专利名称：一种富锌亮菌多糖及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种药食两用的菌类多糖及其制备方法和应用，特别涉及富含微量营养元素的菌类多糖及其制备方法和应用，确切地说是富锌亮菌多糖及其制备方法和用途。
背景技术：
亮菌[Armillariella tabescens(Scop.ex Fr.)Sing]又名假蜜环菌，是我国首次发现的一种具有药用兼食用的担子菌。中医认为，该菌性寒、味甘，有强筋壮骨、明目、利肺、益肠胃等保健功效，在我国民间多作为治疗急慢性肝炎及胆道疾患的中草药。从其中提取的亮菌多糖具有免疫调节、护肝、抑瘤、升白等多种药理活性。
锌是人体必需的微量元素之一，它是许多金属酶的组成成分或酶的激活剂；锌参与细胞基因的转录与复制、蛋白质生物合成、激素与受体结合等，促进生长发育与组织再生，促进维生素A的生理和代谢以及参与免疫功能等；尤其在有机化之后，形成的锌-有机复合物对人体可产生各种特殊的生理功能和高度的生化效应。目前已有报道，多种药用菌对锌具有富集作用且富锌后其药理活性增强。
随着人类利用辐射的日趋广泛，人体受辐射的机会增多，致使对辐射损伤的机制和防护药物研究成为人们关注的焦点。研究表明，多种多糖具有抗辐射作用，是非常有前景的天然辐射防护剂。亮菌的固态发酵和液体深层发酵方法国内已经有报道，但利用固态发酵和液体深层发酵使亮菌富锌并从中制备富锌亮菌多糖，进一步研究其抗辐射的生物活性，迄今为止未见报道。制备富锌亮菌多糖和研究其医药用途对研制、开发富锌亮菌多糖功能性产品具有现实意义。
发明内容
本发明利用亮菌富集锌的特性制备富锌亮菌菌索并从中提取富锌亮菌多糖，进而深入研究其药理作用，旨在拓展亮菌的应用范围，所要解决的技术问题是由出发菌株培养得到富锌亮菌菌索并从中提取富锌亮菌多糖，进一步研究此多糖所具有的抗辐射药理活性。
本发明所称的富锌亮菌多糖是以亮菌菌株为出发菌株、经液态富锌静置发酵培养制备富锌亮菌菌索，从该富锌亮菌菌索中提取得到的富锌亮菌多糖。
所谓液态富锌静置发酵培养就是在富含锌的液体培养基中进行静态发酵培养。
本富锌亮菌多糖的制备方法，以亮菌菌株为出发菌株，包括液态富锌静置发酵培养和富锌亮菌多糖的提取、分离及干燥，其特征在于所述液态富锌发酵培养是亮菌接种在灭菌的pH5～8的液体培养基中于24～30℃条件下培养15～25天制备富锌亮菌菌索，所述的液体培养基为每1000ml中含以下组分及重量葡萄糖100～200g， 蔗糖 150～200g， 玉米粉 100～200g，乙醇 5～15ml， KH2PO40.5～3g，MgSO40.2～2g， ZnSO4400～800mg。
优选每1000ml液体培养基中各组分重量为葡萄糖120～180g， 蔗糖 170～230g， 玉米粉 120～180g，乙醇 7～13ml，KH2PO40.6～2g，MgSO40.3～1g，ZnSO4500～700g。
最佳每1000ml液体培养中各组分重量为葡萄糖150g， 蔗糖200g，玉米粉150g，乙醇10ml，KH2PO41g，MgSO40.5g， ZnSO4600mg。
液态培养基的pH值优选pH6～7，最佳pH6.5。发酵培养的温度优选24～28℃，最佳25～27℃，培养时间优选16～24天，最佳18～22天。液态静置发酵培养结束后便得到富锌亮菌菌索。
所述的自富锌亮菌菌索中提取富锌亮菌多糖就是将富锌亮菌菌索匀浆后用水提醇沉法进行提取，首先用75～85℃的水浸提至少2次，分离、合并水浸提液，浓缩水浸提液以提高多糖的浓度，然后在0～10℃条件下加入乙醇使多糖沉淀(浓缩液与乙醇的体积比为1∶2～1∶5)，分离、干燥，得富锌亮菌多糖。优选75℃水浸提，4℃时醇沉。
本培养方法富锌率达90～95％，即液体培养基中的无机锌绝大部分被亮菌菌索所富集。
本发明所称的富锌亮菌多糖为无定形灰色粉末，提取得率达14％，多糖含量为75～80％，有机锌含量105～135mg/g。经DNS(3、5-二硝基水杨酸)比色法和苯酚硫酸法测定，该提取物属多糖类化合物，称富锌亮菌多糖(ZnATS)。当用离子交换法吸附、分离、纯化后得到两种多糖组分，分别称ZnATS-1、ZnATS-2。ZnATS-1呈灰色，ZnATS-2呈白色。
