专利名称：：一种快速检测结核分支杆菌多重耐药性的试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明属生物医学检验领域，涉及微生物分子生物学检测方法，具体涉及一种快速检测结核分支杆菌多重耐药性的试剂盒。
背景技术：
：近年来，结核病在全球呈现明显回升趋势。除HIV感染之外，耐多药结核病成为全球结核病回升的主要原因之一。多重耐药结核病的主要治疗策略是避开应用结核杆菌耐药的抗结核药物，这就要求能快速得到耐药资料，但目前的传统培养与药敏测定方法往往需要1个月后才能得到耐药性资料，如果培养阴性则根本不能得到耐药性资料。建立一种快速检测结核菌感染以及检测耐药性的方法，是结核防治工作的迫切需要。传统的结核分支杆菌耐药性的检测，依靠培养法进行药敏试验，是体外结核分支杆菌耐药性的直接证据，但耗时长达12个月。近年来，一些新的药敏试验方法己用于耐药菌株的测定，但能将测定时间控制在l-2天者仍少见。目前已用于或有可能开发为耐药表型快速检测技术的主要有Bactec呼吸测定与分支杆菌生长指示管法(MGIT);2、流式细胞仪测定法(FCM);3、噬菌体发光法与噬菌体裂解法。目前治疗结核的一线药物主要包括异烟肼、利福平、乙胺丁醇、链霉素、吡嗪酰胺等。这些药物作用的靶位、导致抗性产生的基因突变位点已基本清楚，这是进行耐多药基因型检测的基础。目前临床检测多采用PCR方法直接对标本中的结核杆菌抗性相关基因进行扩增，与野生株(药物敏感株)进行比较，检测是否发生突变，从而判断是否产生相应的抗性。目前常用的分析方法有DNA序列分析、异源双链分析、固相杂交分析法和单链构象多态性(SSCP)分析、线性探针杂交(LiPA)方法等。这些方法均较快速，1~2天就可出结果，但均未能同时对多种耐药基因型进行检测，若对多种耐药基因型分开检测成本势必大大上升，难以在临床上推广应用。在所有目前分子生物学技术中，线性探针杂交(LiPA)方法是操作性最强与成本相对较低的技术，目前该技术仅用于检测单个药物的耐药基因型；基因芯片是耐药基因型检测技术中的佼佼者，具有快速、高效地分析生物信息的特点，美国休斯顿现代研究中心(HARC)已研制出了一种DNA芯片，检测利福平、异烟肼、乙胺丁醇3种药物对结核杆菌的耐药性。但基因芯片技术虽然敏感、准确、快速，但成本过于昂贵，临床应用尚有争议。且目前没有成熟的产品；已有研究用等位基因多重PCR方法同时鉴定利福平和异烟肼耐药(①金嘉琳，张文宏等，中华结核和呼吸杂志，2005，28(9):623-625;金嘉琳，张文宏等，中华传染病杂志，2005,23(3):146-149)。但所述方法只能检测有限的耐药基因，而且仅能覆盖利福平和异烟肼2个药物，且敏感性不高；有报道应用反向杂交技术进行耐药基因的测定(庞茂银，张文宏，胡忠义，等.中华传染病杂志2004;22(4):234-236;刘洋，等.中华检验杂志2005;28(4):394—396)。但该技术目前只能用于检测一种基因而未能对多基因进行同时检测。
发明内容本发明的目的是提供一种快速检测结核分支杆菌多重耐药性的试剂盒。本试剂盒可通过一次反应同时多个耐药基因。本发明的另一目的是提供上述试剂盒的制备方法。本试剂盒包括可以同时扩增4种结核耐药相关基因的多重PCR体系和可以同时检测所述4种耐药相关基因中相应点突变的探针杂交体系。本发明联合应用多重PCR技术及核酸杂交技术，首先采用多重PCR(mutiplexpolymerasechainreaction,MPCR)也称复合PCR技术，设计4对特异性的结核分支杆菌(MTB)耐药基因扩增引物，在同一反应体系中同时扩增KatG、embB、rpsL及rpoB四种最常见的易发生突变的MTB耐药基因，PCR扩增产物再利用SouthernBlot技术分别对四种基因的突变位点进行检测，从而达到"一次扩增，多次杂交"的快速检测之目的。