专利名称：包含hpv抗原和应激蛋白或者其表达载体的组合物激发的抗hpv抗原免疫应答的制作方法
技术领域：
本发明主要涉及由连接的应激蛋白和人乳头瘤病毒抗原参与的、诱导针对人乳头瘤病毒蛋白质抗原的免疫应答的方法和组合物。
背景技术：
人乳头瘤病毒(HPV)的感染很常见，此病毒可通过性传播。据估计性活跃的成人中有20％至80％已被感染。绝大多数感染不出现症状，但感染可引发生殖器湿疣以及肛门和生殖道癌症。生殖器湿疣在成人中流行率为1-5％。全世界有约1％的妇女患有宫颈癌，这是50岁以下妇女致死的最常见原因。宫颈癌与HPV密切相关。Frazer，Genitourin Med 72398-403(1996)。
目前尚无针对HPV的有效治疗组合物或预防组合物即疫苗，因而需要开发有效组合物。传统的灭活疫苗或减毒活疫苗前景黯淡。Frazer认为，目前还不能用细胞培养繁殖HPV，HPV感染的肿瘤刺激效应和HPV的完全物种特异性显示存在其它尚无法轻易克服的困难(Frazer，Genitourin Med 72398-403(1996)).已发现主要衣壳蛋白在真核细胞中表达时，形成无需佐剂便有免疫原性的病毒样颗粒，有人提议这可能成为疫苗开发的基础(Christensen等，普通病毒学杂志752271-6(1994)；亦见PCT/EP95/03974和PCT/US95/12914)。
HPV属于乳多空病毒科的A属，此科还包括SV40和多瘤病毒。已鉴定的HPV超过68个不同型别，它们之间结构上高度相关但在DNA序列水平上相同性不到50％。所有已知型别均为趋上皮细胞病毒，只感染特定类型的上皮并常引起上皮增殖。在普通疣中鉴别出几种型别。已知23个型别感染女性和男性的肛门和生殖道。由HPV的这些型别引起的肛门和生殖道疾病包括生殖器湿疣和侵袭性鳞状细胞癌等。经活检证实有鳞状内上皮损伤或宫颈内上皮瘤形成的妇女中80％以上可鉴定出HPV DNA。一些特定型别，包括HPV 16，18和31均与深度鳞状内上皮损伤及宫颈、外阴、阴茎和肛门的侵袭性癌密切相关(Lorincz等，产科与妇科(ObstetGynecol)79328-37(1992))。Frazer指出，宫颈癌90-95％与HPV有关。Frazer，Genitourin Med 72398-403(1996)。HPV不仅与肛门及生殖系统的癌症有关，还存在于咽癌、喉癌和膀胱癌中(Brachman等，癌症研究524832-6(1992)；Rotola等，国际癌症杂志52359-65(1992))。近期一项研究报道接受检查的肺癌30％有HPV DNA。已鉴定到的型别包括HPV 6，11，16，18，31和33(Soini等，Thorax 51887-893(1996))。因此，与癌症最相关的HPV型别是6，11，16，18，31和33，其中在90％以上宫颈癌中可检测到的HPV 16和18(van Driel等，医学年鉴(Ann Med)28471-477(1996))已得到最彻底的研究。
乳头瘤病毒均为DNA病毒，具有含7800-7900个碱基对的双链环状DNA基因组、无包膜病毒体和由72个壳粒组成的二十面体衣壳。基因组包含三个主要区段，一个晚期基因编码区，一个早期基因编码区和非编码区(Park等，癌症761902-1913(1995))。非编码区也称为上游调节区。该区长约400个碱基对，包含控制早期及晚期基因表达的各种转录因子的一系列结合位点。晚期基因区有两个各自独立的编码病毒衣壳蛋白L1和L2的开放读码框。蛋白质L1是主要衣壳蛋白，在不同种HPV之间高度保守。早期基因区包括六个开放读码框，命名为E1，E2，E4，E5，E6和E7。蛋白质E6和E7为癌基因产物，对病毒复制及宿主细胞永生化和转化比较关键。蛋白质E1、E2和E4在病毒复制中也有重要作用。此外，E4在病毒成熟时起作用。E5的作用不明。
恶性肿瘤细胞有两个重要的生长特点。它们是永生化的，即它们不会衰老，而且能不受接触抑制地生长。将HPV 16或18 DNA导入永生化啮齿类细胞导致这些细胞发生转化，即它们获得在缺乏基质附着时生长的能力及注入小鼠时形成肿瘤的能力(Crook等，美国国家科学院学报858820-24(1988))。将HPV DNA导入早期代数的未永生化细胞中时获得不同的结果细胞变得永生化但未转化(Woodworth等，癌症研究484620-28(1988))。因此，肿瘤发生的途径之一涉及以下变化此变化导致细胞永生化，随后表达使之发生转化的HPV基因。与体外细胞转化有关的HPV基因是编码E6和/或E7的基因(Bedell等，病毒学杂志613635-40(1987))。已有人提出了E6和E7蛋白可能引起细胞转化的机制(Park等，癌症761902-1913(1995)，及其中所引用的文献)。
E6是包含Zn结合区的小分子(约15,000MW)多肽。其转化功能的一个证据是发现此蛋白质结合p53。p53是众所周知的可对细胞周期的进程进行负调节并因此对细胞生长和分化进行负调节的肿瘤抑制蛋白。E6与p53的结合导致晚期蛋白的遍在化(ubiquination)及最终降解，此过程与另一个称为“E6相关蛋白”的细胞蛋白质有关。结果，表达E6的细胞的p53基础水平降低。p53水平受DNA损伤的刺激而上升。这一水平上升导致细胞周期蛋白依赖型激酶抑制物p21(其介导细胞周期的停滞)的表达增加。该机制为细胞提供了在可能产生损伤/突变的复制之前先修复受损DNA的时间段。p53因E6的影响而加强转换可能阻止该机制的启动。近期也有人发现，E6对细胞周期的调节不仅由于加速p53的降解而实现，甚至更直接通过阻断p53与DNA的作用而完成(Thomas等，癌基因10261-8(1995))。
E7蛋白是小分子(约10,000Mw)，能与成视网膜细胞瘤基因产物Rb结合的Zn结合型磷蛋白。Rb是与转录因子E2F结合并使之失活的肿瘤抑制物。E2F的失活控制着一系列生长相关基因的转录，这些基因包括编码胸苷激酶、c-myc、二氢叶酸还原酶和DNA聚合酶α的基因。Rb-E2F复合物的形成阻止后续基因在G0和G1期的表达，限制它们在程控Rb-E2F解离、释放活性转录因子E2F的S期发生表达。Rb-E7复合物的形成阻止Rb-E2F复合物的形成并导致前S期缩短，即加速细胞周期的进程。这些机制的重要性可由以下发现证实HPV的高度致癌型(如HPV 16或18)的E6蛋白对p53的亲和力高于非致癌型的相应蛋白，高度致癌型的E7蛋白对Rb的亲和力高于非致癌型的相应蛋白。
在大多数宫颈癌及先兆损伤中，HPV DNA整合在宿主细胞基因组中(Cullen等，病毒学杂志65606-12(1991))。似乎在多数病例中，整合涉及HPV基因组DNA在E1/E2区被打断，而E6/E7区保留完整。E1/E2区被打断的后果之一是打断了编码两种不同E2蛋白(其中较小的蛋白是早期基因表达的转录抑制物)的开放阅读框架。这将导致E6和E7表达的上调。
发明简述本发明涉及可通过在受试者体内施用而诱导针对HPV蛋白抗原的免疫应答的组合物。免疫应答可以是体液免疫应答或细胞免疫应答，特别是细胞介导的、针对HPV蛋白抗原的细胞溶解性应答。组合物可用于预防或治疗。用于预防时，免疫应答的诱导指在固有免疫水平非常低的情况激发免疫反应。用于治疗时，受试者体内免疫应答的诱导指产生无论在量或质上均超过此前因接触病毒上的、或受试者的受感染或被转化细胞上的HPV蛋白抗原而激发的应答的应答。在特定实施方案中，组合物用于产生针对表达和展示HPV蛋白抗原的肿瘤细胞的免疫应答。在这些实施方案中，组合物所针对的HPV蛋白抗原优选已知一贯表达于HPV相关肿瘤中的E6和E7早期病毒蛋白。在一个实施方案中，组合物包含与应激蛋白(或热休克蛋白(Hsp))相连的HPV蛋白抗原。此HPV蛋白抗原可与此应激蛋白通过化学偶联进行连接，或者抗原与应激蛋白可在能成功表达并分离包含抗原及应激蛋白序列的融合蛋白的核苷酸水平上连接。组合物可导入受试者或应用于来自体内的组织细胞，以刺激和/或引起受试者靶向或介导靶向HPV或包括展示HPV蛋白抗原的肿瘤细胞在内的细胞的免疫细胞增加。组合物在不含佐剂的情况下以非颗粒(如不作为病毒或病毒样颗粒的一部分)蛋白质溶液施用时能有效刺激免疫应答。
在另一实施方案中，组合物包含携带有编码HPV蛋白抗原和应激蛋白的核酸序列的表达载体。该表达载体还包含指导编码序列转录和翻译的序列元件，还可能包括促进核酸向受试者细胞中转移并在其中维持或扩增的元件。表达载体可导入受试者细胞，或可用于转导来自受试者的细胞，从而表达可诱导针对HPV蛋白抗原的免疫应答的HPV蛋白抗原-应激蛋白融合蛋白。
本发明还涉及组合物，其中包含与应激蛋白连接的HPV蛋白抗原及另一种药学可接受的成分。在一个实施方案中，组合物包含偶联物，该偶联物包含与HPV蛋白抗原连接的应激蛋白。在另一个实施方案中，组合物包含融合蛋白(如pET65HE6和pET65HE7表达的蛋白质)，其中应激蛋白与HPV蛋白抗原融合在一起。与编码并能指导包含应激蛋白和HPV蛋白抗原序列的融合蛋白在受试者细胞中表达的表达载体一样，这些组合物的偶联物和融合蛋白也被要求保护。
本发明还涉及应用组合物以提高对HPV蛋白抗原及，在特定实施方案中，对展示HPV蛋白抗原的肿瘤的免疫应答。本文所引科技文献及专利申请，尤其那些涉及本发明组合物的制备和应用的，均全文引入以作参考。
附图简述
图1为构建体pET65H的图示。
图2为构建体pET65HE6的图示。
图3为构建体pET65HE7的图示。
图4为TC-1肿瘤攻击后肿瘤发生百分率对时间作图，证实用Hsp65-E6和-E7融合蛋白成功地免疫了小鼠，使之抗肿瘤。
图5为TC-1肿瘤细胞的特异性细胞裂解率对效应物比靶细胞之比作图，证实在已免疫小鼠体内发生了针对表达HPV抗原(E7)的靶肿瘤细胞的细胞介导型细胞裂解应答。
图6为不同靶细胞的裂解率对效应物比靶细胞之比作图，证实已免疫小鼠体内针对表达HPV-E7的靶肿瘤细胞的细胞介导型细胞裂解免疫应答的特异性。
图7为接受1.3×105TC-1肿瘤细胞后再注入盐水、含Hsp65-E7融合蛋白的盐水或含E7肽的盐水/IFA的小鼠的肿瘤发生率对肿瘤细胞接受后之天数作图。
图8为接受2×105TC-1肿瘤细胞后再注入盐水、含Hsp65-E7融合蛋白盐水或含E7肽的盐水/IFA的小鼠的肿瘤发生率对肿瘤细胞接受后之天数作图。
图9为构建体pET/E7(H)的图示。
图10为一组图，显示Hsp65-E7融合蛋白或E7蛋白免疫小鼠得到的淋巴结细胞体外培养时的胸苷掺入。