本ZnATS，无毒，安全性好。
毒性试验取健康昆明小鼠30只，雌雄各半，体重18～22g，禁食(自由饮水)12h，次日上午、下午各灌胃ZnATS一次，浓度为200mg/ml，容量为0.5ml/10g体重，连续7d，正常饲养并观察给药间隔及给药动物反应和死亡情况。结果给药后小鼠在30min内活动减少，随后恢复正常，摄食、粪便、毛发等均无明显异常，亦无一小鼠死亡。结果显示ZnATS给小鼠灌胃的最大耐受量＞14g/kg，提示ZnATS安全性好。
本发明用ZnATS对60Coγ射线致小鼠损伤动物模型进行了试验，结果表明ZnATS对γ射线所致小鼠辐射损伤有明显的保护作用。
1.ZnATS对受照小鼠存活率的影响实验方法昆明种小鼠适应性喂养3d后，随机分7组，即空白对照组和辐射对照组、阳性对照组(参芪片，剂量8g/kg，浓度0.4g/ml)、ATS组、ZnATS高、中、低剂量受试组，每组15只。空白和辐射对照组每天灌0.4ml生理盐水，其余各组灌相同体积的相应药物。另外，除空白对照组外，其余各组小鼠于ig后D7d进行60Coγ一次性照射，总剂量为8.0Gy。各组小鼠继续ig14d，观察辐射后30d内小鼠的存活率。30d存活率＝(每组小鼠30d存活数/每组小鼠总数)×100％；保护指数＝实验组鼠平均存活天数/辐射对照组鼠平均存活天数。
实验结果由表1可知，ZnATS高、中、低剂量组存活率分别为40％、33.3％和13.3％，分别比辐射对照组提高33.33％、26.63％和6.67％；平均存活时间分别延长10.67、9.94和5.00d，其中高、中剂量组与照射对照组比较有显著性差异(P＜0.01)，且其保护系数K值分别达1.73和1.68，说明有保护意义(K＞1.20)。ZnATS与同剂量组的ATS比较，平均存活时间有所延长但无生物学意义(P＞0.05)。
表1ZnATS对8.0Gyγ射线受照小鼠平均寿命和30d存活率的影响(n＝15，x±s)
注与辐射对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01.
2.ZnATS对受照小鼠外周血血象的影响实验方法昆明种小鼠适应性喂养3d后，随机分7组，即空白对照组和辐射对照组、阳性对照组(剂量8g/kg，浓度0.4g/ml)、ATS组、ZnATS高、中、低剂量受试组，每组10只。空白和辐射对照组每天灌0.4ml生理盐水，其余各组灌相同体积的相应药物。另外，除空白对照组外，其余各组小鼠于ig后第7d进行60Coγ一次性照射，总剂量为4.0Gy。各组小鼠继续灌胃，分别在照射前1d、照射后第3d、第7d、第10d、第14d取小鼠尾血，用常规显微计数法测量外周血白细胞数。
实验结果由表2可知，照射后，ZnATS 3个剂量组小鼠外周血白细胞数与空白组比较，白细胞总数明显下降；继续给药灌胃，各组小鼠白细胞都在回升；且于照射后第10d、第14d与辐射对照组相比，有生物学意义(P＜0.05，P＜0.01)，其中，ZnATS高剂量组白细胞回升效果较阳性对照组好，而且ZnATS组小鼠白细胞回升速度较同剂量ATS组的快。说明中、高剂量ZnATS溶液能促进辐照后外周血中白细胞数的恢复，从而起到加速患者体质恢复的功能。
表2ZnATS对4.0Gyγ射线受照小鼠外周血白细胞数的影响(n＝10，x±s)
注与辐射对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01，与亮菌多糖组比较ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01。
3.ZnATS对受照小鼠骨髓DNA含量和体重的影响实验方法另取昆明中小鼠，分组、给药和辐射剂量同动物模型试验2。每5天称小鼠体重一次，计算小鼠辐射前后体重变化。并取处死后小鼠的一侧股骨骨髓，用紫外分光光度计测量其DNA含量。
