC(杂交的阴性质控)和PC(杂交的阳性质控)组成的阵列。QC是一端带有Hex标记，另一端氨基修饰的寡核苷酸探针，用于观察芯片点样和固定的效率，其序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTTAGAGTGCTTGGTGCCATAAC-HEX；BC为50％的DMSO，点于QC之后，用于质控点样过程中有无样品残留污染；NC是一段氨基修饰的寡核苷酸探针，与杂交液中的所有待检测序列不会杂交，用于观察有无非特异杂交，其序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTTGCAACCACCACCGGAGG；PC是一段氨基修饰的寡核苷酸探针，可以与杂交液中添加的荧光标记的互补序列(c-PC)杂交，用于杂交过程的质控，其序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTTGGTATCGCGACCGCATCCCAATCT。
通用芯片上的Tag探针序列结构通式为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-TagX，其中X为1至22中的任何一个自然数。如Tag1探针的序列结构为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag1，tag22探针的序列结构为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag22。即探针的5′端氨基修饰，氨基旁边连接poly-T15，然后是分别具有序列表中序列1至22的核苷酸序列的Tag1至Tag22。其中，Tag1至Tag22的核苷酸序列分别与引物序列中的Tag1至Tag22的核苷酸序列相同。
表1.检测的突变位点、引物及Tag序列
所有的引物与探针由上海Invitrogen公司(Invitrogen Co.，Shanghai，China)合成与纯化。
将探针固定到醛基化修饰的玻片上。所有的Tag探针用50％DMSO溶解，终浓度为15μM，每个点重复五次点制到玻片上。图3为通用芯片点阵排布示意图，实际点阵中每个点延水平方向连续重复5个点。其中包括检测GJB2基因上的35delG、167delT、176del16、235delC、299delAT突变位点的Tag1至Tag10探针；检测GJB3基因上的538C＞T、547G＞A突变位点的Tag11至Tag14探针；检测SLC26A4基因上的707T＞C、2168A＞G、IVS7-2A＞G突变位点的Tag15、Tag16、Tag19、Tag20、Tag21和Tag22探针；检测线粒体12S rRNA上的1555A＞G突变点的Tag17和Tag18探针。图3中，35W代表Tag1探针，35M代表Tag2探针，167W代表Tag3探针，167M代表Tag4探针，176W代表Tag5探针，176M代表Tag6探针，235W代表Tag7探针，235M代表Tag8探针，299W代表Tag9探针，299M代表Tag10探针，538W代表Tag11探针，538M代表Tag12探针，547W代表Tag13探针，547M代表Tag14探针，707W代表Tag15探针，707M代表Tag16探针，1555W代表Tag17探针，1555M代表Tag18探针，2168W代表Tag19探针，2168M代表Tag20探针，IVS7-2W代表Tag21探针，IVS7-2M代表Tag22探针。
3.多重等位基因特异性PCR该多重PCR扩增中用到了通用引物UP，共用引物序列5′末端连接通用引物，在PCR体系中加入荧光标记的通用引物(与共用引物末端的通用引物序列相同)，待前两轮PCR反应结束后，产生通用引物的互补序列，荧光标记的通用引物与之结合继续扩增，增加了PCR产物中单链DNA产量，从而增强杂交信号分别以各个病例样品的全血基因组DNA为模板，进行多重PCR。为防止某些引物间的相互作用，多重PCR在两管中进行。其中，引物547G＞A-WT，547G＞A-MU，GJB3-C，2168A＞G-WT，2168A＞G-MU和2168A＞G-C，IVS7-2A＞G-WT，IVS7-2A＞G-MU和IVS7-2A＞G-C在同一管中进行，表1中的其它引物在另一管扩增。25μl扩增体系，包括0.2mM dNTPs，1×Qiagen PCR buffer，添加MgCl2至2mM，pH 8.7，1单位HotStarTaq DNA Polymerase(Qiagen，Hilden，Germany)，和100ng基因组DNA，各位点的检测引物，其中共用引物浓度高于等位基因特异性引物，通用引物分别加入两管中。25μl扩增体系中，35delG-WT 0.02μM，35delG-MU 0.02μM，35delG-C 0.4μM，167delT-WT 0.03μM，167delT-MU 0.03μM，176del16-WT 0.03μM，176del16-MU 0.03μM，235delC-WT 0.02μM，235delC-MU 0.02μM，299delAT-WT0.02μM，299delAT-MU 0.03μM，GJB2-C 0.6μM，538C＞T-WT 0.02μM，538C＞T-MU0.02μM，547G＞A-WT 0.02μM，547G＞A-MU 0.02μM，GJB3-C 0.4μM，707T＞C-WT 0.02μM，707T＞C-MU 0.02μM，707T＞C-C 0.3μM，2168A＞G-WT 0.03μM，2168A＞G-MU 0.03μM，2168A＞G-C 0.4μM，IVS7-2A＞G-W 0.03μM，IVS7-2A＞G-MU 0.03μM，IVS7-2A＞G-C0.4μM，1555A＞G-WT 0.008μM，1555A＞G-MU 0.008μM，1555A＞G-C 0.2μM，通用引物1μM。
扩增参数为先95℃15分钟；然后94℃30秒，0.5℃/秒降至56℃，56℃30秒，0.2℃/秒升至70℃，70℃45秒，10个循环；再90℃30秒，0.5℃/秒降至56℃，56℃30秒，0.2℃/秒升至70℃，70℃45秒，22个循环；最后60℃10分钟；4℃保存。