图11显示有TC-1肿瘤细胞的小鼠经Hsp-E7融合蛋白或E7治疗对肿瘤大小的影响。
图12为构建体pET65C的图示。
图13为构建体pET65C/E7-1N的图示。
发明详述本发明涉及可诱导受试者内针对展示HPV蛋白抗原的受试者细胞中人乳头瘤病毒的免疫应答的组合物。在一个实施方案中，该组合物包含HPV蛋白抗原和应激蛋白。在另一个实施方案中，该组合物包含能指导HPV蛋白抗原-应激蛋白融合蛋白表达的表达载体。
本发明的组合物用于预防时可提高对HPV蛋白抗原的免疫力，阻止HPV或受试者内表达和展示HPV蛋白抗原或呈现其部分的细胞的产生和增殖。该组合物也可用于治疗已感染HPV的受试者，以阻止进一步的病毒增殖或排除受试者体内因HPV感染而增殖的细胞，包括表达和展示HPV抗原或呈现该抗原一部分的肿瘤。本文提及HPV蛋白抗原作为本发明组合物所诱导免疫应答的靶时，应理解为包括完整的HPV蛋白质或HPV蛋白质展示在HPV表面或受试者被感染细胞表面的多肽(分子量大于10kDa)部分以及受感染细胞因加工和呈递HPV蛋白质(如通过经典的MHCI类或II类途径)而显示的肽。
已克隆了多种不同型别的HPV的基因组序列并用DNA序列分析法进行了鉴定。含完整或部分HPV基因组的细菌载体可从多处得到，包括如美国典型培养物保藏中心(ATCC)。可用于本发明之实践的其它HPV型别可用此前为之建立的本领域已知方法分离并定型。
HPV表达六或七种非结构蛋白和两种结构蛋白，原则上这每一种蛋白质均可作为用来消除HPV和/或受感染细胞的免疫预防或免疫治疗法的靶。病毒衣壳蛋白L1和L2均为由晚期基因编码的HPV结构蛋白。L1是在不同种HPV之间高度保守的主要衣壳蛋白。七种非结构蛋白均为早期病毒基因产物。蛋白质E1、E2和E4在病毒复制中起重要作用。蛋白质E4还在病毒成熟过程中起作用。E5的作用了解不多。蛋白质E6和E7是对病毒复制及宿主细胞永生化和转化很关键的癌基因产物。这些可掺入本发明组合物中的蛋白质均称为HPV蛋白抗原。
本发明应用于预防和治疗HPV相关癌症时的特殊重要性在于，有人发现HPV E6和E7蛋白质在宫颈癌中持续表达(Zur Hausen，病理学应用(Appl.Pathol.)519-24(1987)；Pater和Pater，病毒学145313-8(1985))。Kinoshita等，英国癌症杂志71344-9(1995)已证实E6和E7基因也在肺癌中表达。而且，在宫颈癌病人体内发现有某种天然免疫的(体液)免疫应答(Jochmus-Kudielka等，J.Nat’l Cancer Inst.811698-704(1989))。最后，模型研究证实，用修饰的E7蛋白免疫可保护小鼠抵抗活化c-Ha-ras基因和HPV E6/E7基因转化的肺细胞的攻击(Lin等，癌症研究5621-26(1996))。这些蛋白通常表达于HPV感染所致癌症中、这些蛋白也是在癌症的发展和维持中最可能起主要作用的癌基因产物、针对这些蛋白质的免疫应答可经诱导产生，有鉴于此，E6和E7是免疫干预或预防的优选靶，并因此是将用于预防或治疗HPV相关癌症的本发明组合物中的优选HPV蛋白抗原。
多种动物模型中已显示细胞毒T细胞(CTL)肽可诱导针对特定病毒的保护性免疫(Kast和Melief，免疫通讯30229(1991))。有人发现，免疫抑制者比有免疫力者更易患宫颈癌(Schneider等，细胞学通报(ActaCytologica)27220-4(1983))。这一点强烈暗示免疫系统，特别是T细胞系统的细胞免疫能力在对抗HPV相关恶性肿瘤的免疫防御中起主要作用。支持CTL应答在针对E6和E7转化细胞产生保护性免疫时有重要作用的证据来自以下实验，实验中用HPV 16 E7的CTL相关表位接种的小鼠受到保护，可抵抗可移植性HPV 16诱导的肿瘤(Feltamp等，欧洲免疫学杂志232242(1993))。本发明基于我们的以下发现将应激蛋白与HPV蛋白抗原连接可得到能强烈刺激针对所连接HPV蛋白抗原的细胞应答，尤其是细胞介导型细胞裂解应答(这是能杀死展示HPV抗原的细胞的应答)的组合物。
本发明的HPV蛋白抗原可以是HPV编码的任意多肽。此外，它可以是HPV蛋白质的一个部分，只要该部分与应激蛋白连接时仍保持诱导对感染细胞所展示或HPV所显示HPV蛋白抗原的免疫应答的能力即可。本发明之包含HPV抗原各种部分而不是完整HPV蛋白抗原的组合物可用诸如本篇后文所述或分子生物学和生物化学教材中所述的常规方法生产。Sambrook等，分子克隆实验室手册第二版，冷泉港实验室出版社(1989)；Deutscher.M.，蛋白质纯化方法指南，酶学，卷182。Academic Press.Inc.，San Diego.CA(1990)。可在诸如本篇后文所述实施例的实验中检测每种含HPV蛋白抗原特定部分的组合物所产生的针对HPV蛋白抗原的免疫应答的强度及质量。最低限度，本发明组合物中的HPV蛋白抗原应包含HPV蛋白质的至少一个B或T细胞表位(如CTL或T辅助细胞表位)。当提到本发明的组合物时，术语“HPV蛋白抗原”包括HPV蛋白抗原的一些部分，只要这些部分保留了诱导针对感染细胞所展示或HPV所显示HPV蛋白抗原的免疫应答的能力即可。
E6，尤其E7是转化蛋白质。所含HPV蛋白抗原为完整E6或E7蛋白质序列或者足够完全而保留了转化能力的部分的组合物中，其中抗原的转化特性可能是真正的危险，也可能不是，这取决于HPV抗原的制备方法。例如，若HPV蛋白抗原或包括此抗原的组合物是用可能带来DNA污染的重组技术制备，比较谨慎的做法是采取能消除该抗原的转化能力的步骤。若所用组合物包括可指导包含完整HPV E6或E7蛋白质序列或者足够完全而保留了转化能力的部分的融合蛋白在受试者体内表达的表达载体，可能需要去除使蛋白产物有转化力的序列。E6和E7的非转化变异体可通过融合E6和E7序列获得(PCT/AU95/00868)。因此一些包含E6或E7序列和应激蛋白序列的融合蛋白仍有可能是非转化性的。或者说，可应用本领域内熟知、并已述于PCT/AU95/00868中的技术从E6或E7中选择删除一些序列。删除可在只表达E6或E7序列的表达载体中进行，或在表达E6-或E7-应激蛋白融合蛋白的载体中进行。这类操作的结果可通过在转染实验中检验删除蛋白的转化能力而评估。例如，可用包括删除蛋白基因的表达载体转染NIH3T3细胞，转化能力可通过软琼脂上的集落形成试验而估计。此具体试验也述于PCT/AU95/00868。
在本发明的一个实施方案中，组合物包含两个部分应激蛋白和希望细胞免疫应答所针对的HPV蛋白抗原。这两部分连接成一个独立的单元。这两部分可偶联，即应激蛋白和HPV蛋白抗原之间通过共价键连接。Hermanson，G.T.，生物偶联技术(Biocon jugate Techniques)，AcademicPress.Inc.，San Diego，CA(1996)；Lussow，A.R.等，欧洲免疫学杂志，212297-2302(1991)；Barrios，C.等，欧洲免疫学杂志，221365-1372(1992)。或者，可用重组技术连接这两部分使之表达，该技术将产生在单个分子中包括应激蛋白和HPV蛋白抗原的重组融合蛋白。这将使在生产过程中生产和纯化单一重组分子成为可能。两个部分也可非共价连接。多种已知的高亲和性相互作用可用于非共价连接这两部分。例如，可将生物素基团加在HPV蛋白抗原上，而将需要与之相连的应激蛋白表达为亲和素-应激蛋白融合蛋白。此亲和素-应激蛋白融合蛋白将与生物素化的HPV蛋白抗原牢固结合。类似地，可将HPV蛋白抗原部分与完整应激蛋白或应激蛋白的部分相连，也可将应激蛋白的部分与完整HPV蛋白抗原或与HPV蛋白抗原的部分相连，只要上述相应部分足以在受者体内诱导针对HPV蛋白抗原的免疫应答即可。在另一个实施方案中，组合物包含可指导HPV蛋白抗原-应激蛋白融合蛋白表达的表达载体。
任何合适的应激蛋白(热休克蛋白(Hsp))均可用于本发明之组合物。如实施例所述，可用Hsp60和/或Hsp70。就应激蛋白总体而言，细胞通过增加通常称为应激或热休克基因的一组基因的表达而对应激条件(通常是热休克处理)产生响应。热休克处理涉及将细胞或生物体暴露于比细胞已适应温度高1至数摄氏度的温度下。随着这些基因被诱导，相应应激蛋白水平在受应激的细胞中升高。如本文所用，“应激蛋白”，亦为“热休克蛋白”或“Hsp”，是由应激基因编码的蛋白，因此通常在生物体遭遇或暴露于应激条件时其产生量明显增加。“应激基因”也称为“热休克基因”，在本文中指因生物体(含有该基因)遭遇或暴露于应激条件(如热休克、缺氧、葡萄糖缺乏、重金属盐、能量代谢和电子传递抑制物、蛋白质变性)或某些苯醌袢霉素(benzoquinone ansamycins)而活化或可检测地上调的基因。Nover，L.，热休克应答，CRC出版公司，BocaRaton，FL(1991)。“应激基因”也包括已知应激基因家族中的同源基因，如Hsp70和Hsp90应激基因家族中的某些基因，即使这些同源基因本身并不由应激条件所诱导。本说明书所用应激基因和应激蛋白这两个术语可相互包容，除非本文中另有所指。
在特定实施方案如涉及应激蛋白和HPV蛋白抗原之间化学偶联的实例中，本发明所用应激蛋白为分离的应激蛋白，意思是这些应激蛋白已从产生它们的细胞中选择并分离出来。这样的分离过程可如本文所述并用本领域内已知的蛋白质分离常规方法进行。Maniatis等，分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，N.Y.(1982)；Sambrook等，分子克隆实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社(1989)；Deutscher，M.蛋白质纯化方法指南，酶学，卷182，Academic Press.Inc.，San Diego，CA(1990)。
细菌的主要应激蛋白为分子量分别约70和60kDa的蛋白质，它们常被分别称为Hsp70和Hsp60。这些和其它特异性应激蛋白及编码它们的基因在下文中将进一步讨论。经十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳和考马斯亮兰染色，细菌中Hsp70和Hsp60通常占细胞蛋白质的约1-3％，但在应激条件下累积水平高达25％。应激蛋白似乎参与了重要的细胞过程如蛋白质合成、胞内运输及蛋白质复合物的装配和解体。似乎应激期间合成的应激蛋白量增加的作用主要是使所诱导的蛋白解折叠后果减至最小。事实上，先使细胞接触能诱导应激蛋白合成的温和应激条件可以保护细胞免受随后更强烈应激条件的有害影响。