鉴于当前的反向杂交技术是基于单纯PCR的杂交技术，只能检测一个耐药基因，本发明试剂盒基于多重PCR的技术，通过一次反应同时检测多个基因；其次，当前的反向杂交技术只能检测一个基因的不同耐药位点，而不能对多个基因同时检测，本发明则能同时检测多个耐药基因，实现快速检测结核分支杆菌多重耐药性的目的。本发明试剂盒通过下述方法和步骤制备1、利用多重PCR技术，设计4对特异性的结核分支杆菌(MTB)耐药基因扩增引物，在同一反应体系中同时扩增KatG、embB、rpsL及rpoB四种最常见的易发生突变的MTB耐药基因，表1是引物序列及扩增产物耐药基因包含的易突变位点。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>其中，所有反向引物均以生物素标记，便于后续的核酸杂交检测。采用常规PCR体系进行梯度PCR反应，扩增相应的4个靶基因。本发明所述的多重PCR，其基本原理与常规PCR相同，区别是在同一个反应体系中加入一对以上的引物，如果存在与各对引物特异互补的模板，则它们分别结合在模板相对应的部位，同时在同一反应体系中扩增出一条以上的目的DNA片段。本发明的多重PCR有着单个PCR无可比拟的优越性消耗时间和试剂少，一次反应可以检测多个基因型，能减轻工作量，提供内部对照，能指示模板的数量和质本发明对240株临床标本进行了检测。结果表明所有的MPCR反应均在同一体系中扩增出了4种耐药基因，且4种耐药基因的扩增产物量相当，而阴性对照及空白对照均无任何目的产物条带产生，说明应用多重PCR技术一次扩增结核分支杆菌4种耐药基因其敏感性及特异性均高，且方法快速简便，所得PCR产物可直接进行后续的核酸杂交反应以进一步检测耐药基因点突变情况。2、采用核酸杂交技术检测结核分支杆菌耐药基因点突变情况1)确定探针的序列及对应的位点表2为探针的序列及对应的位点。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>用核酸杂交技术方法对240株临床标本进行了检测。所有的探针均检测出了所对应的突变位点，敏感性为100%(240/240)。根据杂交结果判断基因突变的情况，并与直接测序结果比较，其中，有230株相符，准确率为95.8%(230/240)。附图2、3、4显示了部分杂交结果。与目前已有的结核耐药基因检测试剂盒相比，本试剂盒的突出优点是可以通过一次操作同时检测多个结核耐药相关基因的突变，快速省时，整个流程仅需l个工作日。此外，与基因芯片检测技术相比，本试剂盒费用相对低廉，且不需要配备昂贵的芯片判读机，易于在基层医疗机构实施和推广。上述优势对于实现结核耐药菌株的早期诊断和控制是至关重要的。图1是多重PCR技术一次扩增结核分支杆菌4种耐药基因电泳图其中，M:lOObpDNA分子量梯度标记(DNALadderMarker),M':150bpDNADNALadderMarker,3、10、26、44、413、451:临床标本，neg:阴性对照。图2用本试剂盒检测148号菌株中KatG基因和rpoB基因耐药相关突变的结果，其中，KatG(P1、P2、P3)和rpoB(P1、P2、P3、P4、P5)分别代表检测相应基因不同位点突变的探针；杂交结果显示此菌株KatG基因为野生型；rpoB基因有突变，发生在511，513，522，526，531，533位点。图3是用本试剂盒检测185号菌株中KatG基因和rpoB基因耐药相关突变的结果，其中，KatG(P1、P2、P3)和rpoB(P1、P2、P3、P4、P5)分别代表检测相应基因不同位点突变的探针；杂交结果显示该菌株KatG基因315位点突变为AAC型；rpoB基因有突变，发生在522，526，531，533位点。图4本试剂盒应用于更多临床标本时的结果，显示该试剂盒适用于临床样品，能很好地鉴定出相应的耐药基因突变位点。