4.通用芯片杂交两管PCR产物混合，取10μl混合物加到20μl杂交缓冲液中(6×SSC，5×Denhardt′s reagent，25％甲酰胺，0.1％SDS，5nM c-PC(与芯片PC互补的序列，5′端TAMRA标记)。98℃变性5分钟，冰浴，杂交混合物加入到两个相邻的点阵中作为重复实验。然后将芯片放置50℃水浴中杂交1小时。取出玻片分别在两种洗液中42℃各洗2min，洗液I0.3×SSC/0.1％SDS，洗液II0.06×SSC。最后，玻片稍离心甩干。
为验证通用芯片的特异性，人工合成荧光标记的Tag1至Tag22的互补核苷酸序列(cTag1至cTag22)，用杂交缓冲液溶解至5nM，分别与芯片进行杂交，杂交与洗片条件同上。
5.数据分析使用ScanArrayTMexpress microarray scanner(PerkinElmer，MA，USA)扫描玻片，扫描图见图4所示。Laser power和photomultiplier tube(PMT)power分别为90％和70％。使用GenePix 4.0 software(Axon Instruments，CA，USA)提取数据。取每个位点的AMSI值(absolute median signal intensities)，即荧光信号中位值减去背景值。每个位点的AMSI值应该不低于1000。为了排除引物二聚体导致的假阳性信号，每个位点的AMSI值与PCR阴性对照(不加模板)相应位点AMSI的比值应该大于10。满足这两个条件后，该位点的信号才可以算作阳性。对于通用芯片验证实验，ratio值被用来判断Tag探针的特异性。特异性的标准为ratio应该大于10；该Tag探针的AMSI值至少为1000。
Ratio＝(AMSI)期望阳性信号/(AMSI)阴性信号最大值通用芯片验证实验结果见图2，T代表Tag，结果表明Tag1至Tag22探针的AMSI值均大于1000，ratio值均大于10。说明该通用芯片具有较高的特异性。图2中，T1至T22分别表示Tag1至Tag22探针。
图4显示的是用图3所示的通用芯片对耳聋病人的临床样品进行实际检测的结果。芯片中左边的一列探针均为野生型检测探针，右边一列探针为突变型检测探针，每种探针延水平方向重复点样五次。因此，对于已知野生型(WT)样品基因组DNA(gDNA)的杂交结果左边的野生型检测探针全部出现杂交信号，而右边的突变型检测探针没有杂交信号(工作正常)；gDNA 235delC MU、gDNA 299delAT MU、gDNA 1555A＞G MU和gDNA IVS7-2A＞G MU分别为已知遗传性耳聋基因突变类型235delC MU、299delAT MU、1555A＞G MU和IVS7-2A＞G MU的病例样品的基因组DNA，代表了四种突变情况，杂交图中相应的突变检测探针已经给出了相应的正确检测信号。由图4结果可知，所有位点检测结果都正确无误，特异性很好。
实施例2、用本发明的通用芯片和方法检测已知遗传性耳聋基因突变分型的病例样品为了简化检测流程，降低该方法对仪器的依赖程度，设计了用磁珠进行最终标记的实验。这样检测结果就可以用CCD照相机拍摄或用低倍显微镜直接目测，这使得复杂的基因检测变的非常容易和简便。
选择235delC和299delAT两个位点进行此实验。将相关引物和探针上的荧光标记换为biotin标记。PCR条件、杂交和清洗过程同实施例1所述。使用Streptavidin包被的MyOneTMDynalbeads(Dynal invitrogen，0slo，Norway)显示杂交结果。先将Streptavidin包被的Dynalbeads按照说明书方法进行预处理。磁珠混合液加到玻片上，常温结合10分钟后，使用磁铁去除非特异结合的磁珠，离心甩干。最后使用光学显微镜观察结果，用CCD照相机拍摄图像。反应结果如图5所示，点阵形式为4×10格式(见图中左上角排布格局)，每种探针重复点5个点。所用的引物和探针序列见表1所示。可见结果显示非常清楚，与图中右边的荧光检测结果一致。图5中，A为通用芯片点阵排布示意图，实际点阵中每个点延水平方向连续重复5个点。其中包括检测GJB2基因上的235delC和299delAT突变位点的Tag7至Tag10探针。图4A中，235W代表Tag7探针，235M代表Tag8探针，299W代表Tag9探针，299M代表Tag10探针，QC(点样阳性质控)，BC(点样阴性质控)，NC(杂交阴性质控)和PC(杂交阳性质控)。图5中B是以磁珠显示的通用芯片检测结果，图5中C是以荧光信号显示的通用芯片检测结果。WT为已知野生型基因组DNA样品，235delC MU、299delAT MU分别为已知遗传性耳聋基因突变类型235delC MU和299delAT MU的病例样品的基因组DNA。
序列表<160>22<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1gttactgcta cgcgtgctac gt 22<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2catgagcaag ctgtctaagg cg 22<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3cgacgagctg ccgcgcaaga t 21<210>4<211>21<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>
<400>4tatcgcgacc gcatccaatc t21<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>5gctcgaagag ggctacagat c21<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>6ttcccgtccg tcatcgctca ag 22<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>7