主要应激蛋白似乎表达于迄今已检查的每种生物体和组织类型中。此外，似乎应激蛋白是迄今所鉴定蛋白质中最保守的一组。例如，比较多种不同生物体中的应激蛋白时，Hsp90和Hsp70在氨基酸水平上有50％或更高相同，且不相同位点也非常相似。已注意到同一物种内的特定应激蛋白家族不同成员之间展示相似或更高水平的同源性。
编码应激蛋白的基因在细胞或生物体的基因组中可能以单拷贝或各不相同的多拷贝形式存在。例如，人类基因组显示包含至少一拷贝hsp100基因，至少两个不同的hsp90基因，多达十个hsp70基因(其中至少好几个是不相同拷贝)，几个T复合物基因(Tcp基因)和至少一个编码相关的线粒体蛋白Hsp60的基因，及至少三拷贝小hsp基因(编码分子大小在20-30kDa范围内的Hsp)。在大多数应激基因家族中，至少有一个基因其表达水平相对较高且为完全组成型或仅仅是轻微热休克诱导型。而且，应激基因中好几个家族包括并非因热而是因诸如钙水平上升等原因而上调的成员。
应激蛋白，尤其是Hsp70，Hsp60，Hsp20-30和Hsp10，都是宿主免疫系统在针对结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌感染的免疫应答中识别的主要决定簇。Young，R.A.和Elliott，T.J.，应激蛋白、感染和免疫监视。细胞505-8(1989)。此外，一些大鼠致关节炎T细胞识别Hsp60表位。VanEden，W.等，自然331171-173(1988)。然而，无分枝杆菌感染史或自身免疫病史的人，包括健康人也携带可识别细菌和人的Hsp60表位的T细胞；健康人中以表达γ-δT细胞受体为特征的相当一部分T细胞可识别自身及外源应激蛋白。O’Brien，R.等，细胞57664-674(1989)。因此，人人(甚至健康人)都有识别外源和自身应激蛋白表位的T细胞群。
这一识别应激蛋白表位的系统大概组成一个针对入侵生物体的“早期防御系统”。Murray，P.J.和Young，R.A.，细菌学杂志1744193-6(1992)。该系统可因细菌和病毒的不断刺激而得到维持。如上述，健康人有识别自身应激蛋白的T细胞群。因此，自身反应性T细胞的存在与正常健康相容，不会导致自身免疫病；这证实人体中应激蛋白的安全性。应激蛋白的安全性另外还可由BCG(卡介苗，一株牛型分枝杆菌菌株)接种的成功和相对安全性证实，这一接种诱导的针对应激蛋白的免疫应答也可保护人体抵抗结核分枝杆菌。
本发明所用应激基因和蛋白质家族是本领域内众所周知的，包括如Hsp100-200，Hsp100，Hsp90，Lon，Hsp70，Hsp60，TF55，Hsp40，FKBPs，亲环蛋白，Hsp20-30，ClpP，GrpE，Hsp10，泛素，钙联接蛋白和蛋白质二硫键异构酶。Macario，A.J.L.，冷泉港实验室研究2559-70，1995；Parsell，D.A.& Lindquist，S.遗传学年鉴27437-496(1993)；美国专利第5,232,833号(Sanders等)。一组特殊的应激蛋白包括Hsp90，Hsp70，Hsp60，Hsp20-30，更优选Hsp70和Hsp60。
Hsp100-200的实例包括Grp170(葡萄糖相关蛋白)。Grp170位于前高尔基体中的ER腔内，可能在免疫球蛋白折叠和装配中起重要作用。
Hsp100的实例包括哺乳动物Hsp110，酵母Hsp104，ClpA，ClpB，ClpC，ClpX和ClpY。酵母Hsp104与大肠杆菌ClpA形成六聚体颗粒，与大肠杆菌ClpB形成四聚体颗粒，这些颗粒的装配似乎需要腺嘌呤核苷酸的结合。Clp蛋白酶产生由ClpP(蛋白水解亚单位)和ClpA组成的一个750kDa异聚多亚基。ClpB-Y结构上与ClpA有关，与ClpA不同的是它们似乎不与ClpP形成复合物。
Hsp90的实例包括大肠杆菌中的HtpG，酵母中的Hsp83和Hsc83，人体中的Hsp90α、Hsp90β和Grp94。Hsp90结合多组蛋白质，这些蛋白质通常为细胞调节分子如类固醇激素受体(如糖皮质激素、雌激素、孕酮和睾丸激素受体)、转录因子和在信号传导机制中起重要作用的蛋白激酶。Hsp90蛋白还参与形成包括其它应激蛋白的丰富的大蛋白质复合物。
Lon是大肠杆菌中作为ATP依赖型蛋白酶降解非天然蛋白质的四聚体蛋白。
Hsp70的实例包括哺乳动物细胞的Hsp72和Hsc73，细菌尤其是如麻风分枝杆菌、结核分枝杆菌和牛型分枝杆菌(如卡介苗本文中称为Hsp71)之类分枝杆菌中的DnaK，大肠杆菌、酵母和其它原核生物中的DnaK，以及BiP和Grp78。Hsp70能特异性结合ATP及解折叠的多肽和肽，从而参与蛋白质的折叠与解折叠以及蛋白质复合物的装配和解体。
Hsp60的实例包括分枝杆菌的Hsp65。细菌的Hsp60常常也称为GroEL，如大肠杆菌的GroEL。Hsp60形成比较大的同聚多亚基复合物，并似乎在蛋白质折叠中起关键作用。Hsp60同系物存在于真核线粒体和叶绿体中。
TF55的实例包括Tcpl、TriC和thermosome。这些蛋白质通常出现在真核生物和古细菌的细胞质中，形成多组分环，促进蛋白质折叠。它们还与Hsp60有较小同源性。
Hsp40的实例包括原核生物如大肠杆菌和分枝杆菌的DnaJ，还有HSJ1、HDJ1和Hsp40。Hsp40在蛋白质折叠、耐热性和DNA复制以及其它细胞活性中起着分子伴侣的作用。
FKBP的实例包括FKBP12、FKBP13、FKBP25和FKBP59、Fprl和Nepl。这些蛋白质通常具有肽酰-脯氨酰异构酶活性并与免疫抑制剂如FK506和雷帕霉素(rapamycin)作用。这些蛋白质通常发现在细胞质和内质网中。
亲环蛋白的实例包括亲环蛋白A、B和C。这些蛋白质具有肽酰-脯氨酰异构酶活性并与免疫抑制剂环孢菌素A作用。环孢菌素A结合钙调磷酸酶(一种蛋白磷酸酶)。
Hsp20-30也称为小分子Hsp。Hsp20-30通常存在于大的同聚多亚基复合物中，或当生物体或细胞型表达几种不同类型的小分子Hsp时也可能存在于异聚多亚基复合物中。Hsp20-30与细胞骨架结构作用，并可能在肌动蛋白的聚合/解聚过程中起调节作用。在应激条件下或当静止期细胞暴露于生长因子时Hsp20-30迅速磷酸化。Hsp20-30的同系物包括α-晶体蛋白。
ClpP是参与异常蛋白质降解的大肠杆菌蛋白酶。在叶绿体中发现有ClpP的同系物。ClpP与ClpA形成异聚多亚基式的复合物。
GrpE是约20kDa的大肠杆菌蛋白质，参与因应激而损的蛋白质的修复以及损坏蛋白质的降解。GrpE在大肠杆菌应激基因的表达调节中起作用。
Hsp10的实例包括GroES和Cpn10。Hsp10通常存在于大肠杆菌中，以及真核细胞的线粒体和叶绿体中。Hsp10形成一个七元环，该环与Hsp60寡聚体有联系。Hsp10还参与蛋白质折叠。
已发现泛素在ATP依赖型胞液蛋白酶水解去除蛋白质时与蛋白质结合。
在特定实施方案中，本发明的应激蛋白来自肠道细菌、分枝杆菌(尤其是麻风分枝杆菌、结核分枝杆菌、母牛分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、牛型分枝杆菌)、大肠杆菌、酵母、果蝇、脊椎动物、鸟类、小鸡、哺乳动物、大鼠、小鼠、灵长类或人类。
应激蛋白可为酸性盐或碱性盐形式，或为中性形式。此外，可通过氧化或还原修饰单个氨基酸残基。而且，可对氨基酸或核酸序列进行各种置换、缺失、或添加，如此造成的最后效果是使应激蛋白已增加的生物学活性得到维持或进一步增强。例如由于密码的简并性，在编码相同氨基酸序列的核苷酸序列中可以有相当多的变异。本发明也适于应用应激蛋白的部分或来自应激蛋白的肽，只要这些部分或肽包括与促进对所选HPV蛋白抗原的免疫应答有关的表位即可。获得应激蛋白的部分可通过蛋白酶裂解，或通过重组方法如编码应激蛋白的核苷酸序列中仅一部分(既可以独立存在也可以与另一段编码蛋白质的核酸序列融合)的表达。肽的生产也可应用这些方法，或经化学合成。应激蛋白可能包括经各种已知技术在特定位点导入的突变。参见如Sambrook等，分子克隆实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社(1989)；Drinkwater和Klinedinst，美国国家科学院学报833402-3406(1986)；Liao和Wise，基因88107-111(1990)；Horwitz等，基因组3112-117(1989)。本文中术语应激蛋白包括应激蛋白的这种部分和肽。
鉴定所研究基因或蛋白质是否为应激基因或应激蛋白的方法是本领域熟知的。例如，由于特定应激蛋白家族在基因和蛋白质上的保守性，使得可以通过如核酸杂交或者核酸或氨基酸测序随后经计算机比较分析，将所研究基因/蛋白质的核苷酸或氨基酸序列与已知应激基因如DnaK、GroEL或DnaJ进行比较。Voellmy，R.等，美国国家科学院学报824949-4953(1985)。或者，可用一项试验鉴定和/或区别所选应激蛋白的基本结构特征和/或功能特点。例如，可用抗Hsp抗体筛选表达库。众所周知Hsp90与苯醌袢霉素格尔德霉素有很高亲和力。因此可用格尔德霉素筛选表达库以发现可与苯醌袢霉素结合的蛋白质作为Hsp90的可能同系物。由所分离核酸编码的蛋白质的特点可经其它试验如基于抗体的试验进一步证实。抗体实验室手册。Harlow和Lane(编)，冷泉港实验室出版社(1988)。此外，还可利用特定应激蛋白组的生物学活性。Guidon，P.T.和Hightower，L.E.，生物化学253231-3239(1986)。例如，Hsp70在蛋白质复合物装配过程中能特异性结合ATP以及解折叠的多肽和肽。因此，将所研究蛋白质与包含适当多肽、肽、或ATP的样品混合，再测定是否产生蛋白质-蛋白质或蛋白质-核苷酸复合物，可指示是否明显存在Hsp70蛋白或基因，而这种存在与否可用其它试验如基于抗体的试验证实。