实验结果ZnATS各剂量组的骨髓DNA含量与照射对照组比较，有极显著性提(P＜0.01)；与同剂量组ATS的比较，有显著性差异(P＜0.05)；说明ZnATS溶液能一定程度上能修复由辐射造成的对小鼠骨髓DN A的损伤。另外，小鼠体重在辐射后增加的幅度明显减小；继续给药后，各给药组小鼠体重较辐射对照组有所增加，但无统计学意义(P＞0.05)。结果见表3。
表3ZnATS对4.0Gyγ射线受照小鼠骨髓DNA含量和bw的影响(n＝10，x±s)
注与辐射对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01，与亮菌多糖组比较ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.014.ZnATS对受照小鼠骨髓微核和精子畸变的影响实验方法取动物模型试验3中的小鼠，将取处死后小鼠的另一侧股骨骨髓，以小牛血清涂片，染色，采用双盲法计数，每只小鼠计数1000个骨髓嗜多染红细胞(PCE)的微核(MN)数，计数微核细胞数，以千分率表示。另取小鼠附睾，以生理盐水制片，染色，显微观察1000个精子，计数畸变精子数，以千分率表示。
实验结果由表4可知，小鼠受到照射后，有微核的骨髓嗜多染红细胞数和有畸变的精子细胞数较正常组明显增加。给药后，ZnATS 3个剂量组的小鼠微核率和精子畸变率与照射对照组比较均有极显著降低(P＜0.01)，使其更接近正常组水平；与同剂量组的ATS比较，也有显著性差异(P＜0.05)；说明ZnATS溶液对由辐射造成的小鼠骨髓微核率和精子畸变率上升，有较好的对抗作用。
表4 ZnATS对4.0Gyγ射线受照小鼠骨髓微核和精子突变率的影响(n＝10，x±s)
注与辐射对照组比较较*＜0.05，**P＜0.0
电离辐射对机体造成的损伤是多方面的，如引起突变、造成衰老和缩短寿命，尤其是对造血系统和免疫系统的损伤。本实验的ZnATS中、高剂量组能提高8.0Gy照射小鼠平均存活时间和30d存活率，可以显著回升4.0Gy照射小鼠受照小鼠骨髓DNA含量和外周血白细胞数、降低骨髓微核率和精子畸变率；其中部分指标测定结果比阳性对照组和亮菌多糖组更接近正常组水平。表明ZnATS有明显的抗辐射作用。
综上所述，ZnATS能促进受辐射损伤的造血系统和免疫系统功能的恢复，并对它们具有一定的保护作用。ZnATS本身毒性低，代谢后成为机体的营养物质，而有机锌有利于机体的吸收，无蓄积作用。实验结果表明，富锌亮菌多糖类物质是一种有潜在价值的抗辐射活性物质，可用于相关人群对辐射伤害的预防或因辐射、放疗引起的辐射损伤的临床治疗。也可用于相关人群的抗辐射膳食食品或保健食品。这就是说ZnATS在制备抗辐射药品或保健品中的应用。
ZnATS同ATS和其他多糖类物质一样具有良好的加工性，可与药学上允许的多种辅料加工成口服制剂，如糖浆剂、片剂、胶囊胶、颗粒剂等。
本发明中培养基配方法简单、原料便宜、操作稳定、周期短，锌富集率高，有利于实现产业化，规模化。ZnATS的提取工艺也很简单，ZnATS中有机锌含量高。
具体实施例方式
(一)、培养基的配制取500ml蒸馏水，加入下表中各组分，然后用蒸馏水稀释至1000ml，消毒灭菌，备用。
(二)、发酵培养与多糖的提取在无菌条件下以接种量为5g/L，将亮菌菌种接种在装有上表中任一培养基的发酵瓶中，在26℃条件下液态静置发酵培养20天。培养结束后收集富锌亮菌菌索，并用持续透析法将菌索中的无机锌除去。具体方法为将富锌亮菌菌索在含有0.02％叠氮化钠的双蒸水中反复透析，直到用茚三酮法检验透析液中无氨基酸为止。再将透析后富锌菌索匀浆，用80℃的水浸提3次，分离得到水浸提液并浓缩，流水透析24h后再浓缩，在4℃条件下加入乙醇使多糖沉淀(浓缩液与乙醇的体积比为1∶3)，然后分离，复溶，用Sevag法除去蛋白质，冷冻干燥后得富锌亮菌多糖。该有机锌含量为105～135mg/g。
