应用早熟染色体凝集预测肿瘤细胞辐射敏感性的方法

专利名称：：应用早熟染色体凝集预测肿瘤细胞辐射敏感性的方法
技术领域：
：本发明主要涉及预测肿瘤细胞辐射敏感性的方法，尤其涉及应用早熟染色体凝集预测肿瘤细胞辐射敏感性的方法。
背景技术：
：国外曾报道应用早熟染色体凝集技术来研究细胞在接受射线照射后染色体损伤状况，这是一种快速而精确的研究方法。但是这种方法仅仅应用于研究辐射诱导的染色体损伤，没有明确提出染色体损伤和细胞辐射敏感性之间的必然关系，而且，没有早熟染色体诱导效率的相关报道。癌症是致死率很高的疾病之一。放射生物学家都把研发一种能够预测肿瘤放射效应的方法作为主要目标。精确的肿瘤放射效应的预测分析方法不仅可以为癌症的治疗提供理论依据，而且能够给临床医生选择诊疗方案提供极大的帮助。克隆形成法是一种常用的研究肿瘤放射效应的方法之一(Girin勿T，B咖heimA,Lubin民etal.InternationalJournalofRadiationOncologyBiologyPhysics,1994,30:789;WestCM,DavidsonSE，RobertsSA,etal.BritishJournalofCancer,1997,76:1184;CocoMartin,JM,MoorenE,OttenheimC，etal"InternationalJournalofRadiation,Biology,1999,75:1161;KawataT,ItoH，GeorgeK，改al.RadiationResearch,2003,159:597)，但是作为一种常规的方法，它至少需要14—21天的时间才能形成克隆，对于临床诊断和治疗就不太可行。应用早熟染色体凝集技术来研究肿瘤的辐射效应，从细胞处理到结果统计仅需要2天时间。自从Johnson等(JohnsonRTandRaoPN.Nature,1970,226:717)，Hittelman等(Hi他lman■andRaoPN.MutationResearch,1974，23:251)，Comforth等(CornforthMNandBedfordJS.Science,1983，222:1141)应用早熟染色体凝集(prematurechromosomecondensationPCC)技术研究放射诱导的染色体损伤以来，PCC技术已经成为一种研究辐射诱导各细胞周期时相染色体原初损伤的成熟的方法，尤其在G2期，这一技术效果更佳。G,和G2是细胞周期的两个阶段，G,是和程前间期，G2是分裂前间期。研究资料报道了不同种类的细胞系经不同种类的射线如X射线、Y射线以及重离子束照射后表现出了线性剂量依赖关系。但大多的研究侧重于对细胞G2期的研究，对于G,期以及Gt期和G2期相关性的研究报道很少。
发明内容本发明的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种应用早熟染色体凝集预测肿瘤细胞辐射敏感性的方法。利用早熟染色体凝集预测研究了Y射线对肝癌细胞SMMC-7721的辐射效应，结果表明G,和G2期细胞内的染色单体和等点染色单体断裂数与照射剂量之间存在着线性相关性，染色单体断裂总数与细胞存活率之间存在良好的线性相关性。说明辐射诱导的染色单体断裂可以作为预测SMMC-7721细胞内在辐射敏感性的指标，也可为临床诊断和治疗肝癌提供依据。本发明的目的可以通过采用以下技术方案来实现一种应用早熟染色体凝集预测肿瘤细胞辐射敏感性的方法，其主要特点包括有如下步骤(1)培养细胞，待其处于对数生长期时开始操作；(2)在照射前5分钟加入45—55nmol/L早熟染色体凝集诱导剂蛋白丝氨酸/酪氨酸磷酸酶抑制剂CalyculinA;(3)分别按照不同剂量对细胞进行照射；(4)用克隆形成法测定照射后细胞的存活率；(5)胰酶消化，收集各剂量照射点细胞，通过低渗、固定处理，滴片制作早熟染色体凝集染色体样本；(6)计数染色体断裂的结果，并和细胞存活分数进行拟合，从而得出染色体断裂与细胞辐射敏感性之间的关系。