用已知方法可生产应激蛋白、应激蛋白部分、应激蛋白同系物及与组合物中的应激蛋白偶联或非共价连接的HPV蛋白抗原。例如，应激蛋白和/或抗原可以从已知来源获得(分离)，可从细胞培养物中产生并收获，或如果是抗原，可从感染细胞中获得，可经克隆(如有必要)并表达编码所需应激蛋白或抗原的基因而产生，或可化学合成。而且，编码所需应激蛋白或抗原的核酸序列可化学合成。包含应激蛋白和HPV蛋白抗原的融合蛋白可用重组方法产生。例如，可将编码应激蛋白的核酸与编码HPV蛋白抗原的核酸序列的任一末端连接，从而使这两个蛋白质编码序列享有一共同的翻译读码框架并表达为包括HPV蛋白抗原和应激蛋白的融合蛋白。将合并序列插入按所需表达特点及宿主细胞特性选择的合适载体中。在本文实施例中，核酸序列被装配在适于大肠杆菌中表达蛋白质的载体中。在所选宿主细胞中的表达完成后，可经常规生化分离技术或经应用针对融合蛋白之一或另一部分的抗体的免疫亲和方法纯化融合蛋白。或者，所选载体可在融合蛋白序列上添加一个标记，如后文实施例所述寡聚组氨酸标记，从而表达标记的融合蛋白，这种融合蛋白可用抗体或其它与标记有适当高亲和性的物质经亲和方法纯化。Sambrook等，分子克隆实验室手册，第二版。冷泉港实验室出版社(1989)；Deutscher，M.，蛋白质纯化方法指南，酶学，卷182，Academic Press，Inc.，San Diego，CA(1990)。若应用的是适于在哺乳动物细胞中表达的载体，如下述载体之一，则融合蛋白可在哺乳动物细胞中表达并纯化。或者，可将哺乳动物表达载体(包括编码融合蛋白的序列)施用于受试者体内，指导受试者细胞表达融合蛋白。编码包括应激蛋白和HPV蛋白抗原的融合蛋白的核酸也可用化学方法产生，再插入适于融合蛋白产生和纯化或施用于受试者的合适载体中。最后，融合蛋白还可用化学方法制备。
包含本文所述应激蛋白和HPV抗原的组合物可用于增强对HPV、或表达HPV抗原的HPV感染细胞或HPV转化细胞的免疫应答，特别是细胞介导的细胞裂解应答。优选地，组合物包含来自欲激发针对其蛋白质的免疫应答的特定HPV类型的蛋白抗原序列。
包含本文所述应激蛋白和HPV抗原的组合物可以多种方式施用于受试者。用药途径包括皮内、经皮(如缓释聚合物)、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、口服、硬膜外及鼻内途径。也可应用任何其它方便的用药途径，如，输注或大丸剂注射、或经上皮或粘膜皮肤衬里吸收。此外，本文所述组合物可包含其它药学可接受的成分如生物活性试剂(如铝之类的佐剂)、表面活性剂、(如甘油酯)、赋形剂(如乳糖)、载体、稀释剂和载色剂，并与它们一起施用。而且，可离体使用组合物，以刺激来自受试者体内的白细胞，使HPV蛋白抗原特异性免疫细胞在体外受到激发、增大并增殖，随后再导入受试者体内。
也可通过体内表达编码这类蛋白序列的核酸而将应激蛋白-HPV蛋白抗原融合蛋白施用于人体。这些核酸的表达也可通过刺激来自受试者体内的白细胞，使HPV抗原特异性免疫细胞在体外受到激发、增大并繁殖，随后再导入受试者体内而实现。适于指导HPV蛋白抗原-应激蛋白融合体表达的表达载体可选自本领域内目前所用的各种载体。优选能产生高水平表达并能有效转导目的基因的载体。如可用重组腺病毒载体pJM17(All等，基因治疗1367-84(1994)；Berkner K.L.，生物技术6616-241988)，第二代腺病毒载体DE1/DE4(Wang和Finer，自然医学2714-6(1996))，或腺伴随病毒载体AAV/Neo(Muro-Cacho等，免疫治疗杂志11231-7(1992))。还可用重组逆转录病毒载体MFG(Jaffee等，癌症研究532221-6(1993))或LN、LNSX、LNCX、LXSN(Miller和Rosman，生物技术7980-9(1989))。基于单纯疱疹病毒的载体如pHSV1(Geller等，美国国家科学院学报878950-4(1990))或病毒疫苗载体如MVA(Sutter和Moss，美国国家科学院学报8910847-51(1992))也可使用。
常用的包括启动子和3’序列的特异性表达单位存在于质粒CDNA3(Invitrogen)、质粒AH5、pRC/CMV(Invitrogen)、pCMU II(Paabo等，EMBO杂志51921-1927(1986))、pZip-Neo SV(Cepko等，细胞371053-1062(1984))和pSRa(DNAX.Palo Alto.CA)中。将基因导入表达单位和/或载体的过程可用基因工程技术完成，如《分子克隆》和《分子生物学最新实验方案》(Sambrook，J.等，分子克隆冷泉港出版社(1989)；Ausubel，F.M.等，《分子生物学最新实验方案》，Greene出版协会及Wiley-Interscience(1989))等手册所述。可以通过任何能将核酸以可表达形式置入细胞的方法将能成功表达的核酸导入人体细胞中，如作为上述病毒载体的部分、裸露质粒或其它DNA、或包装在定向脂质体或红细胞外壳中的形式(Friedman，T.科学2441275-1281(1989)；Rabinovich，N.R.等，科学2651401-1404(1994))。转导方法包括直接注入组织和肿瘤、脂质体转染(Fraley等，自然370111-117(1980))、受体介导的胞吞作用(Zatloukal等，纽约科学院年鉴660136-153(1992))和粒子轰击介导的基因转移(Eisenbraun等，DNA和细胞生物学12791-797(1993))。
本发明组合物中应激蛋白和HPV蛋白抗原(如上述融合的、偶联的或非共价连接的)的量将足以在人体内产生有效的免疫刺激应答。所谓有效量即施用时将导致产生免疫应答的量。此外，施用于人体的应激蛋白和HPV蛋白抗原的量将根据各种因素以及它们的总体免疫应答能力而变化，这些因素包括所用HPV蛋白抗原和应激蛋白、受试者的身高、年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食习惯。本领域技术人员能对已确立的剂量范围进行很好地调整和操作。例如，应激蛋白和抗原的量可从约1微克至约1克，优选从约100微克至约1克和从约1毫克至约1克。含表达载体的组合物的有效量即施用时可诱导针对它编码的HPV蛋白抗原的免疫应答的量。而且，施用于人体的表达载体的量将根据各种因素以及它们的总体免疫应答能力而变化，这些因素包括所表达的HPV蛋白抗原和应激蛋白、受试者的身高、年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食习惯。需要考虑的其它因素有用药途径及所用载体类型。例如，若用包含编码HPV蛋白抗原-应激蛋白融合蛋白的核酸的病毒载体进行预防或治疗性处理时，有效量将在每kg体重104-1012无辅助病毒的复制缺陷型病毒的范围内，优选每kg体重105-1011病毒，更优选每kg体重106-1010病毒。
本发明由以下实施例进行举例说明，但无论如何不以此为限。
实施例实施例1重组应激蛋白的分离重组分枝杆菌Hsp71质粒Y3111包含有功能地插入表达控制序列之间的结核分枝杆菌hsp71基因(Mehlert，A.和Young，D.B.，分子微生物学3125-130(1989))。包含截短的dnaK基因的大肠杆菌菌株CG2027(得自C.Georgopoulos，日内瓦大学，瑞士)用质粒Y3111经标准程序转化。(Maniatis等，分子克隆实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，N.Y.(1982))。
带质粒Y3111的细菌在含100微克/ml氨苄青霉素的2xYT培养基(每升含20g蛋白胨，10g酵母浸膏，10g NaCl)中37℃振荡(250rpm)培养过夜。从中制备10％甘油保存物并贮于-70℃。将一些刮自冷冻甘油保存物的碎屑接种于大批量培养基中，如前所述培养约48h。当590nm处的光密度达到2.5-3.5时，离心收集细胞。
以下步骤在4℃下进行。将细胞沉淀按每克沉淀细胞加3ml裂解液重新悬浮。裂解液的组成为10mM Tris-HCl，2mM乙二胺四乙酸盐(EDTA)，5mMβ-巯基乙醇，10微克/ml抑酶肽，10微克/ml亮抑酶肽和1微克/m1抑胃酶肽。向细胞悬液中加入溶菌酶至终浓度为0.14mg/ml。然后将悬浮液冻于-70℃。
将细胞悬液解冻，超声破碎细胞。对超声裂解物经17,000rpm离心30分钟(JA-17转头，Beckman)。加入固体(NH4)2SO4至上清液中直至溶液的(NH4)2SO4饱和度为65％。温育30分钟后，同上述离心混合物。将沉淀溶于Q SEPHAROSE缓冲液A中。加入10微克/ml抑酶肽、10微克/ml亮抑酶肽和1微克/ml抑胃酶肽至此溶液中，然后使该溶液对65倍体积的Q SEPHAROSE缓冲液A进行透析。Q SEPHAROSE缓冲液A含有30mMTris-HCl(pH 7.5)、1mM EDTA、5mMβ-巯基乙醇。透析后溶液如上述离心澄清。
将透析后溶液上样于已在Q SEPHAROSE缓冲液A中平衡好的QSEPHAROSE柱(Pharmacia)。用2倍体积的同样溶液洗柱。以0-600mM NaCl梯度进行洗脱。经SDS-PAGE和考马斯亮兰染色检验级分中主要71 kDa多肽(即重组结核分枝杆菌Hsp71蛋白)的存在。收集含该多肽的级分，加入固体(NH4)2SO4至65％饱和度。如上述离心混合物，沉淀溶于ATP Start缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 8.0)，20mM NaCl，5mM MgCl2，15mMβ-巯基乙醇，0.1mM EDTA)，所得蛋白质溶液对65倍体积的相同缓冲液透析过夜并离心澄清。
然后将透析后的蛋白质溶液上样于已用ATP Start缓冲液平衡好的ATP琼脂糖层析柱(Fluka)中。用一个柱体积的含1M NaCl的ATP Start缓冲液洗柱。以添加10mM ATP的ATP Start缓冲液洗脱。向洗脱物中加入(NH4)2SO4至饱和度65％，如上述收集沉淀的蛋白质。将离心沉淀物溶于Blue SEPHAROSE缓冲液(30mM Tris-HCl(pH 7.5)，5mM MgCl2，5mMβ-巯基乙醇)并对200倍体积的该溶液透析。
将最后一步透析所得蛋白质溶液上样于已用Blue SEPHAROSE缓冲液平衡好的Blue SEPHAROSE层析柱(Pharmacia)中。用1.5倍柱体积的相同缓冲液洗柱。将流过级分和洗脱级分(含Hsp71)收集在一起。终产物纯度的评估经SDS-PAGE和考马斯亮兰染色，用分别特异于分枝杆菌Hsp71和大肠杆菌DnaK的小鼠单克隆抗体经蛋白印迹分析(Maniatis等，分子克隆实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，N.Y.(1982))；(参见Sambrook等，分子克隆实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社，NY(1989))，以及经ATP酶活性试验而进行。根据制品在考马斯亮兰染色的凝胶中的染色模式，制品纯度通常超过90％，更优选超过95％，并包含不到1％的大肠杆菌GroEL，检测不到大肠杆菌DnaK。