(三)、富锌亮菌多糖中锌含量的测定用原子吸收分光光度法测定，具体方法如下电子天平称取经冷冻干燥的富锌亮菌多糖样品约2.0g左右，放入坩埚内，加(1+10)磷酸0.5mL，小火炭化约2h，再在温度为500℃马福炉中灰化8h，灰化后待坩埚冷却，加混合酸少许，再小火加热至无黑色碳粒，取出后用1mol/L盐酸定容至50mL容量瓶中，即样液。吸取0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50mL锌标准使用液分别置于50mL容量瓶中，以1mol/L盐酸稀释至刻度，混匀。将处理后的样液、试剂空白液和各容量瓶的锌标准液分别用美国热力公司M6型原子吸收分光光度计进行测定，在波长213.90nm、狭缝0.20nm、灯电流2.60A、电压455.00V、空气流量5.0L/min、乙炔流量1.2L/min的条件下测定锌元素的含量。
(四)、富锌亮菌多糖制剂1、颗粒剂取富锌亮菌多糖100g，甘露醇390g和适量甜味剂投入高速搅拌制粒机中，混合5min后加入5％羟丙甲纤维素继续搅拌制湿粒，热风干燥后喷入适量香精混匀，18目筛整料。
2、胶囊剂取干淀粉25g、乳糖15g、滑石粉10g、十二烷基硫酸钠1g，用倍量稀释法混合均匀后加入100g富锌亮菌多糖混合均匀，将该粉末直接装胶囊。
3、片剂取富锌亮菌多糖100g，微晶纤维素18g，淀粉75g混合均匀，10％PVP乙醇溶液适量制软材，过筛制湿粒，干燥、整粒后加硬脂酸镁混匀压片。
4、糖浆剂取富锌亮菌多糖100g，蔗糖650g，苯甲酸纳2g，先加纯化水溶解，然后用纯化水稀释至1000ml。
5、注射用冻干粉取富锌亮菌多糖100g，注射用水200ml，经无菌过滤后分装于2ml安瓿瓶中，低温冷冻干燥后无菌熔封。
权利要求
1.一种富锌亮菌多糖，其特征在于本多糖是自亮菌菌株经液态富锌静置发酵制备的富锌亮菌菌索中提取得到的富锌亮菌多糖，多糖含量75～80％，有机锌含量105～135mg/g。
2.由权利要求1所述的富锌亮菌多糖的制备方法，以亮菌菌株为出发菌株，包括液态富锌静置发酵培养和富锌亮菌多糖的提取、分离及干燥，其特征在于(1)、所述液态富锌发酵培养是亮菌接种在灭菌的pH5～8的液体培养基中于24～30℃条件下培养15～25天制备富锌亮菌菌索，所述的液体培养基为每1000ml中含以下组分及重量葡萄糖100～200g，蔗糖150～250g，玉米粉100～200g，乙醇5～15ml，KH2PO40.5～3g，MgSO40.2～2g， ZnSO4400～800mg。(2)、所述的富锌亮菌多糖的提取就是将菌索匀浆后用75～85℃的水浸提至少2次，分离、合并水浸提液，浓缩后于0～10℃条件下加入乙醇使多糖沉淀，分离后将沉淀干燥。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于pH6～7的每1000ml液体培养基中各组分重量为葡萄糖120～180g，蔗糖170～230g，玉米粉120～180g，乙醇7～13ml， KH2PO40.6～2g，MgSO40.3～1g， ZnSO4500～700g。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于pH6.5的每1000ml液体培养基中各组分重量为葡萄糖150g，蔗糖200g，玉米粉150g，乙醇10ml，KH2PO41g，MgSO40.5g，ZnSO4600mg。
5.由权利要求1所述的富锌亮菌多糖的用途，其特征在于富锌亮菌多糖在制备抗辐射药品或保健品中的应用。
全文摘要
一种富锌亮菌多糖，由亮菌在富含锌的液体培养基中经静态发酵培养制备的富锌亮菌菌索中提取得到的多糖，为无定形灰色粉末，提取率达14％，其多糖含量75～80％，有机锌含量105～135mg/g。实验结果表明，本多糖无毒，能促进受辐射损伤的造血系统和免疫系统功能的恢复，具有抗辐射作用，可应用于制备抗辐射药品或保健食品。
文档编号C12N1/14GK1970577SQ20061009812
公开日2007年5月30日 申请日期2006年11月29日 优先权日2006年11月29日
发明者沈业寿, 郑媛 申请人:安徽大学