所述的应用早熟染色体凝集预测肿瘤细胞辐射敏感性的方法还包括有所述的早熟染色体凝集诱导剂CalyculinA的制备，将Calyculin-A溶于浓度大于99.99%的乙醇里制成lmM的储存液；照射前将其加入需照射细胞的培养液内，终浓度为50nM。所述的应用早熟染色体凝集预测肿瘤细胞辐射敏感性的方法还包括有所述的克隆形成法包括细胞培养、消化、细胞种植、形成克隆。所述的应用早熟染色体凝集预测肿瘤细胞辐射敏感性的方法所述的染色体的制备，细胞经照射后在37°C，5%C02的恒温培养箱内继续培养30~120分钟；收集细胞，75mMKCl低渗处理15"25分钟，卡诺氏液固定，最后以少量固定液悬浮细胞，滴片，在热蒸汽上烘干，温度在85"90。C，2%-5%姬姆萨Giemsa染色。所述的应用早熟染色体凝集预测肿瘤细胞辐射敏感性的方法，包括有按照Savage(SavageJRK.JournalofMedicalGenetics,1975,13:103)报道的标准，每个剂量点不少于40个的G2期细胞染色体，并计算其染色单体和等点染色单体的断裂数，同时，记录在此过程中出现的G,期细胞，每个等点染色单体断裂被计为两个断裂。这是因为一个等点染色体断裂是指发生在两条染色单体同一位置的两个断裂。本发明还包括有G,和G2期细胞内的染色单体和等点染色单体断裂数与照射剂量之间的关系为Gi期细胞的数量远小于G2期细胞的数量，两者之间的比值介于12.5和20之间。由于改进了国外报道的技术方法，首次测定了化学诱导剂诱导细胞在经射线照射后发生早熟染色体凝集的诱导效率，即化学诱导剂CalyculinA花萼海绵素诱导的02早熟染色体凝集是G,早熟染色体凝集的5到8倍，即Gi期细胞的数量远小于G2期细胞的数量，两者之间的比值介于12.5和20之间。这样就避免了检测所有细胞周期时相早熟染色体凝集的工作量大、而且除G2期外其他时相早熟染色体凝集损伤不易分辨和计数的缺点，在以后的工作中，只要检测G2早熟染色体凝集，就可以来判定受试细胞的辐射敏感性。所述的应用早熟染色体凝集预测肿瘤细胞辐射敏感性的方法，包括有染色单体断裂总数与细胞存活率之间的关系为S=exp(-0.03D-0.06D2)，其中R2=l，a和(3值分别为0.03和0.06。本发明的有益效果是，公开了一种应用于生物
技术领域：
的应用早熟染色体凝集预测肿瘤细胞辐射敏感性的方法。本发明可以快速、精确地预测肿瘤细胞的辐射敏感性；耗时短，24小时之内可以给出结果；工作量小，只需要检测40个G2期细胞内的染色体断裂类型和数目就可以给出结果。本发明广泛地应用到肿瘤临床放射治疗机构，用于放射治疗计划的制定。图1为SMMC-7721细胞存活曲线；图2为G,与G2期染色单体断裂剂量效应关系；图3为G2期细胞等点染色单体断裂与照射剂量之间的关系；图4为G2期染色单体断裂数和等点染色单体断裂数与细胞存活之间的关系。具体实施例方式以下结合附图所示之最佳实施例作进一步详述实施例l:一种应用早熟染色体凝集预测肿瘤细胞辐射敏感性的方法，有如下步骤(1)培养细胞，待其处于对数生长期时开始操作；细胞培养人类肝癌细胞系SMMC-7721(购自CCTCC)用含有10%胎牛血清的RMPI-1640培养液在37aC，5%C02的恒温培养箱内培养。