重组分枝杆菌Hsp65质粒RIB 1300包含有功能地插入表达控制序列之间的牛型分枝杆菌BCG hsp65基因。(Thole，J.E.R.等，实验医学杂志178343-8(1993))。大肠杆菌菌株M1546用标准方案以质粒RIB 1300转化(Thole，J.E.R.，同出处)。Maniatis等，分子克隆实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，NY(1982)。
带质粒RIB 1300的细菌接种物在含200微克/ml氨苄青霉素的NCZYM培养基(每升含10g N-Z胺A，5g细菌用酵母提取物，1g Casamino acid，5g NaCl，2g(NH4)2SO4-7H2O)中于28℃振荡培养(250rpm)生长至饱和。将此培养物接种于大批量培养物中，在与接种培养物相同的条件下生长直至培养物在590nm处的光密度介于0.3和0.6之间。通过热水浴快速提升培养温度至42℃而启动重组体蛋白质的生产。在此温度下振荡维持培养3h。然后离心收集细菌，每份细菌沉淀团按重量加6倍体积裂解缓冲液重新悬浮。裂解缓冲液包含10mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM乙二胺四乙酸盐(EDTA)，0.1mM PMSF和0.1％RIVM BA(每50ml含0.104g 4-氨基-苯甲脒-2HCl，0.066gε-氨基己酸)。加入溶菌酶至浓度为0.1mg/ml，将悬浮液冻于-70℃。
将细菌悬浮液解冻并置于4℃。以下操作在此温度下进行。经超声处理彻底裂解细菌。将超声裂解物在JA-17转头(Beckman)上以17,000rpm离心30分钟。将饱和(NH4)2SO4加入上清液直至达到20％的饱和度。离心(同上)去除沉淀。向上清液中加饱和(NH4)2SO4至55％的饱和度。再次离心，所得沉淀团溶于TE缓冲液(10mM Tris-HCl(pH 8.0)，15mMβ-巯基乙醇，1mM EDTA)。将TE中的蛋白质溶液对50倍体积的TE缓冲液透析。
离心(同上)去除沉淀物后，将透析后的蛋白质溶液上样于DEAESEPHAROSE(Pharmacia)柱。用TE缓冲液洗柱后，以溶于TE缓冲液中的0-300mM NaCl梯度洗脱蛋白质。含牛型分枝杆菌BCG Hsp65的级分经SDS-PAGE和考马斯亮兰染色鉴定并集中。向其中加入10微克/ml抑酶肽、10微克/ml亮抑酶肽、1微克/ml抑胃酶肽，然后用YM30膜在Amicon小室中浓缩。
将浓缩汇集物上样于已用S200缓冲液(10mM Na2HPO4(pH 6.8)，150mM NaCl和15mMβ-巯基乙醇)平衡好的S-200SEPHACRYL(Pharmacia)柱。用同样的缓冲液洗脱。如前述检验级分中分枝杆菌Hsp65的存在，汇集包含高纯度蛋白质的阳性级分并对HAP缓冲液(10mM Na2HPO4(pH6.8)，15mMβ-巯基乙醇)透析过夜。
将透析后的汇集物上样于在HAP缓冲液中平衡好的羟基磷灰石(Bio-Rad；Bio-Gel HTP Gel)柱中。用1mM MgCl2和15mMβ-巯基乙醇以3倍柱体积洗柱，接着用1mM Na2HPO4(pH 6.8)和15mMβ-巯基乙醇洗柱。蛋白质用10-60mM磷酸盐梯度洗脱。如上述检验级分，汇集阳性级分、浓缩并通过PD10(Pharmacia)凝胶过滤交换至0.85％NaCl中。分枝杆菌Hsp65的纯度经SDS-PAGE和考马斯亮兰染色，以及应用大肠杆菌DnaK和GroEL的特异性抗体进行的蛋白印迹分析评估。制品通常纯度超过90％，并包含不到0.5％的大肠杆菌GroEL和不到0.1-0.2％的大肠杆菌DnaK。
Hsp制品的去热源过程既可在DetoxiGel树脂(Pierce)上加多粘菌素B进行亲和层析完成，也可用诸如Triton X-114和X-100之类的去污剂抽提完成。脂多糖含量减少后，可进行鲎变形细胞试验(LAL；Biowhittaker，QCL 1000)。Hsp制品可在缓冲液中贮于-70℃，或更优选以冻干形式贮于-70℃。
实施例2蛋白抗原-应激蛋白偶联物的制备本实施例旨在举例说明可用于制备应激蛋白和蛋白抗原之间的偶联物的技术，在本实施例中，蛋白抗原为衍生自流感病毒核蛋白(NP)的肽。
应激蛋白(Hsp71)和抗原(NP.B)的合成如实施例1所述制备结核分枝杆菌Hsp71。在Applied Biosystems431A型肽合成仪上以Fmoc(9-芴甲氧羰基)作为α-氨基保护基、以HMP(Wang)树脂作为固相支持物合成生产(0.25mM一批)带有相应于完整NP中第363-374位残基并包含已知CTL表位(H-2b-限制性)的氨基酸序列[C]VQLASNENMETM(SEQ ID NO1；此肽在氨基末端多一个半胱氨酸残基)的NP肽(本文称为NP.BMotal，U.M.A.等，欧洲免疫学杂志2511214(1995)及其中的参考文献)。所有氨基酸和合成化合物均购自Applied Biosystems。将NP.B从支持物上裂解下来，通过使连续搅动的NP.B树脂在2ml混合物中温育3小时而去除侧链保护基，该混合物是将10ml三氟乙酸、0.5ml水、0.75g结晶苯酚、0.25ml乙二硫醇(ethanedithiol)和0.5ml茴香硫醚混合制成。将裂解混合物滤入40ml冷的二乙基醚(diethyl ether)中。在5000xg离心8分钟收集不溶物。倾去醚，将沉淀团重新悬浮于冷的二乙基醚中并离心，如此反复3次完成洗涤。最后一次洗涤后，将沉淀团风干，溶于蒸馏水，然后冻干。
NP.B与Hsp71和白喉类毒素的化学偶联进行与Hsp71的偶联，以及与白喉类毒素(缩写DT；DT得自WakoChemical)的偶联，DT是常用的载体蛋白，可作为比较对CTL活性的特异性刺激效力的标准。
活化的载体蛋白溶液9mg Hsp71溶于4.5ml 0.1M硼酸钠缓冲液，pH 8.0。将磺基MBS(间马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxy-sulfosuccinimide ester)(2.3mg溶于100μl dimethyl sulfoxamine)加入蛋白质溶液中，使反应混合物在室温温育1小时。然后将pH调至6.0，使反应混合物在4℃对20mM磷酸钠和150mM NaCl，pH 5.6的溶液1升透析过夜。DT也作类似处理。
还原肽溶液每次偶联反应时，将3mg肽溶于0.1Mβ-巯基乙醇100μl中。温育1小时使肽还原后，在SpeekVac离心机中抽干反应混合物可去除还原剂。再将肽溶于蒸馏水0.5ml中，向其中加1N NaOH 5μl等分液直至肽完全溶解。偶联DT时，还原6mg肽并重新溶于1ml水中。
用0.1N NaOH调整活化载体蛋白溶液的pH至6.8。将含3mg活化载体蛋白的溶液与0.5ml还原肽溶液(或制备与DT的偶联物时为1ml还原肽溶液)室温连续混合下反应3小时。为去除未反应肽，将所得含偶联物的溶液在4℃对20mM磷酸钠和150mM NaCl，pH 7的溶液1升透析过夜。蛋白质浓度经BCA试验测定。该方案所获偶联效率已事先在预试验中用放射性标记的NP.B肽测得。肽蛋白质的比率在NP.B-Hsp71偶联物(71.NP)中为17.5，在NP.B-DT(DT.NP)中为10.1。
实施例3Hsp-E6和Hsp-E7融合基因的制备细菌表达载体pET65H的制备质粒RIB 1300包含牛型分枝杆菌BCG hsp65基因(Thole，J.E.R.等，实验医学杂志178343-8(1993))。在自动寡核苷酸合成仪上合成扩增hsp65基因所需的引物对并用常规方案纯化。正向引物包括一个NdeI限制性位点并具有核苷酸序列5’AAT CAC TTC CAT ATG GCC AAG ACA ATT。反向引物包括位于终止密码子侧翼的EcoRI和NheI位点并具有核苷酸序列5’CGC TCG GAC GAA TTC TCA GCT AGC GAA ATC CAT GCC。
聚合酶链式反应(PCR)用上述引物对并以pRIB 1300为DNA模板进行。PCR片段按常规亚克隆方案经限制性内切核酸酶NdeI和EcoRI双酶切消化，再与NdeI/EcoRI双酶切消化的pET28a(Invitrogen)连接(Maniatis等，分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，NY(1989))。用连接混合物转化大肠杆菌菌株DH5α的转化感受态细胞，铺板于含100g/ml氨苄青霉素的琼脂上。分离已转化细胞的菌落，制备质粒DNA并经限制性图谱和核苷酸测序分析hsp65基因和载体序列的存在。鉴别出包含分枝杆菌hsp65基因的正确构建体(命名为pET65H)，将它转化至大肠杆菌菌株BL21(DE3；Novagen)中以分析hsp65基因的表达。构建体pET65H的图谱示于图1。为检验hsp65基因的表达，对菌株BL21的转化细菌按供应商(Novagen)的建议进行培养、诱导并收获。裂解细菌，在SDS-PAGE上电泳分离可溶物及自包涵体中被盐酸胍溶解出的物质(Maniatis等，分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，NY(1989))，并用特异于分枝杆菌应激蛋白的单克隆抗体进行抗Hsp65免疫印迹。
用于在细菌中表达Hsp65-HPV16 E6融合蛋白的构建体的制备将HPV16 E6的完整编码区插入pET65H中hsp65基因的羧基端。
质粒pHPV16在Bluescript载体SK(ATCC 45113)中包含HPV16的完整基因组。参见Seedorf等，病毒学145181-5(1985)。在自动寡核苷酸合成仪上合成用于扩增E6基因的引物对并用常规方案纯化。正向引物包括一个NheI限制性位点并具有核苷酸序列5’AAA AGC AGA GCT AGC ATGCAC CAA AAG。反向引物包括EcoRI和终止密码子并具有核苷酸序列5’CTCCAT GAA TTC TTA CAG CTG GGT。