具体实施方式实施例l采利用多重PCR技术，设计下述表1中的4对特异性的结核分支杆菌(MTB)耐药基因扩增引物，在同一反应体系中同时扩增KatG、embB、rpsL及rpoB四种最常见的易发生突变的MTB耐药基因及包含的易突变位点，表1<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表中所有反向引物均以生物素标记，以便进行后续的核酸杂交检测。所述的多重PCR体系采用下述试剂(1)TaKaRaTaqHS酶(5U/u1)，(2)10XPCR缓冲液(Mg2+Plus):Tris-HCl(pH8.3)100mM;KCl500mM;MgCl15raM，(3)dNTP混合物各2.5mM，(4)灭菌双蒸水，(5)6X上样缓冲液(Loadingbuffer)(6)lOObpDNALadderMarker,(7)150bpDNALadderMarker,(8)琼脂糖(agrose)，(9)二溴乙烷(ethylenedibromide，EB)，(10)TBE电泳缓冲液。MPCR反应体系为Temp(结核杆菌基因组DNA)10XPCR缓冲液(Mg2+Plus)dNTPMixture(各2.5mM)KatG-F(lOuM)KatG—R*UOyM)lu15u14u13u1<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>普通琼脂糖凝胶电泳初步检测MPCR反应产物(1)制备2%Agarose凝胶；(2)按每5u1PCR反应液中加入1n16XLoadingBuffer的比例添加混合后进行电泳；(3)70VX2.5h-3h。对240株临床标本进行了检测，结果表明所有的MPCR反应均在同一体系中扩增出了4种耐药基因，且4种耐药基因的扩增产物量相当，而阴性对照及空白对照均无任何目的产物条带产生，说明应用多重PCR技术一次扩增结核分支杆菌4种耐药基因其敏感性及特异性均高，且方法快速简便，所得PCR产物可直接进行下一步核酸杂交反应。2、核酸杂交技术检测结核分支杆菌耐药基因点突变情况确定下述表2所示探针的序列及对应的位点表2<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>所采用试剂是(1)20xSSC，(2)50xDenhardt试剂，(3)鄉SDS，(4)去离子甲酰胺，(5)鲑精DNA，(6)亲和素标记碱性磷酸酶(Avidin-AP)，(7)NBT/BCIP试剂盒(华美公司)，其中包括NBT、BCIP、1Qx稀释液;(8)小牛血清。1)预杂交液6xSSC，100yg/ml鲑精DNA,5xDenhardt，1%去离子甲酰胺，0.5%SDS;2)杂交液6xSSC，0.2%SDS;3)洗膜液2xSSC，0.1%SDS。4)酶染液10%小牛血清，0.5%Avidin-AP5)显色液BCIP:NBT:"稀释液=1:1:50。显色液须使用前5—10min临时配制。进行SouthernBlot核酸杂交技术操作将固定好探针的尼龙膜置于杂交槽中，加入1ml预热至37'C的预杂交液，37'C缓慢振荡40min或37'C静置，其间轻晃2—3次；弃去预杂交液，加入2ml预热至55。C的洗膜液，55。C振荡10min;PCR产物加热至100。C，8min以变性；弃去洗膜液，加入1ml预热至37。C的杂交液，将50pl变性好的PCR产物立即加入其中，晃动混匀，37t:缓慢振荡1.5—2h或37'C静置，期间晃动3—5次；弃去杂交液，加入1ml预热至55"C的洗膜液，55。C振荡2min;弃去洗膜液，再加入1ml预热至55。C的洗膜液，55。C振荡5min;弃去洗膜液，加入0.5ml酶染液，室温作用30—40min，其间轻晃2—3次，其中，尼龙膜浸泡于酶染液中；弃去酶染液，加入1ml洗膜液，轻晃3—5次，弃去洗膜液；加入1ml显色液，室温、避光静置30—60min，根据显色程度用大量蒸馏水终止反应，其中，尼龙膜浸泡于酶染液中。