(2)在照射前5分钟加入50nmol/L早熟染色体凝集诱导剂蛋白丝氨酸維氨酸磷酸酶抑制剂CalyculinA;(2)分别按照不同剂量对细胞进行照射；细胞照射指数生长期的人类肝癌细胞SMMC-7721在兰州医学院第一附属医院6()0)源产生的Y射线(剂量率0.20^111111)进行照射。(4)用克隆形成法测定照射后细胞的存活率；克隆形成法包括细胞培养、消化、细胞种植、形成克隆等步骤。(5)胰酶消化，收集各剂量照射点细胞，通过低渗、固定处理，滴片制作早熟染色体凝集染色体样本。(6)计数染色体断裂的结果，并和细胞存活分数进行拟合，从而得出染色体断裂与细胞辐射敏感性之间的关系。观察每个剂量点不少于40个的G2期细胞染色体，并计算其染色单体和等点染色单体的断裂数，同时，记录在此过程中出现的G!期细胞,每个等点染色单体断裂被计为两个断裂。实施例2:本发明早熟染色体凝集诱导剂CalyculinA的制备方法，将Calyculin-A溶于100%的乙醇里制成lmM的储存液；照射前将其加入需照射细胞的培养液内，终浓度为50nM。实施例3:本发明染色体的制备方法，细胞经照射后在37'C，5n/oC02的恒温培养箱内继续培养30分钟。收集细胞，75mM，KC1低渗处理20minutes,卡诺氏液固定，最后以少量固定液悬浮细胞，滴片，在热蒸汽上烘干，温度在85^9(TC，5。/。Giemsa姬姆萨染色。实施例4:包括有G，和G2期细胞内的染色单体和等点染色单体断裂数与照射剂量之间的关系为G,期细胞的数量远小于G2期细胞的数量，两者之间的比值介于12.5和20之间。Calyculin-A是一种蛋白丝氨膨酪氨酸磷酸酶抑制剂，是一种有效的PCC诱导剂，它可以在细胞周期的各个时相诱导染色体凝集，尤其在G2期其诱导效率更高。Calyculin-A在50nM的浓度下可使混合细胞发生早熟染色体凝集，被凝集的染色体中，G,期细胞约占20W，80%左右为02期细胞，把这两个时相细胞数的比例称为PCC诱导效率。Calyculin-A诱导02期染色体凝集的效率是G,期的5—8倍，在各个剂量点，.当计数40个G2期细胞时，分别有5到8个G,期细胞进入计数范围，说明在此实验中PCC诱导效率是12.5%~20%，结果见表l。表1G,期与G2期早熟染色体凝集细胞数及比例<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>该结果显示G,期细胞的数量远小于G2期细胞的数量，两者之间的比值介于12.5和20之间，通过重复实验，我们发现了这一规律，因此，我们认为可以利用这一比值关系的确定性来只采用G2期PCC分析染色体断裂的结果，从而避免了大量繁重的工作，这也是该方法最有价值之处。实施例5:包括有染色单体断裂总数与细胞存活率之间的关系为SDcp(-0.03D-0.06D2)，其中R2=l，a和p值分别为0.03和0.06。图1为SMMC-7721经Y射线照射后的存活曲线。该曲线经线性平方拟合后结果良好，方程为S=exp(-0.03D-0.06D2)，R2=l，a和p值分别为0.03和0.06。|3值大于a值表明在细胞杀伤贡献方面，高剂量辐射较好地克服了细胞修复即时效应，存活率以指数形式衰减，而不像低剂量辐射时以线性衰减为主。在G期和G2期，染色单体断裂数的增加与细胞存活率的下降都具有良好的线性相关性。图2显示了G,期和G2期细胞染色单体断裂数与照射剂量之间的关系。不论在G,期还是G2期，染色单体断裂数与剂量呈线性增长关系。在同一剂量点，Gi期平均每细胞染色单体断裂数要少于G2期，两者之间的比值介于12.5和20之间。图3为G2期细胞等点染色单体断裂与照射剂量之间的关系。经线性回归分析，其回归方程为j^ftW+ft2c，/2=0.卯，说明两者之间具有良好的线性相关。图4为G2期染色单体断裂数和等点染色单体断裂数与细胞存活之间的关系。