用上述引物对，以pHPV16为DNA模板进行聚合酶链式反应(PCR)。PCR片段按常规亚克隆方案经限制性内切核酸酶NheI和EcoRI双酶切消化，再与NheI/EcoRI双酶切消化的pET65H连接(Maniatis等，分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，NY(1989))。用连接混合物转化大肠杆菌菌株DH5α的转化感受态细胞，铺板于含100μg/ml氨苄青霉素的琼脂上。分离已转化细胞的菌落，制备质粒DNA并经限制性图谱和核酸测序分析hsp65-E6融合基因和载体序列的存在。鉴别出包含hsp65-E6融合基因的正确构建体(命名为pET65HE6)，将它转化至大肠杆菌菌株BL21(DE3；Novagen)以分析融合基因的表达。构建体pET65HE6的图谱示于图2。为检验Hsp65-E6的表达，对已被pET65HE6转化的菌株BL21细菌按供应商(Novagen)的建议进行培养、诱导并收获。裂解细菌，在SD-PAGE上电泳分离可溶物及自包涵体中被盐酸胍溶解出的物质(Maniatis等，分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，NY(1989))。纯化的Hsp65作为标准平行电泳。在被pET65HE6转化的细菌样品中，有一条十分明显的考马斯亮兰染色带(表观分子量(MOO)约73kDa)，迁移速率略小于标准Hsp65(表观分子量约56kDa)，而在相应的未转化细菌样品中没有这一现象，由此证实Hsp65-E6的表达。
在细菌中表达Hsp65-HPV16 E7融合蛋白的构建体的制备将HPV16 E7的完整编码区插入pET65H中hsp65基因的羧基端。
在自动寡核苷酸合成仪上合成用于扩增E7基因的引物对并用常规方案纯化。正向引物包括一个NheI限制性位点并具有核苷酸序列5’AAC CCACCT GCT AGC ATG CAT GGA GAT。反向引物包括EcoRI和终止密码子并具有核苷酸序列5’AGC CAT GAA TTC TTA TGG TTT CTG。
用上述引物对，以pHPV16为DNA模板进行聚合酶链式反应(PCR)。PCR片段按常规亚克隆方案经限制性内切核酸酶NheI和EcoRI双酶消化，再与NheI/EcoRI双酶切消化的pET65H连接。用连接混合物转化大肠杆菌菌株DH5α的转化感受态细胞，铺板于含100μg/ml氨苄青霉素的琼脂上。分离已转化细胞的菌落，制备质粒DNA并经限制性图谱和核酸测序分析hsp65-E7融合基因和载体序列的存在。鉴别出包含hsp65-E7融合基因的正确构建体(命名为pET65HE7)，将它转化至大肠杆菌菌株BL21(DE3；Invitrogen)中以分析融合基因的表达。构建体pET65HE7的图谱示于图3。为检验hsp65-E7的表达，对被pET65HE7转化的菌株BL21细菌用常规方案进行培养、诱导并收获。裂解细菌，在SDS-PAGE上电泳分离可溶物及自包涵体中被盐酸胍溶解出的物质，用特异于HPV16 E7的单克隆抗体(Zymed Laboratory公司，产品目录号28-0006)进行抗E7印迹。
实施例4融合蛋白的表达和纯化Hsp65-E6融合蛋白的表达和纯化方案1将构建体pET65HE6转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3；Novagen)中，转化细胞在含30μg/ml卡那霉素的6升2xYT培养基(每升含20g蛋白胨，10g酵母提取物，10g NaCl)中于30℃进行培养。当每批培养物的密度达到0.5(OD590)时，以0.5mM异丙基硫代半乳吡喃糖苷诱导融合蛋白的表达，然后将培养物置于37℃再培养3小时。离心收集细胞，悬浮于含200微克/ml溶菌酶的90ml裂解缓冲液(10mM Tris-HCl，0.5mMβ-巯基乙醇，pH 7.5)中，冻于-70℃。一天后，将冷冻的细胞悬浮液在37℃水浴中解冻，加入2微克/ml抑酶肽、2微克/ml亮抑酶肽、2微克/ml抑胃酶肽和2mM PMSF。所有后续步骤均在0-4℃下进行。超声破碎细胞，在17,000rpm离心15分钟(JA-17转头，Beckmann)收集不溶物。成团物质用裂解缓冲液洗2次，然后借助于超声处理使其溶于90ml缓冲液A(50mM Tris-HCl，pH 7.5，6M盐酸胍)。如上述离心去除不溶物。然后将可溶物上样于已用缓冲液A平衡好的含50ml镍离子金属螯合树脂(Chelating Sepharose Fast Flow；Pharmacia)的柱上。结合的融合蛋白在树脂上用0-1M NaCl梯度缓慢地进行重折叠。树脂经5倍体积的缓冲液B(1M NaCl)洗涤以去除残存的盐酸胍，经5倍体积的缓冲液C(50mM咪唑，pH 7.5，0.5mMβ-巯基乙醇，150mM NaCl)洗涤以去除污染蛋白。然后用缓冲液C中的50-500mM线性咪唑梯度以6倍体积洗脱融合蛋白。将汇集的洗脱蛋白对近40倍体积的Dulbecco’s磷酸盐缓冲液(2.7mM KH2PO4，4.3mM Na2HPO4，2.7mM KCl，0.137M NaCl)透析过夜，超滤浓缩(Amicon，截留值为30kDa MW)，流经已用Dulbecco’s磷酸盐缓冲液平衡好的Detoxigel树脂以去除内毒素。
Hsp65-E6融合蛋白的表达和纯化方案2将构建体pET65HE6转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3；Novagen)中，将转化细胞在含30μg/ml卡那霉素的12升2xYT培养基(每升含20g蛋白胨，10g酵母提取物，10g NaCl)中于30℃进行培养。当每批培养物的密度达到0.5(OD590)时，以0.5mM异丙基硫代半乳吡喃糖苷诱导融合蛋白的表达，然后将培养物置于37℃再培养3小时。离心收集细胞，悬浮于含200微克/ml溶菌酶的180ml裂解缓冲液(10mM Tris-HCl，0.5mMβ-巯基乙醇，pH 7.5)中，冻于-70℃。一天后，将冷冻的细胞悬浮液在37℃水浴中解冻，加入2微克/ml抑酶肽、2微克/ml亮抑酶肽、2微克/ml抑胃酶肽和2mM PMSF。所有后续步骤均在0-4℃下进行。超声破碎细胞，在17,000rpm离心15分钟(JA-17转头，Beckmann)收集不溶物。成团物质用裂解缓冲液洗2次，然后借助于超声处理使其溶于180ml缓冲液A(50mM Tris-HCl，pH 7.5，6M盐酸胍)。如上述离心去除不溶物。然后将可溶物上样于已用缓冲液A平衡好的含50ml镍离子金属螯合树脂(Chelating Sepharose Fast Flow；Pharmacia)的柱中。结合的蛋白用缓冲液D(缓冲液A加5％Triton X100)洗涤，然后在树脂上以0-1M的NaCl梯度缓慢地进行重折叠。树脂经5倍体积的缓冲液E(1M NaCl，1％Triton X100)和5倍体积的缓冲液B(1MNaCl)洗涤以去除残存的盐酸胍，然后用5倍体积的缓冲液F(50mM咪唑，pH 7.5，0.5mMβ-巯基乙醇，0.5M NaCl，15％甘油)洗涤以去除污染蛋白。融合蛋白用缓冲液F中的50-500mM线性咪唑梯度6倍体积洗脱。汇集的洗脱蛋白对40倍体积的缓冲液G(30mM Tris-HCl，pH 6.5，2mM EDTA，5mMβ-巯基乙醇，15％甘油)透析过夜，然后上样于已用同样的缓冲液平衡好的50ml SP-Sepharose柱中。回收流过级分中的融合蛋白(约42mg，代表未分级分离提取物的融合蛋白总量的约50％)，对近40倍体积的Dulbecco’s磷酸盐缓冲液(2.7mM KH2PO4，4.3mM Na2HPO4，2.7mM KCl，0.137M NaCl)透析过夜，并超滤浓缩(Amicon；截留值30kDa MW)。
Hsp65-E7融合蛋白用同样的方案表达和纯化。融合蛋白的纯度用SDS-PAGE和考马斯亮兰凝胶染色进行评估。蛋白质用方案1常获得70-90％的纯度，用方案2常获得近95％的纯度。用方案2纯化后内毒素水平低于20EU/mg蛋白质。
实施例5用HSP65-E6和HSP65-E7免疫6至8周龄的雌性C57/BL/6小鼠得自Charles River实验室(St.Constant，魁北克，加拿大)。6-8只小鼠一组的多组小鼠均在后颈用如实施例4所述纯化的、溶于Dulbecco’s磷酸盐缓冲液的等量Hsp65-E6和Hsp65-E7融合蛋白皮下免疫接种。所施用的融合蛋白总剂量分别为20微克或200微克。阴性对照用不完全弗氏佐剂的盐水(IFA)免疫，阳性对照用包括第44-62位残基的合成性HPV16 E7肽100微克于IFA和盐水中的溶液免疫。相对于所用融合蛋白的剂量，E7肽的这一用量分别过量了20或200倍。14天后重复免疫。第二次免疫12天后，小鼠在裸露背部皮下注射表达E7的TC-1肿瘤细胞1.3×105个细胞进行攻击。肿瘤发生率以基于目视和触诊所见肿瘤的有无进行计分，每隔一天查一次，共计50天。表达HPV16 E7蛋白的TC-1肿瘤细胞系，是用HPV16 E6和E7基因及Lin等所述活化的人c-Ha-ras基因(癌症研究5621-26(1996))使C57/B1/6小鼠的原代肺细胞永生化和转化而衍生所得。为接种肿瘤，将TC-1细胞(由T.C.Wu博士，The Johns Hopkins MedicalInstitutions，Baltimore，MD提供)在补加了10％胎牛血清(Hyclone，Logan，UT)、非必需氨基酸、谷氨酰胺、丙酮酸、庆大霉素、β-巯基乙醇、0.4mg/ml遗传霉素(Life Technologies，Grand Island，N.Y.)和0.2mg/ml潮霉素B的RPMI1640培养基中于37℃培养至60-70％汇合。经胰酶消化收获细胞并重新悬浮于Hank’s缓冲液，配成6.5×105细胞/ml。
一个这样的实验的结果示于图4。攻击后不久，所有处理组的肿瘤发生率上升(攻击后5-15天之间)。IFA组的发生率维持较高水平时，用200微克融合蛋白混合物或用含E7肽的IFA处理的组发生率戏剧性地降至0％。20微克融合蛋白处理组得到的结果介于中间。故，在无任何佐剂的情况下经Hsp65-E6和Hsp65-E7融合蛋白混合物免疫可有效地保护小鼠免受表达E7的肿瘤细胞的致死性攻击。简要结果示于表1。
表1对TC-1肿瘤第二次攻击的应答