gatcggcggt gaagcgaaag g21<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>8gatggtgatc tcgcgcgtgc g21<210>9<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>9tgtgcgcccg agttcggta tc22<210>10<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>10ttgatcccat cgaaggacga tg 22<210>11<211>22<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>
<400>11tgatgcgtct gggacgtgcc tg 22<210>12<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>12cagagcatca acgacgcagg a21<210>13<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>13acgatcaacg cggagacaca g21<210>14<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>14acgagacacg caacgagaca g21<210>15<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>15ttgaaagcct acacgcgagc g21<210>16<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>16caagcagagc tatggttcgc tg 22<210>17<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>17gtcagtatcg cgttcgctta cg 22
<210>18<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>18ccatactcac gcaactgtgc a21<210>19<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>19gttagggtcg gccaaactct cc 22<210>20<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>20gacaaaggtc tgcccagcac ca 22<210>21<211>22<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>
<400>21tgcaacacgc taggatctcc tc 22<210>22<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>22tgcacttctc ggtaggcagc ga 2权利要求
1.一种鉴别等位基因类型的方法，是以待测样品的基因组DNA为模板，用待检测目的基因的一个或一个以上突变位点对应的等位基因的引物组和不具有5′→3′外切核酸酶活性的DNA聚合酶，进行多重PCR扩增包括突变位点在内的待测目的基因的等位基因片段，将得到的多重PCR扩增产物与通用芯片杂交，根据杂交结果确定是哪种等位基因；所述引物组包括一种通用引物，和用于扩增每种目的基因的每个突变位点对应的两种等位基因特异性引物和一种共用引物；每种等位基因特异性引物的5′端均连接有不同的Tag序列；所述Tag序列可以和所述多重PCR产物具有的互补Tag序列杂交，所有的Tag序列的Tm值之差小于等于5℃，相互之间以及与所有的引物之间没有交叉杂交，并且无发夹结构，与含有所述目的基因的物种的基因组的同源性较低；所述通用芯片包括若干种Tag探针，所述Tag探针与所述Tag序列一一对应，一种Tag探针含有只与其相对应的Tag序列相同的寡核苷酸序列；其中，每一种Tag探针可以与多重PCR反应产生的互补的序列杂交。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述待检测目的基因至少有一种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述共用引物和通用引物带有荧光分子或可通过化学发光或固体微粒进行标记检测的分子。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述多重PCR扩增在一管中进行，或分为多管进行多管多重PCR反应。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述目的基因的两个等位基因是由于单核苷酸的置换、插入或缺失产生，或多个碱基的插入或缺失产生；所述用于扩增目的基因的两个等位基因的两种等位基因特异性引物中的一种的3′末端碱基与目的基因突变位点的野生型碱基相同或互补，另一种的3′末端碱基与目的基因突变位点的突变型碱基相同或互补。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述用于扩增目的基因的两个等位基因的两种等位基因特异性引物中引入人工错配碱基；所述人工错配碱基是天然的A、T、C、G四种碱基或其类似物。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述共用引物的5′末端还连接有通用引物序列；所述通用引物序列与所述等位基因特异性引物的Tm值之差小于等于5℃，无发夹结构和二聚体形成，与含有所述目的基因的物种的基因组的同源性较低，与所有的Tag序列无交叉杂交。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述Tag序列为单链寡核苷酸序列或肽核酸序列。