应用直线回归分析，在G2期细胞中，染色单体断裂数和等点染色单体断裂数与细胞存活率之间具有比较好的相关性。尽管个别数据点小幅偏离拟合曲线，但断裂数随着细胞存活率下降而增长的趋势是明显的。权利要求1.一种应用早熟染色体凝集预测肿瘤细胞辐射敏感性的方法，其特征包括有如下步骤(1)培养细胞，待其处于对数生长期时开始操作；(2)在照射前5分钟加入45-55nmol/L早熟染色体凝集诱导剂蛋白丝氨酸/酪氨酸磷酸酶抑制剂CalyculinA；(3)分别按照不同剂量对细胞进行照射；(4)用克隆形成法测定照射后细胞的存活率；(5)胰酶消化，收集各剂量照射点细胞，通过低渗、固定处理，滴片制作早熟染色体凝集染色体样本；(6)计数染色体断裂的结果，并和细胞存活分数进行拟合，从而得出染色体断裂与细胞辐射敏感性之间的关系。2.如权利要求1所述的应用早熟染色体凝集预测肿瘤细胞辐射敏感性的方法，其特征还包括有所述的早熟染色体凝集诱导剂CalyculinA的制备，将Calyculin-A溶于浓度大于99.99n/。的乙醇里制成lmM的储存液；照射前将其加入需照射细胞的培养液内，终浓度为50nM。3.如权利要求1所述的应用早熟染色体凝集预测肿瘤细胞辐射敏感性的方法，其特征还包括有所述的克隆形成法包括细胞培养、消化、细胞种植、形成克隆。4.如权利要求1所述的应用早熟染色体凝集预测肿瘤细胞辐射敏感性的方法，其特征包括有所述的染色体的制备，细胞经照射后在36—37.5°C，4.5—5.5n/oC02的恒温培养箱内继续培养3O"120分钟；收集细胞，75mMKCl低渗处理15—25分钟，卡诺氏液固定，最后以少量固定液悬浮细胞，滴片，在热蒸汽上烘干，温度在85—9(TC，2%-5%姬姆萨染色。5.如权利要求1所述的应用早熟染色体凝集预测肿瘤细胞辐射敏感性的方法，其特征包括有观察每个剂量点不少于40个的G2期细胞染色体，并计算其染色单体和等点染色单体的断裂数，同时，记录在此过程中出现的G;期细胞，每个等点染色单体断裂被计为两个断裂。6.如权利要求5所述的应用早熟染色体凝集预测肿瘤细胞辐射敏感性的方法，其特征包括有G,和G2期细胞内的染色单体和等点染色单体断裂数与照射剂量之间的关系为G,期细胞的数量远小于G2期细胞的数量，两者之间的比值介于12.5和20之间。7.如权利要求1所述的应用早熟染色体凝集预测肿瘤细胞辐射敏感性的方法，其特征包括有染色单体断裂总数与细胞存活率之间的关系为:S=exp(-0.03D-0.06D2)，其中R2=l，a和p值分别为0.03和0.06。全文摘要本发明主要涉及预测肿瘤细胞辐射敏感性的方法，尤其涉及应用早熟染色体凝集预测肿瘤细胞辐射敏感性的方法。一种应用早熟染色体凝集预测肿瘤细胞辐射敏感性的方法，其主要特点包括有如下步骤(1)培养细胞，待其处于对数生长期时开始操作；(2)在照射前5分钟加入早熟染色体凝集诱导剂蛋白丝氨酸/酪氨酸磷酸酶抑制剂CalyculinA；(3)分别按照不同剂量对细胞进行照射；(4)用克隆形成法测定照射后细胞的存活率；(5)胰酶消化，收集各剂量照射点细胞，通过低渗、固定处理，滴片制作早熟染色体凝集染色体样本；(6)计数染色体断裂的结果，并和细胞存活分数进行拟合，从而得出染色体断裂与细胞辐射敏感性之间的关系。本发明可以快速、精确地预测肿瘤细胞的辐射敏感性；耗时短，24小时之内可以给出结果；工作量小，只需要检测40个G₂期细胞内的染色体断裂类型和数目就可以给出结果。文档编号C12Q1/02GK101126719SQ20061010503公开日2008年2月20日申请日期2006年8月15日优先权日2006年8月15日发明者李文建,杨建设申请人:中国科学院近代物理研究所