*括号内给出每组中发生肿瘤的动物数/动物总数。右列中，对动物继续25天(第二次攻击后)监控有无肿瘤。
**包括用于比较的未免疫动物组，作为第二次肿瘤攻击的对照。
实施例6对免疫动物进行第二次肿瘤细胞攻击为评估对HPV抗原的免疫应答的寿命，前一项实验幸存的动物(第54天时)4只一组(来自融合蛋白处理组和E7肽/IFA组)，每只动物用1.3×105个TC-1活肿瘤细胞进行第二次攻击。一组未经处理的小鼠用相同肿瘤攻击以作对照。25天后评估肿瘤发生率。
结果示于表1。事先经融合蛋白或E7肽/IFA免疫的动物在第二次攻击时受到完全或几乎完全地保护，而未免疫动物显示了100％的肿瘤发生率。
实施例7免疫动物和未免疫动物脾细胞的细胞裂解活性两只一组的融合蛋白免疫、肽免疫或未免疫动物断颈处死，取出它们的脾脏。制备脾单细胞悬液并在补加5％胎牛血清的Hank’s缓冲液中洗一次。取活细胞20×106与丝裂霉素C处理的TC-1细胞2×106一起，在补加了10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、50μM 2-巯基乙醇和50微克/ml硫酸庆大霉素的RPMI-1640培养基中，在37℃和5％CO2下培养5天，以重新刺激淋巴样细胞。然后收获脾细胞(效应细胞)并应用于下述CTL活性试验中。
TC-1以及HLA型别相配、不表达E7表位的细胞系EL4和MC57G作为靶细胞使用。将细胞与Na251CrO4150 uCi一起温育90分钟，若是EL4细胞，则同时还与10μg流感病毒核蛋白肽366-374/106细胞一起温育。粗洗去除过量放射性标记后，将25×103标记靶细胞与已重新刺激的效应细胞以各种效应细胞、靶细胞比进行共培养。培养4-5小时后，培养平板在200xg离心5分钟，将细胞内释放出的含放射性标记的上清液取每100μl一份收集在Beckman Ready Caps中。经液体闪烁计数测量放射活性。为测定放射活性的自发释放量和可释放总量，收集只含靶细胞的培养物上清液或补加Triton X100裂解靶细胞得到的上清液，同上测定放射活性。结果表示为校正裂解率，根据以下公式计算校正裂解率＝100×(cpm检验-cpm自发)/(cpm总-cpm自发)其中cpm检验为一特定共同培养物释放的放射活性，cpm自发为靶细胞培养物放射活性的自发释放量，cpm总为Triton X100裂解靶细胞所释放的放射活性。CTL试验进行了三次重复，提供的是平均值。
以TC-1细胞作靶细胞的实验的结果示于图5。由分别以200微克和20微克融合蛋白免疫的动物所得效应细胞(所用较靶细胞过量100倍)介导TC-1细胞裂解的40％和25％。
在第二次实验中，用以20微克融合蛋白免疫的动物的脾细胞检验CTL活性的特异性。示于图6的结果证实了对HPV16 E6/E7转化的TC-1细胞的有效裂解。对另两种不表达HPV抗原的细胞类型(EL4和MC57G)的裂解效力大大降低，证实了Hsp65-E6和-E7融合蛋白免疫所刺激的CTL应答的特异性。
实施例8小鼠经HSP65-E7融合蛋白处理后TC-1肿瘤的退化8只一组共3组C57/B1J6小鼠用于本实验。每只小鼠在裸露背部皮下接种TC-1细胞1.3×105。2天后，第一组施用盐水(阴性对照)，第二组施用溶于盐水的Hsp65-E7融合蛋白100微克/动物，第三组施用溶于盐水及IFA的E7肽100微克/动物(阳性对照)。所有注射(0.2ml)均在后颈皮下进行。14天后(肿瘤接种16天后)，再注射一次。从肿瘤接种后一天开始，每两天一次经目视和触诊检查小鼠肿瘤的存在与否。
图7显示，肿瘤接种9天后所有处理组展示最大肿瘤发生率(表示为显示肿瘤的动物的百分率)，为85-100％。但到第17天，Hsp65-E7融合蛋白处理组和IFA中的E7肽处理组的肿瘤发生率显著降低，最低降至约15％。对比之下，盐水处理组在观察期的剩余时间里保持了接近100％的肿瘤发生率。这些结果证实，Hsp65-E7融合蛋白在无佐剂时施用可引起HPV所致肿瘤的显著退化。
一项类似实验的结果示于图8。在此实验中，动物的肿瘤接种剂量(2×105/动物)高于前一项实验。所得结果接近前一项实验。
实施例9E7蛋白和HSP65-E7融合蛋白诱导细胞免疫应答的能力的比较如实施例4生产和纯化Hsp65-E7融合蛋白。全长的HPV E7蛋白用以下方案获得。
用AmpliTaq DNA聚合酶(Perkin Elmer)从HPV16基因组DNA(得自美国典型培养物保藏中心的pSK/HPV16)中扩增E7基因。正向引物(5’-AAC CCA GCT GCT AGC ATG CAT GGA GAT-3’)有一个紧邻ATG起始密码子上游的NheI位点，而反向引物(5‘-AGC CAT GAA TTC TTA TGG TTTCTG-3’)有一个紧邻E7编码序列TAA终止密码子下游的EcoRI位点。PCR产物经NheI和EcoRI消化，在琼脂糖凝胶上纯化，再与已用同样的限制酶消化的pET28a连接。经标准方案转化细菌、分离含重组体的菌落、从已扩增的菌落制备质粒DNA。参见如，Ausubel等(编)，分子生物学简易方案(Short Protocols in Molecular Biology)，第三版(John Wiley和Sons公司，1995)。所得质粒构建体pET/E7(H)的鉴定经诊断性限制性消化和DNA序列分析证实。pET/E7(H)的图谱示于图9。
在12升含30μg/ml卡那霉素的2xYT培养基中接种带pET/E7(H)的大肠杆菌BL21(DE3)培养物，于30℃通气培养过夜。当光密度达到0.5时，用0.5mM IPTG对培养物诱导3小时。然后离心收获细胞，重新悬浮于补加了200μg/ml溶菌酶的裂解缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 7.5，0.5mM 2-巯基乙醇)180ml中，在-70℃冰冻过夜。在有2μg/ml抑酶肽、2μg/ml亮抑酶肽和2μg/ml抑胃酶肽时于37℃水浴中解冻细胞悬液。加入2mM PMSF后，以强超声破碎细胞，然后离心收集不溶性蛋白质。将蛋白质沉淀团再悬浮于裂解缓冲液、再次超声破碎并再次离心收集，共重复2次。然后将蛋白质沉淀团超声溶于缓冲液A(50mM Tris-HCl，pH7.5，6M盐酸胍，1mM 2-巯基乙醇)，离心去除不溶物。将可溶蛋白质上样于已用缓冲液A预平衡的50ml镍螯合柱(2.6cm×12cm；Pharmacia)。结合蛋白质用5倍床体积的缓冲液E(加2％Triton X-100的缓冲液A)洗涤并用盐酸胍-氯化钠梯度(0.1M NaCl/6.0M盐酸胍；5倍床体积)在有1％Triton X-100存在时重新折叠。将重折叠的蛋白质用5倍床体积的缓冲液F(30mM Tris-HCl，pH 7.5，1M NaCl，15％甘油，2％Triton X-100，1mM 2-巯基乙醇)洗涤，随后用5倍床体积的缓冲液G(无Triton X-100的缓冲液F)洗涤以去除Triton X-100。再用5倍床体积的缓冲液H(50mM咪唑，pH 7.5，0.5M NaCl，15％甘油，1mM 2-巯基乙醇)洗涤柱以去除微弱结合的蛋白质。E7蛋白用线性咪唑梯度(溶于缓冲液H的50mM-1M咪唑)洗脱。浓缩E7蛋白，对补加了25％甘油的Dulbecco’s磷酸盐缓冲液透析。将可溶性蛋白贮于-70℃。E7制品经SDS-PAGE和蛋白染色发现是基本均一的蛋白。
蛋白制品的内毒素浓度用鲎变形细胞试验评估，结果发现每毫克蛋白不超过50内毒素单位。
5只一组的多组C57BL/6小鼠经尾根注射盐水，或0.055、0.55或1.8nmole E7蛋白或Hsp65-E7融合蛋白的盐水进行免疫。注射体积为0.2ml。10天后，无菌取每只小鼠的腹股沟淋巴结(LN)，将每组5只小鼠的LN集中。用标准方案制备细胞悬液。取每组集中的LN细胞(2×106细胞/ml)接种平底96孔板，每孔接种4×105细胞。重复三次检验细胞对加入培养基、加入10或50μg/ml E7蛋白、加入10或100μg/ml Hsp65-E7融合蛋白、或者加入1或10μg/ml E7肽(“pep”第44-57位残基)的增殖应答。加完后，将细胞置于37℃和5％CO2的条件下温育4天。向每一培养物中加入氚标记胸苷(1μCi)。再培养15小时后，收获细胞，准备闪烁计数。数据以所掺入放射活性的平均cpm+/-标准偏差表示，见图10。
不同系列(panel)显示用上述不同量Hsp65-E7融合蛋白或E7蛋白免疫的动物的LN细胞所做的试验。结果表明，经Hsp65-E7融合蛋白免疫即可诱导对融合蛋白自身的细胞免疫(上面两图及中间左图)，也可诱导对E7蛋白的细胞免疫(中间左图)。增殖受到已知有T辅助细胞表位的E7肽的诱导，这一发现更证实对E7蛋白的识别(中间左图)。对比之下，用不同量E7蛋白免疫(中间右图和下面两图)或用盐水模拟免疫后，未观察到动物LN细胞有增殖应答。从E7蛋白免疫动物制备的细胞是有活力的，这一点可由它们对T细胞有丝分裂原ConA应答时的增殖能力证实。简而言之，用免疫动物LN细胞的增殖进行评估，结果是与E7免疫相比，Hsp65-E7融合蛋白免疫激发了针对E7的更高级细胞免疫应答。
实施例10用HSP65-E7融合蛋白处理使已经相当大的肿瘤退化为检验Hsp65-E7融合蛋白在肿瘤治疗中的效应，将C57/BL/6小鼠在裸露背部经皮下注射接种1.3×105TC-1肿瘤细胞。7天后，当所有小鼠均出现可触诊/可测量的肿瘤时，将它们随机分为三个处理组。每组有12-14只小鼠。所有处理均是在后颈皮下接受体积为0.2ml的注射。第一组注射100μg Hsp65-E7融合蛋白，第二组注射20μg E7蛋白(相当于100μg融合蛋白的近似摩尔量)，第三组注射盐水。自肿瘤接种一天后起，经目诊和触诊检查小鼠肿瘤的存在。肿瘤体积用卡尺在两个垂直方向上进行测量而定。用Naito等，癌症研究464109(1986)所述转换公式将测量值换算成体积。结果以每组平均肿瘤体积+/-标准误差表示，见图11。
结果证实，Hsp65-E7融合蛋白处理使已相当大的肿瘤完全退化。这一效应在每只处理小鼠中都很明显。对比之下，模拟处理组或E7蛋白处理组最多只引起肿瘤的短暂退化。在实验后期选取三个时间点对肿瘤测量进行的统计学评价结果示于表2。正如算得的P值所示，Hsp65-E7融合蛋白处理对肿瘤大小的影响与其它处理的影响有显著差别。
表2处理组的统计学比较