9.权利要求1至8中任一所述的方法，其特征在于所述等位基因是由基因突变产生的。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述基因突变为遗传性耳聋基因突变；所述待检测目的基因为GenBank Accession Number为NC_000013的GJB2(cox26)、GenBank Accession Number为NC_000001的GJB3(cox31)、GenBankAccession Number为NC_000007的SLC26A4(PDS)和GenBank Accession Number为NC_001807的12S rRNA基因；所述引物组包括用于扩增GenBank Accession Number为NC_000013的GJB2(cox26)基因的35delG、167delT、176del16、235delC和299delAT突变位点分别对应的两种等位基因特异性引物和一种共用引物，用于扩增GenBank AccessionNumber为NC_000001的GJB3(cox31)基因的538 C＞T和547 G＞A突变位点分别对应的两种等位基因特异性引物和一种共用引物，用于扩增GenBank AccessionNumber为NC_000007的SLC26A4(PDS)基因的707 T＞C和2168 A＞G和IVS7-2 A＞G突变位点分别对应的两种等位基因特异性引物和一种共用引物，GenBankAccession Number为NC_001807的12S rRNA基因1555A＞G突变位点对应的两种等位基因特异性引物和一种共用引物；用于扩增GenBank Accession Number为NC_000013的GJB2基因的35delG突变位点的两个等位基因特异性引物的5′端分别连接有具有序列表中序列1和序列2的核苷酸序列的Tag1和Tag2；用于扩增GenBank Accession Number为NC_000013的GJB2基因的167delT突变位点的两个等位基因特异性引物的5′端分别连接有具有序列表中序列3和序列4的核苷酸序列的Tag3和Tag4；用于扩增GenBank Accession Number为NC_000013的GJB2基因的176del16突变位点的两个等位基因特异性引物的5′端分别连接有具有序列表中序列5和序列6的核苷酸序列的Tag5和Tag6；用于扩增GenBank Accession Number为NC_000013的GJB2基因的235delC突变位点的两个等位基因特异性引物的5′端分别连接有具有序列表中序列7和序列8的核苷酸序列的Tag7和Tag8；用于扩增GenBank Accession Number为NC_000013的GJB2基因的299delAT突变位点的两个等位基因特异性引物的5′端分别连接有具有序列表中序列9和序列10的核苷酸序列的Tag9和Tag10；用于扩增GenBank Accession Number为NC_000001的GJB3基因的538 C＞T突变位点的两个等位基因特异性引物的5′端分别连接有具有序列表中序列11和序列12的核苷酸序列的Tag11和Tag12；用于扩增GenBank Accession Number为NC_000001的GJB3基因的547 G＞A突变位点的两个等位基因特异性引物的5′端分别连接有具有序列表中序列13和序列14的核苷酸序列的Tag13和Tag14；用于扩增GenBank Accession Number为NC_000007的SLC26A4基因的707 T＞C突变位点的两个等位基因特异性引物的5′端分别连接有具有序列表中序列15和序列16的核苷酸序列的Tag15和Tag16；用于扩增GenBank Accession Number为NC_000007的SLC26A4基因的2168 A＞G突变位点的两个等位基因特异性引物的5′端分别连接有具有序列表中序列19和序列20的核苷酸序列的Tag19和Tag20；用于扩增GenBank Accession Number为NC_000007的SLC26A4基因的IVS7-2A＞G突变位点的两个等位基因特异性引物的5′端分别连接有具有序列表中序列21和序列22的核苷酸序列的Tag21和Tag22；用于扩增GenBank Accession Number为NC_001807的12S rRNA基因1555A＞G突变位点的两个等位基因特异性引物的5′端分别连接有具有序列表中序列17和序列18的核苷酸序列的Tag17和Tag18。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于所述通用芯片包括分别含有序列表中序列1至序列22的22种Tag序列的22种Tag探针。
12.一种鉴别遗传性耳聋等位基因类型的芯片，其特征在于所述芯片包括分别含有序列表中序列1至序列22的核苷酸序列的22种Tag探针。
13.包括权利要求12所述的鉴别遗传性耳聋等位基因类型的芯片的试剂盒。
全文摘要
本发明公开了一种鉴别等位基因的方法。该方法是以待测样品的DNA为模板，用待检测目的基因的一个或一个以上突变位点对应的等位基因的引物组和不具有5′→3′外切核酸酶活性的DNA聚合酶，进行多重PCR扩增包括突变位点在内的待测目的基因的等位基因片段，将得到的多重PCR扩增产物与通用芯片杂交，根据杂交结果确定是哪种等位基因；所述引物组包括一种通用引物，和用于扩增每种目的基因的每个突变位点对应的两种等位基因特异性引物和一种共用引物；所有的等位基因特异性引物中每种引物的5′端均连接有不同的Tag序列；所述通用芯片包括若干种Tag探针，所述Tag探针与所述Tag序列相同，其中，每一种Tag探针只与多重PCR产生的互补序列杂交结合。
文档编号C12Q1/68GK1896284SQ20061008952
公开日2007年1月17日 申请日期2006年6月30日 优先权日2006年6月30日
发明者李彩霞, 高华方, 刘湘, 蔡斌, 张地, 程京 申请人:博奥生物有限公司, 清华大学