检测结果显示应用上述方法对240株临床标本进行了检测。所有的探针均检测出了所对应的突变位点，敏感性为100%(240/240)。根据杂交结果判断基因突变的情况，并与直接测序结果比较，有230株相符，准确率为95.8%(230/240)。部分杂交结果如图2、3、4所示。表3是SouthernBlot核酸杂交技术检测结核分支杆菌耐药基因点突变情况结果分析。1表3<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>权利要求1、一种快速检测结核分支杆菌多重耐药性的试剂盒，其特征是包括同时扩增4种结核耐药相关基因的多重PCR体系和同时检测所述耐药相关基因中相应点突变的探针杂交体系。2、按权利要求l所述的快速检测结核分支杆菌多重耐药性的试剂盒，其特征是所述的4种结核耐药相关基因是KatG、embB、rpsL和rpoB耐药基因。3、权利要求1的快速检测结核分支杆菌多重耐药性的试剂盒的制备方法，其特征是联合应用多重PCR技术和及核酸杂交技术，检测结核耐药相关基因突变，包括下述步骤(1)采用多重PCR技术，设计4对特异性的结核分支杆菌耐药基因扩增引物，用常规PCR体系进行梯度PCR反应，扩增相应的4个靶基因；(2)采用核酸杂交技术检测结核分支杆菌耐药基因点突变情况。4、按权利要求3所述的方法，其中所述的结核分支杆菌耐药基因扩增引物其序列及扩增产物耐药基因包含的易突变位点如表1所示，其中，所有反向引物均以生物素标记，表l<table>complextableseeoriginaldocumentpage1</column></row><table>5、按权利要求3或4所述的方法，其中所述的多重PCR其反应条件为:<formula>seeoriginaldocumentpage2</formula><formula>seeoriginaldocumentpage3</formula>所述的多重PCR其反应体系为Te卿结核杆菌基因组DNA10XPCR缓冲液Mg》PlusdNTPMixture各2.5mMKatG-F10uMKatG-R10yM柳bB-F20uMembB-R20rpsL-F10uMrpsL-RlOuMrpoB-F10卬oB-RlOiiMT叫HS酶5U/u1灭菌双蒸水X30cycles15y14u13y13u16u16u13u13u12y12n10.5u111.5y16、按权利要求3所述的方法，其中所述的核酸杂交体系其中检测各耐药相关基因相应点突变的探针序列及对应的位点如表2所示，表2<table>Complextableseetheoriginaldocumentpage4</column></row><table>7、按权利要求3所述的方法，其中所述的核酸杂交体系，其中预杂交液6xSSC，100ng/ml鲑精DNA，5xDenhardt，1%去离子甲酰胺，0.5%SDS;杂交液6xSSC，0.2%SDS;洗膜液2xSSC，0.1%SDS。酶染液10%小牛血清，0.5%Avidin-AP;显色液BCIP:NBT:"稀释液=1:1:50。显色液须使用前5—10min临时配制。全文摘要本发明属生物医学检验领域，涉及微生物分子生物学检测方法，具体涉及一种快速检测结核分支杆菌多重耐药性的试剂盒，包括同时扩增4种结核耐药相关基因的多重PCR体系和同时检测所述耐药相关基因中相应点突变的探针杂交体系，本试剂盒可以通过一次操作同时检测多个结核耐药相关基因的突变，快速省时，整个流程仅需1个工作日。本试剂盒费用相对低廉，且不需要配备昂贵的芯片判读机，易于在基层医疗机构实施和推广。文档编号C12Q1/68GK101168767SQ20061011755公开日2008年4月30日申请日期2006年10月25日优先权日2006年10月25日发明者孟成艳,舒张,张文宏,莹王,翁心华,凌莫,金嘉琳,澍陈申请人:复旦大学附属华山医院