需注意的是，在前述实施例中，Hsp65-E7蛋白是作为组氨酸标记蛋白生产的。为明确证实所见治疗效果与融合蛋白中的寡聚组氨酸序列没有任何关系，制备了不带组氨酸标记的Hsp65-E7融合蛋白并用于本实施例。该融合蛋白用以下方案获得。
为构建质粒ET65C(图12)，从质粒RIB 1300(Van Eden等，自然331171，1988)中用AmpliTaq DNA聚合酶(Perkin Elmer)扩增得到卡介苗(BCG)的hsp65基因。正向引物(5’-TTC GCC ATG GCC AAG ACA ATTGCG-3’)有一个包括hsp65基因ATG起始密码子的NdeI位点，反向引物(5’-CGC TCG GAC GCT AGC TCA CAT ATG GAA ATC CAT GCC-3’)有一个紧邻Hsp65编码序列中TGA终止密码子下游的NdeI位点和一个紧邻下游的NheI位点。PCR产物经NcoI和NheI消化、琼脂糖凝胶纯化、再与经类似消化的pET28a连接。用连接混合物转化大肠杆菌DH5α，分离抗生素抗性菌落并增殖以便制备质粒DNA。质粒ET65C经诊断性限制性消化和DNA序列分析鉴定。
为制备包含未标记的Hsp65-E7融合蛋白基因的质粒ET65C/E7-1N，从HPV 16基因组DNA(得自美国典型培养物保藏中心的pSK/HPV16)用AmpliTaq DNA聚合酶(Perkin Elmer)扩增E7基因。正向引物(5’-CCA GCT GTA CAT ATG CAT GGA GAT-3’)有一个带ATG起始密码子的NdeI位点，反向引物(5’-AGC CAT GAA TTC TTA TGG TTT CTG-3’)有一个紧邻E7编码序列中TAA终止密码子下游的EcoRI位点。PCR产物经NdeI和EcoRI消化、琼脂糖凝胶纯化、再与已用相同限制酶消化的pET65C连接。转化细菌，分离包含重组体的菌落，从已增殖的菌落按标准方案制备质粒DNA。参见如，Ausubel等(编)，分子生物学简易方案，第三版(JohnWiley & Sons公司，1995)。所得质粒构建体pET65C/E7-1N的鉴定由诊断性限制性消化和DNA序列分析证实。pET65C/E7-1N的图谱示于图13。
在含30μg/ml卡那霉素的12升2xYT培养基中接种带pET65C/E7-1N的大肠杆菌BL21(DE3)培养物，于30℃通气培养过夜。当光密度达0.5时，培养物用0.5mM IPTG诱导3小时。然后离心收获细胞，重新悬浮于补加了200μg/ml溶菌酶的180ml裂解缓冲液(10mM Tris-HCl，pH7.5，0.5mM 2-巯基乙醇)中并于-70℃中冷冻过夜。在有2μg/ml抑酶肽、2μg/ml亮抑酶肽和2μg/ml抑胃酶肽的情况下，在37℃水浴中解冻细胞。加入2mM PMSF后，对细胞悬液进行强烈地超声破碎，离心去除不溶性蛋白。大部分未标记的Hsp65-E7蛋白存在于可溶性蛋白级分中。为除去内毒素，将1％Triton X-114加入可溶性蛋白级分中，在冰上使混合物冷却(5分钟或更长)并彻底混合。然后将混合物置于30℃水浴10分钟使之升温，接着在24℃离心。将澄清的上清级分(上层)转移至一支干净管中。重复离心3-6次以除去残余Triton X-114。然后对上清级分进行硫酸铵分级分离。在0-15％硫酸铵(w/v)级分中回收融合蛋白。沉淀的蛋白重新溶于缓冲液B(30mM Tris-HCl，pH 7.5，3M尿素，1mM EDTA，1mM 2-巯基乙醇)，上样于已用缓冲液B预平衡的170ml Source Q柱(3.5cm×20cm；Pharmacia)。先用3倍床体积的缓冲液C(无尿素的缓冲液B)洗柱，接着用3倍床体积的缓冲液D(缓冲液C补加250mM NaCl)洗柱。融合蛋白用线性盐梯度(缓冲液C中250mM-1M NaCl)洗脱(汇集物A)，接着用6M盐酸胍(缓冲液A)洗脱(汇集物B)。汇集物B上样于已用缓冲液A预平衡的50ml镍螯合柱(2.6cm×12 cm；Pharmacia)。结合的蛋白用5倍床体积的缓冲液E(缓冲液A加2％Titon-X-100)洗涤，并用盐酸胍-氯化钠梯度(0.1M NaCl/6.0M盐酸胍；5倍床体积)在有1％Triton X-100的情况下进行重折叠。重折叠的蛋白用5倍床体积的缓冲液F(30mM Tris-HCl，pH 7.5，1M NaCl，15％甘油，2％Triton X-100，1mM 2-巯基乙醇)洗涤，接着用5倍床体积的缓冲液G(无Triton X-100的缓冲液F)洗涤以除去Triton X-100。再用5倍床体积的缓冲液H(50mM咪唑，pH 7.5，0.5M NaCl，15％甘油，1mM 2-巯基乙醇)洗柱以除去微弱结合的蛋白。融合蛋白用线性咪唑梯度(缓冲液H中50mM-1M咪唑)洗脱。对未标记的Hsp65-E7蛋白浓缩并对补加了25％甘油的Dulbecco’s磷酸盐缓冲液透析。将可溶性蛋白贮于-70℃。SDS-PAGE和蛋白染色分析表明制品的纯度约为90％。
直接在基本类似于上述实验的实验中比较组氨酸标记的Hsp65-E7和未标记的Hsp65-E7的效力，进一步证实组氨酸标记并不重要。可以发现这两种融合蛋白使肿瘤退化的效力相同。
等效说明本领域的技术人员仅用常规实验法就了解、或能确定还有与本发明中所述特定实施方案等效的很多其它实施方案。这些和所有其它等效方案都将通过以下权利要求书包含在本发明中。
权利要求
1.用于在受试者内诱导针对HPV蛋白抗原的免疫应答的组合物，该组合物包含与应激蛋白连接的HPV蛋白抗原。
2.权利要求1的组合物，其中免疫应答为细胞免疫应答。
3.权利要求1的组合物，其中应激蛋白为分枝杆菌的应激蛋白。
4.权利要求1的组合物，其中HPV蛋白抗原为E6或E7蛋白。
5.权利要求1的组合物，其中应激蛋白来自Hsp60或Hsp70家族。
6.用于在受试者内诱导针对HPV蛋白抗原的免疫应答的组合物，该组合物包含与应激蛋白偶联的HPV蛋白抗原。
7.权利要求6的组合物，其中免疫应答为细胞免疫应答。
8.权利要求6的组合物，其中应激蛋白为分枝杆菌的应激蛋白。
9.权利要求6的组合物，其中HPV蛋白抗原为E6或E7蛋白。
10.权利要求6的组合物，其中应激蛋白来自Hsp60或Hsp70家族。
11.用于在受试者内诱导针对HPV蛋白抗原的免疫应答的组合物，该组合物包含一种融合蛋白，所述融合蛋白含有与应激蛋白融合的HPV蛋白抗原。
12.权利要求11的组合物，其中免疫应答为细胞免疫应答。
13.权利要求11的组合物，其中应激蛋白为分枝杆菌的应激蛋白。
14.权利要求11的组合物，其中HPV蛋白抗原为E6或E7蛋白。
15.权利要求11的组合物，其中应激蛋白来自Hsp60或Hsp70家族。
16.包含与应激蛋白连接的HPV蛋白抗原及另一种药学可接受成分的组合物。
17.权利要求16的组合物，其中应激蛋白为分枝杆菌的应激蛋白。
18.权利要求16的组合物，其中HPV蛋白抗原为E6或E7蛋白。
19.权利要求16的组合物，其中应激蛋白来自Hsp60或Hsp70家族。
20.包含与应激蛋白偶联的HPV蛋白抗原的偶联物。
21.权利要求20的偶联物，其中应激蛋白为分枝杆菌的应激蛋白。
22.权利要求20的偶联物，其中HPV蛋白抗原为E6或E7蛋白。
23.权利要求20的偶联物，其中应激蛋白来自Hsp60或Hsp70家族。
24.包含与应激蛋白融合的HPV蛋白抗原的融合蛋白。
25.权利要求24的融合蛋白，其中应激蛋白为分枝杆菌的应激蛋白。
26.权利要求24的融合蛋白，其中HPV蛋白抗原为E6或E7蛋白。
27.权利要求24的融合蛋白，其中应激蛋白来自Hsp60或Hsp70家族。
28.权利要求24的融合蛋白，其中HPV蛋白抗原为E6或E7，应激蛋白来自Hsp60或Hsp70家族。
29.用于在受试者内诱导针对HPV蛋白抗原的免疫应答的组合物，该组合物包含编码权利要求24的融合蛋白并能指导该融合蛋白在该受试者细胞中表达的表达载体。
30.权利要求29的组合物，其中免疫应答为细胞免疫应答。
31.用于在受试者内诱导针对HPV蛋白抗原的免疫应答的组合物，该组合物包含编码权利要求28的融合蛋白并能指导该融合蛋白在该受试者细胞中表达的表达载体。
32.权利要求31的组合物，其中免疫应答为细胞免疫应答。
33.编码权利要求24的融合蛋白并能指导该融合蛋白在受试者细胞中表达的表达载体。
34.编码权利要求28的融合蛋白并能指导该融合蛋白在受试者细胞中表达的表达载体。
35.诱导针对HPV蛋白抗原的免疫应答的方法，包括对受试者施用有效量的权利要求33的表达载体。
36.诱导针对HPV蛋白抗原的免疫应答的方法，包括对受试者施用有效量的权利要求34的表达载体。
37.诱导针对HPV蛋白抗原的免疫应答的方法，包括对受试者施用有效量的权利要求16的组合物。
38.诱导针对HPV蛋白抗原的免疫应答的方法，包括对受试者施用有效量的权利要求20的偶联物。
39.诱导针对HPV蛋白抗原的免疫应答的方法，包括对受试者施用有效量的权利要求24的融合蛋白。
40.对展示HPV蛋白抗原的肿瘤进行治疗的方法，包括对受试者施用有效量的权利要求33的表达载体。
41.对展HPV蛋白抗原的肿瘤进行治疗的方法，包括对受试者施用有效量的权利要求34的表达载体。
42.对表达HPV蛋白抗原的肿瘤进行治疗的方法，包括对受试者施用有效量的权利要求16的组合物。
43.对表达HPV蛋白抗原的肿瘤进行治疗的方法，包括对受试者施用有效量的权利要求20的偶联物。
44.对表达HPV蛋白抗原的肿瘤进行治疗的方法，包括对受试者施用有效量的权利要求24的融合蛋白。
全文摘要
本发明涉及可用于诱导针对人乳头瘤病毒(HPV)所显示的或包括来自宫颈癌和其它肿瘤的细胞之类感染细胞所展示的HPV蛋白抗原的免疫应答的组合物。在一个实施方案中，组合物包含与应激蛋白(或热休克蛋白(Hsp))连接的HPV蛋白抗原。在另一个实施方案中，组合物包含表达载体，该载体中包括可表达形式的编码HPV蛋白抗原的序列和编码应激蛋白的序列。本发明还涉及包含与HPV抗原连接的应激蛋白以及另一种药学可接受成分的组合物，涉及应激蛋白－HPV蛋白抗原的融合蛋白和偶联物，涉及编码包含应激蛋白和HPV蛋白抗原序列的融合蛋白并能指导该融合蛋白在受试者细胞中表达的表达载体。本发明还涉及这些组合物的用途。
文档编号C12P21/04GK1915425SQ20061010554
公开日2007年2月21日 申请日期1998年3月20日 优先权日1997年8月5日
发明者L·米赞, R·楚, H·B·吴 申请人:斯特思吉生物技术公司